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生物化学杂志。2010年4月23日；285(17): 12695–12705.
2010年2月16日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。2011年10月10日
预防性维修识别码：项目经理2857073
PMID：20159986

蛋白精氨酸甲基转移酶5使核糖体蛋白S10甲基化调节核糖体生物发生*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

金其任， 王亚庆， 梁玉恒， 张永清， 石莱堡，和徐志恒1
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关联数据

补充资料

摘要

核糖体组装的调节是细胞数量和器官大小控制的微调机制。许多核糖体蛋白质经过翻译后修饰，但它们的确切作用仍然难以捉摸。在这里，我们报道了核糖体蛋白s10（RPS10）是一种癌蛋白蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）的新底物。我们发现PRMT5与RPS10相互作用并催化其在Arg的甲基化158和Arg160残留物。RPS10在Arg的甲基化158和Arg160在核糖体的正确组装、蛋白质合成和最佳细胞增殖中发挥作用。RPS10-R158K/R160K突变体不能有效组装成核糖体，并且不稳定，容易通过蛋白酶体途径降解。在核仁中，RPS10与核磷蛋白/B23相互作用，主要集中在核糖体组装所需的颗粒组分区域。RPS10甲基化突变体与核磷蛋白/B23的相互作用较弱，不能集中在颗粒组分区域。我们的结果表明，PRMT5可能通过核糖体蛋白的甲基化调节细胞增殖，从而揭示了PRMT5在肿瘤发生中的新机制。

关键词：蛋白质甲基化，蛋白质稳定性，蛋白质-蛋白质相互作用，核糖体组装，肿瘤启动子，PRMT5，RPS10

介绍

核糖体是由rRNA和核糖体蛋白质组成的复杂大分子机器，负责合成多肽链。因此，核糖体生物发生是与细胞生长和增殖密切相关的关键过程。能够翻译mRNA的成熟核糖体的产生是一个高度协调的多步骤过程(1). 核糖体蛋白的翻译后修饰，包括磷酸化、甲基化和乙酰化，影响其特性和核糖体的生物发生。例如，核糖体蛋白S6的磷酸化增加已被证明可提高特定mRNA的翻译效率(2).

甲基化被认为是核糖体蛋白质翻译后修饰的最常见形式之一(三). 1979年的研究表明，11种核糖体蛋白可能在HeLa细胞中甲基化(4). Lhoest公司等。(5)估计自体内标记实验表明，酵母60S亚基包含约10个甲基化基团，而40S亚基有2-4个甲基化基。核糖体蛋白甲基化的模式在各种真细菌中似乎相似，但在高等真核生物中精氨酸甲基化的发生率更高(三). 核糖体蛋白S2是蛋白精氨酸甲基转移酶3（PRMT3）的第一个精氨酸甲酯化底物2(6，7). 缺乏PRMT3的酵母细胞表现出游离60S核糖体亚基的积累，导致40S:60S游离亚基比例失衡(8). 然而，其他核糖体蛋白的精氨酸甲基化，尤其是在高等真核生物中，其生物功能仍有待阐明。

蛋白质-精氨酸甲基转移酶是催化甲基转移的酶S公司-腺苷蛋氨酸合成精氨酸(9，10). PRMT分为两类。虽然I型PRMT催化形成单甲基精氨酸和不对称二甲基精氨酰（aDMA），但II型酶催化单甲基精胺酸和对称二甲基精胺酰（sDMA）。最近，越来越多的证据表明精氨酸甲基化在许多细胞过程中具有重要作用，包括RNA加工、转录调控、信号转导、DNA修复和蛋白质相互作用(9，10). 在人类中，PRMT家族已被证明含有约11种甲基转移酶，根据其一级序列和底物特异性被指定为PRMT1-11(11).

PRMT5或Skb1Hs是一种II型精氨酸甲基转移酶，最初被克隆为裂变酵母中Shk1激酶结合1（Skb1）的人类同源物(12). 后来有报道称，它与许多复合物相互作用，并参与各种细胞过程。PRMT5甲基化组蛋白H2A、H3和H4以调节基因表达(13，——15)Sm蛋白B-B′、D1和D3促进其转移到SMN复合体并促进小核核糖核蛋白的生物生成(16，——18)和SPT5调节其与RNA聚合酶II的相互作用，从而控制转录延伸(19).

近年来，PRMT5的生物学功能已被确定。我们在裂变酵母中发现，在高渗胁迫下，Skb1在调节细胞生长和极性方面起着重要作用(20). 我们还发现，植物中PRMT5的同源物SKB1在组蛋白H4R3的甲基化中起作用，并参与控制开花时间拟南芥(21). 在哺乳动物细胞中，PRMT5的过度表达诱导过度增殖，而PRMT5基因敲除抑制细胞生长和增殖(22，——24). 通过与hSWI/SNF染色质重塑蛋白BRG和BRM形成复合物，PRMT5可以促进ATP依赖性染色质重塑，并且是肌肉分化和肌生成所必需的(25，26). 更重要的是，胃癌、各种人类淋巴癌细胞和套细胞淋巴瘤临床样本中PRMT5蛋白水平升高(23，27). PRMT5还通过抑制白血病和淋巴瘤细胞中RB家族和ST7（致瘤性抑制因子7）的转录而与肿瘤发生相关(23，28). PRMT5对p53精氨酸甲基化也影响p53的靶基因特异性，PRMT5缺失触发p53依赖性凋亡(29). E-钙粘蛋白的丢失是上皮-间质转化的标志。最近的一份报告表明，PRMT5敲除导致E-cadherin表达升高，进一步表明PRMT5是一种癌蛋白(30).

在本研究中，我们确定RPS10是PRMT5的一种新型底物。PRMT5与RPS10相互作用并在两个精氨酸上甲基化158和Arg160残留物。RPS10对细胞增殖和甲基化至关重要。此外，我们在此提供证据表明，PRMT5介导的RPS10甲基化在RPS10和B23之间的相互作用、RPS10在核仁颗粒组分（GC）区域的定位以及RPS10组装成核糖体中发挥作用。

实验程序

细胞培养和转染

HEK293和U2OS细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基中培养，而肝细胞癌细胞系Bel7402在RPMI-1640中培养，补充10%胎牛血清。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行细胞转染。

抗体和化学品

β-管蛋白、FLAG抗体和FLAG-琼脂糖珠购自Sigma；来自Calbiochem的Lamin B和MG132；Upstate Biotechnology Ltd.的兔SYM11多克隆抗体。；Myc-tag单克隆抗体，来自MBL Ltd.的克隆PL14。；来自圣克鲁斯的小鼠GFP（克隆B-2）和GAPDH抗体。用纯化的人His标记RPS10作为免疫抗原，在小鼠体内制备RPS10抗血清。制备His-tagged RPS10蛋白pET-30a-RPS10型被转化为大肠杆菌，由0.4米感应米1-硫代-β异丙基-d日-吡喃半乳糖苷在25°C下过夜，并用镍-硝基三乙酸-葡萄糖（齐亚根）纯化。

质粒

这个RPS10型利用引物5′-CGGATATCGCACACATGTGATGGCTAGAAG-3′和5′-CggGATCCCTCTGGCTGACCACG-3′从人cDNA文库中扩增出该基因，并插入pcDNA3.1/Myc-His（−）B（Invitrogen）和pET-30a（+）（Novagen）的EcoRV和BamHI位点。谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合RPS10型通过PCR在pGEX-4T-2（Amersham Biosciences）中亚克隆质粒，并将其插入BamHI/SalI位点（使用的引物：5′-CGGATCACACCATGATGGCCTAAGAG-3′和5′-CCGCTGAGTTACTAGGTGGCTCGACCACG-3′）。GST融合的GAR缺失RPS10型用以下引物通过PCR构建（ΔGAR）质粒：5′-CGGGATCCACCATGTGATGGCCTAAGAG-3′和5′-ACGCGACTTTAGATTCGGTTGCTGAC-3′，并插入pGEX-4T-2的BamHI/SalI位点。GST融合的甲基化突变体RPS10型通过退火不同的合成寡核苷酸并插入pGEX-4T-2的EcoRI/SalI位点构建质粒；R158K，5′-AATTCCAGTTTAGAGGGCGTGTGGTAAG公司GGACGTGTCAGCCTCTCAGTAAC-3′和5′-TCGAGTTACTAGGTGGCTGACGCGTCCCTT公司ACCAAATCCGCTAAACTGG-3′；R160K，5′-AATTCACAGTTTAGAGGCGTGTGGA型AAG公司GGTCACCTCAGTAAC-3′和5′-TCGAGTACGTGGGCTGACCTTTC公司CACGACAAAATCCGCCTCTAAACTGG-3′；R158K/R160K，5′-AATCCAGTTTAGAGGCGTGTGGTAAG公司GGA公司AAG公司GGTCACCTCATAAC-3′和5′-TCGAGTACTAGGTGGCTGACCCTT公司TCC（变矩器离合器）CTT公司ACCAAAATCCGCCTCTAAACTGG-3′。对于WT和R158K/R160K突变结构的GFP融合，peGFP-N1结构被XhoI/BamHI消化并插入RPS10型使用引物：5′-CCGCTCGAGGCACACGATGGATGCCTAGAGAAG-3′和5′-CGGATCCCCTGAGGTGACCG-3′。对于标记了FLAG的RPS10型，通过PCR将一个FLAG标签添加到C末端，并亚克隆到pcDNA3.1的SalI位点。所用引物为：5′-CCGCTCGAGGCACGATGTGGATGCCTCTAAGA-3′和5′-ACGCGACTTACTTATCGTCCATCCTTAATCGAGGTGCTGACC-3′。FLAG标记RPS10型-在pcDNA3.1中通过点突变构建R158A/R160A质粒-RPS10型-用以下引物标记：5′-GTTAGAGGCGGATTGGCGCCGGAGCAGGTCAGCACCTCAG-3′和5′-CTGAGGCTGACCTCCGGCAAATCCCTAAAC-3′。

PRMT5项目cDNA购自Open Biosystems。准备带FLAG标签的PRMT5项目，PRMT5项目利用引物5′-CGGGATCCATGGCGGCGCGGATGGTCG-3′和5′-CCGCTCGAGGCCAATGTATGAGC-3′，通过PCR将其亚克隆到pCMV-tag 2B（Stratagene）载体中；用于GFP融合PRMT5项目构建，将相同的PCR产物克隆到peGFP-C1的BglII/SalI位点。DsRed融合B23型和Myc-taggedB23型通过PCR扩增从pET21a亚克隆构建物-B23型(47). 引物5′-GGAATTCACATGGAATCGATCGAGAGAGAGAC-3′和5′-CGGATCCAAAGAGACTTCCCACTG-3′用于PCR，并插入pDsRed-N1和pcDNA3.1 Myc-His（−）B的EcoRI/BamHI位点。对于GST融合和FLAG-标记的B23，使用引物5’-CGGAGCACATCCAGAGAGATCGATGGACTG-3′和5’-CCGTCGAGAGAGACTCCACTG3′通过PCR扩增B23。将PCR产物插入pGST-4T-1和pCMV-tag 2B的BamHI/XhoI位点。

GST和GST-RPS10融合蛋白的纯化

GST、GST-RPS10野生型和不同的突变体在大肠杆菌BL21（DE3）并按前述方法纯化(44). 用洗脱缓冲液（10 m）从珠中洗脱GST融合蛋白米三氯化氢，20 m米还原型谷胱甘肽，pH 8.0）。净化结果如所示补充图S1.

RNA干扰载体与抗siRNA的构建

如前所述制备RNA干扰质粒(48). 对于PRMT5项目选择5′-GAGAAGATTCGCAGGAACTC-3′和5′-GCTGACCACTCATATC-3′siRNA作为pNeoU6载体中的shRNA。对于RPS10型选择5′-GAGCTGCAGACAAGAAT-3′和5′-GATCATGGTGCCAAGAA-3′命名为siRPS10型-A和siRPS10型-B。将寡核苷酸退火并克隆到RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed（BD Biosciences）中。抗siRNARPS10型构建物是通过pcDNA3.1的定点突变产生的RPS10型-Myc使用QuikChange突变试剂盒（Stratagene）。

GST融合蛋白体外甲基化检测

体外在40μl甲基化缓冲液（25m）中进行甲基化反应米Tris，0.1米米EDTA，1米米苯甲基磺酰氟，50米米NaCl，pH 8.5），含有3μg底物和从转染HEK293细胞提取物中免疫纯化的FLAG-PRMT5。所有甲基化反应都是在0.42μ米[三【H】S公司-腺苷-我-蛋氨酸（GE Healthcare）。反应在30°C下进行1h，用SDS-PAGE分离，用En处理三增强TM（TM）（PerkinElmer Life Sciences），隔夜曝光。

免疫沉淀、蛋白质免疫印迹和体外结合测定

免疫沉淀、免疫印迹和在体外如前所述进行结合分析(49，50).

细胞核/细胞质分离

为了分离细胞液和核成分，细胞在转染24小时后在冰镇磷酸盐缓冲盐水中清洗，并在微型离心管中离心收集。缓冲器A（50 m米氯化钠，10米米HEPES，pH 8.0，500 m米蔗糖，1米米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米米亚精胺，0.15 m米精胺、0.2%Triton X-100和蛋白酶抑制剂）添加到细胞颗粒中并旋转。细胞核在5000×克持续2分钟；上清液作为细胞质提取物保存。用缓冲液B（50 m）清洗核芯块米氯化钠，10米米HEPES，pH 8.0，25%甘油，0.1 m米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米米亚精胺，0.15 m米精胺和蛋白酶抑制剂）。上清液被小心地取出并作为核提取物保存。

细胞增殖和拯救试验

转染后24小时，105将细胞接种到12孔板的每个孔中。在整个实验过程中，每2天更换一次培养基。对于每个样品，从三个重复孔中的每个孔中随机选择三个场，在荧光显微镜下进行计数，并每2天分别进行分析。

蛋白质半衰期测定和泛素化测定

为了测量蛋白质的半衰期，HEK293细胞被转染RPS10型-FLAG或其突变cDNA。24小时后，用100μg/ml环己酰亚胺（CHX）和10μ米MG132作用0、2、4、6和8小时。收集细胞，用抗FLAG和抗管蛋白抗体进行免疫印迹分析细胞裂解产物。对于脉冲期实验，转染后48小时，用无蛋氨酸-半胱氨酸培养基替换培养基40分钟。然后将细胞培养在新鲜的无蛋氨酸/胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中，该培养基含有10μCi/ml[35S] 甲硫氨酸（PerkinElmer Life Sciences）培养1小时。加入完全培养基（含有甲硫氨酸、半胱氨酸和胎牛血清）并孵育所需的追逐时间。用FLAG珠免疫沉淀总细胞裂解物，用10%SDS-PAGE进行分离，并通过放射自显影术进行可视化。泛素化分析如前所述进行(49).

蛋白质合成的测量

标记前，细胞在无蛋氨酸-半胱氨酸的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养30分钟。体内通过添加Trans进行代谢标记35最终浓度为50 mCi/ml的S-标签含有标记我-蛋氨酸。90分钟后，用冰镇磷酸盐缓冲盐水清洗细胞，用10%三氯乙酸沉淀，用冰凉丙酮清洗，然后真空干燥。用Bradford法测定总蛋白含量，用SDS-PAGE分离蛋白质并将其暴露于薄膜中。

图像采集与分析

转染后24h，细胞用2%甲醛溶液固定在磷酸盐缓冲液中。共聚焦图像是在徕卡TCS SP5共聚焦显微镜上拍摄的。免疫荧光图像以1042×1024帧大小、4×变焦和<1.0μm光学厚度进行扫描。调整探测器增益和放大器偏移，以确保所有信号在线性范围内正确显示。设置曝光时间，使最亮强度达到饱和强度的80%。

多聚体分离和多聚体成型

多聚体分离

转染后48小时，用100μg/ml的CHX处理细胞15分钟，然后用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（含有100μg/ml的CHX）洗涤。使用500μl多聚体裂解缓冲液（1.0%Triton X-100，20 m）制备细胞提取物米Tris，pH 7.5，50 m米KCl，10米米氯化镁2，1米米二硫苏糖醇、0.5单位/μl RNase抑制剂、100μg/ml CHX、0.2 mg/ml肝素和蛋白酶抑制剂）。在冰上培养10分钟后，在14000×克在4°C下保持15分钟。上清液在40000×克Beckman SW41Ti转子在4°C时。将颗粒重新悬浮在多聚体缓冲液中，通过SDS-PAGE分离，并通过Western blotting进行分析。用Image J 1.36b软件分析多聚体/总细胞裂解液中RPS10的比率(rsb.info.nih.gov/ij).

多聚体成型

用CHX处理细胞并如上所述进行裂解。上清液在核糖体裂解缓冲液中以5–45%（w/v）蔗糖密度梯度分层，并在摆动桶MLA-55转子中以38000×克在4°C下持续3小时。收集了含有核糖体80S、60S大亚基和40S小亚基的总层数。接下来，使用连接到紫外检测器的Biologic Duo-flow（Bio-Read）仪器，通过向上位移对梯度进行分级，以便在254 nm处进行连续吸光度测量。

结果

RPS10是PRMT5的基板

在我们研究富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）相关复合物的过程中，我们纯化了一组内源性LRRK2-相互作用蛋白。三在这一组中，我们发现了几种属于先前报道的复合物甲基体的蛋白质，包括PRMT5、MEP50（甲基体蛋白50，甲基体的支架）(31)以及PRMT5的几种底物，例如组蛋白2A和组蛋白4。这表明LRRK2相关复合物可能在蛋白质甲基化中起作用。因为富含甘氨酸和精氨酸的基序（GAR基序）是精氨酸甲基转移酶子集的保守甲基化位点，我们搜索了其他包含GAR基元的LRRK2相关蛋白并发现了RPS10。

RPS10是核糖体40S亚基复合物的成员。基于以下证据，我们假设RPS10是PRMT5的底物。首先，40S人核糖体的质谱结果表明RPS10甲基化修饰(32); 其次，对大鼠脑提取物进行了类似的质谱分析，发现了一种RPS10 C末端肽，其质量比预测的大56Da(33); 第三，87.1%的系统性红斑狼疮患者抗Sm血清（识别Sm中的sDMA）具有抗RPS10的抗体活性(34). 最后，Y12，一种特殊的对称二甲基化抗体，识别Sm的sDMA并与RPS10交叉反应(34).

为了验证我们的假设，即RPS10是PRMT5的新底物，我们首先使用交互免疫沉淀法研究RPS10和PRMT5是否相互作用。在转染细胞中，不同标记的PRMT5和RPS10蛋白共同表达，随后免疫沉淀，在RPS10和PRMT5之间检测到一种特殊的复合物(图1，A类和B类). 为了评估内源性PRMT5和RPS10是否相互作用，HEK293细胞裂解物与PRMT5及RPS10抗血清进行联合免疫沉淀和Western印迹。免疫沉淀物分析显示内源性蛋白之间有明显的相互作用(图1C类). 为了进一步表征PRMT5和RPS10之间的相互作用，我们用从HEK293细胞裂解物中纯化的FLAG-PRMT5培养纯化的GST和GST融合的RPS10。观察到GST-RPS10和FLAG-PRMT5之间的相互作用(图1D类).

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RPS10与PRMT5相互作用体内和在体外. A类和B类，RPS10与PRMT5相互作用体内用编码标签的表达载体转染HEK293细胞PRMT5项目和RPS10型如图所示。24小时后，保存小份细胞裂解物用于分析表达的标记蛋白。用FLAG-PRMT5的抗FLAG免疫沉淀剩余部分的裂解物，并分析Myc-RPS10的免疫复合物(A类). 交互共表达/免疫沉淀(IP（IP）)实验中，用抗Myc抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并检测免疫复合物中是否存在GFP-PRMT5(B类).C类，内源性PRMT5和RPS10相互作用。HEK293细胞裂解物用所示的抗RPS10或IgG抗体进行免疫沉淀。分别检测PRMT5和RPS10的免疫复合物。D类，PRMT5与RPS10相互作用在体外表达、纯化用于结合分析的GST和GST-RPS10融合蛋白，并用FLAG珠与从HEK293细胞裂解液中纯化的FLAG-PRMT5蛋白孵育。分别用GST和FLAG抗血清检测GST、GST-RPS10和FLAG-PRMT5。

在认识到RPS10在生理条件下与PRMT5相互作用后，我们接下来检查RPS10是否是PRMT5的底物。通过将免疫纯化的FLAG-PRMT5与GST-RPS10和[甲基-三【H】S公司-腺苷蛋氨酸，我们发现PRMT5可以甲基化GST-RPS10，但不能甲基化GST(图2B类). RPS10在其C末端包含几个潜在的富含甘氨酸-精氨酸（GAR）基序（Arg-Gly-Gly-Phe（RGGF）和Arg-Gly（RG））(图2A类). 为了确定RPS10中的这个区域是否为甲基化位点，我们构建了一个C末端GAR基序缺失突变体（ΔGAR）。GAR基序的去除导致PRMT5甲基化修饰的丢失(图2B类). 这表明PRMT5在其C末端GAR基序内甲基化RPS10。

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PRMT5甲基化物RPS10两者在体外和体内. A类，人类保守RG-丰富基序的比对(智人)，鼠标(小家鼠)，黑腹果蝇，秀丽隐杆线虫、和绒球裂殖酵母高度保守的残基在黑色; 弱保守残基在灰色。B类，PRMT5甲基化RPS10的C末端在体外按照“实验程序”中的描述，使用免疫纯化的FLAG-PRMT5对GST、GST-RPS10或RPS10的GAR基序缺失突变体（ΔGAR）进行甲基化，并通过SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色进行可视化(左边)和放射自显影术(正确的).C类，氩气158和Arg160RPS10中是PRMT5甲基化的残基体外试验。体外采用免疫纯化的FLAG-PRMT5对GST-RPS10、GST-RPS10ΔGAR和RPS10精氨酸单突变体或双突变体（GST-RPS-R158K、-R160K或-R158K/R160K）进行甲基化分析，如B、D类，PRMT5甲基化物RPS10体内用FLAG标记的基因转染HEK293细胞RPS10型或转速10-R158K/R160K以及PRMT5项目24 h后，用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物，用SYM11探针检测RPS10中对称二甲基精氨酸。用RPS10或RPS10-R158K/R160K的抗FLAG抗体对印迹进行了重新验证。E类，RPS10的甲基化需要PRMT5体内用FLAG转染HEK293T细胞-RPS10型与靶向荧光素酶或PRMT5项目比例为1:5。转染后48小时，用抗PRMT5抗血清进行免疫印迹分析细胞裂解物(左侧面板，GAPDH用作加载控制）。免疫沉淀物(IP（IP）)用细胞裂解物中的FLAG抗体获得的RPS10的抗FLAG抗体和RPS10中对称二甲基精氨酸的SYM11抗体进行分析(右侧面板).

RPS10C末端的GAR基序中有三个精氨酸残基，即精氨酸153，氩气158、和Arg160质谱结果显示RPS10的分子质量增加了56-Da(33)表明存在两种二甲基精氨酸。为了确定甲基化位点的准确位置，我们将潜在氨基酸单独或组合突变为赖氨酸残基。所得的RPS10的R158K和R160K突变体通过PRMT5表现出较弱的甲基化，并且R158K/R160K突变体的甲基化完全丧失(图2C类). 精氨酸158和Arg160因此，RPS10可能是PRMT5甲基化的位点。

研究RPS10甲基化是否需要PRMT5以及Arg158和Arg160RPS10的精氨酸甲基化位点体内，我们使用对称的二甲基精氨酸特异性抗体SYM11检测免疫纯化RPS10和RPS10-R158K/R160K蛋白中的甲基化精氨酸残基。如所示图2D类，SYM11抗体在WT RPS10中清楚地检测到甲基化，但在从转染的293细胞免疫纯化的RPS10（R158K/R160K）中没有检测到甲基化。然后，我们敲低了具有不同shRNA的U2OS细胞中PRMT5的表达，发现内源性RPS10的甲基化水平显著降低(图2E类). 综上所述，这些结果表明PRMT5可以在Arg下使RPS10甲基化158和Arg160二者都在体外和体内.

RPS10的甲基化是正常细胞增殖所必需的

因为有报道称一组核糖体蛋白可以调节细胞周期和细胞增殖(35，36)，我们研究了RPS10在细胞增殖中的生理作用。我们生成了两种不同的shRNA-表达结构，以敲低Bel7402细胞中内源性RPS10的表达。如所示图3，A–C，转染后2天内源性RPS10蛋白水平显著降低，转染si的细胞RPS10型构建物的生长速度比转染对照siRNA的细胞慢得多。到第5天，转染对照siRNA的细胞生长速度慢，但转染对照siRNA的细胞的生长速度慢RPS10型构造，形成殖民地(图3A类). 对于其他细胞系，包括U2OS和HEK293，也获得了类似的结果（数据未显示）。这表明RPS10是维持细胞增殖所必需的。

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RPS10通过PRMT5甲基化是正常细胞增殖所必需的。 A类和B类，RPS10是细胞增殖所必需的。pSIREN-DNR-DsRed.si荧光素酶RPS10型A、 和pSIREN-DNR-DsRed.siRPS10型B（标记为控制，标准RPS10 A、和标准RPS10 B）共同转染到Bel7402细胞中。24小时后，将细胞分裂成6孔板，并让其再生长5天。A类，转染细胞在第1天显示(顶部)和5(底部)在荧光显微镜下（×10）。B类每天在荧光显微镜下计数转染细胞数。实验重复三次，数值代表转染细胞的平均数量，是重复培养±S.E.的平均值。C类，RPS10型shRNAs可以下调内源性RPS10的表达。Bel7402细胞被转染为A类36小时后，通过使用RPS10抗血清的蛋白质印迹测定RPS10的表达。以β-微管蛋白作为负荷对照，对印迹进行再表达。D类和E类，重量RPS10型在RPS10敲除细胞中，比甲基化突变体更好地恢复细胞增殖。Myc-tagged WT和甲基化突变siRNA-resistantRPS10型(SR-WT公司和SR-R158K型/对160公里)通过改变三个核苷酸生成，如下划线的，不改变氨基酸序列(D类，下部面板). Bel7402细胞与si共转染RPS10型与控制器SR-WT或SR-R158K/R160K一起使用。36小时后，收集细胞，将一半细胞分成6孔板进行救援实验(E类).D类，内源性和外源性RPS10的表达被确定为C类每2天计数一次转染细胞数，共6天。实验重复四次，数值表示为平均值±S.E.（第4天，第页< 0.05; 第6天，第页<0.01）(E类).

为了检测RPS10的甲基化是否在增殖中起作用，我们比较了WT RPS10和RPS10甲基化突变在RPS10敲除细胞中的拯救作用。首先，我们设计了WT和甲基化突变siRNA-resistantRPS10型（销售代表-RPS10型)通过改变三个核苷酸RPS10型不改变氨基酸序列(图3D类). Bel7402细胞与si共转染RPS10型与siRNA-resistant WT或甲基化突变RPS10型。如所示图3E类，WT SR的表达式-RPS10型RPS10敲除细胞比甲基化突变SR更有效地恢复细胞增殖-RPS10型总细胞裂解物的Western blotting显示，在si中RPS10蛋白水平下调RPS10型-转染细胞和siRNA-resistant RPS10（WT或甲基化突变）的表达恢复了与对照组相似的总RPS10水平(图3D类). 因此，我们推测RPS10的甲基化在适当的细胞增殖中发挥作用。为了进一步支持这一结论，我们能够建立具有SR的永久性细胞系-RPS10型，但不适用于SR-RPS10型-R158K/R160K，在表达RPS10型shRNA(补充图S2和数据未显示）。

RPS10甲基化在RPS10有效组装成核糖体中起作用

因为RPS10的甲基化对细胞增殖很重要，我们继续通过检测RPS10组装成核糖体来研究其潜在机制。将WT RPS10或RPS10甲基化突变体转染到HEK293细胞中，并通过超速离心分离核糖体。如所示图4A类，将翻译的多聚体合并在超速离心沉淀中。正如预期的那样，所有核糖体组分中都存在内源性RPS10，包括总细胞裂解物、上清液和多聚体组分，而GFP和GAPDH仅在总细胞裂解液和上清液组分中检测到。FLAG标记的WT RPS10蛋白存在于游离细胞质组分和多聚体中，表明它可以正确组装成核糖体。

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RPS10的甲基化在RPS10高效组装成核糖体和蛋白质合成中起着重要作用。 A类如“实验程序”所述，通过超速离心分离细胞质多聚体。从转染FLAG标记WT的HEK293细胞中提取多聚体部分RPS10型或R158K/R160K突变体与pCMS一起。EGFP。使用RPS10、GFP和GAPDH特异性抗体通过Western blotting分析收集的组分。T型，S公司、和P（P）分别代表总细胞裂解物、上清液和分离的多聚体。B类，通过ImageJ软件将与多聚体相关的外源性RPS10的分数定量分析计算为多聚体中的RPS10-FLAG/多聚体内的内源性RPS10-FLAG，并用总细胞裂解物中的RPS0-FLAG或总细胞裂解液中的内源性RP S10进行归一化。数值为三个独立实验，平均值±S.E(第页< 0.05).C类，多聚体剖面。转染48小时后，转染HEK293T细胞的总提取物RPS10型shRNA与任一SR-RPS10型-Myc或甲基化突变RPS10型用超速离心法进行5～45%线性蔗糖密度梯度沉淀。线性峰值表示在254nm处的吸光度的连续测量。D类，RPS10甲基化突变导致蛋白质合成速率降低。细胞被转染为C类在转染后.48小时，将培养基换成无Met培养基，补充有[35S] 会议。标记后1h收集细胞，然后进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE凝胶用考马斯蓝染色(左边，车道1，WT SR-RPS10/RPS10 shRNA；车道2，SR-RPS10甲基化突变/RPS10 shRNA），干燥，暴露于x射线胶片35S标记蛋白质(正确的，车道3和4对应于车道1和2).E类，总蛋白质合成的定量分析D类计算为35S放射性/总蛋白（考马斯蓝染色），使用ImageJ软件。数值为三个独立的实验平均值±S.E.（*，第页< 0.01).

为了确定RPS10甲基化突变体是否与WT RPS10一样有效地组装到核糖体中，我们使用ImageJ软件分析了与多聚体相关的外源RPS10的比例。多聚体相关的外源性RPS10的百分比计算为多聚体中的RPS10-FLAG/多聚体中的内源性RPS10，并用总细胞裂解物中的RPS10-FLAG/总细胞裂解物中的内源性RPS10进行归一化(图4B类). 与核糖体相关的RPS10-R158K/R160K突变体的比例小于WT RPS10突变体(图4B类)表明RPS10甲基化突变体组装成核糖体的效率较低。

Rmt3是人类PRMT3的同源物，其特征是核糖体蛋白Rps2的甲基转移酶(21，42). RMT3-完整细胞产生非甲基化的Rps2，并显示40S:60S核糖体亚单位比率失调(21). 由于RPS10甲基化突变体组装成核糖体的效率较低，我们分析了蔗糖梯度中的核糖体谱，包括游离40S和60S核糖体亚基以及80S单体的水平，以确定核糖体生物合成是否受到影响。与酵母Prmt3被破坏的情况一样，当内源性RPS10被shRNA击倒时，细胞中RPS10-R158K/R160K的表达导致40S:60S核糖体亚基比率的扰动。这个A类254表达野生型RPS10的细胞的60S∶40S比率为2.01；这个A类254在表达突变RPS10的细胞中，三个独立实验的比率增加了约19.5%至2.40(图4C类，尖峰箭头). 这表明RPS10的甲基化突变可能导致40S:60S核糖体亚基比率的错误调节。

为了检测在表达突变RPS10的细胞中发现的核糖体亚单位失衡是否影响细胞中的整体蛋白质合成，用[35S] 蛋氨酸并在SDS-PAGE凝胶上分离。如所示图4，D类和E类，表达突变RPS10的细胞中大多数新合成的蛋白质水平低于表达WT RPS10细胞中的蛋白质水平(右侧面板，比较标记为箭头在里面车道4具有车道3)然而，总蛋白水平没有太大差异(左侧面板，比较车道1和2). 我们注意到只有一条与过度表达DsRed的大小相对应的带没有明显变化(虚线箭头). 我们的数据表明，与表达WT RPS10的细胞相比，表达突变RPS10细胞中新蛋白的生物生成较慢。

RPS10甲基化突变体与WT RPS10相比不稳定

核糖体蛋白高水平表达，不同的未组装核糖体蛋白质在核质中被降解(37). 我们注意到外源性表达的RPS10-R158K/R160K的水平始终低于WT RPS10(补充图S2和4C类). 这使我们研究了RPS10甲基化与其稳定性之间的关系。将WT RPS10和不同数量的RPS10-R158K/R160K与EGFP表达载体共转染293细胞。如所示图5A类WT RPS10的表达水平远高于突变体。EGFP显示，尽管转染的突变体数量增加了3倍，但突变体的表达量更低，转染效率更高(图5A类). 为了测试快速降解是否可以解释突变RPS10蛋白CHX（一种从头开始蛋白质合成）脉冲相实验。如所示图5B类，RPS10水平在CHX存在时下降。然而，我们发现RPS10-R158K/R160K突变体更加不稳定（通过ImageJ软件分析，RPS10-R158K/R160K的半衰期为～5小时，而WT RPS10的半衰周期约为8小时）。据报道，CHX处理会影响核糖体组装和亚单位的稳定性，因此我们使用[35S] WT RPS10和RPS10-R158K/R160K突变体定量免疫沉淀的蛋氨酸脉冲相分析，以PRMT5为对照。如所示图5D类，RPS10-R158K/R160K突变体的稳定性明显低于WT RPS10。

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RPS10甲基化突变体不如WT RPS10稳定。 A类，RPS10甲基化突变体的表达远低于WT RPS10。用FLAG标记转染HEK293细胞RPS10型，或不同数量的RPS10型-R158K/R160K，以及1μg pCMS。表皮生长因子。36小时后，使用抗FLAG抗体通过Western blotting检测RPS10的表达。以抗GFP抗体作为转染效率的对照，对印迹进行再验证。B类和C类，RPS10甲基化突变更不稳定，可以通过蛋白酶体抑制剂稳定。用FLAG标记转染HEK293细胞RPS10型或RPS10型-158K兰特/160K兰特。36小时后，用100μ米环己酰亚胺(瑞士法郎)或10μ米如图所示，在不同的时间点收集MG132和细胞。使用RPS10抗血清通过Western blotting测定RPS10的表达水平。以β-微管蛋白作为负荷对照，对印迹进行再表达。D类，用WT转染HEK293细胞RPS10型-FLAG或RPS10型-R158K/R160K-FLAG和FLAG-PRMT5项目。脉冲相位实验通过标记[35S] 甲硫氨酸处理1h，随后用含有非放射性甲硫氨酸的培养基在细胞溶解前进行追踪。用抗FLAG珠免疫沉淀WT和突变RPS10和PRMT5蛋白。35用FLA-3000荧光成像仪分析S标记的RPS10-FLAG，并以FLAG-PRMT5作为对照。E类，RPS10甲基化突变易于通过蛋白酶体途径降解。HEK293细胞与对照载体共转染(车道1和4)，RPS10型-旗帜(车道2和三)，或RPS10型-158K兰特/160K兰特(车道5和6)与Myc-tagged泛素一起。转染后36小时，用MG132处理细胞(车道4–6)如图所示。使用抗FLAG珠免疫沉淀FLAG标记的RPS10，然后进行SDS-PAGE和免疫印迹(IB公司)用抗Myc抗血清检测泛素化RPS10或RPS10-R158K/R160K。用抗FLAG抗血清重复印迹，检测RPS10和RPS10-R158R/K160K。

许多核糖体蛋白质以蛋白酶体依赖的方式降解(37). 为了确定RPS10是否也通过蛋白酶体途径降解，我们分析了蛋白酶体抑制剂MG132对RPS10降解的影响。如所示图5C类MG132存在时，WT RPS10和RPS10-R158K/R160K均迅速积累。为了进一步研究RPS10的表达是否受到泛素化的调控RPS10型甲基化突变体与Myc-tagged泛素共同转染HEK293细胞。免疫沉淀RPS10并分析其泛素化水平。我们检测到RPS10以上的高分子量涂片，经MG132治疗后其强度显著增强(图5E类，车道2与车道5). RPS10甲基化突变的泛素化比WT更明显RPS10型尤其是在MG132在场的情况下(图5E类，车道5与车道6). 总之，我们的结果表明RPS10甲基化突变不太稳定，容易通过蛋白酶体途径降解。

RPS10的甲基化是其在核苷酸GC区富集所必需的

核糖体的生物发生发生在核仁中，核仁是细胞核内的一个专门的隔室。每个核仁包含三种形态上不同的成分，反映了核糖体的生成过程。前rRNA的合成、修饰和初始裂解发生在纤维组分和周围致密纤维组分内，而核糖体的后期加工步骤和组装则发生在GC区域内(38).

我们通过免疫染色确定了RPS10在Bel7402永久性细胞系（稳定表达RPS10-Myc）中的定位，并期望它像其他核糖体蛋白一样定位在核仁中(39).RPS10型-Myc定位于细胞核中，主要聚集在与核仁相对应的结构中(补充图S3). 还发现了较弱的弥漫性细胞质染色。RPS10在稳定细胞系中的环状亚细胞定位与NPM/B23（核仁GC区的一个众所周知的标记）相对应，并且与瞬时转染细胞中融合到GFP的RPS10非常相似(补充图S4和数据未显示）。这使我们通过联合转染来测试RPS10是否集中在核仁的GC区域B23型无论是哪一种RPS10型或RPS10-R158K/R160K型进入U2OS单元。我们发现57%的WT RPS10主要与B23共定位，表明RPS10集中在GC区域(图6，A类和E类). 令我们惊讶的是，在任何细胞中都没有发现RPS10-R158K/R160K与B23的共定位。相反，它的信号在核仁区域而不是GC区域内增强(图6，B类和E类). 为了进一步定义RPS10的位置，重量RPS10和RPS10-R158K型/16万兰特与共转染纤维素酶分别进行。如所示图6，C类和D类，突变体RPS10，而不是WT RPS10与纤维素酶这些结果表明RPS10在核仁的GC区富集，RPS10的甲基化是其在核仁GC区富集所必需的。

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RPS10的甲基化是其在核仁GC区的浓度所必需的。 A类和B类WT RPS10和RPS10甲基化突变体的亚核定位差异。RPS10型-GFP公司(A类)和RPS10型-R158K/R160K-GFP(B类)与B23-DsRed共转染U2OS细胞，24小时后固定。RPS10型(绿色)和B23(红色)共聚焦显微镜下观察。指示区域的高放大率(正方形)显示在底部。酒吧，5微米。这个图对应于以任意单位表示的强度绿色和红色中通过轴绘制的线的每个像素的标签A类和B类分别是。C类和D类，RPS10型-GFP公司(C类)，RPS10型-R158K/R160K-GFP(D类)、和纤维素酶-DsRed被转染并分析为A类和B.工程WT RPS10和甲基化突变在核仁中的不同分布。GFP标记RPS10型和RPS10型-R158K/R160K与B23-DsRed或纤维素酶-DsRed进入U2OS细胞，24小时后固定，观察如下A类和C类RPS10被归类为与B23共定位时的GC区域定位或致密纤维成分(贴现现金流)/纤维成分(常设费用)与共同本地化时纤维蛋白每个类别分析100个细胞。F类，更多RPS10型-R158K/R160K倾向于留在细胞核中。用FLAG标记的WT或甲基化突变体RPS10转染HEK293细胞。转染24h后，分离细胞质和细胞核成分。总裂解物中RPS10的WT和突变形式(T型)，胞质溶胶(C类)、和核能(N个)用抗FLAG抗体进行Western blot分析。Lamin B和GAPDH分别用作核和细胞质组分的标记。

由于RPS10的甲基化是其在核仁GC区的浓度所必需的，并且在RPS10组装成核糖体中发挥作用，我们继续研究RPS10在整个细胞中的分布，特别是其向胞浆的输出是否受到甲基化的影响。重量RPS10型和RPS10-R158K型/1.6万兰特转染HEK293细胞。48小时后分离并分析细胞核和细胞质部分。使用拉明B作为标记，图6F类表明核部分中存在更多RPS10-R158K/R160K突变。因此，我们的研究结果表明，RPS10的甲基化在其在核仁GC区的位置中发挥作用，也可能在其从细胞核到胞质溶胶的运输中发挥作用。

RPS10甲基化突变体与B23的结合降低

B23/NPM，也称为Numatrin1，在核糖体的加工和/或组装中起着关键作用(40). B23的伴侣性质可能是这一过程的关键，因为它可以防止蛋白质聚集，并选择性地储存核糖体蛋白质的子集以促进核糖体的生物生成(41，45). RPS10与B23的共同定位使我们确定RPS10是否与B23相互作用。利用标记物转染细胞的裂解物进行双向免疫共沉淀分析B23型和/或RPS10型进行并确认RPS10和B23之间的特定相互作用(图7，A类和B类). 为了评估内源性RPS10和B23是否相互作用，对HEK293细胞裂解物进行免疫共沉淀和免疫印迹（Western blotting）以及RPS10与B23抗血清。免疫沉淀物分析显示内源性蛋白之间有明显的相互作用(图7C类). 为了确定B23和RPS10之间的相互作用是直接的还是间接的，GST下拉分析使用B23和RP S10从大肠杆菌被雇佣。如所示图7D类GST-B23（而非GST）可以下拉His-tagged RPS10，表明RPS10与B23直接交互。

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RPS10甲基化突变体与B23的结合减少。 A类和B类，RPS10与B23交互体内用FLAG或Myc-tagged转染HEK293细胞RPS10型和B23型如图所示。24小时后，用抗FLAG珠免疫沉淀细胞裂解物，并分析免疫复合物的Myc-tagged RPS10或B23。C类内源性B23和RPS10相互作用。抗RPS10小鼠血清用于免疫沉淀(IP（IP）)以小鼠IgG作为对照，从HEK293细胞提取物中提取B23。细胞裂解(下部面板)和免疫复合物(上部面板)分别探测内源性B23和RPS10。D类，RPS10与B23交互在体外表达GST、GST-B23融合蛋白和His-RPS10用于结合分析，纯化自大肠杆菌相互孵化。分别用GST和His抗血清检测GST、GST-B23和His-RPS10。E类，RPS10甲基化突变体与B23的结合减少。用FLAG标记的B23和Myc-tagged基因转染HEK293细胞RPS10型或RPS10型-R158R/K160K。金额RPS10型-用于转染的R158K/R160K加倍，使其表达水平与WT RPS10相似。24小时后，分析细胞裂解物中标记蛋白的表达(下部面板). 用抗FLAG抗体免疫沉淀剩余部分的裂解物，并用抗Myc抗体分析RPS10或RPS10-R158K/R160K的免疫复合物。F类RPS10甲基化突变体与内源性B23的结合减少。带有Myc标记的HEK293细胞RPS10型或RPS10型-158K兰特/160K兰特。RPS10-R158K/R160K的用量增加了三倍。用抗B23抗体免疫沉淀细胞裂解物，并分析RPS10或RPS10-R158K/R160K与抗Myc抗体和B23与抗B23血清的免疫复合物。

我们在上文中表明，大多数WT RPS10与B23在核仁中共定位，RPS10甲基化突变体没有这样做。因此，我们使用共免疫沉淀分析来研究B23与WT和RPS10的甲基化突变之间的相互作用是否存在差异。值得注意的是，RPS10-R158K/R160K与过度表达或内源性B23之间的相互作用弱于WT RPS10与过度表达的或内源性的B23之间(图7，E类和F类). 综上所述，这些结果表明RPS10是一种新的B23结合蛋白，RPS10的甲基化突变导致与B23的结合减少，因此可以解释为什么RPS10甲基化突变未能在核仁GC区与B23/NPM共存。

讨论

RPS10是PRMT5的新型基板

核糖体蛋白的精氨酸甲基化在原核生物和真核生物中很常见。虽然一些甲基化的核糖体蛋白已经被鉴定出来，但这种甲基化的生物学意义仍不清楚(43).

在本研究中，我们发现RPS10与PRMT5相互作用体内和在体外它是PRMT5的新型基底。使用shRNA的敲除实验表明，PRMT5在RPS10的甲基化中起作用。因为尽管PRMT5被有效敲除，但RPS10甲基化水平的降低并不显著(图2E类)，RPS10也可能被其他PRMT家族成员甲基化。RPS10中的甲基化位点被鉴定为Arg158和精氨酸160.

RPS10甲基化在核糖体生物发生和蛋白质合成中的作用

核糖体蛋白质组装在核仁中，尤其是GC区域，以构建核糖体(38). 然后作为核糖体亚单位输出到细胞质中。核糖体蛋白转录后修饰在这一过程中的作用尚不清楚。

我们发现，WT RPS10在核仁的GC区域富集，而甲基化突变体没有富集。这至少部分解释了为什么RPS10的甲基化突变型没有像WT RPS10那样有效地组装到核糖体中。RPS10的甲基化可能促进其与B23的相互作用及其在GC区域的富集。然而，RPS10的甲基化也有可能诱导RPS10定位到GC区域，并促进其与那里的B23的相互作用。

有趣的是，RPS10的甲基化在RPS10组装成核糖体中起到了作用。这对核糖体的生物发生也很重要，因为RPS10的突变导致40S:60S核糖体亚基比率的错误调节和蛋白质合成的次优。这可以解释为什么用shRNA敲低RPS10的表达几乎完全阻止了细胞增殖，而WT RPS10可以挽救细胞增殖，但RPS10甲基化突变可以在较小程度上挽救细胞增殖。

以前的研究表明，未组装的核糖体蛋白质降解速度很快，而核糖体相关核糖体蛋白的细胞质池相对稳定(37). 这可能解释了为什么RPS10甲基化突变体没有组装成核糖体并有效地输出到细胞质中，不如WT RPS10稳定，并且以蛋白酶体依赖的方式降解得更快。

PRMT5、RPS10甲基化与肿瘤发生

PRMT5和核糖体活性与细胞增殖和肿瘤发生密切相关(1，22，23). 与PRMT5一样，B23也参与多种形式的肿瘤(40，41). 我们的发现支持一种模型，即PRMT5可能通过RPS10的甲基化调节细胞生长。PRMT5对RPS10的甲基化可能在其与B23的相互作用、蛋白质稳定性、定位于核仁的GC区域以及有效组装成核糖体方面发挥作用。

未来研究PRMT5是否通过调节核糖体组装和蛋白质合成来控制细胞增殖将是一件有趣的事情。越来越多的证据表明，一些蛋白质可以被I型和II型PRMT甲基化。因此，同一蛋白质的aDMA和sDMA甲基化可能会导致不同且可能相反的生物学后果。因此，研究除PRMT5外，其他PRMT家族成员是否在不同核糖体蛋白的甲基化、定位和组装以及细胞增殖的调节中发挥作用，将是一件有趣的事情。

PRMT5、RPS10甲基化与系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮（SLE）的特征是存在细胞成分的循环自身抗体。其中，在30%以上的SLE患者中发现抗Sm抗体，并将其用作SLE的诊断标记(46). 我们的结果表明，RPS10被PRMT5二甲基化，其他人报告称，在11%的SLE患者和31%的活动性SLE患者的血清中发现了抗RPS10抗体。在SLE患者的抗Sm血清中发现了高频率的RPS10抗体活性（87.1%）。这些患者往往处于SLE的活动期(34). 更有趣的是，Sm和RPS10中RG基序的sDMA是被识别的主要位点。这又提出了一个问题：对称二甲基化Sm和RPS10在SLE中的确切作用是什么？PRMT5以前曾被证明在Sm蛋白的RG基序中产生sDMA(17)在本研究中，RPS10中。除了研究PRMT5与肿瘤发生的关系外，未来还将研究PRMT4是否也与SLE相关。

补充材料

补充数据：

致谢

我们感谢L.Greene博士、J.Zhang、C.Yang和X.Huang博士在编写本手稿期间提出的意见和建议。

*这项工作得到了中国科学技术部“973”计划（2007CB947202/2006CB500701）、“863”项目（2006AA02Z173/Z140）和2009DFA32450的部分支持；国家科学基金项目（30970580/30725007/30670663/30870527/30670479）；和中国科学院（百人计划和KSCX1-YW-R-62/84）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1–S4.

三任勇军、王毅、梁毅、张毅、鲍绍、徐振中，手稿正在编写中。

2使用的缩写如下：

项目管理团队
蛋白精氨酸甲基转移酶
自动存取存储器
不对称二甲基精氨酸
sDMA（码分多址）
对称二甲基精氨酸
GC公司
粒状组分
GFP公司
绿色荧光蛋白
GAPDH公司
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
消费税
谷胱甘肽S公司-转移酶
重量
野生型
LRRK2型
富含亮氨酸重复激酶2
小核糖核酸
小干扰RNA
瑞士法郎
环己酰亚胺
SLE公司
系统性红斑狼疮
shRNA
短发夹RNA
EGFP公司
增强型绿色荧光蛋白
Ds红色
盘状体sp.红色。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会