基于microRNA的治疗：肝癌的新途径

摘要

引言

肝炎、肝纤维化和肝癌是威胁人类健康的主要肝脏疾病。特别是，肝癌是世界上最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一[1]发生于慢性肝病，主要与乙型和丙型病毒性肝炎有关[2-4]和肝硬化[5]. 与其他恶性疾病一样，多基因参与加上遗传和表观遗传变化的积累[6-8]尽管人们一直致力于研究HCC的分子发病机制，但导致高死亡率却没有显著变化。

许多因素包括接触肝炎病毒[9-11]，被曲霉毒素B1（AFB）污染的食品₁) [12]，大量饮酒[13]，非酒精性脂肪性肝病[14]，口服避孕药[15]和血色病[16]可能导致肝癌。然而，肝癌的确切病理生理学尚不清楚。潜在的肝功能障碍是肝癌的诱因，这是我们唯一可以证实的[5]. 事实上，肝癌的易感条件极大地改变了细胞信号通路，在肝癌的发生过程中观察到了许多遗传和表观遗传变异以及相应的分子通路改变。相关通路描述如下：（a）通过β-catenin突变以及上游元件（如Frizzled受体）的上调激活Wnt/Frizzled/β-catening通路[17-21]，（b）通过HBV或HCV感染改变MAPK信号通路[22,23]，（c）通过JAK结合蛋白的失活激活JAK/STAT途径[24-26]（d）通过基因突变、与病毒蛋白的转录后相互作用以及氧化应激使抑癌基因p53失活[27-29]，（e）通过突变或启动子甲基化改变肿瘤抑制性视网膜母细胞瘤（pRb途径）和p16INK4基因[19-21]和（f）转化生长因子-β途径的改变[19-20].

到目前为止，许多与肝癌相关的癌基因，包括法新社,RAS系统,c-FOS公司,c-6月,RHO公司,转化生长因子-a,HGF公司,CerbB2类,HER-2型,HER-2/neu型,新的,NGL公司,MDM2型,基质金属蛋白酶、和IGF公司-已找到⫽。这些基因的异常表达与持续的细胞增殖有关，最终导致致癌[30].

抗击肝癌还有很长的路要走。在肝癌的所有治疗方法中，手术切除和肝移植是目前治疗肝癌的最佳选择。根治性切除后肿瘤复发和转移的高频率是肝癌治疗过程中的主要障碍。统计数据表明，手术后5年的患者生存率为30%至40%[10]. 化疗和放疗这两种常用的癌症治疗方法，由于肝癌的耐药性，也得到了不利的评分。此外，肝癌的发生往往伴随着肝功能障碍，这导致常规化疗的使用受到限制，因为其或多或少具有非选择性毒性和显著的全身副作用[31]. 病毒载体，例如重组腺相关病毒（rAAV），通过静水压注射以肝脏为靶点，介导基因治疗，被认为是治疗肝病的诱人方法，因为它非常有效，具有较高的感染率和长时间的表达。然而，病毒载体诱导的免疫反应，再加上外源基因在不需要的组织或细胞中的表达，可以阻断功能基因的表达[30]. 其他实验治疗方法，包括激素治疗、生物和生化治疗[32-36]和分子靶向治疗[37-40]在临床应用中仍需进一步验证。对于复发性和晚期肝癌，迫切需要开发新的治疗方法。

开发新治疗方法的主要努力应该包括使用分子谱来表征肿瘤，并在HCC过程中提供准确的预测和潜在的治疗靶点。miRNAs是一类丰富的内源性小分子非编码RNA，由19～25个核苷酸组成，通过与靶mRNAs的3′-非翻译区（3′-UTR）的不完全碱基配对，在转录后水平上调节蛋白编码基因的表达。在蛔虫中发现第一个miRNA后秀丽隐杆线虫通过安博斯[41]，这些短调控RNA已被证实是植物、灵长类、啮齿动物、鸟类、鱼类、蠕虫和苍蝇中丰富的一类RNA(http://microrna。桑格。ac.uk（英国）/). 还发现大型DNA病毒携带miRNA基因：5个在Epstein–Barr病毒中，12个在Kaposi肉瘤相关疱疹病毒中，9个在小鼠g-herpes-virus 68中，以及9个在人类巨细胞病毒中[42]. miRNAs是参与发育时间、信号通路、凋亡、代谢、致癌和大脑发育的基因的转录后调节器[43]. 越来越多的证据表明，miRNAs也参与癌基因和肿瘤抑制途径[44-47]. 在多种肿瘤类型中发现miRNA基因的异常表达和结构改变[48-56].

肝脏中的miRNAs是基因的调节器，从非疾病肝脏到肝癌患者（包括肝硬化和肝炎感染患者）的miRNAs表达谱不同[57-59]. miRNAs在正常肝脏和病变肝脏中的不同表达可能会导致一个新的方向，这不仅有助于诊断，也有助于肝癌治疗中新的治疗靶点。

肝癌生物学中的miRNA

正如广泛回顾的那样，microRNA生物发生的调控（图。​11)有助于细胞表型的微调，包括增殖、细胞信号和凋亡；毫无疑问，miRNAs与肝癌生物学有关。

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图（1）。miRNA的生物发生和调控。

从细胞核中的miRNA基因转录后，pri-miRNA被Drosha和DGCR8切割，产生前体分子（miRNA前体）。在Exportin-5和Ran-GTP的帮助下，前miRNA被转运到细胞质。在细胞质中，前miRNA是被核糖核酸酶Dicer裂解生成短RNA双链。成熟的单链miRNA被整合到RNA诱导的消音复合体（RISC）执行调节功能。miRNA的调控机制依赖于靶mRNA的3′-UTR区与miRNA 5′末端的所谓“种子区”之间的互补程度，如果有完美的互补性，然后mRNA被RISC切割。如果互补性不完善，则通过压制进行监管P体中的翻译。

miRNA与病毒性肝炎

病毒性肝炎是HCC的主要可预防原因，不仅在中国，而且在全世界都是一个重大的医疗和公共卫生问题。它会导致严重的发病率和死亡率[81]. 病毒性肝炎是由至少五种不同病毒感染引起的，其中在美国最常见的三种是甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）[82]. 病毒性肝炎可能非常严重。到目前为止，全球有近20亿人感染了乙型肝炎病毒[83]3.5亿慢性HBV感染者，每年有32万人死亡[84]. 至于丙型病毒性肝炎，估计世界上有3%的人口（超过1.7亿人）感染了丙型肝炎病毒，导致美国每年1万至2万人死亡[85]. 目前，包括α干扰素（IFN-α）、聚乙二醇干扰素-α和利巴韦林在内的病毒性肝炎治疗药物仍不能完全控制该病。此外，干扰素或利巴韦林都很昂贵，往往会引起严重的副作用，限制其更广泛的应用，并强调一种新的治疗方法以改善治疗结果。

新疗法的开发应基于对肝炎病毒，尤其是HBV和HCV转录活性和复制活性确切机制的明确理解。正如所希望的那样，这些研究最近引起了人们的广泛关注。越来越多的证据表明，表观遗传变化可能与隐性HBV感染有关[60,86]. 进一步研究表明，乙型肝炎病毒cccDNA岛2的甲基化可能与乙型肝炎病毒cccDNA复制活性受损有关，这进一步证明乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的甲基化可以调节乙型肝炎病毒的复制[87].

此外，有明确证据证实miRNAs也参与HBV的调节活动。基于计算方法的数据显示，发现病毒miRNA靶向一个病毒mRNA，表明HBV可能使用病毒miRNA来调节其自身的基因表达[88].乌普里查德进一步证明，病毒特异性siRNA治疗可以强烈抑制HBV复制和基因表达[89]，阐明了RNAi在HBV基因治疗中的应用。然而，siRNAs的高序列特异性，加上长期治疗，促进了siRNA-resistant病毒变体的出现。一项基于小鼠miR-155序列的人工miRNA表达载体的改进研究表明，amiRNA能够有效抑制HBV的表达和复制在体外没有出现抗siRNA病毒变体[90]. 另一个例子是，通过使用转录抗HBV初级miRNA（pri-miR-122）的Pol II启动子盒和pri-miR31穿梭器，HBV复制可以有效抑制在体外和体内[91].

HCV是一种肝炎病毒属的包膜阳性RNA病毒，基因组约9.6 Kb，编码约3000个氨基酸的多聚蛋白[92]. HCV具有相当大的遗传多样性，但HCV 5′非编码区（NCR）在病毒复制中起着重要作用，翻译活性高度保守。最近一项旨在整合HCV 5′NCR的RNA结构和功能分析的研究表明，5′NCR-结构域I在RNA翻译效率中起着重要作用[93].刘的研究表明，亲环素A（CyPA）是一种具有肽基脯氨酸反义酶活性的细胞伴侣，通过招募机制形成特殊的膜结构，促进HCV RNA的复制[94].

此外，对siRNA和miRNA相关的HCV研究进展表明，RNA干扰（RNAi）可能是一种有希望的病毒感染治疗实体。由于丙型肝炎病毒基因组是一种单链RNA，既是转录的模板，又是负链复制中间产物的模板，因此它是RNAi的主要候选者。特别是，位于病毒基因组5′非编码区的内部核糖体进入位点（IRES）、高度保守的序列以及在翻译中的重要作用，使其成为RNAi的理想靶点，许多研究已经证明了这一点[95-98].

作为一种潜在的病毒感染治疗实体，miRNA永远不会比siRNA差，如果不是更好的话。到目前为止，还没有证据证实丙型肝炎病毒可以利用自我编码的miRNA来调节其自身的基因表达，但来自宿主细胞的miRNA可能在丙型肝炎的调节活动中发挥重要作用。一个有趣的例子是miR-122，一种肝脏特异性miRNA。miR-122通过靶向病毒5′非编码区来促进HCV的复制[99]. 结论是HCV RNA可以在表达miR-122的Huh 7细胞中复制，但在不表达miR-22的HepG2细胞中不能复制[99]. 进一步研究[100]由同一团队进行的研究揭示了一个重要事实，即丙型肝炎病毒RNA基因组中miR-122结合位点的位置表明其对基因调节的影响，因为HCV miR-122的结合位点插入报告者mRNA的3′NCR中导致mRNA表达下调[100]，而miR-122与丙型肝炎病毒RNA基因组的5′端相互作用，导致病毒RNA增加[99].

此外，miR-122可以通过下调血红素氧化酶-1（HO-1）的表达间接促进HCV复制[101]，HO-1可以抑制丙型肝炎病毒复制[102]. 因此，下调miR-122和上调HO-1可能是抗HCV干预和细胞保护的新策略。同时，丙型肝炎病毒RNA的翻译也与miR-122密切相关。miR-122在肝细胞系中的滞留强烈降低了HCV的翻译，而miR-122的加入刺激了肝细胞系和非肝HeLa细胞中的HCV翻译[103].

在其他miRNAs中，miR-199a^*，另一个与HCV基因组序列相似的肝脏特异性miRNA已被确定为HCV复制的潜在抑制剂[104]. 与miR-122不同，miR-199a的过度表达^*抑制HCV基因组复制，抑制miR-199a^*; 然而，加速了病毒复制。

miRNAs与肝纤维化

以肝星状细胞（HSC）激活为特征的肝纤维化是导致HCC的另一个原因。HSC是促进肝纤维化的主要肝细胞[105]. 正常情况下，HSC位于Diss空间，可通过与炎症细胞相关的炎症激活，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-6、CC-细胞因子配体2/单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、白细胞介素（IL）-1和TGF-α[106]. 虽然一些炎症细胞因子通过影响肝纤维化相关miRNA的表达而在肝纤维化中发挥作用[107,108]. 如今，肝纤维化可以逆转的观点已被普遍接受[109]前提是激活的HSC切换到更安静的HSC。在这里，我们捕获了基于miRNA的肝纤维化研究的关键进展，以提高治疗潜力。

HSC含有大量富含维生素A的脂滴，而活化的HSC失去细胞质脂滴并转分化为增殖性，而成纤维细胞在肝纤维化的形成中起着重要作用[105]. 最近一项基于miR-27a和27b下调的研究表明，在原代培养激活的大鼠HSC中过度表达的两种miRNAs表明，培养激活的鼠HSC转变为更静止的HSC表型，胞质脂滴恢复，细胞增殖减少[110]. 与miR-27a和27b不同，miR-29a和29b在肝纤维化形成过程中经常下调，在体外研究表明，miR-29作为新型抗凝血介质可以抑制胶原蛋白合成[111]. 尽管这是唯一可用的例子，但它可能会在基于miRNA的肝纤维化治疗时代拉开帷幕。

肝脏疾病中的肝脏特异性miRNA信号

某些miRNAs普遍表达，而其他则以高度组织特异性的方式表达[112]. miR-122占miRNA总数的70%，是一种在肝脏中特异表达且丰富的鸟类，在所有其他组织中均未被检测到[112,113].

识别肝脏特异性miRNA:miR-122还有很长的路要走。1989年发现了miR-122的前体。此外，从不同小鼠组织制备的小RNA的系统克隆和测序表明，miR-122是肝脏中丰富的miRNA。进一步的研究表明，miR-122存在于小鼠、土拨鼠和人类肝脏、人类原代肝细胞以及培养的肝源细胞中，例如小鼠Hepa 1-6细胞和人类Huh7细胞[114]. 基于计算工具的研究表明，推测的miR-122靶基因参与细胞应激反应[113]，肝癌发生[65,115]和病毒感染[99,103]在培养的肝细胞中进一步实验证实。

miR-122在各种疾病的病理学中起着重要作用，包括癌症、感染和代谢疾病。对20例人类HCC样本的RNA分析表明，与来自相同个体的非恶性肝组织相比，miR-122在50%的肿瘤中显著下调[116]，由其他人再次确认[117]. 进一步的研究表明，miR-122在肝内转移中也发挥着重要作用。转移性Mahlavu和SK-HEP-1细胞中慢病毒载体（lent-122）miR-122的过度表达显著降低在体外迁移、入侵和凤尾鱼独立生长以及体内原位肝癌模型中的肿瘤发生、血管生成和肝内转移[118].

此外，丙型肝炎病毒（HCV）的感染也依赖于miR-122的表达状态[99,103]. 由凯瑟琳·L结果表明，HCV RNA只能在表达miR-122的细胞中复制，但复制失败。miR-122在HCV RNA复制中的作用通过沉默Huh7细胞中的miR-122而被证实，其复制结果在市场上丢失[99]. 同时，丙型肝炎病毒RNA的翻译也与miR-122密切相关。肝细胞系中miR-122的序列强烈降低HCV翻译，而miR-122刺激肝细胞系以及非肝HeLa细胞和兔网织红细胞裂解物中HCV翻译。进一步评估miR-122的作用表明，miR-122通过增强核糖体与病毒RNA在早期启动阶段的结合来刺激HCV翻译[103].

到目前为止，miR-122在代谢调节中的总体重要性已经通过一种针对miR-122的反义策略进行了阐述[119]. 通过基于2′-OMe硫代磷酸修饰寡核苷酸的反义策略沉默miR-122，可以显著降低高脂肪喂养小鼠的肝脏脂肪变性[119]. 同样，沉默miR-122也会导致数百个基因的表达增加，这些基因明显表现为假定的miR-122靶基因，包括那些在肝细胞中通常被抑制的基因，以及一些基因的表达减少，包括那些参与胆固醇生物合成的基因[119]. 所有这些结果都证明了miR-122通过调节非肝脏基因的表达来维持成人肝脏表型的重要性。

如上所述，肝特异性miRNA（miR-122）在各种肝脏疾病的病理学中起着非常重要的作用，这也意味着miR-122可能是一个潜在的治疗靶点。例如，基于抑制miR-122的疗法已被证明在抑制病毒复制方面是有效的在体外和体内过去几年[91,120]. 功能的重要性[119]以及监管的便利性[120-123]所有这些都使得基于miR-122的治疗药物具有应用于肝脏疾病的吸引力。一种潜在的治疗应用来自于miR-122安替戈米尔对高脂肪喂养小鼠减少肝脂肪变性的作用，这可能为治疗非酒精性脂肪性肝炎患者提供一个有趣的机会[119]. miR-122 antagomir的另一个有趣应用有助于利用其对成人肝脏基因表达下调的作用，生成在体外一种具有干/祖细胞表型的新型可膨胀肝细胞移植细胞源[119]; 第三种吸引人的miR-122安替戈米尔应用有助于抑制病毒复制和翻译，这可能为治疗病毒感染患者提供了一个有趣的机会[99,103].

miRNAs作为通用抗癌药物

miRNAs通过序列互补调节基因表达，可以影响一系列生物学过程，包括分化、增殖、凋亡、血管生成、侵袭和转移。由于对这些相同过程的放松管制是癌症的一个标志，一方面，它直接表明miRNAs可能作为假定的抑癌基因或致癌基因发挥作用，另一方面，这间接表明癌症治疗的努力应集中于这些假定的抑瘤基因或致癌性基因。越来越多的数据证明，基于miRNAs的治疗可能是有希望的抗癌治疗方法[70]. 在这里，我们总结了肝癌的现有证据。

迄今为止，越来越多的证据表明，假定的肿瘤抑制因子miRNAs可能是肝癌的新治疗实体，尤其是miR-26a[70]通常在正常成人肝脏中高水平表达，但在人类和小鼠肝脏肿瘤中显著下调。一项基于miR-26a替代物的研究使用AAV作为传递载体有效抑制癌细胞增殖并激活肿瘤特异性凋亡体内miR-26a通过下调细胞周期蛋白D2和E2诱导人肝癌细胞G1期阻滞，从而显著抑制肿瘤进展而无毒性[70]. 同样，在肝癌中，骨桥蛋白（OPN）被确定为促进肝癌转移的主导基因之一[124]. 最近一项基于编码抗OPN microRNA的慢病毒载体的研究表明，沉默OPN可以显著抑制在体外入侵和体内HCCLM3细胞的肺转移，甚至可以抑制在体外扩散和体内阻断MAPK通路和NF-κB通路促进HCCLM3肿瘤生长[125]，这表明OPN可能是控制转移和HCC肿瘤生长的一个有希望的靶点，并且病毒载体介导的针对OPN的微小RNA可以作为一种新的治疗方法进行治疗。

在其他推测的肿瘤抑制因子miRNAs中，miR-101[64,126]，miR-122和miR-223是特别感兴趣的。miR-101在大多数被检测的癌细胞系和癌组织中显著下调。通过瞄准Mcl-1[64]，Bcl-2家族的抗凋亡成员[127]，并抑制FOS癌基因的表达[126]，miR-101不仅抑制菌落形成在体外和致瘤性体内而且还使癌细胞对各种化疗药物诱导的凋亡敏感。因此，miR-101不仅可以作为抗癌治疗的靶点，而且可以作为诊断预后的分子标志物。肝脏特异性miRNA miR-122最早可在植入后12.5天检测到，并在出生前达到稳定状态[113]表明miR-122可能在肝脏发育中起关键作用。最近的研究[65,118]表明miR-122在肝癌中显著下调，可能起到抑癌作用。通过恢复转移性Mahlavu和SK-HEP-1细胞中的miR-122，迁移、侵袭在体外以及肿瘤发生、血管生成和肝内转移体内被明显抑制[118]. 进一步研究表明，miR-122通过调节血管生成的关键成分ADAM17（去整合素和金属蛋白酶17）抑制肝癌肝内转移。此外，miR-122可以靶向细胞周期蛋白G1（CCNG1）mRNA的3′-UTR进行调控。原发性肝癌中miR-122和CCNG1呈负相关，进一步强调了miR-122在肝癌发病中的重要性[65]. 这仅仅是一个开始。有许多新的miR-122靶点尚未确定。最近一项使用miRNA-like siRNA表达载体的研究证明，miR-122可以通过靶向3′-UTR中的结合位点直接抑制Bcl-w蛋白水平[128]. 此外，ADAM10（一种分化蛋白和金属蛋白酶家族10）、血清反应因子（SRF）和胰岛素样生长因子1受体（Igf1R）均被证实为miR-122的靶点[129]. 库劳恩进行的研究强调miR-122是HCC进展的诊断和预后标志物，这种观点是因为miR-122的缺失导致细胞迁移和侵袭增加，miR-122恢复可逆转这种表型[130,131]. 此外，miR-122的丢失与肝脏富集的转录因子有关，如HNF1A、HNF3A和HNF3B[130]. 所有这些数据表明miR-122在肝癌中起着非常重要的作用，肝癌也是一个很有吸引力的治疗靶点。与miR-122类似，miR-223在肝癌中也显著下调。miR-223在HBV、HCV和非HBV非HCV相关HCC细胞系中的重新表达显示了对细胞活力的一致抑制作用。进一步研究表明Stathmin 1（STMN1）是miR-223的下游靶点。肝癌细胞系miR-223表达恢复后，STMN1蛋白显著减少[132]. 因此，miR-223可能是肝癌治疗的新靶点，因为它调节STMN1，STMN1是PTEN/PI3K通路活性的良好标记物。

在癌症中扩增或过度表达的miRNAs可能作为假定的致癌基因或靶向一个或多个抑癌基因以抑制抑癌途径的活性的miRNA。miR-21是主要的参与者之一。与上述假定的肿瘤抑制因子miRNAs不同，miR-21在HCC中总是高过表达[58,61,63,117]. 抑制培养的肝癌细胞中的miR-21可增加磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）抑癌基因的表达，并降低肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[117]. 与结果一致，在用前体miR-21转染的肿瘤细胞中观察到肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的增加[117]. 另一项基于miR-21特异性反义寡核苷酸的研究表明，miR-21在维持肝细胞恶性转化中起着重要作用[133]. 所有这些数据表明，miR-21的过度表达可以通过调节PTEN的表达来促进HCC的生长和扩散。PTEN是miR-21的直接靶点，沉默miR-21可能是一种新的有吸引力的治疗方法。另一个有趣的病例是miR-221，与其他肿瘤的报道类似[134]miR-221也在肝癌中上调。此外，先前报道的靶点为p27和p57[135]miR-221可以通过靶向Bmf抑制细胞凋亡，上调表达并影响多种原癌途径表明miR-222是肝癌非常规治疗的潜在靶点[136].体内Pineau基于肝癌小鼠模型的研究等。研究表明，miR-221过表达通过适时调节mTOR通路的调节剂DNA损伤诱导转录物4（DDIT4）刺激致瘤小鼠肝祖细胞的生长[137]. 加罗法洛等进一步证明miR-221可以通过靶向PTEN和TIMP3肿瘤抑制因子激活AKT通路和金属肽酶，诱导TRAIL抵抗并增强细胞迁移[138].

综上所述，基于miRNA的治疗方法是一种潜在的肝癌治疗方法，即使这些miRNA调控的大多数可能途径仍不清楚。然而，这不会模糊将miRNA作为一般抗癌药物治疗的可能性，因为基于沉默或恢复miRNA的策略在抑制肿瘤进展、迁移、侵袭性肿瘤发生、血管生成和肝内转移方面证明是非常有效的。此外，不仅可以使用反义寡核苷酸特异性沉默miRNA，还可以使用病毒载体恢复miRNA。在这里，我们可以大胆预言，基于miRNA的疗法将有无限光明的未来。

miRNAs与载体肝靶向

如前所述，基于siRNA和miRNA的RNAi可能是发展抗病毒治疗和抗癌治疗的最有希望的途径之一。RNAi在治疗应用中的成功还取决于有效的传递系统，该系统可以支持长期siRNA的产生和持续的基因沉默。到目前为止，最强大的基因治疗载体来自经过几步修饰的病毒，作为一种理想的传递系统，基因治疗载体应具有特定的靶向性，以使其能够转导靶细胞，同时避免在其他器官中隔离或避免有害细胞感染的毒性。包括转录靶向在内的大量方法[139]，转导靶向[140]和翻译目标[141]，已用于载体定位。然而，没有一个对所有矢量都有效。通过构建包含miRNA靶标（miRT）元素的载体靶向盒，使其能够被内源性细胞miRNA识别和调节，已引起了广泛关注。在这里，我们提供了miRNAs可用于载体肝靶向的证据。

如今，越来越多的证据表明，组织特异性miRNAs在调节载体肝靶向性方面发挥着重要作用。一个潜在的应用来自特定组织中含有组织特异性miRT元件的载体对抑制衣壳蛋白基因表达的影响，这为系统地减少/消除病毒载体介导的基因治疗过程中复制活性病毒潜在污染的影响提供了一个有趣的机会[142]（图。​22).

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图（2）。通过组织特异性miRNAs消除可复制AAV潜在污染的影响。

将肝脏特异性miRNA（紫色）识别的靶序列（红色）掺入包装质粒（绿色）可确保复制病毒不能在肝细胞中复制。

组织特异性miRNAs的另一个有趣应用是利用其在造血谱系中下调转基因表达以逃避免疫反应的作用。目前，稳定基因转移的主要障碍之一是转基因特异性免疫的发展[143]因为转基因产物在免疫系统的专业抗原呈递细胞（APC）内直接表达[144]. 即使使用了组织特异性促进剂，仍然可以观察到免疫反应。最近的一项研究[145]基于编码造血特异性mir-142-3p靶序列的慢病毒载体，证明了通过阻止转基因在造血谱系中表达，同时允许在非造血细胞中高水平表达，miRNA调节可以在没有免疫反应的情况下实现稳定的基因转移[146]. 其他人再次确认了合理的应用[146-148].

组织特异性miRNA在载体肝靶向中的第三个有吸引力的应用来自基于溶瘤病毒的基因治疗，以降低肝毒性。通过在E1A基因的3′UTR中加入一个包含与肝脏特异性miR-122互补序列的外壳，重组腺病毒在其他细胞中正常复制，但在肝源性细胞中没有复制[149-151]. 此外，基于介导miR-122a调节HSVtk表达的Ad载体的自杀基因治疗可以通过完全降低肝毒性而更加安全有效[152].

众所周知，miRNAs在各种以miRNA调控解除为特征的疾病中总是有特征性的。特别是在癌症中，致癌miRNA在正常组织中普遍表达，但在肿瘤中高度富集，而抑癌miRNA在癌症中特异性下调。因此，在载体中进行靶元件的肿瘤抑制miRNAs应答工程可以增加正常组织中的基因沉默，从而使基因在癌症中特别表达。例如，let-7、miR-143和miR-145作为假定的肿瘤抑制miRNAs，被证明在某些癌细胞中低表达[153]. 基于let-7或miR-143和miR-145的调控赋予野生型病毒肿瘤特异性复制，同时消除正常细胞中的不良复制和相关毒性[154,155]. 所有这些数据表明，由miRNA调节的载体靶向性不仅可以是肿瘤特异性的，而且还可以减少肝毒性和免疫反应。因此，它有望在生成肝靶向表达载体方面发挥重要作用。

结论与展望

肝癌miRNA功能的鉴定为miRNA-肿瘤相关基因的相互作用提供了重要的知识，并揭示了许多潜在的治疗靶点。正如许多研究所记录的那样，一些miRNAs可能作为致癌基因发挥作用，而另一些则作为肿瘤抑制因子发挥作用。对于致癌miRNAs，如miR-21，一种理想的治疗策略，会降低其在细胞中的功能。至于抑制肿瘤的miRNA，恢复miRNA应该会提供有吸引力的结果。

尽管基于miRNA的治疗取得了显著进展，但仍有许多问题有待回答。我们要解决的第一个难题是，我们应该清楚地了解在生命周期中对miRNA调节和生理功能作出反应的确切机制。对于一般由miRNAs控制的细胞回路，尤其是由癌相关miRNAss控制的细胞电路，人们知之甚少。应努力检查miRNAs及其靶序列中突变的真实频率。此外，应采用计算方法，以更全面地了解其作用机制。只有这样，我们才能更清楚地了解miRNAs在人类癌症中的作用。不同的miRNA表达在不同的拷贝数上，相同的miRNA在不同的细胞谱系中表达在不同拷贝数上。我们最感兴趣的是必须达到miRNAs的阈值拷贝才能实现明显的基因沉默。然而，可供参考的数据较少。

作为发展抗癌治疗最有希望的途径之一，miRNA在治疗应用中的成功依赖于高效的递送系统。目前，载体靶向仍是实现稳定基因转移的主要障碍之一。收集研究表明，通过设计盒来包含miRNA靶标（miRT）元素，从而被内源性细胞miRNA识别和调节的载体靶向是非常有效和通用的，尽管，对于miRT元素的确切拷贝数和串联拷贝之间的间距元素，仍有许多工作要做，这将证明对于向量定位来说是最有效的。rAAV介导的基因治疗被认为是治疗肝病的最有吸引力的方法。然而，由衣壳蛋白合成在靶组织中诱导的免疫反应，来自残留的具有复制能力的AAV颗粒，通常会关闭功能基因的表达。为了系统地减少/消除潜在污染rcAAV颗粒的影响，我们的实验室设计了一种新型AAV辅助物（pH22mir），该辅助物带有一个microRNA结合盒，其中包含肝脏特异性（hsa-mir-122）和造血特异性（has-mir-142-3p）序列的多个拷贝，以专门控制cap基因的表达[142]. 在肝脏中，99.9%的衣壳蛋白表达被抑制，Western blot检测不到cap表达。总的来说，很难高估miRNAs在肝脏中的调节回路的潜在影响，这可能为肝癌治疗提供有吸引力的靶点。

致谢

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参考文献