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.2008年10月；28(20):6426-38.
doi:10.1128/MCB.00359-08。 Epub 2008年8月18日。

Oct4/Sox2调节的miR-302靶向人类胚胎干细胞中的细胞周期蛋白D1

黛博拉贺卡 1, Pratibha B Hebbar公司, 李乐平, 凯文·沃特罗, 小松义弘, Yuji Mishina公司, 特雷弗·K·阿彻
附属机构

Oct4/Sox2调节的miR-302靶向人类胚胎干细胞中的细胞周期蛋白D1

黛博拉贺卡等。 分子细胞生物学. 2008年10月.

摘要

Oct4和Sox2是早期胚胎发生过程中多能性和维持胚胎干细胞（ESC）特性所需的转录因子。多能性的功能机制预计与这些因子转录激活的基因有关。这里，我们显示Oct4和Sox2结合到miR-302的保守启动子区域，这是一个在ESCs和多能干细胞中特异表达的8个microRNA簇。miR-302a的表达依赖于Oct4/Sox2在人类胚胎干细胞（hESCs）中的表达，并且在胚胎发生期间，miR-302与Oct4在相同的发育阶段和相同的组织中表达。miR-302a被预测靶向许多细胞周期调节因子，并且在原代和转化细胞系中miR-302 a的表达促进了S期细胞的增加和G（1）期细胞的减少，这让人想起ESC样的细胞周期曲线。相应地，miR-302的抑制导致hESCs在G（1）期积聚。此外，我们发现miR-302a抑制了重要G（1）调节因子cyclin D1在人胚胎干细胞中的高效翻译。miR-302的转录激活及其靶点（如cyclin D1）的翻译抑制可能在Oct4/Sox2和多能干细胞中的细胞周期调节之间提供联系。

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数字

图1。
图1。
Oct4、Sox2和Nanog结合到hESCs中miRNAs的miR-302簇的启动子区域。（A） 来自人类、小鼠和鸡的miR-302 miRNAs簇的同源启动子区域的比对。预测的Oct4、Sox2和Nanog结合位点分别以蓝色、红色和绿色突出显示。星号表示序列同源。（B） 包含预测的WT Oct4结合域和EMSA分析中使用的突变体1、突变体2和双突变体寡核苷酸（m1、m2和D）的双链DNA探针序列。（C） 含有预测的Sox2结合位点的双链DNA探针序列，该位点更接近Oct4结合位点（−471）。m、 突变体。用具有Oct4结合位点的BG-01细胞提取物进行（D和E）EMSA分析。（D） EMSA含有50倍WT、突变体1、突变体2和双突变体（m1、m2和D）寡核苷酸的冷竞争对手。（E） Oct4抗体超移。（F和G）使用Sox2结合位点进行EMSA分析。（H） Oct4、Sox2和Nanog结合到多能干细胞中miR-302的启动子区域。hESCs与甲醛交联，通过超声波剪切DNA制备染色质。然后用针对Oct4、Sox2、Nanog和非特异性抗体（IgG）的抗体对片段染色质进行免疫沉淀。通过qRT-PCR扩增与每种染色质免疫沉淀相关的DNA，使用miR-302和Oct4或GAPDH cDNA的启动子区特异性引物作为阴性对照。此处显示的qRT-PCR结果是BG-01细胞系至少三个实验结果的代表性示例。误差线表示标准偏差。核萃取结合探针的两个主要络合物，命名为A和B，用凝胶右侧的箭头表示。+，存在；−，缺席；FP，自由探头；SS，超换档；竞争对手；NE，核提取物；抗体；ChIP，染色质免疫沉淀。
图2。
图2。
在RA治疗期间，Oct4的表达与miR-302 miRNAs的表达相关。（A、B和C）收获暴露于1μM RA 0至10天的hESCs，并通过qRT-PCR用miR-302转录物、miR-302a和Oct4特异性引物分析从全细胞裂解物中提取的RNA和蛋白质（A）；用Oct4和α-微管蛋白（Tub）（B）特异性抗体进行免疫印迹；用miR-302b、-c和-d（c）特异性引物进行qRT-PCR。（D） 使用miR-302转录物和miR-302a特异性引物或Oct4和β-actin特异性抗体的Western blotting对暴露于RA 10天的NTERA2细胞进行分析，如A组所述。此处显示的qRT-PCR和Western blot是H1细胞或NTERA2细胞三个实验结果的代表性示例，用RA治疗；−，未接受RA治疗。误差线表示标准偏差。
图3。
图3。
表达miR-302 miRNAs需要Oct4和Sox2转录因子。（A） 按照材料和方法中的描述，用200 nM非特异性对照（NS）或100 nM Oct4和Sox2（O/S）siRNA寡核苷酸分别转染BG-01细胞，并制备全细胞提取物。Oct4、Sox2和β-actin蛋白表达水平通过特异性抗体的Western blotting进行分析。（B） 用pGL3-Basic或pGL3-miR-302将BG-01细胞与非特异性对照siRNA（NS）或Oct4/Sox2 siRNA（O/S）转染48小时，如面板A所述。此外，将所有样品转染pRL-CMV作为转染对照。然后采集细胞提取物并分析其相对荧光素酶活性。显示了pGL3-miR-302中克隆的启动子区域的示意图。luc/ren，荧光素酶/雷尼利亚活动。（C） 将100 nM的非特异性对照（NS）、Oct4 siRNA（O）、Sox2 siRNA（S）或Oct4/Sox2 siRNA（O/S）转染BG-01细胞，如A组所述，并用特异性抗体通过Western blotting分析Oct4、Sox2和β-actin蛋白表达水平。（D） qRT-PCR用于分析siRNA-缺失细胞中成熟miR-302a miRNA的相对表达水平（归一化为5S rRNA水平）。（E） 用pGL3-Basic或pGL3-miR-302转染HeLa细胞，并用pCAG-Myc-Oct4和pCAG-HA-Sox2共转染或空载体共转染。用Oct4、Sox2和β-肌动蛋白抗体检测蛋白质印迹，存在；−，不存在。（F） 分析HeLa细胞裂解物的相对荧光素酶活性；数据以相对单位表示。
图4。
图4。
miR-302在早期胚胎发生中表达。（A） 在E3.5、E6.5、E7.5和E8.5发育点分离CD1胚胎。提取RNA并通过qRT-PCR分析Oct4 mRNA、miR-302转录物和miR-302a的水平，并显示平均相对表达水平。（B） 如图所示，使用miR-302a（miR-302）探针和阴性对照通过原位杂交分析E6.5和E7.5胚胎。顶部、E6.5和E7.5胚胎在同一田地中；底部，E6.5和E7.5胚胎，如图所示。条形图显示所示尺寸。
图5：。
图5：。
miR-302簇miRNAs的表达与短G1阶段。用前miR-302a或阴性（neg）对照前miR转染HeLa细胞。细胞周期分析采用FACS进行。G中细胞的百分比1、S和G2/图中描述了M。这里显示了典型的FAC分析图（a）和表示三个独立实验结果平均值±SEM的图表（B）。（C和D）NHF转染前miR-302a或阴性对照前miR。这里显示了典型的FAC分析图（C）和表示四个独立实验结果平均值±SEM的图表（D）。如材料和方法中所述，用200 pmol的miR-302a、-b、-c和-d抑制剂（inh）或阴性对照物进行核感染，转染生长在Matrigel板上的（E和F）BG-01细胞，并用FACS进行细胞周期分析。G中细胞的百分比1、S和G2/图中描述了M。这里显示了典型的FAC分析图（E）和表示三个独立实验结果平均值±SEM的图表（F）。
图6。
图6。
潜在miR-302靶点cyclin D1的表达分析。（A） 如图2图例所示，对RA处理的H1细胞提取物中的细胞周期蛋白D1蛋白表达进行Western blot分析，并对细胞周期蛋白DmRNA进行qRT-PCR分析。αTub，α-微管蛋白。（B） NTERA2细胞cyclin D1表达的Western blot和qRT-PCR分析，用RA治疗；−，未接受RA治疗。（C） Western blot分析RA处理的H1细胞提取物中Cdk2、Cdk4、Cdk6和E2F1蛋白的表达。
图7。
图7。
miR-302a与细胞周期蛋白D1的3′UTR结合，抑制转录后蛋白表达。（A） 用200 pmol的miR-302a、-b、-c和-d抑制剂（inh）或阴性对照物（neg）对生长在Matrigel平板上的BG-01细胞进行核感染，如材料和方法中所述，并从全细胞提取物中分离蛋白质和RNA。对转染抗miR-302抑制剂后成熟miR-302a水平进行qRT-PCR分析。用特异性抗体进行Western blotting分析细胞周期蛋白D1和β-肌动蛋白表达水平。用对cyclin D1 mRNA特异的引物，用qRT-PCR分析从相同细胞裂解物中分离的RNA，并将结果绘制为相对单位。（B） 如图所示，将20纳米摩尔前miR-302a或阴性对照前miR（neg）转染到HeLa细胞中，一式两份。显示转染后成熟miR-302a水平的qRT-PCR分析结果。用qRT-PCR分析内源性miRNA miR-24。利用针对细胞周期蛋白D1或α-微管蛋白（αTub）的抗体，通过Western blotting分析从全细胞提取物中分离的蛋白质。用对cyclin D1 mRNA特异的引物，用qRT-PCR分析从相同细胞裂解物中分离的RNA，并将结果绘制为相对单位。（C） 插入pMIR-REPORT荧光素酶报告载体的细胞周期蛋白D1 3′UTR中miR-302a、-b、-C和-d结合位点示意图。将含有预测miR-302a、-b、-c和-d结合位点（以红色突出显示）的细胞周期蛋白D1 3′UTR片段插入pMIR-REPORT载体中荧光素酶的下游。WT cyclin D1 3′UTR中预测的配对区域用红色表示，而cyclin D2突变结构中改变的残基用粗体和斜体表示。（D） 用WT细胞周期蛋白D1或突变细胞周期蛋白D1载体转染HeLa细胞，如图所示，用前miR-302a或阴性对照前miR（neg）转染。此外，所有样本均转染pRL-CMV。然后采集细胞提取物并分析其相对荧光素酶活性。这里显示了三个独立实验结果的平均值±SEM。（E） 如面板D所述，用荧光素酶载体转染BG-01细胞。此外，如材料和方法所述，添加25 nM miR-302a、-b、-c和-D抑制剂（inh）或100 nM抗miR阴性对照物（neg）。然后分析相对荧光素酶活性。这里显示了三个独立实验结果的平均值±SEM。星号表示P（P）值<0.05。Luc/Ren，荧光素酶/雷尼利亚活动；D1，细胞周期蛋白D1；mut，突变体。
图8。
图8。
潜在miR-302靶点Cdk4的表达分析。（A） 如图7A所示，转染阴性对照（neg）或miR-302a、-b、-c和-d抑制剂（inh）的BG-01细胞中Cdk4蛋白表达的Western blot分析。（B） 如图7B所示，转染阴性对照（neg）或前miR-302a的HeLa细胞中Cdk4蛋白表达的Western blot分析。αTub，α-微管蛋白。
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