美国国家科学院院刊。2010年8月31日;107(35): 15449–15454.
核心上皮-间充质转化相互作用组基因表达特征与claudin-low和化生型乳腺癌亚型相关
,a、,1 ,b、,1 ,c中,1 ,日期:,e(电子) ,(f) ,克 ,小时 ,日期:,e(电子) ,e中,(f) ,一 ,一 ,c(c) ,日期:,e、,f、,我 ,b条 ,日期:,e、,j、,2和a、,2
杰森·赫斯科维茨
b条德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子和细胞生物学系,邮编77030;
卡卡扬·科穆洛夫
c(c)德克萨斯大学安德森癌症中心系统生物学,德克萨斯州休斯顿,邮编77054;
Alicia Y.Zhou女士
d日马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142;
e(电子)麻省理工学院生物系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02142;
苏普里亚·古普塔
(f)马萨诸塞州剑桥市布罗德学院,邮编02142;
泾阳
克加利福尼亚大学药理学系,加利福尼亚州拉霍亚,92093-0636;
金伯利·哈特维尔
小时马萨诸塞州波士顿市百翰女子医院医学部,邮编02115;
Tamer T.Onder公司
d日马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142;
e(电子)麻省理工学院生物系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02142;
皮尤什·B·古普塔
e(电子)麻省理工学院生物系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02142;
(f)马萨诸塞州剑桥市布罗德学院,邮编02142;
普拉拉德·T·拉姆
c(c)德克萨斯大学安德森癌症中心系统生物学,德克萨斯州休斯顿,邮编77054;
埃里克·S·兰德
d日马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142;
e(电子)麻省理工学院生物系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02142;
(f)马萨诸塞州剑桥市布罗德学院,邮编02142;
我哈佛医学院系统生物学系,马萨诸塞州波士顿02115;和
杰弗里·罗森
b条德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子和细胞生物学系,邮编77030;
罗伯特·A·温伯格
d日马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142;
e(电子)麻省理工学院生物系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02142;
j个马萨诸塞州剑桥市路德维希分子肿瘤学中心麻省理工学院,邮编02139
Sendurai A.Mani公司
以下部门一分子病理学和
以下部门一分子病理学和
c(c)德克萨斯大学安德森癌症中心系统生物学,德克萨斯州休斯顿,邮编77054;
b条德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子和细胞生物学系,邮编77030;
d日马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142;
e(电子)麻省理工学院生物系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02142;
克加利福尼亚大学药理学系,加利福尼亚州拉霍亚,92093-0636;
小时马萨诸塞州波士顿市百翰女子医院医学部,邮编02115;
(f)马萨诸塞州剑桥市布罗德学院,邮编02142;
我哈佛医学院系统生物学系,马萨诸塞州波士顿02115;和
j个马萨诸塞州剑桥市路德维希分子肿瘤学中心麻省理工学院,邮编02139
Robert A.Weinberg供稿,2010年6月24日(2010年1月26日送审稿)
作者贡献:J.H.T.、J.I.H.、K.K.、R.A.W.和S.A.M.设计的研究;J.H.T.、J.I.H.、K.K.、A.Y.Z.、S.G.、J.Y.、P.B.G.、K.W.E.、B.G.H.和S.A.M.进行了研究;J.Y.、K.H.、T.T.O.、P.B.G.、P.T.R.、E.S.L.、J.M.R.、R.A.W.和S.A.M.贡献了新的试剂/分析工具;J.H.T.、J.I.H.、K.K.、P.B.G.、R.A.W.和S.A.M.分析数据;J.H.T.、J.I.H.、K.K.、R.A.W.和S.A.M.撰写了论文。
1J.H.T.、J.I.H.和K.K.为这项工作做出了同等贡献。
上皮-间充质转化(EMT)是一个过程,在这个过程中,粘附的上皮细胞摆脱其上皮特性,取而代之的是间充质特性,包括成纤维细胞形态、特征基因表达变化、运动潜能增加,在癌细胞的情况下,侵袭性增加,转移与化疗耐药(1,2). 最近的研究将EMT与癌症转移进展联系起来(三–5)干细胞特征的获取(6,7)这导致了这样一种假设,即经历EMT的癌细胞能够通过其获得性侵袭性转移,并且在传播后,通过其获得的自我更新潜能转移,这使得它们能够产生构成宏观转移的大细胞群。
通过将某些正常和肿瘤上皮细胞暴露于各种生长因子,包括TGF-β1、肝细胞生长因子和PDGF,可以在体外诱导EMT(1,8). 在这些生长因子及其同源受体的下游有一系列转录因子(TF),每个TF本身都能够诱导EMT。这些转录因子包括同源盒蛋白鹅膏样蛋白(Gsc)(9)、锌指蛋白Snai1(蜗牛)和Snai2(鼻涕虫)(10–12),基本螺旋-环-螺旋蛋白Twist1(Twist)(三),叉头盒蛋白FOXC1(8,13)和FOXC2(14)以及锌指、E盒结合蛋白Zeb1和Sip1(Zeb2)(8,15).
除TF外,miR-200家族的成员在EMT期间也下调(16). 这种下调反过来导致几个关键靶基因的上调表达,尤其是Zeb1和Zeb2。在适当的上皮细胞中,任何一种TF的表达或miR-200家族的下调都足以诱导EMT(17,18). 此外,许多这些TF在通过EMT的间充质细胞中同时表达。尚未充分探讨每种诱导剂对EMT计划的重叠和独特贡献。
最近的微阵列分析已允许将临床乳腺癌分层为大量不同的亚型,如管腔型、基底样和HER2+(19–21). 然而,我们和其他人最近已经描绘出了肿瘤的其他亚型(22,23). 这些区别已被证明有助于预测治疗反应、转移时间和生存率。
在本研究中,我们通过表达Gsc、蜗牛、Twist或TGF-β1或通过敲除E-cadherin的表达,检测了诱导进行EMT的人类乳腺上皮细胞(HMLE)中的基因表达特征(GES)(24)发现由这些方法诱导的EMT在基因表达中诱导了一组重叠的变化,我们称之为“EMT核心特征”。我们将EMT核心标志与定义乳腺癌亚型的特征进行了比较,发现与克劳丁-罗和化生型乳腺癌亚类型密切相关。
结果
EMT相关TF作为监管网络的相互作用。
为了阐明EMT调节因子之间的相互作用网络,我们首先评估了已知的EMT诱导物和已知在EMT过程中被调节的基因在各种乳腺癌细胞系中的表达。为此,我们检测了四种乳腺癌细胞系,以检测以下已知促进EMT的TF的表达:Gsc(9),FOXC1(8,13),FOXC2(14)、Zeb1、Zeb2(25,26),鼻塞(10,27)、蜗牛(11,28)、和扭曲(三)以及与间充质状态[N-cadherin(29)和纤维连接蛋白(30)]或上皮状态[E-钙粘蛋白(31)]. 相对于管腔上皮细胞系MCF-7、MDA-MB 231、MDA-MB435和SUM 1315,基底B细胞系持续表达较高水平的蜗牛、Slug和Zeb2,但不表达Gsc或FOXC1().
EMT标记基因在乳腺癌细胞系和非转化EMT诱导的人乳腺上皮细胞中的表达。(A类)通过对MCF-7、MDA-MB231、MDA-MB 435和SUM1315细胞提取的RNA进行半定量RT-PCR,测定EMT标记基因的表达。(B–D类)用过度表达指示基因的逆转录病毒转导HMLE细胞,并用半定量RT-PCR测定指示基因的表达(B类)或定量PCR(C类和天). GAPDH公司(C类)或U6 snoRNA(天)放大以进行归一化。误差条表示三个独立实验的SD。
为了进一步了解EMT诱导的TF之间的相互作用,我们测试了单个EMT诱导TF的过度表达如何影响该网络中其他TF的表达,从而建立“EMT相互作用组”。为此,我们使用表达高水平E-cadherin和低水平vimentin的永生化HMLE细胞,类似于MCF-7乳腺癌细胞系,并与更多间充质MDA-MB 231和SUM1315乳腺癌细胞系形成对比(图S1). 通过过度表达Gsc、蜗牛、Twist或TGF-β1诱导HMLE细胞进行EMT。然后我们使用RT-PCR来确认这些基因的表达水平,以及已知与EMT程序相关的各种基因(和图S2).
在EMT诱导的TF中,FOXC2、Slug、Zeb1和Zeb2的表达在对Gsc公司,蜗牛,扭曲,或TGF公司-β1,表明这四个基因在EMT相互作用组中的Gsc、Snail、Twist和TGF-β1下游运作(). 相反,其他EMT诱导物的过度表达并没有上调Gsc的表达,这表明Gsc是一种独立的转录调控模式().
最近的研究表明,抑制miR-200小RNA家族成员也可以诱导EMT程序(17,18,32). 我们希望确定这些miRNAs在EMT相互作用组中的位置。miR-200家族和Zeb转录因子形成相互抑制的双负反馈环(16–18,33). 与Zeb1和Zeb2在miR-200抑制中的作用一致,所有miR-200家族成员都被Gsc、蜗牛、扭曲或TGF-β1的强制表达所抑制(). 这些结果加强了以下发现:除了EMT诱导TF的相互作用外,miR-200家族microRNAs的抑制也伴随并参与了EMT计划的执行。
肿瘤发生过程中广泛接受的EMT模型表明,肿瘤微环境产生的TGF-β1通过诱导EMT诱导TFs的表达促进肿瘤进展(34). 事实上,用TGF-β1处理HMLE细胞12天可诱导EMT(14)以及一些EMT诱导TF的表达(). 我们着手确定这里是否存在另一种反馈回路,特别是通过过度表达EMT-诱导TF来诱导EMT是否反过来产生TGF-β1的表达。在本实验中,我们通过定量RT-PCR(qRT-PCR)测量了表达空载体对照、Gsc、蜗牛、Twist或TGF-β1的HMLE细胞中TGF-?mRNA的表达。在所有病例中,TGF-β1 mRNA的表达比对照细胞增加了5倍以上().
TGF-β1通过EMT诱导物上调,但不需要上调FOXC2或Slug。(A类)用过度表达指示基因的逆转录病毒转导HMLE细胞,并通过定量RT-PCR测定TGF-β1 mRNA的表达。扩增GAPDH进行归一化。(B类)用DMSO或SM16处理过表达指示基因的逆转录病毒转导的HMLE细胞,并用Western blot检测TGF-β信号抑制剂和指示蛋白的基因表达。通过密度测定法计算pSmad2/3的相对水平,并在谱带下方列出。α-肌动蛋白作为负荷对照。
因为TGF-β1足以诱导EMT,我们研究了在EMT反应中表达的TGF-α1是否以自分泌方式诱导和维持下游EMT效应器的表达,特别是FOXC2和Slug。由于已知蜗牛和扭曲可以诱导完整的EMT,包括FOXC2、Slug和TGF-β1的表达,我们使用SM16阻断这些细胞中TGF-(35). 正如预期的那样,与二甲基亚砜相比,用SM16处理表达空白对照载体、蜗牛或Twist的HMLE细胞可显著降低磷酸化SMAD2/3的水平50-90%(). 在这些条件下,蜗牛和扭曲表达细胞都没有改变FOXC2或Slug蛋白的表达(). 这一发现表明,蜗牛或Twist对EMT的诱导并不依赖TGF-β1自分泌信号,相反,蜗牛和Twist可以通过替代机制诱导FOXC2和Slug,很可能只涉及细胞内信号。
Gsc、蜗牛、扭体、TGF-β1和下调E-Cadherin诱导的EMT中GES的层次聚类。
由于EMT的各种诱导物似乎能够激活一组常见的下游效应物,我们通过确定这些TF对细胞内整体基因表达的更大影响来扩展这些比较。我们首先通过强制表达Gsc、蜗牛、Twist或TGF-β1,或通过敲除E-cadherin,获得受EMT诱导的细胞的单个GES,并对在任何EMT诱导条件下表现出至少2倍上调或下调的基因进行分类。这些分析中还包括E-cadherin实验性下调的细胞,因为我们之前已经证明这种改变也可以在这些细胞中诱导EMT(24). 然后,我们对这些GES进行层次聚类,以衡量它们的相似程度().
根据单个EMT诱导剂基因表达谱彼此的相似性以及与乳腺癌患者基因表达样本的大队列的相似性进行聚类。(A类)每个样本中基因表达谱的热图。值表示log2与控制的比率。每个热图上方的图表显示了EMT诱导剂剖面的相似性。(B类)大队列乳腺癌患者中每个EMT诱导物谱与患者肿瘤基因表达谱相关性的热图(49). 计算所有EMT诱导剂-患者对的皮尔逊相关系数,并绘制成热图,其中红色表示高度显著的正相关,绿色表示高度显著负相关,黑色表示弱相关或不存在相关。
在该分析中用于诱导EMT的五种方法中,Snail和Twist产生了最相似的GES,这与Twist是Snail转录因子的直接靶基因的事实一致(36)Gsc显示出最明显的GES()与观察结果一致,Gsc不是由蜗牛、Twist或TGF-β1的表达诱导的(). 毫不奇怪,TGF-β1的表达或E-cadherin的敲除产生的GES与蜗牛和扭曲都略有不同,这可能是因为,尽管这两种方法都诱导了EMT,但都不涉及TF的异位表达,因此可能对其下游靶点的直接影响较小。
EMT核心签名。
肿瘤微环境中产生的局部旁分泌信号似乎在诱导邻近癌细胞的EMT中起重要作用;因此,只有肿瘤内的少数细胞可能表现出进入或通过EMT的特征。这些观察结果使识别肿瘤内经历EMT的细胞群的尝试复杂化。因此,我们试图确定几种已知EMT诱导信号的共同GES。这种核心特征的建立将被证明有助于识别肿瘤内经历过EMT的小细胞子集,即使这种EMT是由目前未知的该程序诱导物诱导的。
为了确定这种特征,我们重新分析了表达Gsc、蜗牛、Twist或TGF-β1或靶向E-cadherin的siRNA的HMLE细胞基于微阵列的基因表达变化。我们确定了一个EMT核心特征,包括159个下调的基因和87个被所有这些EMT诱导信号上调至少2倍的基因(表S1). qRT-PCR验证了其中一些基因表达变化(图S3). 正如预期的那样,上皮粘附分子E-cadherin(CDH1)在所有样本中均下调,间充质标志物N-钙粘蛋白(CDH2)、波形蛋白和侵袭相关蛋白酶基质金属蛋白酶(MMP2)通常上调(表S1). 此外,Zeb1,一种能够协调EMT的转录因子,通常是上调的。
蜗牛的过度表达已被证明会下调细胞周期蛋白cyclin D2(CCND2)的表达(37)事实上,我们发现CCND2在EMT核心签名中下调。已知接受EMT的细胞对凋亡有抵抗力(38–41). 与这一发现一致,促凋亡基因BIK在所有样本中均下调。此外,在其启动子中存在Zeb1结合位点的基因在EMT下调的一组基因中富集,包括discodin域受体1基因(地址1)编码参与E-cadherin定位的RTK,并区分基底A细胞系和基底B细胞系(42–45)和卵泡抑素基因(FST公司),是TGF-β拮抗剂(表S2和第3章) (46–48).
EMT的贡献-诱导TF导致乳腺癌。
接下来,我们尝试使用各种类型乳腺癌的现有GES来揭示各种TF与乳腺癌发病机制之间的可能联系。我们试图了解单个EMT诱导物及其各自的GES与这些肿瘤的大规模(244名患者)队列中单个乳腺癌的基因表达谱的相关性(49). 来自许多肿瘤的基因表达谱与来自Gsc、蜗牛、Twist和TGF-β1的GES高度相关,但与敲除E-cadherin的信号相关性较小(). 根据之前的观察预测,与蜗牛GES高度相关的肿瘤也与扭曲GES高度关联。此外,该数据集中每个肿瘤的基因表达谱往往与来自多个EMT诱导剂的GES相关。此外,单个肿瘤的表达特征无法解决这些乳腺癌中EMT诱导的替代机制(即Twist-、Snail-、TGF-β1-或Gsc诱导的EMT)之间的差异。尽管如此,单个EMT诱导剂的GES可用于检测乳腺肿瘤中EMT的发生,即使EMT是由未知的诱导剂诱导的,并且该转分化程序仅在每个肿瘤中的少数细胞中发生激活。重要的是,肿瘤样本中的基质元素而不是癌细胞本身导致检测到间充质GES的可能性不容忽视。
EMT核心特征与基础B、Claudin-Low和元塑性特征的相关性。
我们还希望确定EMT核心特征如何与各种乳腺癌亚型的GES相关。我们比较了EMT上调或下调的基因与各种乳腺癌细胞系亚型GES的平均表达值(50)并发现EMT核心特征与来自基底B细胞系的特征密切相关(图S4). 该亚型的特征是波形蛋白高表达和干细胞样表达谱(45,50),类似于经过EMT的细胞;相反,来自基底A亚型和管腔亚型的特征(45,50) (图S4)与EMT核心签名没有密切关系。
我们还测量了EMT核心特征与源自Hennessy等人定义的乳腺癌亚型的GES的相关性(23)并对照先前使用相同微阵列平台分析的一组化生肿瘤的GES(22). EMT核心特征中的上调和下调基因在化生型和克劳丁低型乳腺癌中也显著上调和下调,但在其他乳腺癌亚型中没有上调和下调(). 这一发现与最近的报道一致,这些报道将E-cadherin低表达(表明通过EMT)与临床上遇到的claudin-low或化生亚型乳腺肿瘤联系起来(22,23). 因为通过EMT也与获得干细胞特性有关(6)这表明这些肿瘤中的肿瘤细胞含有相对较高比例的肿瘤干细胞。
核心EMT特征与化生型和克劳丁低乳腺癌相关。(A类和B类)基因表达数据绘制为EMT-up基因平均表达的方框图(A类)和EMT-down基因(B类)使用Hennessey等人(23)加上12个化生肿瘤。如Herschkowitz等人(22). 该列表是使用微阵列显著性分析得出的,并在顶部截断了约1155个探针,544个向上,611个向下。接下来,在数据集中提取基因,并在每个肿瘤中取平均值(分别向上和向下)。每个图的单因素方差分析显著性为P(P)< 0.0001.
我们还分析了编码EMT-诱导TFs的mRNA在乳腺癌中的表达,这些乳腺癌被归类为碱性HER2+、管腔型、克劳丁低型和化生型(22,23). 我们发现Snail、Slug、Zeb1、Twist1和FOXC1 TF在化生肿瘤中上调,而Zeb2在克劳丁低肿瘤中最常见上调(). 化生型和克劳丁低型肿瘤亚型均显示E-cadherin mRNA表达(CDH1)和克劳丁4显著下调(). 虽然几乎所有克劳丁低肿瘤都表达高水平的Zeb2,但只有一半的肿瘤同时表达高水平其他EMT诱导基因(蜗牛,扭曲,FOXC1系列) (). 引人注目的是,几乎所有基底样乳腺肿瘤,但不包括管腔或HER2+肿瘤中,EMT诱导剂FOXC1持续高表达,已知其与细胞运动和侵袭增加以及E-cadherin表达减少有关(13) (和图S5).
EMT诱导基因在化生和克劳丁低肿瘤中上调,FOXC1表达标志着基底样肿瘤,是不良临床预后的预测因子。(A类)提取EMT相关基因的数据,并按照Herschkowitz等人的固有亚型对样本进行排序(22). Hennessey等人的12个化生肿瘤(23)也包括在内。(B类)来自NKI和UNC数据集的患者被分为高FOXC1和低FOXC1表达者,并比较其生存率。这个P(P)使用χ生成值2平等测试。
EMT诱导因子表达与患者生存率的相关性。
我们预计,表达EMT相关基因的肿瘤将比不表达EMT相关基因的肿瘤表现出较差的生存率。因此,我们对荷兰癌症研究所(NKI)和北卡罗来纳大学(UNC)数据库中的乳腺肿瘤进行了临床预测分析(49,51),使用EMT核心签名。然而,我们发现EMT核心特征的肿瘤表达不能预测患者的生存率。
因此,我们寻求另一种假设:能够诱导EMT的单个基因的表达,而不是多基因特征,可以预测患者的生存率。尽管Gsc公司,蜗牛,扭曲,或TGF公司-β1基因不能预测临床结果,FOXC1 TF的高表达确实是不良临床结果的有力预测因子。因此,那些肿瘤表现出高水平FOXC1系列基因表达显示生存率显著降低(). 虽然FOXC1不是由Gsc、蜗牛、Twist或TGF-β1诱导的,但在永生化但非致癌的人类乳腺上皮MCF12A细胞中FOXC1的表达已被证明可诱导EMT(8,13).
最近的报道将特定基因组的表达与乳腺癌患者的化疗耐药联系起来(52,53). 使用M.D.Anderson癌症中心关于紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素和环磷酰胺新辅助化疗疗效的研究(54)我们询问病理完全应答(pCR)患者的肿瘤基因表达谱是否与EMT核心特征相关。我们发现pCR患者肿瘤的基因表达谱与EMT核心特征呈负相关,而无pCR患者的肿瘤GES与EMT中心特征呈略微正相关(图S6).
讨论
我们已经确定的EMT核心特征是通过比较Gsc、蜗牛、Twist或TGF-β1过度表达或E-cadherin水平降低引起的基因表达变化而产生的,在转录起始位点附近含有Zeb1转录因子结合位点的基因中,这种特征得到了丰富(表S2)与克劳丁低乳腺癌、化生乳腺癌以及无pCR的乳腺癌的GES最为相似。
值得注意的是,最近的一项研究表明,从正常乳腺上皮干细胞中获得的GES与claudin低信号最相似(55). 这一发现与目前的研究结果相一致,即与EMT诱导的TF相关的表达变化与claudin low和化生性乳腺癌最密切相关,也与我们早期的证明一致,即通过EMT可以获得干细胞特征(6).
对过表达EMT诱导剂的细胞中mRNA表达水平的分析表明,Twist、Snail和TGF-β1均上调Foxc2、Zeb1和Zeb2的表达(). 此外,我们证明蜗牛和扭曲产生最密切相关的GES,TGF-β1、Gsc的表达和E-钙粘蛋白的敲除产生非常独特、不太密切相关的特征。进一步探索这些不同GES之间的差异,可能会深入了解激活EMT计划所需的机制以及维持由此产生的间充质/干细胞状态所需的机理。
令人惊讶的是,尽管我们观察到EMT核心特征与化生肿瘤相关,而化生肿瘤本身与患者生存率较低相关,但我们无法观察到乳腺癌患者中EMT核心标志中的基因表达与较低生存率之间的任何关系(56). 有趣的是,Creighton等人最近的一份报告发现,来源于乳腺肿瘤起始细胞的GES也在克劳丁低肿瘤中富集,但同样也不能作为临床进展的有用预后标志物(53). 然而,他们发现传统化疗后存活下来的细胞群富含EMT相关间充质和干细胞相关肿瘤引发特征的细胞(53). 此外,Farmer等人提出EMT与化疗耐药性而非生存率之间存在关联,他们表明,基质相关GES预测接受化疗的患者的无复发生存期较短,但在未治疗的乳腺癌患者中没有预测(52). 这些发现与我们的数据一致,这些数据表明,化疗反应患者肿瘤的基因表达谱与EMT核心特征呈负相关。
使用从整个肿瘤中分离的总mRNA注释表达数据集可能会排除对经历EMT的细胞的检测,因为每个肿瘤中只有一小部分肿瘤细胞可能表现出EMT表型。因此,预后较差的肿瘤可能没有足够数量的具有间充质表型的细胞,因此对整个肿瘤的基因表达谱没有明显影响。因此,可能有必要收集肿瘤细胞岛侵袭边缘的肿瘤细胞,并对其进行分析,以检测EMT相关基因的表达,从而评估整个肿瘤的真正恶性潜能。
在这里研究的EMT诱导基因组中,在NKI和UNC数据集中,FOXC1的表达与乳腺癌患者较低的生存率密切相关(). FOXC1在化生型和基底样乳腺癌亚型中高表达()目前尚无高效治疗方法。众所周知,密切相关的FOXC2 TF在诱导EMT、促进转移以及使用免疫组织化学方法研究侵袭性基底样乳腺癌方面起着关键作用(14). 然而,在所引用的基于微阵列的乳腺癌患者分层中,FOXC2的表达与生存率无关,因为所使用的阵列不包含合适的FOXC2探针。鉴于FOXC1在基底样和化生型乳腺癌亚型中持续高水平表达,Zeb2在克劳丁低乳腺癌中的高水平表达以及FOXC2对基底样乳腺癌的作用(14)这些基因或调控这些基因的途径似乎是开发新型抗癌药物的潜在靶点。
方法
逆转录聚合酶链式反应。
通过三唑提取(Invitrogen)从培养细胞中制备RNA。使用Moloney Murine白血病病毒逆转录酶(Invitrogen)合成互补DNA。使用ddCt方法计算相对定量值(57)使用GraphPad Prism v5.0(GraphPad-Software,Inc.)用SD绘制和值。
细胞培养。
不朽HMLE的生长如前所述(58). 根据ATCC指令维护MCF-7、SUM1315和MDA-MB 231细胞。用于本研究的SUM159细胞系是从乳腺癌患者的胸腔积液中培养出来的(59). 将SUM159细胞培养在添加了5%FBS(组织培养生物制剂)、5μg/mL胰岛素和1μg/mL氢化可的松的F-12火腿(Gibco)中,37°C,5%CO2.
微阵列数据分析和沉积。
HMLE shCDH1和载体控制的微阵列数据是根据GSE9691从基因表达综合(GEO)数据库中提取的。HMLE Gsc、蜗牛、Twist、TGF-β1和病媒控制的微阵列数据已保存在GEO中,登记号为GSE9691。
为了比较不同EMT诱导剂之间的基因表达,使用至少在聚类中包含的一种情况下发生至少2倍变化的基因生成热图。为了将单个EMT特征与乳腺癌患者基因表达数据进行比较,绘制了一张热图,显示EMT诱导剂的基因表达谱与UNC队列中乳腺癌患者肿瘤的基因表达图谱之间的相关性。计算所有EMT诱导患者对的基因表达谱之间的皮尔逊相关系数。
微阵列的显著性分析。
上调和下调EMT基因的列表是使用微阵列显著性分析得出的,并在1155个探针的顶部切断,544个探针向上,611个探针向下。然后提取数据集中的基因,并在每个样本中求平均值(分别向上和向下)。进行方差分析,并使用GraphPad Prism v5.0(GraphPad Software,Inc.)绘制基因表达的箱形图。每个图的单向方差分析为P(P)< 0.0001.