I型干扰素通过对非造血细胞的作用控制基孔肯亚病毒

摘要

印度洋上的一个岛屿La Réunion岛，人口约785000人，爆发了基孔肯雅热，一种由蚊子传播的虫媒病毒疾病。2005-2006年，估计累计有300000例(Simon等人，2006年;Schuffenecker等人，2006年;Gérardin等人，2008年). 疫情涉及印度，据估计，印度感染人数接近600万，疫情出现在意大利(Mavalankar等人，2007年;沃森，2007)，东南亚存在持续感染(Ng等人，2009年). 1952-1953年在东非的一次疫情中首次发现了这种疾病。病原体基孔肯亚病毒（CHIKV）是多哥病毒科科，属阿尔法病毒(约翰斯顿和彼得斯，1996年)，是被包裹的单链正性RNA病毒。在人类中，CHIKV通常在感染后2–7天引发症状，其特征是快速发热（最高温度为39–40°C）、严重关节痛和肌痛，随后出现体质症状（头痛、畏光、恶心和腹痛）和皮疹(Bodenmann和Genton，2006年;Borgherini等人，2007年). 据报道，病毒血症在症状出现后第2天达到高峰，在第3天和第4天急剧下降，到第5天无法检测到(Carey等人，1969年). 基于高亲和力中和抗体进化前病毒血症急剧下降(Carey等人，1969年)，我们假设I型干扰素介导这种快速抗病毒反应。

IFN是由Alick Isaacs和Jean Lindemann于1957年发现的一种具有抗病毒活性的未定义物质。过去几十年的工作将这种抗病毒物质定义为I型干扰素（IFN-α/β），将其与II型干扰物（IFN-γ）和最近描述的III型干扰民（IFN-λ；Sheppard等人，2003年). 白细胞是IFN-α的主要产生者，成纤维细胞是IFN-β的主要生成者。存在各种IFN-α亚型（至少13种；van Pesch等人，2004年)但只存在一种IFN-β亚型；然而，所有人都使用单个干扰素-α/β受体（IFNAR），这些多亚型的功能意义尚不清楚。有趣的是，在20世纪60年代和70年代，CHIKV被用于刺激鸡胚成纤维细胞样细胞产生干扰素(弗里德曼，1964年;瓦格纳，1964年). 这些是在当前疫情之前，在IFN途径的背景下评估CHIKV的最后几篇著名的科学文章。

宿主免疫反应，尤其是干扰素的产生，是由被称为模式再认知受体（PRR）的受体参与触发的。类Toll受体（TLR）和RNA解旋酶（称为RIG-I类受体[RLR]）代表哺乳动物中的两类PRR。这两种类型的PRR通过识别被称为病原体相关分子模式（PAMP）的保守分子基序来感知入侵的病原体，在先天免疫的启动中都具有重要作用，该分子基序包括表面糖蛋白、单链RNA（ssRNA）或双链RNA（dsRNA）等结构，和非甲基化CpG DNA。TLR由11个跨膜蛋白组成，其中6个与抗病毒免疫有关（TLR-2、-3、-4、-7、-8和-9）。据报道，病毒表面糖蛋白（如麻疹病毒的血凝素蛋白）是TLR2和TLR4的激动剂(Kurt-Jones等人，2000年;Bieback等人，2002年;Rassa等人，2002年;Compton等人，2003年). ssRNA病毒（例如流感）触发TLR7和TLR8信号(Diebold等人，2004年)而细胞外dsRNA被TLR3识别(Alexopoulou等人，2001年)，并且含有非甲基化CpG的DNA病毒（例如单纯疱疹病毒）可能激活TLR9(Krug等人，2004年). 在本文中，我们将这些受体称为细胞外传感器，因为激动剂结合域在拓扑上朝向内体的细胞外空间或内腔。细胞内传感器家族包括RNA解旋酶Mda5（黑色素瘤分化相关基因5）和RIG-I（维甲酸诱导基因I），它们都通过Cardif（也称为IPS-1、Visa和MAVS；卡瓦伊和阿基拉，2006年). 由于CHIKV是一种ssRNA病毒，可能与dsRNA中间体复制，我们预测TLR7和/或TLR3参与。令我们惊讶的是，我们的结果表明CHIKV并不直接激活表达这些受体的造血细胞。相反，直接感染和心脏依赖性途径的参与似乎对启动宿主对CHIKV的反应至关重要。此外，我们还发现了MyD88介导的第二条传感器通路的证据，该通路在控制病毒传播方面起着重要作用。

关于I型干扰素在疾病发病机制和病毒感染控制中的作用，已有一些病毒表明IFNAR的表达对其至关重要。这些病毒包括DNA（如γHV68和MCMV）、dsRNA（如呼肠孤病毒）、阳性ssRNA（如塞姆利基森林病毒[SFV]）和阴性ssRNA（例如VSV）病毒(Müller等人，1994年;Aricó等人，2004年;Johansson等人，2007年). 也就是说，即使没有IFNAR信号，包括VV和LCMV在内的许多病毒也可以被控制(Müller等人，1994年). 尽管如此，在感染不是致命的情况下，I型干扰素在协调抗病毒免疫反应和IFNAR中发挥作用^−/−小鼠感染更严重，组织病理学更严重(Müller等人，1994年;Havenar-Daughton等人，2006年). 尽管在我们的知识中存在许多差距，但值得注意的是，在某些情况下，I型干扰素主要通过具有直接抗病毒活性的干扰素刺激基因（ISG）发挥作用，而对于其他感染，它们的主要作用是刺激体液和细胞免疫。我们的研究表明，CHIKV严重依赖于I型干扰素对非造血细胞的作用，因此可能通过诱导一个或多个ISG发挥直接抗病毒作用。本研究首次详细介绍了干扰素-α/β在CHIKV复发发病机制中的作用。

结果

CHIKV感染导致高水平的I型干扰素，但不能直接触发造血细胞产生

为了确定CHIKV感染诱导I型干扰素的作用，我们分析了2005-2006年拉留尼旺疫情期间招募的患者队列的血清。事实上，在感染者的血清中检测到高水平的IFN-α，其浓度与病毒载量相关(图1 A). 值得注意的是，感染者的IFN-γ血浆浓度与对照组没有统计学差异（未发表的数据）。因此，我们研究了感染期间产生I型干扰素的机制。获得了CHIKV的初步分离株并测定了其基因组序列(Schuffenecker等人，2006年). 本研究中提出了一个具有代表性的分离物CHIKV-21。为了避免实验室适应，病毒在C6/36蚊子细胞中仅扩增两次，并通过BHK细胞上的噬斑分析进行滴定。

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图1。

CHIKV在人体内诱导IFN-α/β，但不能刺激造血细胞的产生。（A） 患者血清样本取自同意感染CHIKV的成年人（年龄=16–86岁；n个=25）和年龄匹配的对照组（年龄范围=16-89岁；n个= 17). 用luminex监测IFN-α，并绘制病毒载量的函数图，用定量PCR测定。虚线表示，对照人群的平均IFN-α血清浓度为179 pg/ml。实线表示患者中病毒载量和IFN-α之间的线性回归。（B） 单核细胞衍生树突状细胞来自健康捐赠者，10个⁵未成熟DC（iDC）或成熟DC（mDC）暴露于CHIKV。并联，3×10⁴新分离的pDC或10⁶用CHIKV培养PBMC。在所示的实验中，10⁶使用PFU/ml，培养细胞40 h。通过报告试验分析培养上清液中IFN-α/β的产生，该报告试验涉及IFNAR表达细胞系HL-116，该细胞系稳定转染了编码IFN-诱导荧光素酶基因的质粒（检测限为5 IFN U/ml）。50例HAU流感A/PR8或50µg/ml poly I:C用作阳性对照。三个不同捐赠者的结果相同。在单核细胞来源的巨噬细胞中也发现了类似的结果（未描述）。（C和D）增加MOI时感染人包皮成纤维细胞（黑色）或MRC-5细胞系（白色）并培养48 h。收集细胞，用抗CHIKV单克隆抗体进行细胞内染色，并用FACS（C）进行分析。同时，用Elisa分析培养上清液中的干扰素-β（检测限，20 pg/ml；D）。误差条表示SD。数据代表五个实验。

人类浆细胞样树突状细胞（pDC）是I型干扰素的强大来源(Siegal等人，1999年). 此外，已有研究表明，常规DC（cDC）可能表达高水平的IFN-α/β(Diebold等人，2003年). 为了测试CHIKV在这些细胞类型中直接触发I型干扰素产生的能力，我们生成了未成熟和成熟的单核细胞衍生人类cDC，并根据其BDCA-4的表达从PBMC中分离出pDC。此外，我们测试了普通PBMC以评估其他细胞群（例如单核细胞）。细胞暴露于10⁶PFU CHIKV（感染多重性范围10-50[MOI]）持续24或40小时，并评估培养上清液中是否存在I型干扰素。令我们惊讶的是，我们没有检测到IFN-α（9/15个测试亚型）或IFN-β（未公布的数据）。这些数据通过对IFNAR信号敏感的报告分析在功能上得到了证实(图1 B). 作为阳性对照，将pDC中已知TLR7激动剂a/PR8流感病毒或cDC中已知的TLR3激动剂poly I:C添加到细胞培养物中。总之，这些结果表明，尽管IFN是在CHIKV疾病发病过程中产生的，但造血细胞不会直接受到CHIKV的刺激而产生IFN-α/β。尽管这些观察结果可以解释为这些细胞未能有效感染的结果(Sourissau等人，2007年)，应该注意的是，pDC能够在没有直接感染的情况下产生IFN(Dalod等人，2003年).

考虑到直接感染的需要，我们接下来评估了人类成纤维细胞，它们是CHIKV感染的已知靶点(Sourissau等人，2007年;Couderc等人，2008年)，因为它们能够产生干扰素-α/β。原代人包皮成纤维细胞和MRC-5在低MOI时均易感染(图1 C)与诱导高水平IFN-β相关(图1D). 小鼠造血细胞也获得了类似的结果，这些细胞不能被直接感染，也不产生I型干扰素，而小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）对感染敏感，并产生大量的干扰素-β（未描述）。

通过STAT1信号通路作用的I型干扰素对控制CHIKV至关重要

为了更好地确定干扰素在控制CHIKV中的作用，并确定产生干扰素的病毒传感器，我们建立了CHIKV感染小鼠模型。使用IFNAR^−/−在C57BL/6株小鼠上，可以证明IFNAR信号在控制CHIKV中的关键作用。值得注意的是，10²皮内注射PFU（ID）足以杀死IFNAR^−/−感染后2.5至4天的小鼠(图2 A). 注入10⁶PFU导致了更快的死亡，所有动物在第2天到第3天都死于感染。与在高病毒血症人群中观察到的情况类似(图1 A;Laurent等人，2007年)IFNAR中的病毒载量^−/−感染10只小鼠⁶感染后第2天的PFU>10⁸组织培养感染剂量50（TCID₅₀)/ml（未描述）。相反，WT动物在所有测试时间点都用检测不到的血清病毒滴度清除了感染。这些数据与IFNAR报告的数据类似^−/−129株小鼠(Couderc等人，2008年).

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图2。

CHIKV感染的IFNAR^−/−小鼠产生高水平的I型干扰素。（A） C57BL/6 IFNAR公司^−/−小鼠感染ID 10²PFU或10⁶PFU CHIKV。每天两次评估生存率，绘制Kaplan-Meier生存曲线(n个= 5). （B） STAT1（状态1）^−/−，定子4^−/−和STAT6^−/−(n个=5）小鼠，以及具有相似菌株背景的相应WT小鼠，用10⁶PFU CHIKV。每天评估两次生存率，绘制Kaplan-Meier生存曲线。（C和D）WT和IFNAR^−/−小鼠感染了10只⁶在感染后第2天监测PFU CHIKV和血清IFN-β和IFN-α浓度。每个点代表一个单独的鼠标，水平条代表平均值。所示数据来自两个独立的实验。

接下来，我们使用STAT1^−/−，状态4^−/−和STAT6^−/−小鼠，证明STAT1对清除CHIKV至关重要(图2 B). 这些数据表明，典型的STAT1/2异二聚体负责传递来自IFNAR的信号以控制CHIKV感染。与I型干扰素的关键作用相反，缺乏干扰素-γ的小鼠在第2天不会出现病毒血症，并成功清除了CHIKV感染（未公布的数据）。尽管这些数据表明I型干扰素具有关键作用，但在感染后3、6、9、24、48、72和96小时的时间过程中，在野生动物的血清中未检测到干扰素-α/β蛋白。与此形成鲜明对比的是，我们在两个IFNAR中都观察到高水平的IFN-β和IFN-α^−/−和STAT1^−/−动物(图2、C和D; 且未描述）。这些结果可能反映了无法通过IFNAR发出信号的动物体内的高病毒载量，而不是WT动物体内CHIKV的快速清除。

局部产生I型干扰素可防止病毒在WT小鼠中传播

为了进一步了解WT小鼠如何控制CHIKV传播，我们调查了注射部位。将表达GFP的重组CHIKV注射到耳朵中，24小时后，解剖注射部位并进行免疫组织荧光分析。我们在注射的皮肤内层皮脂腺、血管和软骨中观察到GFP阳性细胞(图3 A). 由于GFP在我们使用的结构中没有并入病毒(Vanlandingham等人，2005年)GFP检测提供了病毒复制的直接证据。

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图3。

I型干扰素的本地生产控制了WT动物中的病毒传播。（A） 将表达GFP的CHIKV注射给WT小鼠。在感染后第1天，在注射部位（耳朵）的皮肤上进行免疫荧光检测。细胞核用DAPI（蓝色）染色，用抗GFP单克隆抗体（绿色）检测复制病毒。棒材，50µm。（B） 在感染后3、8、24和48小时从感染部位分离出mRNA。进行RT和IFN-β、IFN-α₂，干扰素-α₄，并通过定量PCR测定Mx-1mRNA的表达。单个小鼠用点表示，横条表示平均值。所提出的实验是三个独立实验的代表。（C） 与B组一样，在不同时间从感染皮肤中分离出总RNA，并评估病毒载量。绘制了三个独立实验的数据，以显示病毒RNA随时间的变化。代表单个小鼠。

为了确定局部感染是否触发了局部免疫反应，我们对从注射部位提取的信使RNA（mRNA）进行了定量RT-PCR分析。事实上，我们观察到干扰素β和干扰素α的爆发₄在感染后24小时达到峰值(图3 B). 此外，我们观察到IFN-α的诱导₂和IFN应答基因Mx1，表明CHIKV感染的WT小鼠中IFN启动回路是完整的(图3、D和E). 有趣的是，干扰素峰值与CHIKV负荷下降相关(图3 C). 综合观察WT小鼠没有播散性感染，我们得出结论，局部干扰素能够控制CHIKV。

成纤维细胞是受心脏依赖性途径介导的CHIKV控制感染的主要细胞类型

为了更准确地定义WT小鼠感染的细胞类型，我们首先评估了造血细胞的感染。我们用CD45和CHIKV-GFP进行双重标记。从多个实验中筛选>25个切片，我们没有观察到任何GFP阳性CD45表达细胞。这里显示了一个代表性的图像(图4 A). 为了进一步表征非造血细胞，我们用抗波形蛋白抗体标记切片，该抗体是成纤维细胞和间充质细胞的标记物，抗CD31抗体是内皮细胞的标记，抗平滑肌肌动蛋白（SMA）是血管平滑肌细胞、周细胞和肌成纤维细胞的标记。我们鉴定了波形蛋白阳性的CHIKV感染细胞(图4 B)在某些情况下，SMA中的协同定位^整数细胞，提示肌成纤维细胞(图4C，箭头）。在大多数情况下，GFP阳性细胞为CD31⁻和SMA⁻(图4、B和C). 这些数据表明，与IFNAR一样^−/−动物(Couderc等人，2008年)，WT动物皮肤中CHIKV感染的主要细胞类型是成纤维细胞。这些数据是令人信服的，因为它们构成了第一个原始病毒分离物通过自然感染途径感染WT小鼠的证据，并且与在受感染人体组织样本中的观察结果一致(Couderc等人，2008年).

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图4。

WT小鼠感染的是皮肤成纤维细胞，而不是造血细胞。ID感染CHIKV-GFP（A、C和d）或WT CHIKV（B）后1d，在接种部位进行免疫荧光检测。细胞核用DAPI染色，并使用抗GFP单克隆抗体（A、C和D）或抗CHIK抗体（B）检测复制病毒。CD45（A）、Vimentin（B）或CD31和SMA（C和D）染色用于确定感染细胞的表型。S、 皮脂腺；C、 软骨；箭头，感染的肌成纤维细胞（SMA^+整数). 棒材，20µm。数据是两个独立实验的代表。

接下来，我们考虑了负责检测感染和触发干扰素产生的宿主传感器。对于通过假定的dsRNA中间体进行复制的ssRNA病毒，如CHIKV(斯特劳斯和斯特劳斯，1994年)，触发器包括TLR3、TLR7、PKR、Mda5和RIG-I(Stetson和Medzhitov，2006年). 迄今为止，用于家庭成员的主机传感器多哥病毒科仍然未知。我们首先考虑了细胞内传感器，并测试了来自Cardif的MEF的感染^−/−动物。卡迪夫（也称为MAVS/VISA/IPS-1）是RIG-I和Mda5下游的关键适配器。

卡迪夫^−/−MEF暴露于增加的病毒MOI，并监测CHIKV抗原的表达。卡迪夫^−/−MEF对感染的敏感性高于WT，尤其是在低MOI下(图5 A). 接下来我们评估了干扰素的生产，令人惊讶的是，卡迪夫^−/−MEF未能产生IFN-β(图5 B)这在RNA水平上得到了Cardif的证实^−/−与WT-MEFs相比，IFN-βmRNA表达减少500倍(图5 C). 基于这些数据，我们认为受感染的成纤维细胞通过依赖心脏的传感器对CHIKV感染作出反应，产生I型IFN并限制感染。

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图5。

成纤维细胞中CHIKV的细胞内控制由细胞内传感器介导。（A） 卡迪夫^−/−相应的WT对照MEF感染CHIKV的MOI增加。48小时后，用FACS分析细胞CHIKV抗原的表达。（B） 在48小时时收集培养上清液并分析IFN-β蛋白。作为阳性对照，MEF暴露于FluΔNS1。（C） 感染后24 h用RT-PCR检测IFN-βmRNA的诱导。给出了三个独立实验的平均值。错误条显示SD。

多种病毒传感器参与体内控制CHIKV感染

为了确定与Cardif啮合的上游传感器，我们比较了RIG-I和Mda5-缺陷MEF(图S1)和动物(图6). 在感染动物的关节、肌肉、肝脏、脾脏、皮肤和血清中测量病毒滴度。尽管我们在RIG-I的血清中观察到更高的病毒滴度^−/−与WT动物相比，近交WT小鼠对CHIKV感染的敏感性增加，这一结果令人困惑(图6). 值得注意的是，WT-ICR小鼠的关节中存在明显的病毒滴度。更引人注目的是，RIG-I^−/−和Mda5^−/−小鼠有这样一个微妙的表型。

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图6。

RIG-I和Mda5路径之间的冗余。Mda5型^−/−，钻机-I^−/−和窝友WT对照组受到感染。感染72小时后收集组织和血清，并使用TCID测定病毒滴度₅₀.检测极限用虚线表示。单个老鼠被表示出来，几何平均数用条表示。曼希特尼U型使用了测试，并在显著的情况下报告了p值。所示数据来自两个独立的实验。

为了更好地了解CHIKV的体内反应，我们感染了Cardif^−/−（C57BL/6背景）动物，并再次评估存活率和病毒传播。支持RIG-I中的发现^−/−和Mda5^−/−没有卡迪夫^−/−感染10只小鼠⁶CHIKV的PFU死于感染(n个= 15). 然而，有一个可复制的表型。卡迪夫的病毒滴度^−/−与WT小鼠相比，感染后48小时血清中的含量增加(图7 A)感染后72小时，在皮肤、关节、肝脏、肌肉、脾脏和血清中发现了低水平但可检测到的病毒(图7 B).

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图7。

Cardif和MyD88依赖性通路之间的串扰可有效清除CHIKV。卡迪夫^−/−，MyD88型^−/−，TLR3^−/−，相应的WT对照组感染了10⁶PFU。（A） 在感染后24小时和48小时测量病毒滴度。作为对照，我们显示IFNAR感染^−/−动物。（B） 感染72小时后收集组织，并使用TCID测定病毒滴度₅₀。检测极限用虚线表示。单个老鼠被表示出来，几何平均数用条表示。值得注意的是，IFNAR小鼠在该时间点死亡。曼·希特尼U型使用了测试，并在显著的情况下报告了p值。所示数据来自两个独立的实验。

一种可能性是CHIKV通过两个或多个传感器路径的顺序动作进行控制。事实上，在SFV中有证据表明，受感染的细胞可以在吞噬细胞中触发TLR依赖性IFN的产生(Schulz等人，2005年). 因此，我们评估了MyD88^−/−和TLR3^−/−这些小鼠也没有死于CHIKV感染(n个=10），但在MyD88中可以观察到显著的病毒传播^−/−动物，特别是在以后的时间点(图7 B). 值得注意的是，没有一只被测试的传感器缺陷小鼠像IFNAR那样容易感染^−/−动物，表明宿主-传感器通路可协同控制CHIKV感染。

I型干扰素作用于非造血细胞以控制CHIKV感染

最后，我们询问病毒感染诱导的I型干扰素是否直接作用于受感染细胞以介导病毒控制，或者免疫细胞是否是I型干干扰素的必要靶点，从而促进间接控制CHIV感染。为了评估这两种可能性，我们通过对宿主CD45.1WT小鼠进行致死性照射，然后过继转移CD45.2IFNAR，建立了骨髓嵌合小鼠^−/−骨髓（两种小鼠均为C57BL/6背景）。小鼠被称为IFNAR→WT。引人注目的是，IFNAR～WT嵌合体能够限制感染，这表明接受IFNAR刺激的宿主基质细胞足以控制病毒(图8). 在IFNAR→Langerin-DTR小鼠中观察到类似的结果，用白喉毒素处理以耗尽皮肤中的抗辐射Langerhans细胞（未公布的数据）。支持这一结论，我们观察到在WT→IFNAR嵌合体中，WT骨髓无法拯救IFNAR^−/−老鼠。这些数据表明，抗辐射基质细胞需要IFNAR反应性，从而将CHIKV与其他病毒（如呼肠孤病毒）区分开来(Johansson等人，2007年)也杀死了IFNAR^−/−但可能受与WT-BM衍生细胞嵌合的控制。

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图8。

国际食品与天然气协会^−/−→WT骨髓嵌合体保持其清除CHIKV感染的能力。WT和IFNAR^−/−对小鼠进行致命照射，并用IFNAR的骨髓重建^−/−或WT小鼠。2-3个月后，用10²或10⁶PFU CHIKV。（A） 连续2周每天监测两次生存率，并显示Kaplan-Meier曲线(n个=8只小鼠）。数据代表两个独立的实验。（B） 感染后第3天，使用TCID测定病毒滴度₅₀在IFNAR中→WT和WT控制(n个=3只小鼠）。虚线表示检测极限。水平条表示平均值。

讨论

在本文中，我们描述了CHIKV感染的病毒控制机制，并证明了I型干扰素的关键作用。我们在受感染的人类受试者中提供证据，证明CHIKV感染触发了I型干扰素的产生(图1 A). 以前有报道称CHIKV不会直接感染原代白细胞(Sourissau等人，2007年). 尽管如此，我们预计ssRNA病毒能够直接激活造血细胞。值得注意的是，我们对人PBMC以及人和小鼠DC亚群的体外刺激表明，CHIKV不能直接参与PRR诱导I型IFN(图1 B以及未描述的数据）。相反，我们认为受感染的成纤维细胞是I型干扰素的来源。这一结论基于体外实验和WT动物注射部位的调查(图1D和图3). 通过使用定义的敲除小鼠，我们可以进一步描述CHIKV发病机制中I型干扰素的产生和靶点。具体而言，我们报告称，I型干扰素的成纤维细胞生产受Cardif的控制(图5). 此外，我们证明干扰素作用于非造血细胞以实现病毒清除(图8).

尽管这些数据表明成纤维细胞在IFN信号的产生和接收中起着中心作用，但宿主对CHIKV的反应更为复杂。值得注意的是，成年人卡迪夫^−/−感染CHIKV的小鼠只有一个细微的表型。除了RLR通路的作用外，我们发现缺乏MyD88的小鼠也会感染病毒(图7). 单独而言，这两种途径都不能解释在IFNAR中观察到的表型^−/−小鼠，表明RLR和TLR识别之间存在协同作用，共同调节CHIKV的快速清除。

基于组织取向(图4)我们认为Cardif是由于成纤维细胞和基质细胞感染引起的。我们试图定义上游传感器，即RIG-I或Mda5。据Cardif报道^−/−尽管与对照动物相比，这两种缺乏传感器的动物在选定组织中的病毒载量都增加了，但它们都没有强表型(图6). 一个警告是，由于致命性问题，RIG-I和Mda5淘汰赛具有混合ICR/C57BL/6/129背景(Kato等人，2006年). 与我们研究中使用的近交动物相比，远交WT对照组显示CHIKV在关节中复制，使得敲除菌株中的数据更难解释。此外，从这些动物中分离出的MEF表现出高度的变异性，表明其他遗传位点可能会影响Cardif介导的传感器通路（图S1）。根据这些观察结果，我们建议RIG-I和Mda5共同发挥作用，正如西尼罗河病毒的报道(Fredericksen等人，2008年). 除了这两种传感器外，探索PKR和NOD2的作用也很重要，这两种蛋白都与ssRNA病毒的应答有关，可能通过Cardif传递信号(Ryman和Klimstra，2008年;Barry等人，2009年;Sabbah等人，2009年).

关于MyD88的作用，有两种可能的途径可以解释其在控制CHIKV感染中的作用。如前所述，造血细胞没有被直接刺激，这表明CHIKV不以传统方式参与TLR。然而，有可能是由于造血细胞吞噬受感染的细胞，后者是病毒性PAMP的来源，从而参与了内体TLR。例如，被SFV感染的细胞，也是阿尔法病毒属，产生可能与CD8上TLR3结合的dsRNA⁺吞没后的DC(Schulz等人，2005年). 虽然TLR3利用TRIF，因此不能帮助解释MyD88的表型^−/−小鼠，这种PAMP转移机制可能会推广到其他宿主传感器，未来的研究将探索TLR7或TLR8的作用。参与MyD88的第二条途径涉及其作为IL-1β和IL18受体适配器的作用(Muzio等人，1997年). 关于炎症组作用的新信息激增，炎症组被公认为是细菌感染后产生IL-1β的关键。事实上，这种途径似乎也参与了病毒的控制。具体而言，IL-1R激活可提高流感感染模型的存活率(Schmitz等人，2005年). 支持这一观察的是，缺乏Caspase-1、ASC和NALP3的小鼠在控制流感方面存在缺陷(Ichinohe等人，2009年). 因此，CHIKV感染细胞产生的IL-1β或IL18可能通过以MyD88依赖性方式刺激非感染细胞参与病毒控制。

关于I型干扰素的作用，我们提供证据表明，抗辐射基质细胞中的IFNAR信号对清除CHIKV至关重要。这是使用WT→IFNAR进行演示的^−/−骨髓嵌合体死亡的动力学与IFNAR相似^−/−动物(图8). 使用IFNAR^−/−→WT嵌合体，我们还证明造血细胞中的IFN扩增环不需要用于控制CHIKV的传播。据我们所知，之前只有一项研究采用了类似的方法。在呼肠孤病毒感染的情况下，已知感染会杀死IFNAR^−/−肠道上皮细胞而非造血细胞是感染的目标(Fleeton等人，2004年). 将我们的发现与CHIKV区分开来，有趣的是Johansson等人（2007）找到IFNAR^−/−→WT易感染，而WT→IFNAR^−/−嵌合体控制呼肠孤病毒。尽管我们完全承认，在这两种情况下，IFN可能同时作为直接抗病毒和促免疫细胞因子，但前者似乎在CHIKV感染中至关重要，而后者是清除呼肠孤病毒所必需的。

除了研究CHIKV发病机制对公共健康的威胁的重要性外，我们还从基本层面确定了CHIKV与其他α病毒相比具有独特性的特征。值得注意的是，已知Ross River、Sindbis、SFV和委内瑞拉马脑炎会感染和刺激DC(Hidmark等人，2005年;Ryman等人，2005年;Shabman等人，2007年). 值得注意的是，人类和小鼠DC对这些病毒的敏感性不同(Shabman等人，2007年); 然而，在CHIKV病例中，人类和小鼠DC均未直接感染。因此，最近的数据表明，在这方面，CHIKV与东部马脑炎病毒更为相似(Gardner等人，2008年). 将其扩展到其他虫媒病毒，我们还注意到WT小鼠的感染未能证明CD45直接感染的证据⁺细胞，包括Langerhans细胞，从而将CHIKV与其他媒介传播感染（如登革热）区分开来(Wu等人，2000年). 这是相关的，因为它表明CHIKV发病机制中的病毒传感器和宿主反应可能与其他α病毒不同(麦克唐纳和约翰斯顿，2000年;Ryman等人，2005年;Shabman等人，2007年). 负责抗病毒活动的ISG也可能是独一无二的。对于SFV，MxA提供阻力(Landis等人，1998年)而ISG15似乎对控制Sindbis病毒至关重要(Lenschow等人，2007年). 未来的工作将致力于确定主动控制CHIKV复制的成纤维细胞中的ISG。

总之，我们相信我们的研究为制定控制CHIVV感染的预防措施和治疗策略提供了重要的见解。我们的结果还表明，非造血细胞在干扰素产生和病毒控制中发挥着重要作用。

材料和方法

致谢

脚注

参考文献