《维罗尔杂志》。2010年3月；84(5): 2408–2420.
禽流感病毒HA、NA和M2表面蛋白对中和抗体诱导和保护性免疫的贡献▿
,1 ,1 ,2 ,1 ,1 ,2和1,*
Baibaswata Nayak公司
马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，马里兰大学帕克分校，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室2
萨钦·库马尔
马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，马里兰大学帕克分校，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室2
约书亚·M·迪那波利
马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，马里兰大学帕克分校，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室2
安南·帕尔杜赖
马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，马里兰大学帕克分校，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室2
丹尼尔·佩雷斯
马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，马里兰大学帕克分校，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室2
彼得·柯林斯
马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，马里兰大学帕克分校，1马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室2
西巴·萨马尔
马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，马里兰大学帕克分校，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室2
马里兰大学弗吉尼亚-马里兰地区兽医学院，马里兰大学帕克分校，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室2
*通讯作者。通讯地址：8075 Greenmead Drive，College Park，MD 20742。电话：（301）314-6813。传真：（301）314-6855。电子邮件：ude.dmu@lamass 2009年10月8日收到；2009年12月10日接受。
摘要
高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1亚型在家禽中引起严重疾病和死亡。H5N1禽流感病毒从鸟类向人类传播的增加对公共健康构成严重威胁。我们评估了三种HPAIV表面蛋白（即血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和M2蛋白）对诱导鸡产生HPAIV中和血清抗体和保护性免疫的各自贡献。利用反向遗传学技术，设计了三种重组新城疫病毒（rNDV），每种病毒均表达H5N1型HPAIV的HA、NA或M2蛋白。用表达单一抗原（HA、NA和M2）、两种抗原（HA+NA、HA+M2和NA+M2）或三种抗原（HA+NA+M2）的NDV免疫鸡。HA或NA免疫可诱导高滴度的HPAIV中和血清抗体，对HA的反应更大，从而将HA和NA鉴定为独立的中和抗原。M2没有诱导可检测的中和血清抗体反应，并且M2与HA或NA的结合降低了反应的程度。HA单独免疫或与NA联合免疫可诱导对HPAIV挑战的完全保护。单独使用NA或与M2联合免疫并不能预防攻击后的死亡，但延长了死亡前的时间。单用M2免疫对发病率或死亡率没有影响。因此，没有迹象表明M2具有免疫原性或保护性。此外，在鸡用疫苗制剂中除HA外还包括NA可能不会提高HA提供的高水平保护。
禽流感是世界范围内家禽的一种重要经济疾病。禽流感病毒（AIV）属于甲型流感病毒属在家里正粘病毒科AIV基因组由编码11种蛋白质（PB2、PB1、PB1-F2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2/NEP）的八段单链负义RNA组成。基因组被病毒外壳包围，外壳上有两个糖蛋白尖峰，即血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。HA尖峰具有受体结合和融合功能，NA尖峰具有接收器去抑制活性。包膜还包含第三个完整的膜蛋白M2，它暴露在外表面，起到离子通道的作用，这对脱膜至关重要。AIV表面糖蛋白是抗原可变的，在血清学上分为16个HA（H1至H16）和9个NA（N1至N9）亚型，而非糖基化表面蛋白M2高度保守(9,43). 根据禽类疾病的严重程度，禽流感病毒株也分为低致病性（LP）和高致病性（HP）两类。历史上，H5和H7亚型高致病性禽流感病毒（HPAIV）在家禽中造成严重疾病和死亡。最近HPAIV亚型H5N1感染已导致62多个国家5亿多只家禽被扑杀或死亡(27). 自1997年以来，已发现H5N1亚型HPAIV毒株在人类中致病。迄今为止，该病毒已导致436例确诊的人类感染。在这些感染中，262例（60%）是致命的。因此，HPAIV已成为动物和人类的主要威胁(45). 世界动物卫生组织（OIE）建议在家禽源处控制HPAIV，以减少易感禽类的病毒载量，从而降低向人类传播的风险(31). 控制高致病性禽流感的传统方法是消灭受感染的鸡群，包括美国在内的许多国家仍在使用这种方法。但是，由于经济原因，在发达国家或发展中国家，扑杀受感染的禽类不再被视为控制禽流感的实用方法。OIE建议接种疫苗以控制AI(31). 已经评估了几种HPAIV疫苗接种策略，包括灭活疫苗和减毒活疫苗(28). 灭活疫苗不常用，因为成本高，而且“区分感染动物和接种动物”（DIVA）很困难。由于担心疫苗病毒可能通过变异或与流通菌株的基因重组而变得有毒，因此不使用减毒活疫苗(1). 为了克服这些困难，重组DNA技术被用于产生载体、亚单位或DNA疫苗。虽然这些疫苗中有几种已被实验证明可以对抗禽流感病毒，但以新城疫病毒（NDV）为载体的疫苗已显示出最有希望的结果，并且还具有同时对抗NDV和AIV的双价疫苗的优势(11,25,32,42). 此外，NDV载体疫苗也在灵长类动物中进行了评估，结果令人满意(6). 新城疫（ND）是世界范围内家禽的一种重要经济疾病。致病因子（NDV）是一种属于该属的非片段、负链RNA病毒腮腺炎病毒属在家里副粘病毒科NDV毒力差异很大。毒株NDV在全世界家禽中引起严重的呼吸和神经疾病。在世界许多地区，自然产生的无毒NDV株通常用于控制ND(30).
我们最近评估了在鸡中表达H5N1 HPAIV疫苗HA蛋白的重组新冠病毒（rNDV HA）(25). 用rNDV-HA免疫的鸡产生NDV和HPAIV H5特异性抗体，并在用强毒株NDV或HPAIV攻击后对临床疾病起保护作用。此外，没有观察到攻击病毒的脱落，这表明有完全的保护作用。我们的结果表明rNDV-HA是一种合适的NDV和AIV双价疫苗(25). 迄今为止，所有在鸡中进行的NDV载体疫苗研究都使用了来自各种HPAIV毒株的HA基因(11,25,32,42). 然而，除HA蛋白外，禽流感病毒的包膜在其外表面还含有另外两种蛋白质（NA和M2）。虽然NA抗体被认为在病毒附着和穿透宿主细胞中不起任何作用，但它们可以阻止病毒从受感染细胞中释放出来(20)提高人类对禽流感病毒感染的整体抵抗力(37). NA基因被认为进化速度低于HA基因，这表明NA特异性抗体可能会增加HA特异性抗体的保护范围(19). 另一种表面蛋白M2是一种离子通道蛋白，也是抗HPAIV药物的靶点。M2蛋白在诱导HPAIV中和抗体和保护性免疫中的作用尚不清楚。由对应于N末端24-氨基酸外结构域（病毒表面存在的部分）的M2e肽诱导的抗体显示出对同源（H1N1）和异源（H3N1）株甲型流感病毒的广泛保护作用在体外和体内(7). 然而，AIV M2蛋白全长在诱导鸡产生中和抗体和保护性免疫抵抗高致病性H5N1流感病毒方面的作用尚未直接评估。M2蛋白在所有甲型流感病毒中都是保守的，因此被认为是“通用”疫苗的一个有吸引力的靶点(8). 仅HA蛋白抗体可以对抗致命的AIV挑战；在疫苗方案中加入其他表面蛋白可以提高保护效果。
在本研究中，我们检测了三种HPAIV表面蛋白（HA、NA和M2）中的每一种对诱导鸡的中和抗体和保护性免疫的相对贡献。构建重组NDV载体，分别表达三种HPAIV表面蛋白中的每一种。它们被用于单独或以不同的可能组合免疫鸡。评估血清抗体的相对中和滴度、攻击病毒的脱落以及NDV载体HPAIV表面蛋白对致命HPAIV攻击的保护作用，结果表明HA糖蛋白是诱导中和抗体和保护性免疫的主要因素，其次是NA蛋白，授予部分保护。M2蛋白既不能诱导检测到的血清中和抗体水平，也不能保护鸡免受HPAIV致命攻击。
材料和方法
病毒和细胞。
HPAIV毒株A/Vietnam/1203/2004（H5N1）从美国疾病控制与预防中心（CDC；佐治亚州亚特兰大）获得。先前描述了含有修改的HA基因（缺失的多基裂解位点）和病毒株A/Vietnam/1203/2004（H5N1）的NA基因的重组减毒活流感病毒（6attWF10:2H5ΔN1）(38). 无毒NDV菌株LaSota的重组版本之前在我们的实验室中产生(14,36). 病毒在9天龄的无特异性霍乱（SPF）鸡胚中繁殖。MDCK（Madin-Darby犬肾）、HEp-2（人表皮样癌）和DF1（鸡胚成纤维细胞）细胞系取自美国类型培养收集（ATCC；Manassas，VA）。MDCK和HEp-2细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的Eagle最小必需培养基（EMEM）中生长，并在含有5%胎牛血清的EMEM中维持。DF1细胞在含有10%FBS的Dulbecco最小必需培养液（DMEM）内生长，在含有5%FBS的DMEM中保持。
病毒滴定。
用0.8%甲基纤维素覆盖物和5%尿囊液在DF1细胞中进行斑块试验，测定rNDV库存制剂的滴度。感染细胞在37°C下孵育3至4天，直到斑块明显形成。然后用甲醇固定细胞单层，并用结晶紫染色以计数斑块。rNDV和AIV的滴定在体外或体内生长是通过限制DF1和MDCK细胞中的稀释来进行的，分别使用前面描述的Reed和Muench方法(13)，滴度表示为50%组织培养感染剂量（TCID50)单位/ml。使用鸡红细胞（RBC）测定NDV和AIV的HA滴度(29). 50%鸡蛋感染剂量（EID50)rNDVs的值是通过每10倍连续稀释一组感染5个鸡蛋来确定的。感染24小时后，收集尿囊液卵子，并通过HA试验确认存在病毒。对于HPAIV攻击病毒，鸡50%致死剂量（CLD50)通过每组感染三只（5周龄）鸡来确定，50%的终点通过Reed和Muench方法确定(13).
生成包含HPAIV HA、NA和M2编码序列的rNDV。
rNDV构建物基于NDV株LaSota抗原基因RNA的全长cDNA(14,36)被修改为在P和M基因之间包含一个独特的PmeI限制酶位点(36). HPAIV株A/Vietnam/1203/2004（H5N1）的HA、NA和M2开放阅读框（ORF）是定制合成的。ORF的设计目的是在每一端两侧都有PmeI位点，并在上游侧包含NDV基因连接，包括基因末端、基因间和基因启动信号。在M2 ORF的情况下，这些额外的序列包括在定制合成中，用PmeI消化合成基因，并将其插入全长cDNA的唯一PmeI位点以产生pNDV-M2。在HA和NA的情况下，通过PCR扩增添加它们。具体地说，用感观引物Flank NA-F-（5′-GTTTAAAC公司塔加AAAAAT型ACGGGTAGAA公司TTGGAAGAGAGAACCAACCAAGATCATCAC-3′）和反义引物NAorf-Pme I-R-（5′GTTTAAAC公司CTACTTGTCGAGTGAAAGGCAGCTCGG-3′）（PmeI位点斜体化，NDV基因开始和结束信号下划线）。PCR产物用PmeI酶切并克隆到全长NDV质粒的唯一PmeI位点，以获得pNDV-NA。携带HA基因的全长NDV主干pNDV-HA的构建遵循了早期工作中的类似策略(25)保留了其原来的多基解理位点。在每种情况下，总基因组长度保持为6的偶数倍，这是NDV高效复制所必需的(21). 对结果质粒pNDV-HA、pNDV-NA和pNDV-M2中插入的HPAIV基因进行测序，以确认方向和不存在不定突变。如前所述，通过将这些全长质粒连同NDV支持质粒（pTM1-NP、pTM1-P和pTM1-L）转染到HEp-2细胞中，可恢复重组病毒(14,36). 回收的病毒分别命名为rNDV HA、rNDV NA和rNDV M2。
感染rNDV的细胞中HPAIV HA、NA和M2蛋白的表达。
通过Western blot分析检测rNDV对HPAIV HA、NA和M2蛋白的表达。简言之，DF1细胞感染了rNDV、rNDV-HA、rNDV NA和rNDV-M2，感染倍数（MOI）为0.01 PFU。在感染后48小时采集细胞，进行裂解，并使用H5N1 HPAIV感染产生的多价鸡抗血清或针对N1 NA蛋白C末端肽的兔抗血清（Prosci Inc.，Poway，CA）进行Western blotting分析。为了检测禽流感病毒表面蛋白与新城疫病毒颗粒的结合，使用来自rNDV感染鸡蛋尿囊液的部分纯化病毒和相同的两种抗血清进行了Western blot分析。
鸡胚中rNDV的致病性。
根据标准方案，通过9天龄鸡胚的平均胚胎死亡时间（MDT）试验测定rNDV的致病性(30). 简单地说，新鲜感染性尿囊液的10倍连续稀释，稀释度为10−6到10−9用无菌磷酸盐缓冲盐水制成。将每种稀释液总共0.1 ml注入五个9天龄SPF鸡胚（宾夕法尼亚州蜂卵公司）的尿囊腔中，并在37°C下孵育。每只卵每隔12小时检查一次，持续7天，并记录胚胎死亡时间。最小致死剂量是导致接种该稀释液的所有胚胎死亡的最高病毒稀释液。
rNDV在DF1细胞中的生长特性。
测定了rNDV、rNDV-HA、rNDV-NA和rNDV-M2在DF1细胞和胚胎卵中的多周期生长动力学。用MOI为0.01PFU的病毒感染六孔板的重复孔中的DF1细胞。吸附1h后，用DMEM清洗细胞，然后用含有5%FBS和5%尿囊液的DMEM覆盖。收集细胞培养上清液样品，并每隔8小时用等体积的新鲜培养基替换，直到感染后56小时。通过TCID对样本中的病毒滴度进行量化50检测DF1细胞。虽然通过接种每种病毒100个PFU来执行rNDV在鸡胚中的生长动力学，但从三个鸡蛋中每隔12小时采集尿囊液，直到60小时。每个鸡蛋的病毒滴度由TCID测定50检测DF1细胞。
鸡的免疫和挑战试验。
免疫和激发试验分两个阶段进行。在实验的第一阶段，4组(n个=13只/组）的2周龄SPF鸡通过10剂量的眼鼻途径免疫6EID公司50rNDV（空载体）、rNDV-HA和rNDV-NA以及10的混合物6EID公司50rNDV-HA和rNDV-NA（rNDV-HA+NA）。在实验的第二阶段，4组(n个=每组13只），通过相同的途径用10剂量对2周龄SPF鸡进行免疫6EID公司50rNDV-M2，10的混合物6EID公司50rNDV-HA和rNDV-M2（rNDV-HA+M2）各一种，106EID公司50rNDV-NA和rNDV-M2各一种（rNDV-NA+M2），以及106EID公司50rNDV-HA、rNDV-NA和rNDV-M2（rNDV-HA+NA+M2）。用总体积为0.2 ml（每只眼睛和鼻孔0.05 ml）的单剂量rNDV免疫鸡。免疫后三周，收集激发前血清样本以检测血清抗体反应，并通过鼻内途径用100 CLD激发动物50同源HPAIV A/Vietnam/1203/2004病毒。在攻击后第3天，每组取三只鸡处死，以定量攻击病毒复制。从呼吸道采集组织样本，包括气管、鼻甲（上呼吸道）和肺（下呼吸道），以及淋巴系统（脾脏）和神经系统（大脑）。组织在细胞培养基（1 g/10 ml）中均质，并通过离心进行澄清。通过限制稀释测定器官中的挑战病毒滴度。每组剩下的10只鸡每天观察10天，以了解疾病症状和挑战后的死亡率。为了监测挑战性HPAIV的脱落，在攻击后第3天收集了所有鸡的口腔和泄殖腔拭子。通过将拭子样本接种在9天龄鸡胚蛋和MDCK细胞单层中来确定HPAIV攻击病毒的脱落频率，并通过使用鸡红细胞的HA检测来确认是否存在HPAIV。此外，通过MDCK细胞单层的限制稀释试验测定拭子样本中的病毒滴度。在挑战后第10天处死幸存的鸟类之前，收集挑战后血清。所有挑战性实验均在美国农业部和美国疾病控制与预防中心认证的强化BSL3控制设施中进行，研究人员穿戴适当的防护设备，并遵守机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的所有协议根据马里兰州大学动物福利协会（AWA）的规定。
血清学分析。
用血凝抑制（HI）、神经氨酸酶抑制（NAI）和病毒中和（VN）试验以及酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹法（Western blotting），对接种rNDV的鸡血清样本的抗体水平进行评估(13). 对于HI检测，制备免疫鸡血清的两倍系列稀释液（50μl），每个稀释液与rNDV（NDV HI）或A/Vietnam/1203/2004（HPAIV HI。孵育1h后，加入50μl 1%鸡红细胞，在室温下孵育30分钟，并对血凝进行评分。
在NAI试验中，6attWF10:2H5ΔN1病毒被用作AIV N1亚型NA的来源。6attWF10:2HzΔN1的NA活性通过改进的荧光法测定(15). 简言之，在20μl体积的酶缓冲液（33 mM 2-N个-吗啉乙磺酸[MES]，pH 6.5和4 mM氯化钙）。在此基础上，加入20μl甲型流感/6attWF10:2H5ΔN1病毒作为NA源，在酶缓冲液中稀释至恒定的NA量（450 nm处的光密度[OD450]100000），并在室温下培养1小时。将10微升12.5%（vol/vol）二甲基亚砜添加到荧光分析板的每孔中（黑色96孔板；Microfluor，Franklin，MA）。将每种血清和病毒混合物的10微升分两次（两排）转移到分析板上。对于阳性和阴性对照，将10μl稀释的病毒或酶缓冲液单独添加到单独行的每个孔中。通过添加30μl基质混合物[1体积330 mM MES，pH 6.4；3体积10 mM氯化钙；和2体积0.5 mM 2′-（4-甲基伞形花序基）-α-d日-N个-乙酰神经氨酸（MUN）（Sigma）]，以在分析中给出100μM MUN的最终浓度。将反应混合物在37°C下孵育15分钟并摇晃，通过添加150μl终止缓冲液（0.014 M氢氧化钠溶于83%[vol/vol]乙醇中）终止反应。使用Victor3多标签板阅读器（PerkinElmer）以360 nm的激发波长和450 nm的发射波长通过荧光测定定量反应程度。从病毒样本读数中减去底物空白处的读数，并计算重复读数的平均值。
使用96周组织培养板中生长的MDCK细胞中的免疫鸡血清进行病毒中和试验。简单地说，对50μl血清样品（补体失活）进行两次连续稀释，并与100 TCID孵育1小时50欧洲、中东和非洲地区HPAIV流感A/越南/1203/04。培养后，用病毒血清混合物感染细胞。通过确认血清稀释度最高的微孔中存在病毒，获得VN滴度。使用商用AIV NP ELISA和NDV ELISA试剂盒（加利福尼亚州圣地亚哥合生公司）检测AIV的NP抗原抗体和rNDV的全N DV抗原。
统计分析。
采用单因素方差分析（ANOVA）评估不同免疫鸡组血清学分析的统计显著性差异。采用对数秩和χ2检验比较生存模式和中位生存时间。在log-rank检验中，生存曲线比较了任何特定时间的累积生存概率，并且每次按比例死亡的假设在所有时间点都是相同的。使用Prism 5.0（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA）分析生存数据和单向方差分析，显著性水平为P（P）< 0.05.
结果
产生表达H5N1型HPAIV HA、NA和M2表面蛋白的rNDV。
三种HPAIV表面蛋白（HA、NA和M2）中的每一种对免疫原性和保护作用的个体贡献是通过反向遗传学分别表达插入新冠病毒无毒疫苗株LaSota的附加基因中的每一种蛋白来评估的。rNDV-HA是在之前的工作中建造的(25)而本研究构建了rNDV-NA和rNDV-M2病毒。HPAIV基因来自H5N1 A/越南/1203/2004毒株。每个ORF都置于一组NDV转录信号的控制下，并插入NDV载体中的P和M基因之间（图。). 重组病毒是使用先前描述的反向遗传系统回收的(36). 通过逆转录PCR（RT-PCR）和核苷酸序列分析（数据未显示）确认了这三种病毒基因组中每个HPAIV基因的结构。
表达H5N1型人乳头瘤病毒表面蛋白HA、NA或M2的rNDV的构建和鉴定。（A） 描绘rNDV LaSota基因组的示意图，其中插入了一个额外的基因，该基因被设计用于表达HPAIV表面蛋白HA（结构体1）、NA（结构体2）或M2（结构体3）。插入的外源ORF之前有一个NDV基因连接，包含基因-end（GE）和基因片段（GS）转录信号。这将HA、NA或M2 ORF置于一组转录信号的控制下，以便每一个都以单独的mRNA表达。（B）HPAIV表面蛋白HA、NA和M2在DF1细胞中的表达及其并入rNDV病毒。用单个rNDV构建物感染DF1细胞，48小时后收集并处理细胞以制备细胞裂解物。此外，对感染个体构建体的胚胎卵的尿囊液进行澄清，并在蔗糖梯度上进行离心，以制备部分纯化的病毒颗粒制剂。使用感染H5N1 HPAIV产生的鸡抗血清（顶部）或针对N1 NA蛋白C末端肽的兔抗血清（底部）对这些样本进行Western blot分析。泳道1-4：用rNDV空载体（泳道1）、rNDV HA（泳道2）、rNDV NA（泳道3）或rNDV-M2（泳道4）感染的DF1细胞的裂解物。通道5至8：rNDV空载体（通道5）、rNDV-HA（通道6）、rNTV-NA（通道7）或rNDV-M2（通道8）的部分纯化病毒颗粒。鸡HPAIV特异性抗血清检测到HA（第2和第5道，顶）和M2（第4和第8道，顶上）蛋白，但没有检测到NA蛋白（第3和第7道，顶上侧），而NA是用NA-特异性兔血清检测到的（第3道和第7车道，底端）。细胞裂解物中的HA蛋白被检测为未分离的非活性前体（HA0）和蛋白水解的HA1和HA2蛋白（第2通道，顶部），而病毒颗粒中仅检测到最后两种病毒（第6通道，顶部。兔NA-特异性抗体也检测到非特异性条带（NSP，底部）。nt，核苷酸；氨基酸。
使用H5N1型HPAIV感染产生的鸡抗血清，通过Western blotting分析感染DF1细胞中HPAIV表面蛋白rNDV-HA、rNDV-NA和rNDV-M2的表达（图。，顶部）和针对N1 NA蛋白C末端肽的兔抗血清（图。，底部）。用多价HPAIV特异性鸡抗血清进行分析，在感染rNDV-M2的细胞裂解液中检测到一条M2蛋白带，其表观分子量为～12000（图。和感染rNDV-HA的细胞裂解液中的三条HA相关带（图。，顶部，通道2），表示（i）非活性HA前体HA0，表观分子量为～65000；（ii）N末端衍生的蛋白水解裂解产物HA1，表观分子量约40000；和（iii）C末端衍生蛋白水解裂解HA2，表观分子量约为25000。令人惊讶的是，感染后的鸡抗血清在感染rNDV-NA的细胞裂解液中没有检测到任何明显的HPAIV特异性条带（图。，顶部，车道3）。然而，使用NA特异性抗肽兔抗血清，在感染rNDV NA的细胞的裂解物中检测到分子量为～50000的NA蛋白（图。，底部，车道3）。
为了检测HPAIV表面蛋白与NDV颗粒的结合，通过蔗糖梯度离心从感染的尿囊液中部分纯化每个rNDV，并通过Western blotting进行分析（图。，顶部和底部，车道5至8）。用感染后的鸡抗血清进行分析，未分别检测到rNDV-NA和rNDV-M2病毒制剂中的NA和M2蛋白，并检测到了rNDV-HA病毒制剂中HA1和HA2蛋白（图。，顶部，车道6）。用NA-特异性兔抗肽抗体进行Western blot分析，检测到rNDV-NA纯化病毒制剂中的NA蛋白（图。，底部，车道7）。这些结果表明，在NDV载体颗粒中封装了裂解的HA和NA，而不是M2或HA0。
表达人乳头瘤病毒表面蛋白的rNDV的生物学特性。
将rNDV-HA、rNDV-NA和rNDV-M2与空rNDV载体在两个鸡胚中的多周期生长动力学进行了比较（图。)和DF1鸡成纤维细胞（图。). 我们的结果表明，rNDV空载体和rNDV-HA的生长动力学相似，而rNDV-NA和rNDV M2的生长速度稍慢，达到最大滴度，约为1 log10下部（图。).
rNDV在鸡胚（A）和DF1细胞（B）中多周期生长动力学的比较。（A） 用每种病毒的100个PFU接种9日龄鸡胚，在接种后的不同时间点（12、24、36、48、60和72 h）采集3个鸡蛋的尿囊液。（B） 用每种病毒的100个PFU（每个细胞0.01个PFU）感染DF1细胞，每隔8小时收集细胞培养上清液。采用TCID法测定尿囊液和细胞培养上清液样本中的病毒滴度50检测DF1细胞。
通过鸡胚平均死亡时间（MDT）测定评估这些rNDV的毒力。这些病毒的MDT分别为110小时（rNDV）、112小时（rNTV-HA）、114小时（rDNV-NA）和111小时（rNDV-M2）。根据OIE指南，MDT值超过90小时的NDV菌株被视为致透镜或无毒(30). 因此，表达HPAIV表面蛋白的三种rNDV是无毒病毒，HPAIV蛋白的表达并没有增加其毒力。事实上，每个HPAIV基因的存在都略微增加了NDV载体的衰减。
用表达HPAIV表面蛋白的rNDV免疫后NDV和HPAIV特异性血清抗体反应的评估。
为了评估单个HPAIV表面蛋白的免疫原性，将rNDV单独或以几种组合方式经眼感染鸡群。在免疫后第21天使用NDV特异ELISA测定NDV特异性血清抗体反应（图。)和NDV特异性HI检测（图。). 两种检测均检测到高水平的NDV特异性血清抗体，表明rNDV在鸡体内复制。我们发现这两种分析的滴度只有微小的差异。通过HI试验测定rNDV诱导的HPAIV特异性血清抗体反应，以检测HA特异性反应（图。)以及NA特异性反应的NAI测定（图。). Western blot分析检测M2特异性抗体反应（图。). 免疫方案包括rNDV-HA的所有四个鸡组均具有可检测的AIV HI反应。仅用rNDV-HA免疫的鸡组具有最高的HI滴度，而用rNDV HA+NA免疫的鸡的滴度低两倍，用rNDV-HA+M2或rNDV-HA+NA+M2免疫的鸡则低四到八倍。使用减毒重组禽流感病毒株6attWF10:2H5ΔN1作为N1 NA活性源进行NAI分析。使用用空rNDV载体免疫的鸡的血清进行的对照NAI检测为阴性，表明该AIV NA与HN蛋白的NDV特异性神经氨酸酶没有任何交叉反应。免疫接种包括rNDV-NA的所有四个鸡组都有可检测的AIV-NAI反应。仅由rNDV-NA诱导的NAI抗体平均滴度与rNDV-HA+NA诱导的相同（图。). 然而，rNDV-M2以双重组合（rNDV-NA+M2）或三重组合（rNTV-HA+NA+M2）的形式被纳入，导致减少了两到四倍。因此，将rNDV-M2与rNDV-HA或rNDV-NA以双重或三重组合的形式结合，可以减少HI或NAI抗体的诱导。虽然我们缺乏检测AIV M2特异性抗体的功能性检测，但Western blot分析证实了M2蛋白的血清转化。在仅用rNDV-M2免疫的所有鸡的血清中以及在rNDV-M2作为组合的一部分被包括在内的其他鸡组的血清中检测到M2特异性抗体（图。). 单个rNDV-M2载体对M2蛋白的抗体反应似乎明显更大（图。rNDV-M2与rNDV-NA、rNDV-HA或rNDV-HA-NA组合时（分别为2、3和4车道）。
用单独或联合施用的指定rNDV进行眼内免疫后21天，鸡的NDV-和HPAIV特异性血清抗体反应。NDV特异性血清抗体反应由商业NDV ELISA（A）和HI试验（B）测定，而HPAIV特异性抗体反应由AIV HI（C）和NAI试验（D）测定。所有抗体滴度均以平均倒数对数表示2滴度±SEM（平均值的标准误差），虚线以上的样品滴度被视为阳性。在NDV ELISA（A）中，抗体滴度以S/P（样本/阳性）比率表示，滴度高于0.3（虚线）的被视为NDV阳性。在NDV（B）和HPAIV（C）7检测中，滴度表示为平均倒数对数2滴度，且滴度大于1.0 log2（虚线）被认为是积极的。在HPAIV特异性NAI试验（D）中，抗体滴度表示为倒数对数的平均值2NA活性降低50%且滴度高于1.0 log的滴度2（虚线）被认为是积极的。通过单因素方差分析计算统计差异P（P）在NDV ELISA（A）和P（P）在NDV HI（B）、AIV HI和AIV NAI（D）分析中分别<0.0001。
对用rNDV-M2单独免疫或与rNDV-HA或NDV-NA联合免疫的鸡的血清进行Western blot分析。部分纯化的重组AIV 6attWF10:2H5ΔN1，一种通过去除HA中的多碱基裂解位点而减弱的重组AIV，在复制通道中进行电泳，作为Western blot抗原。用检测HA和M2蛋白的感染后HPAIV特异性鸡抗血清（第1道）或用rNDV-HA+M2（第2道）、rNDV-NA+M2的代表性血清（第3道）或rNDV-HA+NA+M2免疫鸡（第4道）进行Western blot分析或使用接种rNDV-M2的个体鸡的血清（第5至13道）。
评估HPAIV中和血清抗体对表达HPAIV表面蛋白的rNDV的反应。
用rNDV单独或联合免疫21天后从鸡身上提取的血清中和H5N1型HPAIV的能力通过微中和试验进行评估（图。). 用rNDV空载体或rNDV-M2免疫的鸟类的血清没有可检测的中和抗体滴度，而用rNDV HA或rNDV NA单独或一起免疫的鸟类的血清诱导了相当滴度的HPAIV中和抗体，其中rNDV HA（和rNDV HA+NA）的滴度高出四倍rNDV-NA组。将rNDV-M2与rNDV-NA或rNDV-HA结合，与单独使用rNDV-NA或rNDV-HA相比，中和抗体滴度分别降低了四倍或八倍。这些结果证实了HA和NA都是独立的中和抗原。相反，rNDV-M2并没有诱导可检测的中和抗体反应，rNDV-M2与rNDV-HA和/或rNDV-NA联合使用会降低其免疫原性。
rNDV疫苗构建物诱导HPAIV中和血清抗体。用单独或联合给药的指定rNDV构建物通过眼鼻途径免疫鸡一次，21天后取血清并分析其中和同源A/Vietnam/1203/2004株的能力在体外血清中和抗体滴度表示为平均倒数对数2滴度（平均值±SEM），滴度大于1 log2（虚线）被认为是积极的。通过单因素方差分析计算统计差异P（P）< 0.001.
rNDV对HPAIV挑战病毒复制的保护作用。
分别或联合接种各种rNDV的鸡在免疫后第21天接受高致死剂量（100 CLD）的攻击50)同源H5N1 HPAIV A/Vietnam/1203/2004病毒。在攻击后的第3天，处死每组中的三只鸡，并从每只鸡的呼吸道（上气管、鼻甲和肺部）、淋巴系统（脾脏）和神经系统（大脑）中采集组织，通过限制稀释法测定HPAIV攻击病毒的滴度（图。). rNDV空载体和rNDV-M2组中的所有动物在激发后第2天死亡（见图。). 在这些组中，在三只鸡死亡时而不是在挑战后第三天采集组织样本。用rNDV空载体或rNDV-M2免疫的鸡中，HPAIV攻击病毒复制率最高，两组之间没有明显差异，而用rNDV-HA或rNDV HA+NA免疫的鸡的任何组织中均未检测到HPAIV复制。在rNDV-NA免疫组中，与rNDV空载体组相比，肺部挑战性HPAIV滴度显著降低（平均降低9.0 log10)气管（平均减少7.2 log10)，鼻孔（平均减少4.25 log10)和脾脏（平均减少7.5 log10)而大脑中的复制在平均滴度上仅减少了10倍。与后两种结构相比，rNDV-M2与rNDV-HA或rNDV-NA的结合导致疗效降低。rNDV-HA+M2组中的一只鸡和rNDV-HA+NA+M2群中的两只鸡缺乏可检测到的挑战性HPAIV复制，这表明反应存在差异，但与HA是最具保护性的抗原相一致。
rNDV免疫21天后感染鸡的不同器官中HPAIV挑战病毒的复制。每个免疫组的三只鸡在攻击后3天被处死。收集每只鸡的各种器官，并在MDCK细胞中进行分析。每只鸡不同器官中的HPAIV滴度以对数表示10TCID公司50每克组织。
HPAIV攻击后rNDV免疫鸡的存活率。用指示的rNDV分别（rNDV空载体、rNDV-HA、rNDV-NA和rNDV-M2）或组合（rNDV-HA+NA、rNDV HA+M2、rND-VA+M2和rNDV HA+NA+M2）免疫8个鸡组（每组10只鸡）。免疫后21天，这些群体受到H5N1型HPAIV的攻击。rNDV空载体和rNDV M2组中的所有鸡在第2天死亡，rNDV NA和rNDV NA+M2组中的所有鸡在第6天死亡，rNDV HA+M2和rNDV HA+NA+M2组中的大多数动物存活，rNDV HA和rNDV HA+NA组中的所有动物存活。各组之间的统计差异通过对数秩检验确定P（P）值<0.0001。
通过在攻击后第3天从每组剩余的10只动物中采集口腔和泄殖腔拭子样本来监测HPAIV攻击病毒的脱落。用拭子样本接种鸡胚和MDCK细胞单层，测定动物释放HPAIV挑战病毒的频率，并进行HA分析以确认分离物为HPAIV。在许多情况下，胚胎蛋提供了更敏感的检测。当用胚胎卵子检测样本时，用rNDV、rNDV-M2、rNDV-NA和rNDV-NA+M2免疫的所有鸟类的口腔和泄殖腔脱落均呈阳性。在rNDV-HA和rNDV-HA+NA组中，未观察到任何鸟类的HPAIV脱落。用rNDV-HA+M2和rNDV-HA+NA+M2免疫的鸡，10只鸡中有7只和6只出现HPAIV口腔脱落，10只中有2只出现泄殖腔脱落。
病毒脱落量通过拭子样本的极限稀释试验确定（图。). 口腔脱落病毒滴度（图。)如预期的那样，用空rNDV载体免疫的鸡的死亡率很高，而用rNDV-M2、rNDV-NA或rNDV-NA+M2免疫的鸡没有显著降低。相反，rNDV-HA或rNDV-HA+NA组未检测到口腔脱落。rNDV-HA+M2和rNDV-HA+NA+M2组的口腔脱落滴度较低，表明rNDV-HA（和rNDV HA+NA）与rNDV-M2联合使用的疗效降低（图。). rNDV空载体和rNDV-M2免疫组的泄殖腔脱落滴度较高（1至2 log10)高于口服脱落病毒的滴度，表明其已通过胃肠道传播（图。). rNDV-HA和rNDV-HA+NA组没有检测到泄殖腔脱落，但rNDV-M2的加入导致了可检测到的泄殖腔流出，这表明这种加入导致疗效下降。有趣的是，尽管rNDV NA-和rNDV NA+M2免疫鸡组的口腔脱落水平很高，与rNDV空对照组的口腔脱落水平难以区分，但如上所述，这两组的泄殖腔脱落水平非常低。因此，rNDV-NA限制挑战性病毒复制的能力对系统性传播的抑制作用明显大于对接种点附近复制的抑制作用。
TCID法测定HPAIV攻击病毒脱落滴度50从接种rNDV的鸡群中采集的口腔（A）和泄殖腔（B）拭子中的检测。病毒滴度表示为平均值±SEM，样品滴度高于虚线（1.0 log10)被认为是积极的。rNDV-HA和rNDV-HA+NA组未检测到病毒。
rNDV对HPAIV攻击致死的保护作用。
在上述免疫和致死激发试验中，在激发后对每组剩余的10只鸡进行监测，以确定幸存者的总数（表)并监测死亡动力学（图。). 用rNDV空载体或rNDV-M2免疫组中的所有鸡在第2天死亡，没有证据表明与rNDV-M2相关的保护效力。用rNDV-NA或rNDV-NA+M2免疫的所有动物分别在第5天或第6天死亡，表明对NA的免疫延长了生存期，但不能阻止死亡。相反，用rNDV-HA或rNDV-HA+NA免疫的所有鸡均存活。进一步加入rNDV-M2（rNDV-HA+M2和rNDV-HA+NA+M2）后，这两种疫苗制剂的保护效果有所降低，分别导致83%和77%的存活率（图。).
表1。
用rNDV免疫后NDV和HPAIV特异性血清抗体应答和同源HPAIV攻击后鸡的存活
| 免疫鸡组（禽类数量） | 免疫接种反应一
|
|---|
| NDV血清HI抗体平均值±SEM（log2) | HPAIV血清阳性的鸟类数量/鸟类总数 | HPAIV血清HI抗体平均值±SEM（log2) | 挑战HPAIV后第21天的幸存者人数/鸟类总数 |
|---|
| rNDV（10） | 5.69 ± 0.63 | 0/10 | 0 | 0/10 |
| rNDV-HA（10） | 6.30 ± 0.48 | 10/10 | 5.07 ± 0.95 | 10/10 |
| rNDV-NA（10） | 6.21 ± 0.80 | 10/10 | 0 | 0/10 |
| rNDV-HA+NA（10） | 6.46 ± 0.87 | 10/10 | 4.38 ± 0.86 | 10/10 |
| rNDV-M2（10） | 5.30 ± 0.75 | 10/10 | 0 | 0/10 |
| rNDV-HA+M2（10） | 5.15±0.68 | 10/10 | 1.69 ± 1.65 | 2010年6月 |
| rNDV-NA+M2（10） | 5.38 ± 0.65 | 10/10 | 0 | 0/10 |
| rNDV-HA+NA+M2（10） | 5.23 ± 0.83 | 10/10 | 2.84 ± 1.21 | 4/10 |
通过DIVA策略比较攻击前后HPAIV特异性血清抗体反应。
我们比较了攻击前（免疫后第21天）收集的血清与攻击后第10天从幸存鸡收集的血清中对HPAIV蛋白的血清抗体反应。仅有的存活组为rNDV-HA（10名幸存者）、rNDV-HA+NA（10名存活者）、rNTV-HA+M2（6名幸存者）和rNDV-HA+NA+M2，因此分析仅限于这些组。我们使用了一种针对AIV NP蛋白的市售ELISA检测方法，以区分受感染的鸟类（在这种情况下可能发生AIV NP-特异性反应）和接种NDV载体的鸟类（不会刺激针对AIV NP的抗体）（图。). 这是DIVA战略的基础。用AIV特异性HI分析攻击前后的血清（图。)和NAI（图。)分析。
从以下免疫组的存活鸟类中测定的HPAIV特异性血清抗体滴度的激发前（第21天）和激发后（第31天）比较：rNDV-HA(n个=10），rNDV HA+NA(n个=10），rNDV-HA+M2(n个=8）和rNDV-HA+NA+M2(n个= 8). 用AIV NP ELISA（A）、HI试验（B）和NAI试验（C）测定HPAIV特异性血清抗体反应滴度。AIV NP ELISA（A）效价通过S/P比值进行测定，高于0.3（虚线）的值被视为阳性。在AIV HI（B）和NAI（C）检测中，抗体滴度表示为平均倒数对数2滴度±SEM。滴度大于1.0 log2被认为是积极的。用单因素方差分析法分析鸡群之间的统计差异P（P）AIV NP ELISA的值<0.001，AIV HI和NAI检测的值<000001。
通过AIV NP ELISA检测，rNDV-HA-疫苗接种禽类的攻击前和攻击后血清中的AIV-NP抗体均为阴性（图。)，这表明挑战性HPAIV复制没有发生，或者限制性太强，无法产生免疫原性。相反，rNDV-HA+NA组每10只鸡中有1只、rNDV-HA+M2组每6只存活鸡中有3只和rNDV-HA+NA+M2组合每4只存活鸡的攻击后血清中有2只AIV NP特异性抗体阳性。这表明HPAIV在这些个体鸟类中的复制具有突破性的挑战性。与此一致，rNDV-HA免疫鸡在激发前后HI抗体的滴度基本上没有差异（图。)这意味着缺乏HPAIV复制。相反，rNDV-HA+NA、rNDV-HA+M2和rNDV-HA+NA+M2组的平均HI抗体滴度在挑战后分别增加了三倍、六倍和八倍，与HPAIV挑战病毒的复制一致。同样，rNDV-HA+NA组和rNDV-HA+NA+M2组的挑战后NAI平均滴度分别增加了四倍和八倍，与挑战性HPAIV复制一致。HI滴度或NAI滴度增加的个别动物也有可检测到的NP抗体。这进一步证明了rNDV-HA对挑战性HPAIV复制的高度限制。
讨论
流通的H5N1型人乳头瘤病毒（H5N1 HPAIV）已显示出遗传和抗原多样性增加，在鸟类中传播，并在水库鸟类宿主中持续存在。H5N1型人乳头瘤病毒（H5N1 HPAIV）也是公共卫生的一个主要关注点，因为它是禽类向人类的跨物种传播，并且在受感染的人类中具有高毒力。家禽接种HPAIV疫苗可以在诱导感染免疫、减少病毒脱落和减少向人群传播方面发挥重要作用。由于灭活和减毒活禽流感疫苗的局限性，包括核酸、亚单位和载体疫苗在内的其他方法已经过测试。在这些策略中，一个有希望的策略是使用NDV疫苗株作为载体，从添加的基因中表达HPAIV HA蛋白(11,25,32,35,42). 新城疫是家禽的一种重要经济疾病，自然产生的NDV无毒毒株在许多国家被广泛用作减毒活疫苗。因此，使用NDV无毒株作为载体表达HPAIV保护性抗原将提供一种针对这两种重要禽类病原体的双价疫苗。与HPAIV一样，NDV是鸡的呼吸道病原体，具有类似的细胞和组织嗜性，因此是一种非常适合的疫苗载体。其他优点包括每剂量价格低、易于给药，以及能够通过检测NDV载体疫苗中不存在的HPAIV蛋白的抗体反应来区分感染动物和接种动物(25).
我们的目标是为家禽开发一种NDV载体疫苗，对HPAIV H5N1感染产生广泛而强大的免疫。我们和其他人之前已经生产出表达H5N1型HPAIV HA蛋白的NDV载体疫苗(11,25,32,35,42). 接种了这些疫苗的鸡能够完全抵御HPAIV的攻击。由于HA蛋白被认为是主要的保护性AIV抗原，因此这些最初的研究侧重于HA蛋白。然而，AIV也编码另外两种表面抗原，即NA和M2蛋白。在自然感染或载体疫苗的背景下，NA或M2在免疫原性和保护中的作用尚不清楚。因此，我们使用rNDV作为载体，比较了三种HPAIV表面蛋白（HA、NA和M2）中的每一种对免疫原性和保护性的相对贡献，即通过眼鼻途径对鸡进行实际免疫和挑战。此外，我们评估了表达HPAIV表面蛋白组合的两种或三种rNDV组合的免疫原性和保护效果。由于NDV和HPAIV是鸡的呼吸道病原体，具有相似的细胞和组织嗜性，NDV载体可能是分析HPAIV HA、NA和M2蛋白在免疫原性和保护性中作用的最相关系统。
我们制备了分别表达HPAIV HA、NA或M2蛋白的rNDV。重组病毒在胚胎卵和DF1细胞中有效生长。Western blot分析表明，三种HPAIV蛋白均在感染不同重组病毒的DF1细胞中表达。HA和NA蛋白均被纳入NDV的包膜中。以前曾发现，表达人类流感病毒HA或NA的重组水泡性口炎病毒也被纳入载体颗粒中(22). 重要的是，在胚胎卵子的标准测试中，将HPAIV表面蛋白并入NDV颗粒并没有增加载体的毒力，这表明NDV表达HPAIV的表面蛋白不会造成生物安全危害。事实上，与减毒流感疫苗病毒相比，非片段负链病毒的基因交换率可以忽略不计，这提供了一个额外的安全因素。
在本研究中，rNDV-HA鼻腔免疫可诱导高水平的HPAIV特异性HI和中和血清抗体，并完全保护鸡免受HPAIV的有力攻击。流感病毒HA蛋白抗体阻止病毒附着，从而保护细胞免受感染(39)可能在观察到的保护性免疫中起主要作用。来自rNDV-HA免疫动物的结果不支持存在任何可检测到的HPAIV复制挑战，无论是通过脱落、尸检组织的直接分析还是激发后抗体增加进行检测，都表明限制性很高。此外，所有动物都受到保护，免受疾病和死亡。因此，与之前的研究一致(11,25,32,35,42)，HA蛋白是一种主要的独立中和和保护性抗原，用单独表达HA的rNDV载体疫苗进行单次免疫诱导了强烈的血清中和抗体反应和对HPAIV攻击的完全保护。
NA蛋白的抗体可以阻止其受体去卵巢功能，从而阻止受感染细胞释放子代病毒(39). 然而，NA-特异性抗体对HPAIV免疫原性和保护作用的个体贡献尚不清楚。编码NA蛋白的DNA疫苗对非自然宿主小鼠的AIV攻击提供保护(2,三). McNulty等人(24)结果表明，接种流感病毒的鸡能够抵抗相同NA亚型和不相关HA亚型的病毒的攻击。然而，在其他研究中，重组NA蛋白、编码NA蛋白的DNA疫苗或含有NA蛋白的α病毒类病毒颗粒对鸡的致命攻击提供了部分保护(40,44). 在本研究中，表达NA蛋白的rNDV诱导高水平HPAIV特异性NAI和中和血清抗体。人们认为，NA-特异性抗体通常与病毒的经典中和作用无关。然而，rNDV-NA诱导的中和抗体滴度仅为rNDV-HA诱导的四倍。因此，HPAIV NA蛋白是一种实质性的、独立的中和抗原。可能是NA-特异性抗体的中和作用是间接实现的：特别是，在HPAIV颗粒表面与NA结合的抗体可能会对HA介导的粘附和渗透造成空间阻碍。尽管诱导了HPAIV中和抗体，但没有一只免疫鸡免于HPAIV攻击，尽管与未接种疫苗的对照组相比，它们的生存时间延长了4至5天。用以传染性喉气管炎病毒（ILTV）为载体的NA疫苗免疫鸡时也观察到类似的结果：没有一只鸡能在挑战性感染中存活，但与未接种疫苗的对照组相比，它们的存活时间延长了1至2天(33). 在本研究中，rNDV-NA免疫并未阻止HPAIV挑战病毒的复制，但滴度降低了4.3至9.0 log10在呼吸道组织和脾脏中，在大脑中是10倍。此外，虽然HPAIV挑战性病毒的口腔脱落仅略有减少，但泄殖腔脱落显著减少，表明通过胃肠道的传播减少。这些结果表明，NA-特异性免疫可以减少HPAIV的复制并延长生存期，但不能防止在高度宽容的宿主中死亡。
AIV M2蛋白在甲型流感病毒亚型中高度保守，被认为是开发广泛交叉反应“通用”甲型流感疫苗的候选抗原。然而，M2蛋白对免疫原性和保护性的贡献尚不清楚。M2蛋白抗体可防止感染细胞释放子代病毒颗粒在体外(39). 抗M2单克隆抗体的被动转移对小鼠抗人类流感病毒具有部分保护作用(41). AIV M2蛋白被发现具有弱免疫原性，不会诱导中和抗体，但会减少非天然宿主小鼠的病毒复制(18). 针对M2通用疫苗的开发，已经评估了各种疫苗方法，包括被动转移M2特异性抗体(23,41)或用结合M2肽抗原免疫(7,26)，完整M2蛋白(16)，或M2的外部域(5,10,16). 尽管这些研究证明了在非天然小鼠宿主中对流感病毒的攻击具有保护作用，但M2蛋白在天然宿主中的免疫原性和保护作用尚未评估。rNDV-M2疫苗在所有免疫鸡中都能产生良好的M2抗体反应，尤其是单独接种时，但免疫后血清不能中和同源病毒在体外HPAIV攻击后，死亡率没有减少，生存期也没有延长。事实上，目前的挑战性研究表明，在未免疫对照鸡死亡之前，有一只免疫鸡死亡，表明疾病可能加剧。M2免疫猪在激发后病情加重(12). 在本研究中，在对rNDV-M2免疫动物进行HPAIV攻击后，口腔或泄殖腔脱落或尸检组织中HPAIV滴度没有明显下降，表明攻击HPAIV复制没有明显限制。这些结果表明，HPAIV M2蛋白在诱导鸡产生中和抗体和保护鸡方面没有显著作用。
此外，通过用表达HPAIV表面蛋白的不同rNDV组合的等量混合物同时免疫鸡，评估了多种HPAIV的表面蛋白在免疫原性和保护性方面的联合作用。Western blot分析表明，用各种病毒组合免疫的鸡产生了针对每种AIV蛋白的抗体，HA和NA抗体的诱导通过HI和NAI分析独立监测。在具有双重组合的组中，用rNDV HA和rNDV NA组合免疫的鸡对两种HPAIV蛋白都产生了良好的抗体反应，并且完全免受HPAIV攻击。未检测到攻击病毒的复制或脱落，表明rNDV-HA+NA组合的疗效与rNDV-HA相当。然而，DIVA分析表明，用rNDV HA+NA免疫的鸡的HPAIV攻击诱导了对HPAIV NP蛋白的可检测抗体，而在单独用rNDV HA免疫的动物的攻击后没有观察到这一点。这表明当rNDV-HA与rNDV-NA联合使用时，HPAIV复制出现了一些突破性进展，表明rNDV-HA在联合疫苗中的效力降低。这与以前使用重组鸡痘病毒（rFPV）和ILTV载体系统进行的研究不同，在这些系统中，NA与HA的联合表达提高了鸡的免疫原性(33,34). 这些研究结果的差异可能反映了用于表达HA和NA蛋白的载体系统的差异。或者，HA诱导的免疫水平如此之高，以至于NA的贡献被掩盖了。当rNDV-M2与rNDV-HA或rNDV-NA混合时，我们还观察到疗效降低，免疫原性降低。rNDV-M2的加入导致由rNDV-HA和/或rNDV-NA诱导的HI、NAI和HPAIV中和抗体的滴度显著降低。相反，混合用药时，M2特异性抗体的滴度也显著降低。rNDV-M2与rNDV-NA的结合对HPAIV的复制或rNDV-NA诱导的生存期延长没有显著影响。然而，rNDV-M2与rNDV HA或rNDV HA+NA的结合大大降低了部分动物的保护效力水平，如挑战性HPAIV复制增加和生存率降低所证明的。此外，当将三种rNDV作为三价疫苗接种时，AIV蛋白（HA、NA和M2）的抗体的产生水平不同。尤其是M2抗体的产生水平低于HA和NA抗体。这可能是由于三个rNDV之间的干扰或竞争造成的。rNDV-HA或rNDV-NA可能干扰rNDV-M2的复制。另外，三家rNDV之间存在增长竞争。rNDV-HA和rNDV-NA在生长方面优于rNDV-M2，导致针对M2蛋白的抗体产生量降低。M2蛋白的已知细胞毒性也可能(4,17)影响rNDV-HA和rNDV-NA的复制和免疫反应。这表明，rNDV-M2及其参与的所有组合对载体的NDV特异性免疫反应也较低。总之，含有rNDV-HA的载体组合保留了大量免疫原性和保护效力，与HA作为主要中和和保护抗原的地位一致，但包含表达其他蛋白的rNDV并没有增加中和抗体或保护性免疫。在这项研究中，细胞介导免疫在保护中的作用尚未评估。将血清抗体从一只鸡转移到另一只鸡的被动抗体实验将很有趣，以了解抗体对使用这些表达AIV抗原的rNDV载体产生的细胞免疫反应的作用。
目前可用的人乳头瘤病毒疫苗的一个主要问题是，它们不能诱导足够的免疫力来完全防止人乳头瘤艾滋病病毒感染和随后的病毒脱落。尽管动物可以免受严重疾病和死亡的影响，但它们可以将高致病性禽流感传染给未接种疫苗的羊群和人类。因此，理想的HPAIV疫苗应能完全防止任何挑战性病毒复制。我们的研究表明，rNDV-HA单独使用可充分保护鸡，并完全阻止可检测到的HPAIV复制和脱落。因此，这些鸟类不会构成传播威胁。总之，本研究的结果表明，HA蛋白显然是HPAIV的主要中和和保护性抗原，也是HPAIV载体疫苗的首选蛋白。NA蛋白诱导了大量的HPAIV中和抗体滴度，但免疫不足以抵抗HPAIV攻击，尽管它延长了生存期。M2蛋白既没有诱导中和抗体，也没有对HPAIV攻击提供保护。这些发现表明，表达HA的NDV载体疫苗优于由表达HA、NA和M2蛋白的rNDV组成的联合疫苗。额外的HPAIV蛋白是否会提供更多的保护，如细胞免疫介导的保护，仍有待研究。
致谢
本研究得到了2005-05523和2007-04981禽流感协调农业项目（AICAP）拨款、NIAID合同N01A060009（85%支持）以及NIAID、NIH校内研究计划（15%支持）的支持。D.R.P.由NIAID-NIH HHSN266200700010C资助。
本文中表达的观点不一定反映卫生与公众服务部的官方政策，也不一定提及商品名称、商业惯例或组织就意味着美国政府的认可。
我们感谢弗拉维亚·米利蒂诺·迪亚斯（Flavia Militino Dias）、丹尼尔·洛克曼（Daniel Rockemann）和伊万·戈麦斯·奥索里奥（Ivan Gomez Osorio）在动物工作中的协助，也感谢安德烈亚·费雷罗（Andrea Ferrero）在BSL3协调。我们还感谢宋海晨在血清学分析方面的帮助。
参考文献
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