当前生物量。作者手稿；PMC 2012年1月11日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院254643
细胞重编程和维持人类胚胎干细胞特性需要高增殖率
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塞尔吉奥·鲁伊斯
1索尔克生物研究所基因表达实验室，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
Athanasia D.帕诺普洛斯
1索尔克生物研究所基因表达实验室，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
阿伊达·赫利亚斯
4巴塞罗那再生医学中心，Aiguader博士，88，08003巴塞罗那，西班牙
卡尔·迪米特·比西格
2索尔克生物研究所遗传学实验室，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
玛格丽特·卢茨
三干细胞核心，索尔克生物研究所，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
W.特拉维斯·伯格伦
三干细胞核心，索尔克生物研究所，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
Inder M.Verma公司
2索尔克生物研究所遗传学实验室，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
胡安·卡洛斯·伊兹皮苏·贝尔蒙特
1索尔克生物研究所基因表达实验室，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
4巴塞罗那再生医学中心，Aiguader博士，88，08003巴塞罗那，西班牙
1索尔克生物研究所基因表达实验室，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
2索尔克生物研究所遗传学实验室，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
三干细胞核心，索尔克生物研究所，10010 North Torrey Pines，92037，La Jolla，CA-USA
4巴塞罗那再生医学中心，Aiguader博士，88，08003巴塞罗那，西班牙
- 补充资料
1
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总结
人类胚胎干细胞（hES）表现出非典型的细胞周期调节，其特点是高增殖率和短G1期[1,2]. 事实上，缩短G1期可能保护ES细胞免受诱导分化的外部信号的影响，如某些干细胞所示[三]. 已有研究表明，自我更新和多能性与ES细胞的细胞周期调控密切相关[4——6]尽管人们对细胞周期机制在维持ES细胞特性方面的整体重要性知之甚少。随着通过表达特定转录因子生成诱导多能干细胞（iPS）的能力的出现，出现了一个很有吸引力的模型，以解决干细胞特性的获得是否与细胞周期调节有关[7——11]. 在这里，我们表明hES细胞的特征性细胞周期特征是作为细胞重新编程的早期事件获得的。我们证明，诱导细胞增殖可提高重编程效率，而细胞周期阻滞可抑制成功的重编程。此外，我们发现细胞周期阻滞足以驱动hES细胞向不可逆分化方向发展。我们的结果建立了一种联系，将细胞周期控制机制与ES细胞特性获得和维持的机制联系在一起。
关键词：诱导多能干细胞、细胞周期、增殖、细胞周期素依赖性激酶
结果
获得高增殖率是细胞重新编程的早期事件
hiPS细胞在分子和功能上与hES细胞在多潜能基因表达和支持分化为三个胚胎生殖层的能力方面相似[7——11]. 一致的是，我们观察到hES细胞的特征性细胞周期结构，包括大量的S期细胞和缩写的G1期细胞[1,2]，也在已建立的hiPS细胞系中获得(图S1和补充文本)。因此，这促使我们调查获取此配置文件是否是重新编程过程中的早期步骤。为此，我们使用了角朊细胞，这是一种具有高重编程效率的细胞来源，在重编程过程中，新生的iPS细胞集落在10-14天之间出现[12]. 因此，我们分析了OCT4、SOX2、KLF4和cMYC（OSKC）表达12天后，由干细胞表面标记物Tra-1-81和Tra-1-60鉴定的新生iPS细胞集落的细胞周期特征[13] ()。Tra-1-60+或Tra-1-81+与Tra-1-60相比，细胞群显示出与hES细胞（H9细胞系）中观察到的细胞周期相似的细胞周期曲线−或Tra-1-81−人口()。接下来，我们还通过测量新出现的表达干细胞标记物Nanog的iPS细胞集落中BrdU掺入的百分比来分析增殖水平。我们确定BrdU的百分比+hES和新生Nanog中的细胞+iPS细胞集落相似，与BrdU水平降低形成对比+在原始体细胞中观察到的细胞()。为了进一步评估这些发现，我们开发了一种细胞分析方法，根据内源性Oct4启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）基因的表达来识别早期hiPS细胞集落。已有研究表明，内源性多能基因表达的重新激活是成功重编程的必要和早期事件[14]. 因此，我们区分了敲除OCT4GFP公司人H1 ES细胞系[15]成纤维细胞样细胞群（dFib-OCT4GFP公司,图S2)。dFib-OCT4的转导GFP公司OSKC细胞重新激活内源性OCT4基因座的表达，这与GFP的出现有关(图S2B)。此外，我们确定新出现的GFP+-与已建立的GFP相比，hiPS细胞集落与hES细胞的转录仍不完全相同+-hiPS细胞系，因此表明该群体代表尚未完全成熟的iPS细胞(图S2C)。在评估增殖的实验中，我们观察到BrdU的可比百分比+hES细胞中的细胞与早期GFP+hiPS细胞，这明显高于在父母群体中观察到的百分比()。此外，我们能够检测到高度增殖的GFP+OSKC转导10天后的菌落()。最后，我们分析了磷甾酮H3的百分比+细胞是一种明确的有丝分裂标记物，用于进一步评估新生hiPS细胞集落中增殖能力的获得。我们观察到GFP+来自dFib-OCT4的菌落GFP公司以及Tra-1-60+来源于角质形成细胞的菌落显示出类似比例的磷酸化氢istone H3+细胞与人胚胎干细胞相比，这明显高于在起始细胞群中发现的百分比()。总之，这些数据有力地表明，hES细胞的特征性增殖能力是作为hiPS细胞生成的早期事件而获得的。
hES细胞的特征性细胞周期特征在重编程早期获得（A） 角朊细胞首次感染（OSKC）后12天，通过EdU掺入Tra-1-60和Tra-1-81阳性和阴性细胞群分析细胞周期分布。H9细胞作为染色阳性对照。进行了两个独立的实验，每个点图中有5000个细胞。Ke=角质形成细胞。
（B） 纳米百分比+/溴化铀+H9细胞和新生hiPS细胞与BrdU百分比的比较+角质形成细胞中的细胞。至少10纳米+在两个独立的实验中对菌落进行了评估。细胞与10μM BrdU孵育30分钟。Ke=角质形成细胞。
（C） 该图显示了BrdU百分比的量化+首次感染dFib-Oct4 14天后，早期出现的hiPS菌落中的细胞获得GFP公司与OSKC合作。H9细胞以及原始dFib-Oct4GFP公司纳入细胞群进行比较。至少10 GFP+在两个独立的实验中对菌落进行了评估。细胞与10μM BrdU孵育30分钟。
（D） 首次感染dFib-Oct4后10天hiPS细胞获得BrdU免疫荧光GFP公司与OSKC合作。显示了一个典型示例。
（E和F）这些图表显示了磷烯酮H3百分比的量化+hiPS菌落中的细胞在角质形成细胞（E）或dFib-Oct4首次感染12或14天后获得GFP公司（F） 分别与OSKC合作。纳入H9细胞和原始细胞群进行比较。至少10 GFP+（E） 或Tra-1-60+（F） 在两个独立的实验中对菌落进行了评估。Ke=角质形成细胞。
诱导细胞增殖促进hiPS细胞的形成，而细胞周期阻滞抑制细胞重编程
据报道，OSKC的表达触发衰老反应并诱导G1细胞周期阻滞[16]. 细胞周期从G1期进展到S期需要视网膜母细胞瘤（pRb）的逐步磷酸化和功能失活，pRb通过结合和抑制E2F转录因子调节细胞周期进展[17]. 这种磷酸化是由细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）介导的，CDK的激活需要细胞周期蛋白（Cyc）的结合[18]. 因此，CycD-CDK4/6和CycE/A-CDK2复合物的形成允许细胞进入S期。相反，细胞周期阻滞是通过CDK抑制剂（CKI）的CIP/KIP（p21、p57和p27）和INK4（p15、p16、p18和p14）家族成员的表达介导的[17——20]. 为了在hiPS细胞中建立hES细胞周期结构，我们测试了克服OSKC诱导的细胞周期阻滞是否是获得多能性的重要事件。因此，我们研究了参与G1到S相转变控制的蛋白质表达的调节以及由此产生的增殖状态是否会影响细胞重新编程的效率。为此，我们设计了一组针对pRb、CDK2/4、CycE1、CycD1/D2编码shRNA的慢病毒(图S3A)以及编码不同细胞周期蛋白（p15、p16、p21、CycD1/D2、CDK1/2/4或CycE2）的逆转录病毒，并与角质形成细胞中的OSKC共同感染。pRb下调导致重编程效率平均增加3倍()。有趣的是，我们观察到当CycE1（CDK2激活物）或CycD2（CDK 4激活物）被下调时，角质形成细胞没有形成集落()而在CDK2、CDK4或CycD1下调后，重编程效率没有变化()。我们还发现细胞周期阻滞介质p15、p16或p21的异位表达几乎没有导致hiPS细胞集落的形成()。此外，我们观察到CycD1、CycD2和CycE2的表达，而不是CDK1、CDK2或CDK4的表达，与对照相比，重编程效率提高了2倍以上()。使用IMR90或BJ成纤维细胞获得了类似的结果（数据未显示）。接下来，我们假设细胞周期蛋白及其CDK催化伙伴的表达，而不是单独表达，可能对重编程效率有更深远的影响。事实上，我们观察到，通过在BJ成纤维细胞中共同表达CycD1/CDK4，重编程效率显著提高，高达10倍，这是一种通常重编程效率低于角质形成细胞的细胞类型()。重要的是，我们观察到细胞增殖的变化与重编程效率的变化密切相关()。此外，我们进一步使用累积BrdU标记进行评估，该标记提供了有关S期进入率和细胞周期长度的信息[21]p16、p15或p21的过度表达，或CycD2或CycE1的下调，导致接受重新编程的细胞群中的细胞周期永久停滞。然而，与对照细胞相比，CycD1、CycE2或CDK4/CycD1.的过度表达或pRb的下调导致在分析期间细胞进入S期的速率恒定增加(图S3B)。总之，我们的结果表明，通过促进S期进入，减轻OSKC诱导的细胞周期阻滞，可以提高细胞重新编程的效率，而进一步诱导细胞周期阻滞则具有相反的效果().
重编程效率受G1到S相转变相关蛋白表达的调节影响（A–D）人类角质形成细胞（A–C）或BJ成纤维细胞（D）培养物感染了编码这4个因子的逆转录病毒、OSKC和编码shRNAs的慢病毒（针对所示蛋白（A））或编码所述蛋白（B、C和D）。相对重编程效率与pMX-GFP或pLVTHM感染角质形成细胞中观察到的效率相对应，并显示了折叠变化(上图)。所有实验均使用未感染细胞作为阴性对照。n=独立实验的数量。所有误差条均表示SEM.Sc=加扰shRNA。
（E–G）BrdU的百分比+在用OSKC加上表达所述蛋白质的逆转录病毒或表达所述shRNA的慢病毒感染后4天，角质形成细胞（E，F）或BJ成纤维细胞（G）中的细胞。注意BrdU的不同百分比+两个实验对照组之间的细胞，即pMX或pLVTHM感染的角质形成细胞（E，F），由于使用了不同的病毒传递方法（逆转录病毒vs慢病毒）。进行了两个独立的实验，结果表示为两个实验中三个不同领域中至少300个细胞的平均±SEM得分。细胞与10μM BrdU孵育60分钟。Sc=加扰shRNA。
（H）左图，GFP数量+每10个菌落5dFib-Oct4感染后接种的细胞GFP公司带有各自的逆转录病毒。进行了两个独立的实验，结果表示每个实验两个生物复制品的平均±SEM。中间和右侧面板不同条件下获得的菌落的形态特征以及GFP表达或Nanog染色8(中间面板)或16(右侧面板)第一次感染后第天。比例尺：100μM。
接下来，我们确定诱导增殖后观察到的重编程效率的增加是由于重编程速率的加速，还是由于可重编程的细胞数量的增加。为此，我们感染了dFib-OCT4GFP公司单独使用OSKC、OSKC+CycD1或OSKC+CDK4/CycD1。第一个GFP的出现+早在感染后8天检测到OSKC表达后的菌落()。令人惊讶的是，在CycD1或CycD1/CDK4介导的细胞增殖增加时，我们没有观察到细胞重编程速度的差异，因为所有条件都显示GFP+第8天的菌落数()。然而，与我们之前的发现一致，当CycD1或CycD1/CDK4过度表达时，我们观察到更多的菌落()。总的来说，这些数据表明，增殖率的增加会导致易于重新编程的细胞数量激增，而不是改变重新编程过程的动力学。
细胞周期阻滞足以驱动hES细胞向不可逆分化方向发展
我们已经证明，在细胞重编程过程中获得自我更新和多潜能与成功克服OSKC介导的细胞周期阻滞和ES细胞周期结构的建立有关。接下来，我们研究了人胚胎干细胞的自我更新和多能性是否依赖于非典型的细胞周期调控模式。我们生成了含有多西环素诱导表达构建物的H9细胞系，用于细胞周期阻滞诱导物p15、p16和p21，以确定这些蛋白在hES细胞中的过度表达是否通过促进细胞周期结构的改变来平衡其分化。在诱导p15、p16或p21表达24小时后，我们检测到hES细胞G1期百分比显著增加，其中p21表现出最显著的影响(和数据未显示）。G1期细胞的积累可能表明G1期有一个细胞亚群停滞，但也可能表明细胞正在经历G1期延长。为了区分这两种可能性，我们对诱导型hES细胞系进行累积BrdU标记。使用这种方法，我们能够确定在G2+M+G1相（TG2+M+G1)（请参见补充实验程序详细信息）。我们观察到p21的诱导导致永久性细胞周期阻滞()而p15或p16的诱导导致T增加G2+M+G1分别为约40%（15.52小时（dox）vs.11.03小时（no-dox））和约30%（12.9小时（dos）vs.9.94小时（no-dox）。重要的是，我们没有检测到TG2+M+G1当GFP被诱导时（TG2+M+G1=8.71小时（dox）vs.9.27小时（无dox））()。接下来，我们评估了p15、p16或p21介导的细胞周期变化对人胚胎干细胞自我更新和多能性的影响。强力霉素治疗10天后，延长p21的诱导导致大量细胞分化为非增殖细胞()。相反，p15或p16的表达导致中间表型，在中间表型中检测到高度增殖的hES细胞样集落，但被分化的非增殖细胞包围()。然后，我们对维持在正常生长介质中或连续使用强力霉素10天后的诱导型H9细胞系进行了多能性和分化标记的基因表达和蛋白质分析(和数据未显示）。我们在形态上类似于hES细胞的区域中p15或p16过度表达后检测到OCT4的表达，但在其周围分化的人群中没有检测到()。然而，在hES细胞中持续p21诱导的细胞周期停滞后，OCT4的表达丢失()。此外，在p15、p16或p21被诱导的hES细胞中，我们检测到一些分化标记的表达水平升高，这在对照GFP系或未用强力霉素处理的相同系中未观察到(数据未显示）。
hES细胞周期阻滞诱导分化（A） 用200 ng/ml多西环素治疗24小时后，对GFP、p15、p16和p21诱导的H9细胞系蛋白提取物进行Western blot分析。
（B） GFP、p15、p16和p21诱导的H9细胞系的累积BrdU标记曲线。在加入或不加入强力霉素培养24小时后，每两小时向培养基中添加一次新鲜的BrdU，并按指示在不同时间点分析BrdU标记指数。BrdU标记指数表示DAPI染色的细胞核中BrdU掺入阳性的比例。每个时间点代表两个生物复制品中不同区域至少500个细胞核的三倍计数的平均值和标准偏差。上面的虚线表示最大标记指数，与强力霉素治疗无关。达到最大标记指数所需的时间对应于细胞周期总长度减去S期长度（TG2+M+G1) [21].
（C） 在没有强力霉素的情况下（第0天）或p15、p16或p21诱导后2、6和10天，相同细胞系的细胞形态。在p15和p16表达株中观察到的小的hES细胞样集落用虚线勾勒出来。比例尺：100μM。
（D） 用强力霉素诱导10天后，对p15、p16和p21诱导的H9细胞系中的BrdU和Oct4进行免疫荧光分析。10月4日+殖民地用虚线勾勒出来。比例尺：100μM。细胞与10μM BrdU孵育30分钟。
（E） 对GFP和p21表达的H9细胞系中的指示蛋白进行10天或不进行强力霉素诱导的Western blot分析。
（F） 用200ng/ml多西环素诱导10天后，对p15、p16和p21-诱导的H9细胞系中胚层（SMA）、滋养层（Cdx2）、外胚层（Tuj1）和内胚层（GATA4、AFP、白蛋白、FoxA2）的分化标记进行免疫荧光分析。比例尺：100μM。
接下来，我们研究了hES细胞中细胞周期诱导的分化是否可逆。我们还评估了细胞周期抑制剂表达触发分化所需的最短时间。为此，我们分析了诱导p21表达的细胞的形态学和分化标志物的表达，方法是在培养基中加入多西环素指定的天数，然后在每个指定的时间点停药，总共培养10天().
hES细胞中p21表达介导的分化是一个不可逆的过程（A） 所进行实验的示意图。简言之，通过向培养基中添加强力霉素，持续指定的天数，然后在每个指定的时间点停药，诱导并维持p21表达。在培养10天后对所有细胞进行分析。
（B） GFP和p21诱导细胞系的细胞形态在指定条件下保持10天。p21诱导一天后观察到的小的hES细胞样菌落用虚线勾勒出来。比例尺：100μM。
（C） 用200ng/ml多西环素诱导3天后，再在退出培养7天后，对p21诱导的H9细胞系中胚层（SMA）、滋养层（Cdx2）、外胚层（Tuj1）和内胚层（AFP、白蛋白、FoxA2）的分化标记进行免疫荧光分析。比例尺：100μM。
（D） 在所指示的诱导条件之后，对p21诱导的H9细胞系中的中胚层（Msx1）、滋养外胚层（Cdx2）、外胚层（Pax6、FGF5）和内胚层（GATA4、GATA6、AFP、白蛋白、FoxA2）胚层的多能性标记物（Oct4）和特异性分化标记物的实时PCR分析。数据显示为一式三份分析的两个生物重复的相对平均值±SEM。
有趣的是，我们观察到只有一天的p21诱导产生了一种形态类似hES的细胞被分化细胞包围的培养()。我们还确定，连续诱导3天p21足以触发大规模分化，而停用强力霉素不足以挽救分化表型()。因此，连续诱导p21表达3天以上可导致几种分化标记的更强表达()。相反，在诱导GFP表达后，我们没有观察到任何形态变化和/或分化标记的表达（数据未显示）。综上所述，这些数据表明hES细胞中细胞周期阻滞诱导的分化是一个不可逆的过程。
讨论
我们的数据确立了细胞增殖在hES细胞重新编程和维持自我更新和多能性方面的重要作用。我们发现，hES细胞增殖速度的改变导致了自我更新和多能性维持的妥协。事实上，我们观察到p15或p16在hES细胞中的表达会导致G2+M+G1期的平均时间延长，这与分化倾向增加有关。鉴于p15和p16都是众所周知的G1-CDK细胞周期抑制剂，延长可能会影响G1期[17——20]. 有趣的是，有人提出G1期的长度可能影响干细胞的命运，并且是干细胞分化的决定因素[三,22——24].
我们还证明，诱导细胞周期阻滞足以使hES细胞分化。令人惊讶的是，在mTeSR1（一种hES细胞化学定义的无饲料培养基）中培养细胞周期阻滞细胞时，我们能够获得分化细胞[25]. 我们进一步观察到，诱导hES细胞周期阻滞所引发的分化是一个不可逆的过程。事实上，三天的细胞周期阻滞足以使人胚胎干细胞分化。这些结果表明，人胚胎干细胞被指定保持高增殖率，以支持其自我更新。事实上，尽管体细胞（如角质形成细胞）中p15或p16的表达诱导了完整的细胞周期阻滞，但hES细胞中相同蛋白的表达仍然能够促进增殖，尽管会导致细胞周期结构的改变。此外，我们观察到，在hES细胞中发现的细胞周期特性是在细胞重新编程的早期获得的。克服OSKC表达诱导的细胞周期阻滞可能是成功重编程的早期和必要事件[16]. 事实上，有报道称墨水4/Arf基因座在细胞重编程早期出现[26]. 此外，OCT4能够抑制p21启动子的表达[27]. 同意，早在dFib-OCT4感染后10天GFP公司细胞，我们检测到高度增殖的小菌落，其中内源性多能网络已经被重新激活().
最后，我们发现刺激细胞增殖可以改善体细胞的重新编程，而诱导细胞周期停滞则会削弱这一过程。事实上，细胞重编程过程中的一些最初遗传事件是p53/p21通路的失活[28——30]和墨水4/Arf轨迹[26]. 我们的结果在刺激或抑制细胞增殖与细胞重新编程效率之间建立了完美的相关性。有趣的是，我们观察到不同CDK的表达，如CDK4或CDK2，既不会改变S期细胞的百分比，也不会影响重编程效率。相反，它们相应的激活物CycD1/D2或CycE2的表达分别正向增加了这两个过程。这可以解释为，细胞周期蛋白是诱导CDK活性和促进进入S期的限制因素。因此，CycD1/CDK4的共同表达诱导了S期细胞的大量积累，并将重编程效率提高了10倍。然而，我们没有观察到CycE/CDK2共表达后重编程效率的变化，这与重编程细胞的增殖状态没有变化有关（数据未显示）。然而，细胞分裂影响重编程效率的确切机制尚不清楚。积极促进通过S期的转变可能使基因组的表观遗传学重置和/或促进增殖，以增加可用于随机重编程的细胞数量。
总的来说，我们证明了自我更新和多能性依赖于在hES细胞中观察到的特定细胞周期调节。因此，我们表明，高增殖率是获得和维持hES/hiPS细胞的多能性和自我更新所必需的事件。总之，我们提供了强有力的证据表明，细胞周期调控途径和多能性网络在保护ES细胞特性方面错综复杂。
致谢
我们特别感谢川崎康彦、杰苏斯·帕拉米奥、杰夫·瓦尔、克里斯·沃尔什、梅·施瓦兹、苏西·加缪和塞尔吉奥·梅内德斯批判性地阅读并改进了手稿的最终版本。我们还感谢Krystal Sousley对Salk Institute干细胞核心研究所的支持，感谢Kristen Brennand对重新编程实验的帮助，感谢MercèMarti在组织学和生物成像部门以及Belmonte实验室的其他人员所做的出色工作。SR得到卡洛斯三世研究所（CGCV-1335/07-3）的部分支持。ADP部分由NIH培训拨款T32 CA009370支持。这份手稿的工作得到了Cellex基金会、G.Harold和Leila Y.Mathers慈善基金会、赛诺菲-安提斯和MICINN的资助。
脚注
亮点：“高增殖率是细胞重编程的早期事件”“细胞增殖影响体细胞重编程效率”“细胞周期阻滞促使hES细胞向分化”
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参考文献
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