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生物化学杂志。2011年1月21日；286(3): 2132–2142.
2010年10月11日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M110.148395号
预防性维修识别码：PMC3023510型
PMID：20937839

细胞命运决定因子腊肠对乳腺癌干细胞功能进行重新编程*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

吴孔明博士,‡§,1 玄毛角,‡ 李兆明,‡§ 桑杰·卡蒂亚尔,‡ 马修·卡西米罗,‡ 杨万才, 张琼,‡ 尼科尔·威尔马思（Nicole E.Willmarth）,‡ 伊乌里·切佩列夫,‖ 马克·克罗萨里奥尔,‡ 张伟,‡ 胡俊波,§ 赵克吉,‖和理查德·佩塞尔‡,2
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

细胞命运决定因子腊肠犬被克隆为过度活跃表皮生长因子受体的主要抑制剂椭圆.的表达式腊肠犬在人类乳腺癌中丢失与预后不良相关。乳腺肿瘤起始细胞（TIC）可能有助于肿瘤进展和治疗抵抗。在此，内源性DACH1在TIC标记物高表达的乳腺癌细胞系和基础乳腺癌表型的患者样本中减少。DACH1的再表达减少了连续移植中新肿瘤的形成体内，减少了乳腺球的形成，并降低了CD44的比例高的/CD24型低的乳腺肿瘤细胞。相反，慢病毒shRNA对DACH1的作用增加了乳腺（B）TIC的数量。乳腺肿瘤的全基因组表达研究表明，DACH1抑制了与干细胞（SOX2、Nanog和KLF4）相关的分子特征，全基因组ChIP-seq分析确定DACH1与干细胞的启动子结合纳奥，KLF4、和第28行基因。KLF4/c-Myc和Oct4/Sox2拮抗BTIC的DACH1阻遏。力学研究表明DACH1直接抑制纳克和Sox2系统通过保守结构域启动子。内源性DACH1调节BTIC在体外和体内.

关键词：乳腺癌，基因调控，干细胞，转录调控，肿瘤抑制剂，DACH1

介绍

最近的研究表明肿瘤中存在自我更新的干细胞样细胞。这些肿瘤起始细胞（TIC）三在造血系统、乳腺、结肠、脑和前列腺肿瘤中均有描述(1,–5). 小鼠乳腺干细胞表达特定的细胞表面标记并显示自我更新特性(6). 只有少数原发性乳腺癌细胞形成继发性肿瘤。这些TIC形成类似于正常乳腺干细胞的乳房球(7). 当在特定条件下培养时，这些TIC或癌症干细胞可以通过荧光激活的CD44细胞分选来富集+/CD24型−/低单元格(2).

控制胚胎干细胞的分子电路也可能在某些肿瘤中起作用。胚胎干细胞特性的几个关键调节器（Oct4和Sox2、EKLF4、Lin28和Nanog）(8)在特定肿瘤的子集中表达(9,10). 已知调节乳腺干细胞特征的基因包括Twist的表达(11). 虽然原始造血干细胞的自我更新需要p21CIP1级(12)肿瘤抑制因子在调节TIC中的作用，尤其是在乳腺癌中的作用尚不清楚。

临床研究表明预后不良的乳腺癌与细胞命运决定因子DACH1表达降低相关(13)在前列腺癌和子宫内膜癌中观察到DACH1表达缺失(14,15). 一些证据表明腊肠可能具有抑癌作用。最初克隆为椭圆在里面果蝇属，哺乳动物DACH1号机组基因抑制培养细胞中乳腺癌细胞DNA合成和增殖(13). DACH1部分通过与DNA-结合转录因子（c-Jun、Smads、Six和ERα）相互作用，部分通过内源性DNA结合调节靶基因的基因表达(13,14,16). 最近的研究表明，DACH1通过类似Forkhead家族蛋白质结合位点的元素传递固有的DNA序列特异性结合特性(17).

这个果蝇dac基因是视网膜决定基因网络的关键成员，该网络规定了眼组织的身份。在果蝇属，有一个协调的基因系统，包括腊肠犬(数模转换器),眼睛缺失(埃亚),ey，双胞胎无眼(玩具),茶衫(坦桑尼亚先令)，以及眼鼻孔(所以).数模转换器在蘑菇体的前体细胞和神经元中表达，蘑菇体是大多数节肢动物的大脑结构，Dac的表达可以诱导异位眼形成果蝇属(18). 哺乳动物的同源物所以被称为Six，Six家族和DACH1的表达改变发生在多种人类肿瘤中(13,19,–23). 目前的实验旨在研究DACH1在调节乳腺肿瘤干细胞中的可能作用。

材料和方法

哺乳动物层的形成及干细胞表面标记的FACS分析

如前所述进行哺乳动物层形成分析(24). FACS分析乳腺癌干细胞的细胞表面标记物的氟化铝和免疫染色基于先前的出版物(25). 标记前，用1:100稀释的正常小鼠IgG封闭细胞30分钟，然后用藻红蛋白标记的小鼠抗人CD24（1:5）（克隆ML5，Pharmingen）和/或藻红蛋白/Cy5标记的大鼠抗人/小鼠CD44（1:200）（克隆IM7，BioLegend，San Diego）孵育1小时。所有实验均在4°C下进行。细胞分选在FACSCalibur细胞分选机（BD Biosciences）上进行。使用FlowJo软件（Tree Star，Inc.，Ashland，OR）对数据进行分析。

细胞培养、质粒构建、报告基因、表达载体、DNA转染和荧光素酶分析

细胞培养、DNA转染和荧光素酶分析使用Sox-2-Luc和纳克-Luc报告基因如前所述进行(26,–29). 编码KLF4/c-Myc和Oct4/Sox 2的表达载体来自Addgene。Met-1细胞在补充有10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM中培养。先前描述了MCF10A和MCF10A-Myc线(13). 编码与DACH1、DACH1 DS连接的N末端FLAG肽的表达质粒(D类ACH1型-S公司无/Ski）域单独（DS）或DACH1 DS域删除（ΔDS）之前已描述。慢病毒DACH1 shRNA来自开放生物系统。转染和感染符合标准方案。用流式细胞术筛选GFP阳性细胞。Met-1细胞以1×10的密度进行电镀5根据制造商的方案，在转染Superfect前一天，将细胞放置在24孔板中（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）。在每次实验中，用50和200 ng表达载体和启动子报告质粒（0.5μg）测定剂量反应。使用β-半乳糖苷酶报告物作为内部对照，将荧光素酶活性归一化为转染效率。通过与空表达载体盒的效果进行比较来确定表达载体的折叠效果，并使用Student’st吨测试。

RNA分离、RT-PCR和定量实时PCR

使用TRIzol从感染DACH1表达载体系统的Met-1细胞中分离总RNA(30). 根据制造商关于ABI Prism 7900HT系统的建议，使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen）和QuantiTect预先验证的小鼠引物分析以及18 S rRNA作为内部对照，进行基于SYBR Green-based的实时PCR。用于RT-PCR的寡核苷酸包括：Nanog、正向CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG和反向GCAATGGATGCTGGGATACTC；10月4日，正向CTGTAGGGAGGGCTTCGGGCACTT和反向CTGAGGGCCAGGCAGAGCACGAG；Sox2，正向GGCAGTAGCGATGCAGGC，反向CTGGTCATGGAGTACTGCAGG；KLF4，正向TGCCAGACAGAGCAGTCAGTCACCAC，反向GTAGTGCCTGGTCAGTTCAC；c-Myc，正向TGAGCCCTAGTGCTGCAT，反向AGCCCCGACTCCTCTT；18个S rRNA寡核苷酸用作对照(30). 用于染色质免疫沉淀（ChIP）的寡核苷酸直接作用于小鼠SOX2：远位，正向5′-gcagtgaggggacta-3和反向5′-ctccctcatcccaac-3；近端位点（sox2-binding位点），正向5′-cgcagaacaatggcacaccac-3′和反向5′-cggtttcagcacaggtcacg-3′；Nanog远位，正向5′-ggcaaactttgaactttgagatgtggaaata-3′和反向5′-ctcagcccttagaatggaagaat-3′；近端位点（oct4-sox2-binding位点）、正向5′-ggatgtcttatagatagagaggatgccc-3和反向5′-ccacagagagagacacaca-acc-3′启动子。

微阵列和聚类分析

从表达GFP或DACH1的Met-1细胞中分离出的无DNA-free总RNA用于探测Affymetrix基因1.0阵列（Affymetix，加州圣克拉拉）。用凝胶电泳法测定RNA质量。如前所述进行探针合成和杂交(31). 使用GeneSpring对阵列进行分析。使用稳健的多阵列分析对阵列进行归一化第页值0.05作为差异表达基因的统计标准。然后使用“完全”聚集的层次聚类对这些基因进行分组，并根据簇中包含的基因的已知功能对每个簇进行进一步分析。表达式配置文件使用Treeview显示(32). 使用在线可用的基因集ASSESS（样本集富集分数分析）进行通路级分析的分类和聚类(33). ASSESS提供了每个样本中每个基因集的富集度。基因集的富集取决于重复中至少两个样本的一致性，而这两个样本在表型之间是相反的。

免疫组织化学、染色质免疫沉淀和ChIP-seq分析

使用多克隆DACH1抗体对人类乳腺癌进行免疫组织化学分析(13). 人类乳腺癌组织阵列来自Biomax。如前所述进行染色质免疫沉淀分析(34,35)使用针对DACH1蛋白的FLAG表位的抗体。ChIP-seq的实施如前所述(17).

裸鼠研究

1 × 105将表达GFP对照物或DACH1的Met-1细胞皮下植入购自美国国立卫生研究院NCI的4-6周龄无胸腺雌性裸鼠体内。用数字卡尺每周测量两次肿瘤生长，持续7周。细胞植入后第35天处死小鼠，测量肿瘤重量。

结果

富含肿瘤干细胞的乳腺癌细胞系中DACH1表达降低

最近的研究表明，DACH1表达的缺失与人类乳腺癌的不良预后相关，并且DACH1在组织培养中抑制MCF7细胞增殖(13). 为了进一步表征DACH1在乳腺癌细胞类型中的表达，使用先前表征的多克隆抗体进行了Western blot分析(图1A类) (13). 多个实验的相对丰度定量显示MDA-MB231和HS578T细胞中DACH1丰度降低。乳腺癌干细胞标志物CD44的免疫表位染色+/CD24型−显示CD44的比例相对增加+/CD24型−MDA-MB231和HS578T细胞中的细胞(图1B类). 人类乳腺癌的不同亚型包括基底样、管腔（A和B）、Her2+和具有明显预后意义的正常乳腺样癌。基底样乳腺癌是一种高级别乳腺癌，具有独特的转移倾向和表达与维持干细胞表型相关的基因(36). 正常人乳腺上皮细胞与基底样细胞的比较与非碱性样mRNA表达显著降低(图1C类)DACH1丰度(图1D类)在基底样肿瘤中。

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DACH1在人乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中的表达。 A、 左侧面板Western blot检测乳腺癌细胞系DACH1丰度，β-actin作为负荷对照。右侧面板，乳腺癌细胞系中DACH1的mRNA表达正常化。B类乳腺癌细胞系CD24/CD44染色。C类，来自Oncomine数据库的规范化DACH1表达式。D类使用DACH1特异性抗体对正常乳腺上皮和三阴性侵袭性人类乳腺癌样本中DACH1表达的代表性图像和半量化。碱性钙基底型癌症。

DACH1表达抑制体内表达肿瘤干细胞标记物的乳腺癌细胞比例

鉴于DACH1低表达与肿瘤干细胞高表达之间的联系，我们研究了DACH1表达是否能优先抑制乳腺癌干细胞。用DACH1表达载体转导Met-1细胞，通过Western blot分析使DACH1的表达增加约2倍(图2A类). 免疫组织化学显示DACH1标记的FLAG表位存在于整个细胞群中。DACH1对乳腺肿瘤生长的影响体内通过裸鼠移植进行评估(图2B类). DACH1表达使肿瘤体积减少了约80%。肿瘤重量减轻了约90%(图2B类). 系列移植实验表明，表达DACH1的Met-1乳腺癌细胞的新肿瘤形成减少了约50%(图2C类).

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DACH1阻断Met-1肿瘤生长体内并抑制与干细胞膨胀相关的特性。(A类)用Flag标记的载体或DACH1表达载体转导Met-1细胞的Western blot和免疫组织化学。(B类)将等量的Met-1乳腺癌细胞与对照载体或DACH1表达质粒联合转导给裸鼠。Met-1细胞移植于裸鼠体内的肿瘤体积和肿瘤重量。对以下各项进行了分析n个= 5. 数据为平均值±SEM(C类)用载体或表达质粒转导Met-1细胞的系列植入研究。(D类)FACS显示从Met-1-GFP或Met-1-DACH1肿瘤分离的细胞的CD24/CD29双重染色（数据为平均值±SEM，n个= 5,第页< 0.001). (E类)用DACH1或DNA结合缺陷的DACH1突变体转导的Met-1细胞的Aldfluor染色（DACHΔDS）。

DACH1抑制哺乳动物层形成和CD44+/CD24型−表型

通过筛选CD24可以富集肿瘤干细胞−/低单元格(2). 确定DACH1表达是否调节CD24的相对比例−/低乳腺肿瘤细胞体内将用DACH1表达载体或对照载体转导的Met-1细胞植入裸鼠体内。在小鼠体内种植肿瘤3周，然后分析CD24−/低细胞。DACH1表达的诱导降低了CD24的比例−/低细胞增加～50%(图2D类).

作为BTIC表型的补充分析，如前所述进行Aldefluor染色(37). 干细胞标记物醛脱氢酶被认为通过视网膜代谢为维甲酸来调节干细胞分化。荧光醛氟测定法测量醛脱氢酶活性，并已用于从脑瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和乳腺癌中分离肿瘤干细胞。DACH1的表达使醛氟阳性细胞的比例降低了约60%(图2E类). DACH1的一个DNA结合缺陷突变体（ΔDS）的表达在减少Aldefluor染色中有缺陷(图2E类).

癌症干细胞假说表明，许多癌症维持在癌症“干细胞”或肿瘤起始细胞的层级组织中，快速分裂扩增细胞（早期前体细胞）和分化肿瘤细胞(38). 肿瘤干细胞被认为有助于肿瘤的进展、治疗抵抗和复发(1)并且可以通过CD44的细胞分选来富集高的/CD24型−/低单元格(2). 少量原发性乳腺癌细胞、TIC或癌干细胞形成继发性肿瘤(8). TICs在无血清的特定条件下培养时会形成非粘附性哺乳动物球。为了进一步研究DACH1在TIC中的作用，对Met-1乳腺肿瘤细胞系进行了乳腺检测。DACH1的诱导使细胞系中的乳腺数目减少了60%以上(图3A类).

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DACH1降低CD24的比例低的/CD44细胞高的细胞。(A类)用载体控制或DACH1转导的Met-1细胞的哺乳动物试验。(B类)基于FACS的Met-1细胞CD24/CD44双重染色在体外表达DACH1或控制载体。(C类)CD24的细胞潜能低的/CD44细胞高的 与CD24型高的/CD44细胞高的细胞测定。Met-1人群分析方法示意图。(D类)FACS分析。(E类)哺乳动物层形成和(F类)比较CD24的裸鼠肿瘤生长研究低的/CD44型高的和CD24高的/CD44型高的细胞。

Met-1细胞中DACH1的表达降低了CD44的相对比例高的/CD24型低的细胞增加～80%(图3B类, 15%与3%,n个= 6,第页< 0.003). 为了检测DACH1介导的CD24抑制的生物学意义，用DACH1转导的Met-1细胞在组织培养中生长，并对CD24进行FACS分析高的 与CD24型低的人口。CD24的多电位高的和CD24低的种群是由它们形成CD24的能力决定的高的和CD24低的群体和形成乳房球作为干细胞扩张的替代措施(图3C类). CD24型低的/CD44细胞+细胞和CD24高的/CD44细胞+细胞经FACS分析分离，培养3周。FACS重新启动CD24低的/CD44细胞高的产生了两个CD24高的/CD44细胞高的和CD24低的/CD44细胞高的，而CD24高的/CD44细胞高的只产生父母CD24高的/CD44细胞高的人口(图3D类). CD24低的和CD24高的接下来对Met-1细胞进行乳房球形成检查。CD24低的这些细胞使乳房的产量增加了4倍(图3E类). 这些研究表明CD24低的和CD44高的细胞保持多潜能。为了确定这两个不同Met-1细胞群的肿瘤生长特征，进行了肿瘤植入分析。CD24低的/CD44型高的肿瘤比CD24大约4倍高的/CD44型高的Met-1细胞(图3F类).

内源性DACH1抑制干细胞表型

这些研究表明，适度诱导DACH1表达足以抑制乳腺增生形成和具有乳腺癌干细胞特征的细胞的相对比例。为了确定内源性DACH1是否具有抑制肿瘤干细胞的功能，使用一种编码DACH1 shRNA的慢病毒，该慢病毒通过一个内部核糖体进入位点连接到GFP，以转导Met-1细胞(图4A类). 与控制矢量进行了比较。在多次实验中用DACH1 shRNA减少DACH1丰度增加了CD44的比例+/CD24型−细胞～2.2倍(图4B类). 乳房球的数量反映了祖细胞的相对比例，而乳房球的大小也可能部分受到细胞增殖能力的影响。DACH1 shRNA表达使哺乳动物体积增加3.5倍(图4C类). DACH1 shRNA使乳房的相对数量增加了350%(图4C类). 具有接触诱导生长特性的永生人MCF10A细胞的c-Myc转导(13)增加CD44的比例+/CD24型−单元格(图4D类)从～24到95%。用DACH1转染MCF10-c-Myc细胞可将乳腺癌干细胞的比例从95%抑制到～40%(图4D类). DACH1 shRNA使乳房的相对数量增加了350%(图4C类). 这些发现表明内源性DACH1是乳腺数目的关键决定因素，因此也是BTIC的关键决定因子。

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内源性DACH1抑制干细胞表型。 A类，通过慢病毒shRNA载体将内源性Dach1表达敲除至Dach1。B类表达shCTL或shDACH1的Met-1细胞的基于FACS的CD24/CD44双重染色和乳腺检测。C类表达shDACH1的Met-1细胞的乳腺数量和大小。数据为>5个实验的平均值±S.E。D类，FACS显示MCF10A和Myc转化MCF10A的CD24/CD44双重染色，用载体控制或DACH1。MCF10A转导细胞的Western blot。每种细胞类型也表达载体中的GFP作为标记。

为了进一步研究DACH1抑制细胞生长和血管生成的机制，对DACH1转基因细胞进行了全基因组表达研究。使用基因本体和KEGG路径集对DAVID进行分子路径分析。DACH1抑制调控造血细胞谱系、细胞通讯、血管发育和多细胞生物发育的信号通路的基因表达。DACH1诱导急性炎症反应和细胞因子受体相互作用(图5A类). 最近的几项研究表明，控制干细胞的分子电路可能在某些肿瘤中起作用。胚胎干细胞特性的一些关键调节因子，10月4日,Sox2系统、和纳克，在特定肿瘤中表达(9,10). 在低分化侵袭性人类肿瘤中发现了一种胚胎干细胞样基因表达特征(36).10月4日,Sox2系统、和纳克是ES细胞在培养中繁殖所必需的。通过基因集富集分析将Met-1细胞中Dach1调节的基因与ES细胞特性相关的基因集进行比较，结果表明Dach1下调Sox2和Oct4基因靶点、NOS靶点（Nanog、Oct4和Sox2共有的基因）的表达，以及人类ES细胞系中过度表达的基因集(图5B类).

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路径分析。 A类，使用基因本体论和KEGG通路集通过DAVID对来自表达DACH1的Met-1细胞或对照载体的微阵列数据进行通路分析。路径通过富集度得分以图形方式表示。红色表示上调和蓝色表示下调。B类，使用Sox2、Oct4或NOS（Nanog、Oct5和Sox2）的基因靶点对Met-1细胞的微阵列进行基因集富集分析，这些靶点在ES细胞中富集(A类).C类，实时RT-PCR检测ES细胞相关基因表达（数据为平均值±S.E。，n个= 3).D类，CD24定量−/CD44细胞+多重转导的染色。E类、用编码KLF/c-Myc或Oct4/Sox2的病毒载体转导的Met-1细胞的FACS分析。

Sox2、Oct4、Nanog和EKLF4基因的表达增加与干细胞表型相关。我们检测了DACH1的表达是否可以抑制与癌症干细胞表型相关的基因的表达。使用表达DACH1或对照的Met-1肿瘤的mRNA定量ES细胞标记物（Sox2、Oct4、Nanog、KLF4和c-Myc）的相对表达(图5C类). RT-PCR分析表明Sox2系统,纳克、和KLF4型每个基因都促进干细胞扩增。

为了确定KLF4和Sox2阻遏的功能意义，用编码KLF4或Sox2的表达载体转染DACH1转导的Met-1细胞。进行FACS分析以检查CD24的相对比例−/CD44细胞+细胞。DACH1降低了CD24的比例−/CD44细胞+约80%。KLF4/Myc或Sox2/Oct4的重新表达部分逆转了表型(图5,D类和E类).

DACH1结合ChIP和ChIP-Seq中调控前体细胞扩增基因的启动子

对表达DACH1的MDA-MB-231细胞进行ChIP-Seq分析，以确定DACH1是否与干细胞调节基因的启动子结合。在Sox2、Nanog、KLF4和Lin28启动子中确定了DACH1的占有率(图6A类). 已知Sox2、KLF4和Lin28在维持干细胞多能性中发挥重要作用(39,40). 进一步检查DACH1与Sox2系统和纳克在局部染色质免疫沉淀的背景下进行基因检测。使用表达FLAG-tagged DACH1或对照载体的Met-1细胞进行比较。使用指向远端或近端启动子的寡核苷酸进行Sox2启动子的ChIP。远端启动子处DACH1的ChIP未能识别染色质相关的DACH1；然而，指向近端启动子的寡核苷酸，包括Sox2结合位点，显示DACH1的募集(图6B类). 类似地，Nanog启动子的ChIP分析确定DACH1向近端启动子区域而非远端启动子区域募集(图6C类).

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DACH1抑制Sox2和Nanog转录。(A类)选定基因启动子的DACH1依赖性标记密度。箭头指示转录的起始位点和方向。(B类)Sox2和(C类)使用Met-1细胞的Nanog启动子表达Flag标记的DACH1或对照GFP载体。指向启动子的寡核苷酸探针的示意图。(D类)荧光素酶报告基因检测Sox-2和(E类)纳克DACH1野生型或保守DS结构域的突变体被联合转染。数据为平均值±SEMn个=6次单独转染(第页< 0.001).

由于DACH1降低了Sox2和Nanog的表达，因此进行了研究以确定Sox2系统和纳克这些基因被DACH1直接抑制。发起人Sox2系统，的纳克基因，以及第28行被DACH1表达直接抑制(图6D类). DACH1 DS结构域的缺失消除了DACH1的转录抑制(图6,D类和E类).

讨论

这项研究提供了一些证据表明DACH1抑制乳腺肿瘤干细胞扩张。首先，DACH1降低了乳腺癌干细胞标记物（CD44）的表达高的/CD24型低的)肿瘤内部。DACH1还降低了CD44的相对比例高的/CD24型低的组织培养中的Met-1细胞。其次，DACH1减少了乳房的数量和大小。只有少数被称为乳腺肿瘤起始细胞的原发性乳腺癌细胞会引发继发性肿瘤，而BTIC作为非粘附性乳房球的生长是BTIC的有用替代物。第三，shRNA-DACH1减少内源性DACH1，增加乳房的数量和CD44的比例+/CD24型−细胞。第四，具有乳腺癌干细胞特征的细胞系和人类乳腺癌的基本表型中DACH1丰度降低。第五，DACH1调控的基因表达谱和已知的调控ES细胞特征的基因显示出明显的重叠(36). ES细胞功能关键调控因子的表达索克斯和纳克在Met-1细胞中被DACH1抑制，而DACH1则抑制索克斯和纳克基因启动子。在ChIP分析或ChIP-seq分析中，DACH1与Nanog、Sox2和KLF4启动子相关。总之，这项研究与DACH1降低乳腺癌干细胞比例的模型一致。

已知DACH1通过结合DNA结合转录因子（c-jun、Smad和SIX）间接调节基因转录(13,35,41,42). 这里，转录抑制索克斯和纳克DACH1基因需要一个高度保守的结构域果蝇属对人类而言。腊肠box N（DS结构域）与Ski/Sno家族共享重要的氨基酸。DS域是目标基因子集转录抑制所必需的，也是DACH1在使用ChIP分析的局部染色质背景下招募HDAC1所必需的(14,35)以及与DNA结合(17). DACH1的DNA结合结构域是抑制使用Aldfluor染色评估的BTIC表型所必需的。DACH1在Sox2和Nanog启动子的近端启动子的局部染色质的背景下被招募。总之，这些研究表明DACH1抑制Sox2、Nanog和KLF4的表达。这些发现与以下发现一致：DACH1在基底部乳腺癌表型中的表达降低，已知基底部表型过度表达Sox2，并且基底部表型显示乳腺癌干细胞的特征(9). Sox2维持干细胞特性，Sox2下调与多能性丧失和分化诱导相关(9). KLF4/c-Myc或Sox2/Oct4的重新表达部分逆转了BTIC表型的抑制。需要进一步研究来区分DACH1和控制乳腺癌干细胞表型的基因产物之间的功能相互作用。

这项研究表明，DACH1降低了CD44的比例高的/CD24型低的细胞。通过对CD44进行分类，可以富集肿瘤干细胞高的/CD24型低的细胞和以其多潜能和自我更新能力为特征(1). 我们证明了CD44的数量高的/CD24型低的丰富了生产猛犸象的能力。CD44人群高的/CD24型低的这些细胞具有多潜能，可同时产生CD44和CD44高的/CD24型低的和CD44高的/CD24型高的组织培养连续传代后的群体。这些研究表明，DACH1抑制具有肿瘤干细胞多潜能特征的乳腺癌细胞比例。

这些发现与之前的研究一致，这些研究表明Dac在祖细胞功能中发挥作用。在果蝇属,数模转换器在前体细胞或干细胞中表达，这些细胞可产生多种不同的器官细胞群，包括肌肉、神经元和性腺生殖细胞。数模转换器在蘑菇体的神经祖细胞（成神经细胞）中表达，蘑菇体是大多数节肢动物的大脑结构。这些成神经细胞以干细胞模式分裂，产生10-20个神经元谱系。Dac被认为在确定Kenyon细胞轴突的结构命运中起到作用，蘑菇体神经丝在数模转换器空突变体(43). 在哺乳动物细胞中，DACH1在发育中的眼、耳、肢和乳腺上皮中表达。尽管第1天小鼠中的基因缺失是围产期致死的，小鼠胚胎中的表达研究表明，基因缺失在第1天细胞内命运测定。因此数模转换器在胚胎祖细胞中表达，在终末分化时失去表达。DACH1在肿瘤（乳腺、前列腺和子宫）中的表达降低(13,14)与预后不良相关。乳腺癌细胞中DACH1的再表达降低了具有肿瘤干细胞特征的细胞的比例。

在这项研究中，DACH1降低了细胞侵袭性，并降低了CD44的比例高的/CD24型低的细胞。对DACH1调节BTIC比例的机制的分析证明了分泌因子的作用。来自DACH1转导的Met-1细胞的条件培养基再现了DACH1转导Met-1细胞以降低CD44比例的作用+/CD24型−/低细胞。在之前的研究中，我们证明了DACH1转导的乳腺癌细胞的条件培养基足以减少Met-1细胞的迁移(44). 未来的研究将有兴趣确定类似的分泌因子是否调节BTIC抑制特征和抑制细胞迁移的不同特性。

补充材料

补充数据：

确认

我们感谢Atenssa L.Cheek准备这份手稿。

*这项工作得到了美国国立卫生研究院R01CA70896、R01CA75503和R01CA86072（发给R.G.P.）以及P30CA56036（Kimmel癌症中心核心拨款给R.G..P.）的全部或部分支持。这项工作还得到了Ralph博士和Marian C.Falk医学研究信托基金（给R.G.P.）、Margaret Q.Landenberger研究基金会（给K.W.）的资助，部分来自宾夕法尼亚州卫生部（给R.G.P.）的资助以及中国国家自然科学基金会81072169的资助。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图1和表1.

三使用的缩写如下：

抽搐
肿瘤起始细胞
BTIC公司
乳腺肿瘤起始细胞
锿
胚胎干。

参考文献

1Al-Hajj M.（2007）货币。操作。昂科尔。 19, 61–64[公共医学][谷歌学者]
2Al-Hajj M.、Wicha M.S.、Benito-Hernandez A.、Morrison S.J.、Clarke M.F.（2003）程序。国家。阿卡德。科学。美国。 100, 3983–3988[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。O'Brien C.A.、Pollett A.、Gallinger S.、Dick J.E.（2007）自然 445, 106–110[公共医学][谷歌学者]
4Ricci-Vitiani L.、Lombardi D.G.、Pilozzi E.、Biffoni M.、Todaro M.、Peschle C.、De Maria R.（2007）自然 445, 111–115[公共医学][谷歌学者]
5Singh S.K.、Hawkins C.、Clarke I.D.、Squire J.A.、Bayani J.、Hide T.、Henkelman R.M.、Cusimano M.D.、Dirks P.B.（2004）自然 432, 396–401[公共医学][谷歌学者]
6Visvader J.E.、Lindeman G.J.（2006）癌症研究。 66, 9798–9801[公共医学][谷歌学者]
7Dontu G.、Abdallah W.M.、Foley J.M.、Jackson K.W.、Clarke M.F.、Kawamura M.J.、Wicha M.S.（2003）基因发育。 17, 1253–1270[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Boyer L.A.、Lee T.I.、Cole M.F.、Johnstone S.E.、Levine S.S.、Zucker J.P.、Guenther M.G、Kumar R.M.、Murray H.L.、Jenner R.G.、Gifford D.K.、Melton D.A.、Jaenisch R.、Young R.A.（2005）单元格 122, 947–956[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9罗德里格斯·皮尼拉（Rodriguez-Pinilla S.M.）、萨里奥（Sarrio D.）、莫雷诺（Moreno-Bueno G.）、罗德里格兹·吉尔（Rodriggez-Gil Y.）、马丁内斯（Martinez M.A.）、埃尔南德斯（Hernandez L.）、哈迪松（Hardison D国防部。病态 20, 474–481[公共医学][谷歌学者]
10Gidekel S.、Pizov G.、Bergman Y.、Pikarsky E.（2003）癌细胞 4, 361–370[公共医学][谷歌学者]
11Mani S.A.、Guo W.、Liao M.J.、Eaton E.N.、Ayyanan A.、Zhou A.Y.、Brooks M.、Reinhard F.、Zhang C.C.、Shipitsin M.、Campbell L.L.、Polyak K.、Brisken C.、Yang J.、Weinberg R.A.（2008）单元格 133, 704–715[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Cheng T.、Rodrigues N.、Shen H.、Yang Y.、Dombkowski D.、Sykes M.、Scadden D.T.（2000年）科学类 287, 1804–1808[公共医学][谷歌学者]
13Wu K.，Li A.，Rao M.，Liu M.，Dailey V.，Yang Y.，Di Vizio D.，Wang C.，Lisanti M.P.，Sauter G.，Russell R.G分子细胞。生物。 26, 7116–7129[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Wu K.、Katiyar S.、Witkiewicz A.、Li A.、McCue P.、Song L.N.、Tian L.、Jin M.、Pestell R.G.（2009）癌症研究。 69, 3347–3355[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Nan F.，LüQ.，Zhou J.，Cheng L.，Popov V.M.，Wei S.，Kong B.，Pestell R.G.，Lisanti M.P.，Jiang J.，Wang C.（2009）癌症生物学。疗法。 8, 1534–1539[公共医学][谷歌学者]
16Popov V.M.、Zhou J.、Shirley L.A.、Quong J.、Yeow W.S.、Wright J.A.、Wu K.、Rui H.、Vadlamudi R.K.、Jiang J.，Kumar R.、Wang C.、Pestell R.G.（2009）癌症研究。 69, 5752–5760[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Zhou J.、Wang C.、Wang Z.、Dampier W.、Wu K.、Casimiro M.C.、Chepelev I.、Popov V.M.、Quong A.、Tozeren A.、Zhao K.、Lisanti M.P.、Pestell R.G.（2010）程序。国家。阿卡德。科学。美国。 107, 6864–6869[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Silver S.J.，Rebay I.（2005）开发 132, 3–13[公共医学][谷歌学者]
19温彻斯特·C、罗伯逊·S、麦克劳德·T、约翰逊·K、托马斯·M（2000）临床杂志。病态。 53, 212–217[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Coletta R.D.、Christensen K.、Reichenberger K.J.、Lamb J.、Micomonaco D.、Huang L.、Wolf D.M.、Müller-Tidow C.、Golub T.R.、Kawakami K.和Ford H.L.（2004）程序。国家。阿卡德。科学。美国。 101, 6478–6483[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Micalizi D.S.、Christensen K.L.、Jedlicka P.、Coletta R.D.、Barón A.E.、Harrell J.C.、Horwitz K.B.、Billheimer D.、Heichman K.A.、Welm A.、Schiemann W.P.、Ford H.L.（2009）临床杂志。投资。 119, 2678–2690[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Laflamem C.、Filion C.、Bridge J.A.、Ladanii M.、Goldring M.B.、Labelle Y.（2003）癌症研究。 63, 449–454[公共医学][谷歌学者]
23Yu Y.、Khan J.、Khanna C.、Helman L.、Meltzer P.S.、Merlino G.（2004）自然医学。 10, 175–181[公共医学][谷歌学者]
24Jiao X.、Katiyar S.、Willmarth N.E.、Liu M.、Ma X.，Flomenberg N.、Lisanti M.P.、Pestell R.G.（2010）生物学杂志。化学。 285, 8218–8226[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Lindsay J.、Jiao X.、Sakamaki T.、Casimiro M.C.、Shirley L.A.、Tran T.、Ju X.，Liu M.、Li Z.、Wang C.、Katiyar S.、Rao M.、Allen K.G.、Glazer R.I.、Ge C.、Stanley P.、Lisanti M.、Rui H.、Pestell R.G.（2008）临床。翻译。科学。 1, 107–115[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26.Shackleton M.、Vaillant F.、Simpson K.J.、Stingl J.、Smyth G.K.、Asselin-Labat M.L.、Wu L.、Lindeman G.J.、Visvader J.E.（2006）自然 439, 84–88[公共医学][谷歌学者]
27Fu M.、Rao M.、Wang C.、Sakamaki T.、WangJ.、Di Vizio D.、Zhang X.、Albanese C.、Balk S.、Chang C.、Fan S.、Rosen E.、Palvimo J.J.、Jänne O.A.、Muratoglu S.、Avantaggiati M.L.、Pestell R.G.（2003）分子细胞。生物。 23, 8563–8575[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Fu M.，Wang C.，Wang J.，Zhang X.，Sakamaki T.，Yeung Y.G.，Chang C.，Hopp T.，Fuqua S.A.，Jaffray E.，Hay R.T.，Palvimo J.J.，Jänne O.A.，Pestell R.G.（2002）分子细胞。生物。 22, 3373–3388[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29.Fu M.、Wang C.、Reutens A.T.、WangJ.、Angeletti R.H.、Siconolfi-Baez L.、Ogryzko V.、Avantaggiati M.L.、Pestell R.G.（2000）生物学杂志。化学。 275, 20853–20860[公共医学][谷歌学者]
30Sakamaki T.、Casimiro M.C.、Ju X.、Quong A.A.、Katiyar S.、Liu M.、Jiao X.，Li A.、Zhang X.、Lu Y.、Wang C.、Byers S.、Nicholson R.、Link T.、Shemluck M.、Yang J.、Fricke S.T.、Novikoff P.M.、Papanikolaou A.、Arnold A.、Albanese C.、Pestell R.（2006）分子细胞。生物。 26, 5449–5469[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Li Z.、Wang C.、Jiao X.、Katiyar S.、Casimiro M.C.、Prendergast G.C.、Powell M.J.、Pestell R.G.（2008）生物学杂志。化学。 283, 7007–7015[公共医学][谷歌学者]
32Eisen M.B.、Spellman P.T.、Brown P.O.、Botstein D.（1998）程序。国家。阿卡德。科学。美国。 95, 14863–14868[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Edelman E.、Porrello A.、Guinney J.、Balakumaran B.、Bild A.、Febbo P.G.、Mukherjee S.（2006）生物信息学 22，e108–e116[公共医学][谷歌学者]
34Hulit J.、Wang C.、Li Z.、Albanese C.、Rao M.、Di Vizio D.、Shah S.、Byers S.W.、Mahmood R.、Augenlicht L.H.、Russell R.、Pestell R.G.（2004）分子细胞。生物。 24, 7598–7611[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Wu K.，Liu M.，Li A.，Donninger H.，Rao M.，Jiao X.，Lisanti M.P.，Cvekl A.，Birrer M.，Pestell R.G.（2007）分子生物学。单元格 18, 755–767[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36Ben-Porath I.、Thomson M.W.、Carey V.J.、Ge R.、Bell G.W.和Regev A.、Weinberg R.A.（2008）自然遗传学。 40, 499–507[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37Charafe-Jauffret E.、Ginestier C.、Iovino F.、Wicinski J.、Cervera N.、Finetti P.、Hur M.H.、Diebel M.E.、Monville F.、Dutcher J.、Brown M.、Viens P.、Xerri L.、Bertucci F.、Stassi G.、Dontu G.、Birnbaum D.、Wicha M.S.（2009）癌症研究。 69, 1302–1313[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Dalerba P.、Cho R.W.、Clarke M.F.（2007）每年。医学版。 58, 267–284[公共医学][谷歌学者]
39Yamanaka S.（2008）菲洛斯。事务处理。英国皇家学会。生物科学B。 363, 2079–2087[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Viswanathan S.R.，Daley G.Q.（2010年）单元格 140, 445–449[公共医学][谷歌学者]
41.Li X.、Perissi V.、Liu F.、Rose D.W.、Rosenfeld M.G.（2002）科学类 297, 1180–1183[公共医学][谷歌学者]
42Wu K.，Yang Y.，Wang C.，Davoli M.A.，D'Amico M.，Li A.，Cveklova K.，Kozmik Z.，Lisanti M.P.，Russell R.G.，Cveckl A.，Pestell R.G（2003）生物学杂志。化学。 278, 51673–51684[公共医学][谷歌学者]
43Noveen A.、Daniel A.、Hartenstein V.（2000）开发 127, 3475–3488[公共医学][谷歌学者]
44Wu K.、Katiyar S.、Li A.、Liu M.、Ju X.、Popov V.M.、Jiao X.，Lisanti M.P.、Casola A.、Pestell R.G.（2008）程序。国家。阿卡德。科学。美国。 105, 6924–6929[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会