癌症研究。作者手稿；PMC 2010年9月20日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理2941886
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院225743
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体改变线粒体膜脂质
,1 ,三 ,1 ,2 ,三 ,1和1
费里·桑德拉
1哈佛医学院病理学系，Beth Israel女执事医疗中心
毛罗·德格利·埃斯波斯蒂
三英国曼彻斯特大学生命科学学院
肯尼思·恩德贝尔
1哈佛医学院病理学系，Beth Israel女执事医疗中心
菲利蒙·戈纳
2马萨诸塞州波士顿市波士顿大学数学与统计系统计与咨询部
马格努斯·罗森奎斯特
1哈佛医学院病理学系，Beth Israel女执事医疗中心
罗亚·科斯拉维·法尔
1哈佛医学院病理学系，Beth Israel女执事医疗中心
1哈佛医学院病理学系，Beth Israel女执事医疗中心
2马萨诸塞州波士顿市波士顿大学数学与统计系统计与咨询部
三英国曼彻斯特大学生命科学学院
要求重印：Roya Khosravi-Far，哈佛医学院病理学系，Beth Israel女执事医疗中心，99 Brookline Avenue，Boston，MA 02215。电话：617-667-8526；传真：617-667-3524；ude.dravrah.cmdib@varsohkr。 摘要
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）已被证明具有选择性抗肿瘤活性。TRAIL诱导普遍存在的细胞死亡途径，其中caspase激活直接或通过线粒体释放凋亡因子介导；然而，线粒体信号通路的确切组成部分尚未得到很好的定义。值得注意的是，线粒体是克服多种肿瘤对TRAIL耐药性的重要靶点。Bid被认为是在死亡受体介导的细胞凋亡过程中参与线粒体的基础，但这种作用依赖于线粒体脂质。在这里，我们报道了TRAIL信号诱导线粒体膜脂，特别是心磷脂的改变。这与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活无关，并启动线粒体膜对Bid的促凋亡作用。我们揭示了TRAIL信号传导与膜脂稳态改变之间的联系，这种改变与顶端胱天蛋白酶的激活平行发生，但由于胱天蛋白酶8的同时激活，不会取代细胞死亡模式。特别是，TRAIL诱导的线粒体脂质改变伴随着磷脂酰胆碱细胞内稳态的失衡，导致二酰甘油（DAG）升高。DAG升高反过来激活磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶C的δ亚型，从而加速半胱氨酸蛋白酶-8的裂解。我们还表明，通过抑制脂质降解酶来保持磷脂酰胆碱体内平衡几乎完全阻碍了前caspase-9的激活，而几乎没有改变caspase-8的激活。
介绍
肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（TRAIL）是一种II型跨膜蛋白，是TNF家族配体（即Fas、TNF-α等；参考文献。1-7). TRAIL主要诱导转化细胞或肿瘤细胞凋亡，因此作为一种选择性抗癌药物具有很大的前景(1,4,5,7-9). 此外，在细胞转化刺激的自然杀伤细胞、树突状细胞、单核细胞和T细胞的表面显示了TRAIL的功能性表达，因此提示TRAIL在肿瘤发生前选择性消融转化细胞中的作用(10-15).
TRAIL受体DR4和DR5通过死亡域相互作用、衔接蛋白（如FADD）和顶端半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（如前caspase-8）的招募介导TRAIL功能。该组件形成死亡诱导信号复合体（DISC；参考文献。三-5,16-18)促进心尖半胱天冬酶的自溶激活和释放(19,20). 激活的顶端半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶启动细胞死亡信号的两条主要途径(21-24)：线粒体非依赖性途径和线粒体依赖性途径。在线粒体非依赖性途径中，顶端半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶直接激活执行者半胱氨酸蛋白酶，如半胱氨酸水解酶-3(17,18,23,25,26). 在大多数细胞（II型细胞）中，包括许多肿瘤细胞(18)死亡信号分为线粒体依赖性途径，其中caspase在线粒体凋亡因子释放到胞浆的下游被激活，激活方式与内在凋亡途径相同(16-18,21,27).
线粒体是Bcl-2家族促凋亡蛋白的靶点，例如广泛分布的BH3-唯一成员Bid(27-34)基因消融可降低Fas诱导的肝毒性和线粒体损伤(35). 半胱氨酸天冬氨酸酶叶子形式的Bid（tBid）迁移到线粒体外膜，在那里与其他Bcl-2家族蛋白（如Bak或Bax）合作，诱导线粒体蛋白释放到胞浆中(28,29,36-38). 尽管现在普遍认为tBid构成了DISC和线粒体之间的基本联系(28)一些观察结果表明，在死亡受体介导的细胞死亡过程中，平行的、非caspase依赖的信号可以传递到线粒体(39-41). 然而，TRAIL受体产生的替代途径到达并影响线粒体的方式尚不清楚。
心磷脂是线粒体中唯一存在的膜脂，可能有助于tBid和Bax的促凋亡作用(31,37,42). 事实上，tBid与心磷脂降解的副产物单唾液酸二脂结合(38,43). 然而，将死亡受体与心磷脂变化联系起来的信号转导步骤仍然难以捉摸。鉴于磷脂酰胆碱是细胞膜中的主要磷脂，参与了心磷脂的重塑(37,44)心磷脂的变化也可以反映磷脂酰胆碱稳态的改变。有趣的是，磷脂酰胆碱体内平衡影响细胞内二酰甘油（DAG）的水平，DAG反过来激活调节磷脂酰胆碱代谢的蛋白激酶C（PKC）家族成员(45-47). 因此，磷脂酰胆碱、DAG和PKC活性的细胞含量变化可能参与介导死亡配体诱导的凋亡。Fas配体（FasL）和TNF已被证明在各种细胞类型中诱导磷脂酰胆碱耗竭(39,45-48)但迄今为止，还没有关于TRAIL与磷脂酰胆碱稳态之间关系的研究报告。
尽管正常细胞和肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡的不同敏感性表明TRAIL是一种潜在的肿瘤选择性肿瘤治疗方法，但一些肿瘤细胞对其具有耐药性(5,7,9,14,49). 值得注意的是，线粒体是克服多种肿瘤（如结肠癌和胶质瘤）对TRAIL固有抵抗的重要靶点。参考文献。16,23,50). 这些观察结果表明，阻断TRAIL诱导的线粒体通路的活性可能会促使某些肿瘤细胞对TRAIL产生耐药性。基于强调线粒体脂质在Bid促凋亡作用中作用的新证据(27,31,40)由于缺乏对TRAIL诱导的、caspase-independent信号调节线粒体通路的机制知识，我们研究了TRAIL诱导信号在线粒体释放凋亡因子中的作用。在这里，我们发现TRAIL有助于线粒体脂质的改变，其方式可能对凋亡因子的释放和细胞死亡的完全执行至关重要。
材料和方法
细胞培养和凋亡检测
HeLa和Jurkat细胞分别在含有10%胎牛血清的DMEM和RPMI中培养，并通过连续稀释分裂成48个单细胞克隆。然后将单个克隆在含有10ng/mL重组人TRAIL-TNFSF10（R&D Systems，Minneapolis，MN）、100ng/mL重组可溶性人FasL（Alexis Biochemicals，San Diego，CA）或10ng/mL重组人TNF-α（R&D Systems）加1μg/mL环己酰胺（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）的培养基中生长24小时。如前所述，通过碘化丙啶染色评估凋亡百分比(51,52)使用FACSCalibur（Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖）。本研究选择了高度敏感的克隆（C1代表HeLa细胞，C3代表Jurkat细胞）。
细胞分馏和脂质分析
在本研究中，如前所述，使用MBL线粒体/细胞质分馏试剂盒（MBL，马萨诸塞州沃特敦）进行细胞分馏(51)以及按照制造商的说明。该试剂盒提供独特的试剂配方，用于有效分离高度富集的线粒体部分。然后将所得细胞溶质和线粒体部分用于Western blot分析。补充分馏研究是根据Sorice等人报告的程序进行的(53).
如前所述，从Jurkat细胞线粒体部分提取脂质(53)并使用LCT仪器（英国曼彻斯特Micromass）在正离子模式下通过纳米电喷雾飞行时间质谱（MS）分析提取物(43,44,53). 使用2250 V的毛细管电压和35 V的样品锥注入几微升提取物。使用一组内部参考离子对脂质峰进行半定量评估，这些参考离子在同一样品的多个光谱内保持等效关系，并且在对照样品和凋亡样品之间几乎没有变化。这些参考离子包括703.4的鞘磷脂米/z(43)占优势的磷脂酰乙醇胺物种棕榈酰、硬脂酰磷脂酰乙醇酰胺，768.6米/z。
线粒体染色
心磷脂敏感探针10-壬基嘧啶橙（NAO）用于监测线粒体脂质的变化体内(39,54). 简单地说，用10 ng/mL TRAIL治疗后，106通过离心收集细胞，清洗，然后在室温下将其重新悬浮在含有200 nmol/L NAO（Molecular Probes，Eugene，OR）的PBS中30分钟。随后使用Fl-1通道通过流式细胞术测量荧光。使用类似的方案，我们还测量了线粒体膜电位。清洗过的电池（106)将其重新悬浮在含有25 nmol/L CMXRos或40 nmol/L TMRE（均来自分子探针）的1 mL PBS中，在37°C孵育30分钟后，通过流式细胞术测定荧光(55).
磷脂酶活性测定
使用Amplex红色检测试剂盒（分子探针）测量与磷脂酰胆碱-磷脂酶C（PLC）和磷脂酰胆碱/磷脂酶D（PLD）以及可能的其他脂肪酶相关的活性。简单地说，106用TRAIL处理细胞并将其悬浮在含有5mmol/L EDTA、1%NP40、100mmol/L NaF、2mmol/L原钒酸钠、10mmol/L焦磷酸钠、蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中（印第安纳波利斯罗氏）。反应在37°C的黑暗中进行30分钟。细菌磷脂酰胆碱-PLC作为阳性对照。用微孔板阅读器（马里兰州盖瑟斯堡Perkin-Elmer）测量红色荧光，并以任意单位（a.u.）表示。
采用三环癸烷-9-基黄原酸酯（D609；Biomol，普利茅斯会议，PA）药理抑制磷脂酶活性(48,56-65)通常在其他治疗前与细胞孵育30分钟。
细胞内还原型谷胱甘肽的分析
为了确保D609没有短期抗氧化作用，使用单氯双烷染色法测定细胞谷胱甘肽(66-68). 通过离心收集Jurkat C3细胞，并将其重悬于含有0.5%胎牛血清的1mL RPMI中，加入或不加入50μmol/L D609，然后进行TRAIL处理。在37°C下培养1小时后，清洗细胞，并将其重新悬浮在含有40μmol/L一氯二烷（分子探针）的500μL PBS中，并在室温下培养5分钟。使用Fl-1通道通过流式细胞术立即测量荧光。
二酰甘油测定
10种油脂提取物6通过使用3 mL氯仿/甲醇（1:2，v/v）并添加1 mol/L NaCl获得PBS洗涤细胞。混合后，再添加1 mL氯仿和1 mL 1 mol/L NaCl。样品重新混合，在5000×离心后分离有机相克持续2分钟。使用放射酶Biotrak分析法（新泽西州皮斯卡塔韦市阿默沙姆）评估脂提取物中的DAG水平。具体来说，DAG被转换为[32P] 暴露于大肠杆菌DAG激酶中的磷脂酸[γ-32P] ATP。放射性物质[32P] 然后提取磷脂酸，通过Amprep色谱分离，并通过液体闪烁计数定量(69).
免疫印迹法
将采集的细胞溶解在磷脂酰胆碱-PLC分析中使用的相同裂解缓冲液中。样品通过SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯板上。在TBS中用5%脱脂牛奶封闭后，用抗磷-PKCδ（特异性Ser643和Thr505磷酸化，细胞信号技术，马萨诸塞州贝弗利），抗PKCδC-17，抗肌动蛋白，抗HSP60 H-300，抗caspase-8 p20，抗Bid C-20，抗caspase-9 p10 H-83和抗caspase 3 H-277（均来自加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术）和单克隆抗细胞色素c（c）（加利福尼亚州圣地亚哥PharMinen）。从Amersham或Jackson Immuno-Research（宾夕法尼亚州West Grove）获得适当的二级抗体，并使用增强化学发光系统（Amersham）观察斑点。
统计
所有数据均作为连续变量进行分析。Wilcoxon检验是对两个独立样本进行的基于等级的统计检验，用于比较治疗组的中位数，因为每个组的重复次数从3到5不等。P（P）<0.10被认为具有统计学意义。选择限制性较低的显著性水平是为了平衡小样本治疗组的样本量，并考虑到作为非参数程序的Wilcoxon检验相对于吨未能拒绝假零假设的测试（犯II类错误的可能性更大；参考文献。70,71). 为补充统计分析，给出了描述组平均值和标准偏差的数字。
结果
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导线粒体脂质改变
导致线粒体脂质发生变化的信号传导事件，为死亡配体的促凋亡作用启动线粒体，目前尚不明确。在本研究中，我们通过表征对TRAIL的反应而诱导的caspase-independent线粒体事件，并影响磷脂（包括心磷脂）的稳态，来研究TRAIL和线粒体脂质之间的联系。
我们的Jurkat和HeLa细胞克隆对TRAIL诱导的凋亡高度敏感()包括II型细胞中的线粒体(16,18). 治疗24小时后，Jurkat和HeLa细胞对TRAIL的敏感性相当（分别为80%和60%的凋亡，). 为了研究线粒体膜脂的早期变化，Jurkat细胞被TRAIL（10 ng/mL）处理1小时。然后使用NAO（一种对心磷脂敏感的探针）测量TRAIL在这些细胞中引起的心磷脂的变化。为了确保用TRAIL治疗1小时后，线粒体膜电位没有明显变化，这可能会干扰NAO染色（参考文献。39)，我们用MitoTracker Red和TMRE等特异性线粒体探针测量了膜电位。一小时的TRAIL处理对这些细胞的膜电位和线粒体形态的影响可以忽略不计（数据未显示）。同时，TRAIL诱导NAO荧光降低40%，如荧光强度直方图的变化所示（图。和).
TRAIL诱导线粒体心磷脂的变化。A、，TRAIL诱导的细胞凋亡：用不同浓度的TRAIL处理HeLa和Jurkat细胞24小时。收集细胞，通过流式细胞术测定亚G细胞的凋亡程度1人口。柱，三次独立测定的平均值；酒吧，SD.*，P（P）<0.05，与对照未处理细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。B、，TRAIL诱导的心磷脂变化：将Jurkat细胞与TRAIL（10 ng/mL）孵育1小时，然后用NAO染色，用流式细胞仪分析其荧光。C、，线粒体脂质提取物的电喷雾质谱图谱：未经处理(顶部)和TRAIL处理的Jurkat细胞（10 ng/mL，1小时；底部). 尽管TRAIL处理的样品中主要磷脂酰胆碱种类的参考强度相对高于对照样品，但心磷脂区域的MS谱记录为等效的信噪比，以强调心磷脂种类的定量和定性变化。D、，以磷脂酰胆碱为主的线粒体磷脂的电喷雾质谱(个人计算机)物种：光谱被归一化为主要棕榈酰、花生四烯酸-磷脂酰胆碱在782的强度米/z尽管这种脂质与其他含花生四烯酸的物种相比显示出TRAIL诱导的增加（例如，808米/z)和内部参考，如主要磷脂酰乙醇胺(聚乙烯)768个物种米/z注意，在760℃时，TRAIL诱导线粒体棕榈酰、油酰基磷脂酰胆碱严重耗竭米/z(粗箭头).
磷脂酶活性介导TRAIL诱导的细胞凋亡。A类磷脂酶活性的抑制抑制TRAIL诱导的凋亡：HeLa和Jurkat细胞与不同浓度的D609预孵育30分钟，然后添加10 ng/mL TRAIL 24小时，并在碘化丙啶染色后通过流式细胞术评估凋亡。柱，三次独立测定的平均值；酒吧，SD.*，P（P）<0.05，与对照细胞（0μmol/L D609和10 ng/mL TRAIL）相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。B类，D609在50μmol/L浓度下无细胞毒性：Jurkat和HeLa细胞被磷脂酶活性的药物抑制剂D609处理24小时，如(A类). 未经处理的细胞与用10或50μmol/L D609处理的细胞之间没有显著差异(P（P）= 0.144). C、 D609不促进短期抗氧化活性：用50μmol/L D609预处理Jurkat细胞1小时。用流式细胞术测定一氯二烷对谷胱甘肽的消耗，评价D609的抗氧化作用。所有测量均一式三份。*，P（P）<0.05，与对照细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。D类磷脂酶活性抑制抑制TRAIL诱导的NAO染色变化：用50μmol/L D609预培养Jurkat细胞30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）培养1小时。E类，用TRAIL、TRAIL和z-VAD以及TRAIL和D609处理的Jurkat细胞中NAO荧光变化百分比的定量测量。柱，三个独立实验的平均值，每个实验重复进行一次；酒吧，SD。
TRAIL处理的Jurkat细胞的线粒体脂质提取物的质谱（MS）分析显示，心磷脂发生了实质性改变(; 参见参考。53). 心磷脂的主要种类[例如，1520米/z经TRAIL治疗后，（二戊酰、二烯酰心磷脂-3Na）严重耗竭(; 参见参考。43). 相反，具有饱和酰基链（例如，1482年的三硬脂酰、棕榈酰-2Na米/z)或长不饱和酰基链[例如，1600米/zTRAIL处理细胞提取物中富含油酰基的物种的相对比例似乎保持不变，甚至增加(). 因此，诱导细胞凋亡不仅耗尽了心磷脂总含量的线粒体，还改变了其余心磷脂物种的脂肪酸分布。这种心磷脂的丢失与TRAIL诱导的NAO染色变化相一致(). 我们观察到小鼠肝脏在Fas刺激后心磷脂的定性变化有类似趋势(43)还有Jurkat细胞，4随着单唾液酸二脂水平的增加。
TRAIL诱导的心磷脂酰基链组成的变化清楚地表明，凋亡信号严重干扰了这种脂质的重塑，这种脂质是在线粒体中以前体形式合成的，如1482年的物种米/z(40,44). 鉴于磷脂酰胆碱是不饱和酰基链的主要供体，可将心磷脂前体重塑为高度不饱和形式(40,44)，我们接下来研究了线粒体磷脂酰胆碱物种的质谱图谱(). 很明显，TRAIL治疗导致一种主要的磷脂酰胆碱、棕榈酰、油酰基磷脂酰胆碱在760℃时严重耗竭米/z以质子化的形式(). 一旦标准化为包括主要磷脂酰乙醇胺物种在内的内部参考物，经1小时TRAIL处理后，棕榈酰、油酰磷脂酰胆碱的水平下降了6倍(; 数据未显示）。相应地，棕榈酰、花生四烯酸-磷脂酰胆碱在782时相对增加米/z而其他物种，如油酰基、花生四烯酸-磷脂酰胆碱（808米/z)，基本保持不变(). 因此，TRAIL诱导的心磷脂变化()似乎反映了棕榈酰、油酰磷脂酰胆碱的选择性耗竭，同时酰基链的整体重新分布有利于花生四烯酸盐的富集。Fas处理细胞线粒体磷脂酰胆碱种类的相对水平也发生了类似但不完全相同的变化（数据未显示）。
有趣的是，TRAIL诱导的线粒体脂质变化独立于caspase活性发生，这一事实证明，泛酶抑制剂z-VAD没有抑制与TRAIL相关的NAO的减少（图。和). 因此，TRAIL信号刺激线粒体脂质的早期变化，这些变化发生在caspase激活之前或独立于caspase活化。事实上，用TRAIL处理1小时后，caspase-8进入其特征片段的过程无法检测到(; 裁判。21). 我们还观察到，与TRAIL诱导的变化类似，用有效浓度的FasL处理Jurkat细胞也会导致NAO荧光和心磷脂耗竭减少（数据未显示；参考文献。53). 这些观察结果表明存在常见的死亡受体介导的反应，这些反应有助于在激活顶端半胱天冬酶之前或同时改变线粒体膜脂质。
TRAIL诱导的NAO染色变化不依赖于caspase激活。A类，z-VAD不抑制TRAIL诱导的NAO染色变化：Jurkat细胞NAO荧光的流式细胞术，其与100μmol/L z-VAD-FMK预孵育30分钟，然后TRAIL（10ng/mL）处理1小时，如。仅在z-VAD存在下获得的数据与对照样品的数据重叠（未显示数据）。B类在与（A）中相同的条件下，在1小时的TRAIL处理后，前半胱氨酸-8没有被显著处理。
磷脂酶参与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的凋亡
一般来说，细胞表面受体通过快速激活脂质降解酶来传递细胞内信号(45,46,56,69,72,73). 例如，一种降解磷脂酰胆碱的PLC活性（磷脂酰胆碱PLC）已被反复报道在刺激细胞表面受体（如Fas）后升高(45,56-62,69,73). 然而，磷脂酶可能参与TRAIL介导的细胞凋亡的线粒体臂，尤其是磷脂酰胆碱，以前没有研究过。
我们最初评估磷脂酰胆碱降解酶参与TRAIL介导的凋亡的方法是用D609药物抑制磷脂酶活性。通常认为该化合物可抑制磷脂酰胆碱-PLC和PLD活性(48,56-65)并且已经证明可以保护细胞免受Fas诱导的凋亡(48,57-59). 如所示用D609（50μmol/L）预处理30分钟的Jurkat和HeLa细胞，经24小时TRAIL（10 ng/mL）处理后，细胞死亡抑制约50%。FasL处理的细胞也获得了类似的结果（100 ng/mL；数据未显示）。相反，相同浓度的D609（50μmol/L）对细胞活力没有影响（只有在浓度超过100μmol/L时才观察到小的细胞毒性作用，如). 考虑到D609具有抗氧化性能(68)，我们还评估了该化合物在死亡受体刺激前后对细胞谷胱甘肽的影响。显著防止细胞死亡的D609浓度()细胞谷胱甘肽受影响较小()同时抑制38%由1小时TRAIL处理诱导的NAO染色变化(). 因此，这些结果提供了新的证据，表明磷脂酶活性参与TRAIL诱导的细胞凋亡，并影响线粒体及其标志性脂质心磷脂。
磷脂酶活性增加对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的反应
上述结果表明，TRAIL诱导的细胞凋亡需要D609敏感性磷脂酶的活性，如之前报道的Fas和TNF的活性(45,48,57). 为了探讨TRAIL直接诱导磷脂酶活化的可能性，我们用10 ng/mL TRAIL处理Jurkat和HeLa细胞1小时，并测量磷脂酰胆碱-PLC和磷脂酰胆碱-PLD的活性，以评估磷脂酶活性水平（分子探针；参考文献。74). 如所示磷脂酶活性迅速增加，用TRAIL处理3小时后，Jurkat细胞和HeLa细胞的磷脂酶活力分别达到11590±701（a.u.）和12590±974（a.u..）。然后，我们通过在用TRAIL处理3小时之前用D609预处理细胞来测试D609抑制细胞磷脂酶活性的能力（解释磷脂酶的最大活性）。D609以浓度依赖的方式抑制TRAIL诱导的两种细胞系磷脂酶活性的增加(). 因此，TRAIL刺激磷脂酰胆碱降解磷脂酶的活性，从而在磷脂酰胆碱稳态的扰动和D609抑制的抗凋亡作用之间提供联系。
磷脂酶活性对TRAIL的反应增强。A类TRAIL诱导磷脂酶活化：HeLa和Jurkat细胞暴露于TRAIL（10 ng/mL）达指定时间，并使用Amplex红色荧光（a.u.）测定磷脂酶活性。点数三个独立实验的平均值；巴，标准**，0.05<P（P）<0.10，双侧Wilcoxon检验，将0小时与1、3、6和12小时进行比较，具有统计学意义。B类，TRAIL诱导的磷脂酶活性被D609抑制：HeLa和Jurkat细胞与不同浓度的D609预孵育30分钟，然后进行TRAIL处理，如(A类).点数，三个独立实验的平均值，每个实验重复进行一次；巴，标准**，0.05<P（P）<0.10，与对照细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义（无D609治疗）。C类，TRAIL诱导磷脂酶活性(A类)未被z-VAD抑制：HeLa和Jurkat细胞用100μmol/L泛酶抑制剂z-VAD预培养30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）处理1、3和6小时。在(A类).
磷脂酶活性介导肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的线粒体凋亡途径
在确定TRAIL诱导磷脂酶的早期激活后，我们研究了这种活性是否影响DISC介导的胱天蛋白酶切割臂或DISC下游线粒体介导的胱天蛋白酶切割扩增(25,26,33,34,75,76). 为了分析这些可能性，我们测量了外源性途径（caspase-8）和内源性途径（caspase-9）中关键顶端caspase的裂解，以及两条途径的主要执行蛋白酶caspase-3的裂解和活性。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原的裂解有助于半胱氨酸蛋白酶-3的激活，并直接跟随近距离诱导的顶端半胱氨酸酶的激活，从而有助于其持续活性(21,77). 我们通过评估Bid切割和平行测量线粒体细胞色素的胞质重新定位来补充这些研究c（c）需要注意的是，尽管Bid是caspase-8的首选底物，但也可以通过内在途径和caspase-3进行处理(33,78). 我们还比较了TRAIL处理后增加D609浓度对caspase和Bid裂解谱的影响().描述了TRAIL治疗后HeLa细胞获得的数据；Jurkat细胞也获得了类似的结果（数据未显示）。
磷脂酶活性介导TRAIL诱导凋亡的线粒体途径。A类，TRAIL以时间依赖的方式诱导caspase-8处理：HeLa细胞接受TRAIL（10 ng/mL）处理指定时间，并对其裂解物进行免疫印迹，以检测caspase-8（p20抗体，Santa Cruz Biotechnology）和肌动蛋白，作为负荷对照。底部，对三个独立实验的p20波段数据进行密度分析。B类和C类磷脂酶活性不会阻止Bid和caspase-8的处理，但会影响细胞色素c（c）释放和caspase-9处理：首先将HeLa细胞与增加浓度的D609孵育30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）处理6小时。对全细胞裂解物进行caspase-8、Bid、caspase-9和caspase-3的免疫印迹，而对细胞溶质部分进行细胞色素印迹C类; 用肌动蛋白re-blots评估蛋白质负荷(底部). p10和细胞色素条带的密度分析C类使用三个独立实验的数据完成(C、 底部). **, 0.05 <P（P）<0.10，双侧Wilcoxon检验与单独TRAIL治疗相比具有统计学意义。D类在抑制TRAIL诱导的caspase-8过程中，z-VAD比D609更有效：如图所示，用100μmol/L z-VAD或50 Amol/L D609预培养HeLa细胞的裂解液30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）处理。使用三个独立实验的数据对p20带进行了密度分析(底部). **, 0.05 <P（P）<0.10，与单独TRAIL治疗相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。
在TNF配体家族刺激细胞凋亡的过程中，蛋白酶-8被蛋白质水解裂解，生成p20特征片段(三,5,17,23,79). 经过3小时的TRAIL处理（10 ng/mL）后，通过免疫检测观察到caspase-8的p20裂解片段，6小时后达到最大值(). 增加D609浓度的预处理对解理轮廓只有轻微影响()caspase-8的活性（数据未显示）。同样，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的裂解几乎不受D609的影响()即使在TRAIL诱导的死亡降低约50%的浓度下(). 尽管Bid的裂解是由TRAIL诱导的，截短的Bid片段的出现证明了这一点，但这种裂解仅部分受到抑制磷脂酶活性的D609浓度的影响(). 因此，当磷脂酶活性被D609广泛抑制时，caspase-8的持续激活及其首选底物caspase-3和Bid的直接裂解持续存在（图。,、和).
前胱天蛋白酶-9是内在途径的顶端胱天蛋白酶，在凋亡体中被有效处理(21,28). TRAIL（10 ng/mL，持续6小时）可诱导前蛋白酶-9的裂解，如前蛋白酶带的伴随降解和p10片段的形成所示(). D609强烈抑制前半胱氨酸蛋白酶-9的裂解(). 同样，细胞色素的释放c（c）D609强烈抑制线粒体(). 因此，磷脂酶活性的抑制似乎主要影响死亡受体介导的线粒体臂凋亡。
我们的数据表明，磷脂酰胆碱降解脂肪酶活性的增强在线粒体参与之前与细胞死亡的分叉路径相交，但无法区分caspase-8和磷脂酶是并行激活还是顺序激活。为了区分这些可能性，Jurkat和HeLa细胞在用TRAIL（10 ng/mL）处理3小时之前，用泛酶抑制剂z-VAD处理。不影响TRAIL诱导的磷脂酶活性()，z-VAD抑制caspase-8裂解约6倍(). 因此，死亡受体刺激导致胞浆磷脂酶活性升高，与caspase-8的早期激活平行。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导快速生成二酰甘油和激活蛋白激酶Cδ
在证明TRAIL诱导的磷脂酰胆碱及其降解酶的变化独立于caspase-8激活发生后，我们接下来研究了磷脂酰胆碱降解的关键副产物（即DAG）参与TRAIL功能的调节。以前有报道称磷脂酰胆碱水解导致细胞内DAG的瞬时积累(45,48)它是磷脂酰胆碱-PLC的直接产物或PLD和脂质磷酸酶联合作用的副产物。此外，DAG本身可以诱导前列腺癌细胞凋亡(47). 与我们之前的结果一致（图。和)、TRAIL刺激Jurkat和HeLa细胞()诱导细胞内DAG升高2至3倍(). 我们还发现，D609以浓度依赖的方式抑制DAG的基础水平和TRAIL增强水平(). 这些结果表明，D609抑制了未经处理和TRAIL处理的细胞中DAG的代谢转换，可能是通过抑制有助于脂质稳定水平的磷脂酰胆碱降解酶来实现的。
TRAIL诱导依赖磷脂酶活性的DAG快速生成。HeLa和Jurkat细胞未经处理（0μmol/L；A类和B类)或与不同浓度的D609（B）预孵育。然后对细胞进行TRAIL（10 ng/mL）处理3小时，并按照材料和方法中的描述测量DAG含量。柱，三个独立实验的平均DAG水平，每个实验重复进行；酒吧，SD.*，P（P）<0.05，与对照细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义；**，0.05 <P（P）HeLa和Jurkat细胞的双侧Wilcoxon试验与对照未处理细胞相比<0.10，具有统计学意义。
有证据表明，PKC调节促进磷脂酰胆碱水解的磷脂酶活性，使磷脂酰胆碱和DAG稳态之间的相互关系复杂化(46,80-83). PKCδ是一个新的PKC亚家族的成员，它被DAG激活并在细胞凋亡刺激下重新定位于线粒体(46,47,80,82,84-87). 尽管不同酪氨酸残基上PKCδ的磷酸化对其在凋亡过程中的功能至关重要(83)，尚不清楚PKCδ是否响应TRAIL而激活。我们的研究表明PKCδ被激活以响应TRAIL(). 用TRAIL（10 ng/mL）处理HeLa细胞可诱导血清PKCδ磷酸化增加3-4倍643和Thr505早在治疗1小时后就明显了(). TRAIL信号传导也导致PKCδ随后重新定位到线粒体，这在TRAIL处理3小时后显著，并在6小时后达到峰值(). 这表明PKCδ在磷酸化后重新定位到线粒体。
为了证明TRAIL诱导的PKCδ的激活和重新定位是否依赖于磷脂酶活性的增加，我们接下来在TRAIL处理前用50μmol/L D609预处理HeLa细胞。我们还使用了{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“R59949”，“term_id”：“830644”，“term_text”：“R59949“}}59949兰特是DAG激酶的一种特异性抑制剂，可阻止DAG的代谢转化。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“R59949”，“term_id”：“830644”，“term_text”：“R59949“}}59949兰特使DAG的细胞水平增加，这与磷脂酶活性增加类似(85). 在50μmol/L的标准浓度下，D609和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“R59949”，“term_id”：“830644”，“term_text”：“R59949“}}59949兰特相对抑制TRAIL诱导的PKCδ向线粒体的移位().
总之，这些研究表明TRAIL信号转导诱导DAG的早期积累(45)这可能源于通过D609敏感性磷脂酶增强磷脂酰胆碱的降解。值得注意的是，PKCδ的早期磷酸化及其线粒体的重新定位伴随着DAG的升高，这是磷脂酰胆碱体内平衡的半胱天冬酶非依赖性失衡。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的蛋白激酶Cδ激活参与介导凋亡，并与死亡诱导信号复合物诱导的caspase激活协同作用
在证明TRAIL诱导PKCδ活化后，我们接下来研究PKCδ是否在介导凋亡中发挥作用。事实上，PKCδ[PKCδ（K376A）的显性负突变体的异位表达；参考文献。86]抑制用TRAIL（10 ng/mL）处理6小时的HeLa细胞中caspase-8（4倍）的处理(). 相反，野生型PKCδ在HeLa细胞中的异位表达增强了TRAIL诱导的胱天蛋白酶-8处理（5倍）和细胞凋亡(). 这些数据表明TRAIL诱导的PKCδ激活与DISC在caspase-8激活中协同作用。为了支持这种可能性，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“R59949”，“term_id”：“830644”，“term_text”：“R59949“}}59949兰特在异位表达野生型PKCδ的HeLa细胞中，也引起TRAIL诱导的胱天蛋白酶-8处理的4倍抑制().
总之，这些研究表明活化的PKCδ通过调节或微调心尖半胱天冬酶-8的裂解参与TRAIL诱导的信号传导。这种作用似乎取决于影响DAG水平的早期caspase-independent反应，这表明TRAIL信号诱导的caspase-endependent和caspase-dependent反应之间可能存在协同循环。
讨论
TRAIL因其选择性杀伤肿瘤和转化细胞而非正常细胞的能力，仍然是一种有希望的癌症治疗方法(5,7-9,15). 在此，我们研究了早期半胱天冬酶非依赖性事件在TRAIL诱导的II型细胞凋亡中的参与，II型细胞需要线粒体介导细胞死亡(16,18,23). 据认为，早期死亡受体介导的信号转导改变线粒体膜，从而启动线粒体释放细胞色素等凋亡因子c（c）(40,78,86,87). 这种启动很可能源于线粒体脂质组成的变化。事实上，我们在这里报道了TRAIL诱导线粒体脂质组成中caspase非依赖性的变化，包括心磷脂()和磷脂酰胆碱().
线粒体心磷脂生物合成与磷脂酰胆碱稳态相协调(39,40)磷脂酰胆碱体内平衡失衡会减少正常心磷脂重塑所需的酰基供体数量。这一过程实质上比心磷脂生物合成更快，需要线粒体和线粒体外酶(40). 由于成熟心磷脂的不寻常的酰基链组成，很可能只有特定种类的磷脂酰胆碱对心磷脂重塑至关重要。因此，经1小时TRAIL处理Jurkat细胞后，棕榈酰、油酰磷脂酰胆碱的选择性耗竭()提示与心磷脂重塑有关。这种消耗产生的磷脂酰胆碱失衡可能是由于磷脂酰胆碱降解酶活性增强所致，这种酶可能对2-油酰基磷脂酰胆碱物种具有特异性。
我们的研究表明，TRAIL诱导D609敏感性反应，导致心磷脂和磷脂酰胆碱耗竭，同时伴随DAG积累（图。,、和). D609以前曾被报道抑制磷脂酰胆碱-PLC(48,56,57,62,63,65,73,88,89). 最近，有人认为D609也具有抗氧化性能(68). 然而，我们的数据表明，D609的抗氧化活性似乎与观察到的效应无关（例如，对线粒体脂质的影响；). 此外，D609已被证明能抑制钙依赖性PLA2(73)和鞘磷脂合成酶(90)在一些蜂窝系统中。我们已经观察到TRAIL诱导的磷脂酶A2活性的最小变化（以及Fas诱导的变化；参见参考文献。42). 此外，鞘磷脂合成酶的激活被认为是磷脂酰胆碱-PLC活性下游的一个事件(48,57,89,90). 因此，似乎TRAIL引发的磷脂酰胆碱失衡是由多种脂肪酶活性的组合引起的(45,48,57-62). 需要进行更多的研究，以确定可能导致细胞磷脂酰胆碱在死亡受体刺激后合成和降解平衡改变的信号转导步骤。
从我们的结果可以清楚地看出，TRAIL诱导的磷脂酰胆碱降解酶的激活更直接地影响caspase-9的裂解和细胞色素c（c）比caspase-8或caspase-3裂解释放(). 这支持了磷脂酶可能主要参与死亡受体介导的凋亡分叉途径的内在（线粒体依赖性）臂的概念。然而，单靠磷脂酶不足以介导细胞凋亡，因为D609阻止脂质降解只能部分保护细胞免受死亡(). 事实上，在TRAIL（以及FasL和TNF；数据未显示）治疗6小时后，磷脂酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶似乎协同结合了它们的作用，正如D609和z-VAD在各种半胱氨酸蛋白酶和Bid的裂解中的累积效应所示。值得注意的是，最近一项基于RNA干扰的表型筛选研究揭示了调节TRAIL诱导凋亡内在途径的新蛋白(91). 根据我们的结果，我们预测这些新的凋亡效应物中的一些可能会影响线粒体脂质对磷脂酰胆碱稳态早期改变的反应。
我们还发现TRAIL诱导PKCδ磷酸化并重新定位到线粒体()DAG积累后。与这一发现一致，PKCδ的异位表达增强了TRAIL诱导的HeLa细胞caspase活化和凋亡(). 有趣的是，通过阻断下游转化或通过D609敏感脂肪酶产生DAG，抑制DAG升高，导致TRAIL诱导的PKCδ活化减少(). 这意味着DAG升高的来源不是PKC激活的基础，可能反映了细胞内信号传导的应激反应。此外，磷脂紧急停搏酶3是负责磷脂在两个线粒体膜之间移位的蛋白家族成员，最近被证明是PKCδ的靶点(86,92). 因此，PKCδ活性的增强可能通过增强其扰民酶介导的穿梭到线粒体表面来促进心磷脂的降解(86,92).
根据其他人的报告，这些研究中出现了什么(93,94)死亡受体信号在早期分叉为caspase-8介导的快速细胞执行途径，在Jurkat等许多细胞中，该途径通过释放线粒体凋亡因子而被放大。分叉的另一个分支实际上被半胱天冬酶-8抑制，导致脂质稳态的改变。在本研究中，我们首次描述了TRAIL信号中改变磷脂酰胆碱代谢的早期生化事件，磷脂酰胆碱是大多数膜的主要磷脂，也是维持心磷脂稳态所必需的。因此，在磷脂酰胆碱下游，caspase-independent arm通过改变线粒体膜的脂质组成，促进通过caspase-8介导途径激活的Bid（可能还有其他因子）的促凋亡作用，从而促进线粒体膜的特异性“启动”。当caspase-8被抑制（例如通过z-VAD）时，改变脂质稳态的caspase-非依赖性死亡信号臂成为主导。这可能导致膜细胞器（液泡、自噬体和溶酶体）的增殖，这些细胞器缓慢吞噬细胞溶质成分，从而产生自噬型细胞死亡。事实上，当磷脂酰胆碱代谢发生改变时()从磷脂酰胆碱转变为磷脂酰肌醇，可以促进代谢产物的产生，如磷脂酰肌糖醇3-磷酸，这是自噬体生物发生和成熟的基础(94).
总之，这些结果表明，TRAIL刺激可诱导影响线粒体膜的脂质代谢变化，并可通过caspase-8依赖和caspase-8-非依赖信号协同促进凋亡。TRAIL诱导的调节磷脂酶活性和促进磷脂酰胆碱和心磷脂变化的信号通路将为亲脂抗癌药物提供新的靶点，这些药物通过干扰细胞脂质代谢，可以选择性杀伤癌细胞。
致谢
拨款支持：NIH/国家心脏、肺和血液研究所向R.Khosravi-Far授予HL080192国防部DAMD 17-02-10299；R.Khosravi-Far是美国癌症学会学者。美国癌症学会研究学者奖CCG-104830（R.Khosravi-Far）、美国癌症研究所（American Institute for Cancer research）资助03-146和生物技术与生物科学研究理事会（M.D.Esposti）资助、NIH资助T32 H07893（K.Ndebele）和IARC博士后奖学金IARC/R.3159（M.Rosenquist）。
我们感谢Ohno博士的PKCδ构建，Shalini Rana的宝贵建议，Elizabeth Mundy对一些实验的贡献，以及Alex Toker博士的建议。
工具书类
1Degli sposti M.死亡或不死亡对TRAIL受体的探索。白细胞生物学杂志。1999;65:535–42.[公共医学][谷歌学者] 2LeBlanc HN，Ashkenazi A.Apo2L/TRAIL及其死亡和诱饵受体。细胞死亡不同。2003;10：66–75。[公共医学][谷歌学者] 三。MacFarlane M.TRAIL诱导信号传导和细胞凋亡。毒理学快报。2003;139:89–97.[公共医学][谷歌学者] 4Abe K，Kurakin A，Mohseni-Maybodi M，Kay B，Khosravi-Far R。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的复杂性。Ann N Y科学院。2000;926:52–63.[公共医学][谷歌学者] 5Thorburn A.死亡受体诱导的细胞杀伤。细胞信号。2004;16:139–44.[公共医学][谷歌学者] 6Golstein P.细胞死亡：TRAIL及其受体。当前生物量。1997;7:750–3.[公共医学][谷歌学者] 7Ozoren N，El-Deiry WS。正常和癌细胞中的细胞表面死亡受体信号。塞明癌症生物学。2003;13:135–47.[公共医学][谷歌学者] 8French LE，Tschopp J.选择性肿瘤死亡的TRAIL。自然医学。1999;5:146–7.[公共医学][谷歌学者] 9Ashkenazi A，Pai RC，Fong S，等。重组可溶性Apo2配体的安全性和抗肿瘤活性。临床投资杂志。1999;104:155–62. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Kayagaki N、Yamaguchi N、Nakayama M、Eto H、Okumura K、Yagita H。I型干扰素（IFNs）调节人类T细胞上肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的表达：I型IFNs抗肿瘤作用的新机制。《实验医学杂志》。1999;189:1451–60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Mackay F，Kalled SL.自身免疫中的TNF配体和受体：更新。Curr Opin免疫学。2002;14:783–90.[公共医学][谷歌学者] 12Mariani SM，Krammer PH.激活小鼠T和B细胞中TRAIL/Apo-2配体的表面表达。欧洲免疫学杂志。1998;28:1492–8.[公共医学][谷歌学者] 13Martinez LM、Alava MA、Gamen S等。APO2配体/TRAIL在Jurkat和人类外周血T细胞活化诱导死亡中的作用。欧洲免疫学杂志。1998;28:2714–25.[公共医学][谷歌学者] 14Wang S，El-Deiry WS。TRAIL与TNF家族死亡受体诱导的细胞凋亡。致癌物。2003;22:8628–33.[公共医学][谷歌学者] 15Zamai L、Ahmad M、Bennett IM、Azzoni L、Alnemri ES、Perussia B。自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性：未成熟和成熟初级人类NK细胞对TRAIL和Fas配体的差异使用。《实验医学杂志》。1998;188:2375–80. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Ozoren N，El-Deiry WS。定义I型和II型凋亡细胞对TRAIL的反应特征。肿瘤。2002;4:551–7. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Peter ME、Krammer PH.CD95（APO-1/Fas）DISC及更高版本。细胞死亡不同。2003;10:26–35.[公共医学][谷歌学者] 18Scaffidi C、Fulda S、Srinivasan A等。两种CD95（APO-1/Fas）信号通路。EMBO J。1998;17:1675–87. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Muzio M、Stockwell BR、Stennicke HR、Salvesen GS、Dixit VM。胱天蛋白酶-8激活的诱导接近模型。生物化学杂志。1998;273:2926–30.[公共医学][谷歌学者] 20Yang X，Chang HY，Baltimore D.低聚对前半胱天冬酶的自身蛋白水解激活。分子细胞。1998;1:319–25.[公共医学][谷歌学者] 21Boatright KM、Renatus M、Scott FL等。心尖半胱天冬酶激活的统一模型。分子细胞。2003;11：529–41。[公共医学][谷歌学者] 22Cory S，Adams JM。Bcl2家族：细胞生死开关的调节器。Nat Rev癌症。2002;2:647–56.[公共医学][谷歌学者] 23Khosravi-Far R，Esposti MD。死亡受体向线粒体发出信号。癌症生物治疗。2004;三:1051–7. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Wallach D、Varfolomeev EE、Malinin NL、Goltsev YV、Kovalenko AV、Boldin MP。肿瘤坏死因子受体和Fas信号机制。免疫学年度回顾。1999;17:331–67.[公共医学][谷歌学者] 25Dixit VM的Ashkenazi A。死亡受体：信号和调节。科学。1998;281:1305–8.[公共医学][谷歌学者] 26Cohen GM.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶：细胞凋亡的执行者。生物化学杂志。1997;326:1–16. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Zamzami N，Kroemer G.细胞凋亡：线粒体膜通透性-（w）洞的故事？当前生物量。2003;13：R71–3。[公共医学][谷歌学者] 28王霞。线粒体在细胞凋亡中的扩张作用。基因发育。2001;15:2922–33.[公共医学][谷歌学者] 29Martinou JC，Green DR。打破线粒体屏障。Nat Rev Mol细胞生物学。2001;2:63–7.[公共医学][谷歌学者] 30Degli-Esposti M.投标的作用。细胞凋亡。2002;7:433–40.[公共医学][谷歌学者] 31Newmeyer DD，Ferguson-Miller S.线粒体：释放生命的力量，释放死亡的机器。单元格。2003;112:481–90.[公共医学][谷歌学者] 32Luo X，Budihardjo I，Zou H，Slaughter C，Wang X.Bid，一种Bcl2相互作用蛋白，介导细胞色素c（c）线粒体释放对细胞表面死亡受体激活的反应。单元格。1998;94:481–90.[公共医学][谷歌学者] 33Li H，Zhu H，Xu CJ，Yuan J.通过caspase 8裂解BID介导Fas凋亡途径中的线粒体损伤。单元格。1998;94:491–501.[公共医学][谷歌学者] 34Gross A、Yin XM、Wang K等。半胱氨酸蛋白酶裂解BID靶向线粒体，是细胞色素所必需的c（c）而BCL-XL可以阻止这种释放，但不能阻止肿瘤坏死因子R1/Fas的死亡。生物化学杂志。1999;274:1156–63.[公共医学][谷歌学者] 35Zinkel SS、Ong CC、Ferguson DO等。促凋亡BID是髓系内环境稳定和肿瘤抑制所必需的。基因发育。2003;17:229–39. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36van Loo G、Saelens X、van Gurp M、MacFarlane M、Martin SJ、Vandenabeele P。线粒体因子在细胞凋亡中的作用：俄罗斯轮盘赌。细胞死亡不同。2002;9：1031–42。[公共医学][谷歌学者] 37Wei MC，Zong WX，Cheng EH，等。促凋亡BAX和BAK：线粒体功能障碍和死亡的必要途径。科学。2001;292：727–30。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Goonesinghe A、Mundy ES、Smith M、Khosravi-Far R、Martinou JC、Esposti MD。促凋亡投标通过将选定的溶血磷脂插入双层诱导膜扰动。生物化学杂志。2005;387:109–18. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Degli Esposti M.细胞死亡信号传导过程中的线粒体战场和膜脂质。意大利生物化学杂志。2003;52:43–50.[公共医学][谷歌学者] 40Cristea IM，Degli-Espossti M.膜脂与细胞死亡：概述。化学物理脂质。2004;129:133–60.[公共医学][谷歌学者] 41Lockshin RA，Zakeri Z.半胱氨酸蛋白酶非依赖性细胞死亡。当前操作细胞生物学。2002;14:727–33.[公共医学][谷歌学者] 42Kuwana T、Mackey MR、Perkins G等。Bid、Bax和脂质协同在线粒体外膜上形成超分子开口。单元格。2002;111:331–42.[公共医学][谷歌学者] 43Degli-Esposti M，Cristea IM，Gaskell SJ，Nakao Y，Dive C。促凋亡Bid与单核糖苷结合，这是线粒体膜与细胞死亡之间的一种新的分子联系。细胞死亡不同。2003;10:1300–9.[公共医学][谷歌学者] 44Schlame M，Rustow B.分离大鼠肝线粒体中溶血磷脂的形成和再酰化。生物化学杂志。1990年；272:589–95. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Schutze S，Berkovic D，Tomsing O，Unger C，Kronke M。肿瘤坏死因子通过磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C诱导快速生成1′2′二酰甘油。《实验医学杂志》。1991;174:975–88. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Exton JH公司。磷脂酰胆碱分解与信号转导。Biochim生物物理学报。1994;1212:26–42.[公共医学][谷歌学者] 47Garcia-Bermejo ML，Leskow FC，Fujii T，等。二酰甘油（DAG）内酯，一类新型蛋白激酶C（PKC）激动剂，通过选择性激活PKCα诱导LNCaP前列腺癌细胞凋亡生物化学杂志。2002;277:645–55.[公共医学][谷歌学者] 48Cifone MG、Roncaioli P、De Maria R等。多种途径起源于Fas/APO-1（CD95）受体：磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C和酸性鞘磷脂酶在凋亡信号传播中的顺序参与。EMBO J。1995;14:5859–68. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49LeBlanc H、Lawrence D、Varfolomeev E等。肿瘤细胞对死亡受体的抵抗通过促凋亡Bcl-2同源物Bax的突变失活诱导凋亡。自然医学。2002;8:274–81.[公共医学][谷歌学者] 50Fulda S，Meyer E，Debatin KM.通过Bcl-2过度表达抑制TRAIL诱导的凋亡。致癌物。2002;21:2283–94.[公共医学][谷歌学者] 51Ferry S、Matsuda M、Yoshida H、Hirata M.肌醇六磷酸通过激活凋亡机制以及抑制Akt/NFκB介导的细胞生存途径来阻止肿瘤细胞生长。致癌。2002;23:2031–41.[公共医学][谷歌学者] 52Ghaffari S、Jagani Z、Kitidis C、Lodish HF、Khosravi-Far R。细胞因子和BCR-ABL通过抑制叉头FOXO3a转录因子介导TRAIL诱导的凋亡抑制。美国国家科学院院刊。2003;100:6523–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 53Sorice M、Circella A、Cristea IM等。在死亡受体介导的细胞凋亡过程中，心磷脂及其代谢物从线粒体移动到其他细胞膜。细胞死亡不同。2004;11：1133–45。[公共医学][谷歌学者] 54Kluza J，Lansiaux A，Wattez N，等。丙烯酰亚胺衍生物S23906-1诱导HL-60白血病和B16黑色素瘤细胞凋亡。生物化学药理学。2002;63：1443–52。[公共医学][谷歌学者] 55Matsumura H、Shimizu Y、Ohsawa Y、Kawahara A、Uchiyama Y、Nagata S.Fas受体信号传导中的坏死死亡途径。细胞生物学杂志。2000;151:1247–56. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 56Machleidt T，Kramer B，Adam D等。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C介导的p55肿瘤坏死因子受体“死亡结构域”的功能。《实验医学杂志》。1996;184:725–33. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 57Schutze S、Potthoff K、Machleidt T、Berkovic D、Wiegmann K、Kronke M.TNF通过磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C诱导的“酸性”鞘磷脂分解激活NF-κB。单元格。1992;71:765–76.[公共医学][谷歌学者] 58Han JS，Hyun BC，Kim JH，Shin I.Fas介导的磷脂酶D激活与A20细胞中磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C的刺激相耦合。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1999;367:233–9.[公共医学][谷歌学者] 59Exton JH公司。通过鸟嘌呤核苷酸结合调节蛋白（G蛋白）和磷脂酶传递细胞信号。欧洲生物化学杂志。1997;243:10–20.[公共医学][谷歌学者] 60Simarro M、Pelassy C、Calvo J、Places L、Aussel C、Lozano F。CD5的细胞质域介导TCR/CD3依赖性和非依赖性二酰甘油的产生。免疫学杂志。1997;159:4307–15.[公共医学][谷歌学者] 61Li Y，Maher P，Schubert D.磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C调节谷氨酸诱导的神经细胞死亡。美国国家科学院院刊。1998;95:7748–53. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 62Pastorino JG、Simbula G、Yamamoto K、Glasscott PA，Jr、Rothman RJ、Farber JL。肿瘤坏死因子的细胞毒性依赖于线粒体通透性转变的诱导。生物化学杂志。1996;271:29792–8.[公共医学][谷歌学者] 63Muller-Decker K。抗病毒黄药化合物阻断TPA诱导的信号：抑制磷脂酶C型反应。生物化学与生物物理研究委员会。1989年；162:198–205.[公共医学][谷歌学者] 64Cai H，Erhardt P，Troppmair J，等。在有丝分裂信号转导过程中磷脂酰胆碱水解偶联Ras激活Raf蛋白激酶。分子细胞生物学。1993;13:7645–51. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 65Kim JH、Kim SW、Jung PJ、Yon C、Kim SC、Han JS。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C和RhoA参与促甲状腺素诱导的FRTL-5甲状腺细胞磷脂酶D的激活。分子细胞。2002;14:272–80.[公共医学][谷歌学者] 66.Hedley DW，Chow S.使用流式细胞术测量细胞谷胱甘肽含量的方法评估。细胞测定。1994;15:349–58.[公共医学][谷歌学者] 67Sebastia J、Cristofol R、Martin M、Rodriguez-Farre E、Sanfeliu C。人类神经元原代培养物和神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内谷胱甘肽含量的荧光染料评估。细胞测定。2003;51安:16–25.[公共医学][谷歌学者] 68Zhou D、Lauderback CM、Yu T、Brown SA、Butterfield DA、Thompson JS。D609作为一种有效的抗氧化剂抑制电离辐射诱导的氧化损伤。药理学实验与治疗杂志。2001;298:103–9.[公共医学][谷歌学者] 69唐斯CP，米歇尔RH.In：跨膜信号的分子机制。Cohen P，Houslay医学博士，编辑。爱思唯尔；阿姆斯特丹：1985年。第3-56页。[谷歌学者] 70Wilcoxon F.通过排名方法进行的个体比较。生物统计学公牛。1945;1:80–3. [谷歌学者] 71Glass GV、Peckham PD、Saunders JR。未能满足方差和协方差固定效应分析所依据假设的后果。Rev教育研究。1972;42:239–88. [谷歌学者] 72Perez CA，Huang L，Rong M，等。味觉受体细胞中表达的一种瞬时受体电位通道。自然神经科学。2002;5:1169–76.[公共医学][谷歌学者] 73Preuss I、Kaiser I、Gehring U。磷脂酰胆碱水解磷脂酶C的分子表征。欧洲生物化学杂志。2001;268:5081–91.[公共医学][谷歌学者] 74Rauch P、Ferri EN、Girotti S等。用于测定生物样品中胆碱和磷脂酶D活性的化学发光流量传感装置。分析生物化学。1997;245:133–40.[公共医学][谷歌学者] 75Reed JC，Kroemer G.线粒体膜通透性的机制。细胞死亡不同。2000;7:1145.[公共医学][谷歌学者] 76Sun XM、MacFarlane M、Zhuang J、Wolf BB、Green DR、Cohen GM。在受体介导和化学诱导的凋亡中启动不同的caspase级联反应。生物化学杂志。1999;274:5053–60.[公共医学][谷歌学者] 77Chang DW，Ditsworth D，Liu H，Srinivasula SM，Alnemri ES，Yang X.寡聚化是激活凋亡启动子和炎症前蛋白酶的一般机制。生物化学杂志。2003;278:16466–9.[公共医学][谷歌学者] 78Degli-Esposti M、Ferry G、Masdehors P、Boutin JA、Hickman JA、Dive C。Bid的翻译后修饰对其被caspase 8或caspase 3切割的敏感性有不同的影响。生物化学杂志。2003;278:15749–57.[公共医学][谷歌学者] 79Ozoren N，El-Deiry WS。定义I型和II型凋亡细胞对TRAIL的反应特征。肿瘤。2002;4:551–7. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 80Brodie C，Blumberg PM。蛋白激酶Cδ对细胞凋亡的调节细胞凋亡。2003;8:19–27.[公共医学][谷歌学者] 81Kikkawa U，Matsuzaki H，Yamamoto T.蛋白激酶Cδ（PKCδ）：激活机制和功能。生物化学杂志（东京）2002;132:831–9.[公共医学][谷歌学者] 82武藏M、大田S、西罗西塔N。蛋白激酶C亚型在细胞增殖和凋亡中的作用。国际血液学杂志。2000;72:12–9.[公共医学][谷歌学者] 83Sumitomo M、Ohba M、Asakuma J、Asano T、Kuroki T、Hayakawa M。蛋白激酶Cδ通过前列腺癌细胞中的线粒体信号放大神经酰胺的形成。临床投资杂志。2002;109:827–36. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 84Fukumoto S、Nishizawa Y、Hosoi M等。蛋白激酶Cδ通过抑制G1细胞周期蛋白表达。生物化学杂志。1997;272:13816–22.[公共医学][谷歌学者] 85Meinhardt G，Eppinger E，Schmidmaier R。新型蛋白激酶C活性调节剂对化疗诱导的髓系白血病细胞分化和凋亡的影响。抗癌药物。2002;13:725–33.[公共医学][谷歌学者] 86Liu J，Dai Q，Chen J，等。磷脂扰民酶3控制线粒体结构、功能和凋亡反应。Mol Cancer研究。2003;1:892–902.[公共医学][谷歌学者] 87Duan S，Hajek P，Lin C，Shin SK，Attardi G，Chomyn A.staurosporine诱导的凋亡早期线粒体外膜通透性变化和对洋地黄素的超敏反应。生物化学杂志。2003;278:1346–53.[公共医学][谷歌学者] 88Mufson RA、Gubina E、Rinaudo M、Baxter GA。磷脂酰胆碱磷脂酶C抑制剂D609阻止白细胞介素-3（IL-3）诱导的bcl-2表达，但不阻止细胞凋亡-myc公司人IL-3依赖细胞中的表达。实验细胞研究。1998;240:228–35.[公共医学][谷歌学者] 89Porn-Ares MI，Chow SC，Slotte JP，Orrenius S.黄原酸化合物D609诱导U937细胞凋亡并增强TNF-和Fas介导的凋亡。实验细胞研究。1997;235:48–54.[公共医学][谷歌学者] 90Luberto C，Hannun YA公司。鞘氨醇合酶，SV40转化期间神经酰胺和二酰甘油细胞内水平的潜在调节器。鞘磷脂合成酶能解释推测的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C吗？生物化学杂志。1998;273:14550–9.[公共医学][谷歌学者] 91Aza-Blanc P、Cooper CL、Wagner K、Batalov S、Deveraux QL、Cooke MP。通过基于RNAi的表型筛选鉴定TRAIL诱导凋亡的调节剂。分子细胞。2003;12:627–37.[公共医学][谷歌学者] 92Frasch SC、Henson PM、Kailey JM等。蛋白激酶Cδ在细胞凋亡和细胞激活过程中对磷脂超链反应酶活性的调节生物化学杂志。2000;275:23065–73.[公共医学][谷歌学者] 93Holler N、Zaru R、Micheau O等。Fas利用激酶RIP作为效应分子，触发一种替代的、caspase-8非依赖性的细胞死亡途径。国家免疫组织。2000;1:489–95.[公共医学][谷歌学者] 94Yu L，Alva A，Su H，等。半胱氨酸蛋白酶-8对ATG7-beclin 1自噬细胞死亡的调节。科学。2004;304:1500–2.[公共医学][谷歌学者] 
