美国国家科学院院刊。2006年5月23日；103(21): 8203–8208.
来自封面
具有双重特异性的工程病毒疫苗构建物：禽流感和新城疫
,* ,* ,* ,†和*‡
Man-Seong公园
*纽约州纽约市西奈山医学院微生物系，邮编：10029；和
约翰·斯蒂尔
*纽约州纽约市西奈山医学院微生物系，邮编：10029；和
阿道夫·加西亚·萨斯特雷
*西奈山医学院微生物系，纽约州纽约市10029；和
大卫·斯韦恩
†佐治亚州雅典美国农业部农业研究服务部东南家禽研究实验室，邮编：30605-2195
帕雷斯
*纽约州纽约市西奈山医学院微生物系，邮编：10029；和
*纽约州纽约市西奈山医学院微生物系，邮编：10029；和
†佐治亚州雅典美国农业部农业研究服务部东南家禽研究实验室，邮编：30605-2195
作者：Peter Palese，2006年3月29日
.作者贡献：M.-S.P.、J.S.、A.G.-S.和P.P.设计的研究；M.-S.P.、J.S.和D.S.进行研究；A.G.-S.和D.S.贡献了新的试剂/分析工具；M.-S.P.、J.S.、A.G.-S.、D.S.和P.P.分析数据；M.-S.P.、J.S.、D.S.和P.P.撰写了论文。
摘要
H5和H7血凝素亚型禽流感病毒和新城疫病毒（NDV）是世界各地家禽的重要病原体。具体而言，高致病性H5N1禽流感病毒是一个特别的威胁，因为它现在已经在几个大陆的40多个国家发生。由于全世界大多数鸡都接种了NDV活疫苗，我们开始开发具有双重特异性的疫苗原型，并允许对禽流感和纽卡斯尔病进行单一免疫。利用反向遗传学方法，我们构建了一种嵌合禽流感病毒，该病毒表达NDV血凝素-神经氨酸酶基因的外域，而不是H5N1禽流感病毒的神经氨酸蛋白酶蛋白。我们创造二价疫苗的第二种方法是在融合性和减毒NDV背景下表达H7禽流感病毒血凝素的外结构域。将外源基因插入NDV基因组（仅包含其外结构域，跨膜和细胞质结构域源自NDV的F蛋白）导致嵌合病毒，并将外源蛋白增强并入病毒颗粒。用这种改进的疫苗原型病毒对鸡进行一次免疫，不仅能对H7N7高致病性禽流感病毒产生90%的保护作用，而且还能对高致病性NDV产生完全免疫。我们建议开发嵌合结构，以便在鸡和其他家禽中进行方便、经济和有效的禽流感和新城疫疫苗接种。
关键词：鸡，新城疫病毒，大流行，禽流感病毒，血凝素
近年来，据报道，亚洲和欧洲爆发了高致病性禽流感(1,2). 这些涉及H5N1或H7N7流感病毒的疫情导致家禽发生致命感染，并导致少数人死亡(2–4). 近年来，H5N1病毒在中国家禽中传播(5,6)虽然候鸟被认为是这些病毒的主要宿主，但从受感染的家禽向候鸟的传播被认为是导致病毒地理分布增加的原因(7). 目前，H5N1病毒已从亚洲传播到欧洲和非洲(8). 大规模扑杀家禽被证明是消除1997年香港和2003年荷兰H5N1疫情的一项成功战略(9). 因为最近HPAI疫情的人类受害者与受感染的家禽有密切接触(10)因此，预防禽流感病毒（AIV）的种间传播可以通过屠宰消除家禽中的AIV来实现。然而，出于经济和实际原因，仅销毁受感染家禽不再被视为控制该病的首选方法。此外，出于道德和生态原因，扑杀迁徙野禽被认为是不可接受的做法。最近，世界动物卫生组织和联合国粮食及农业组织建议考虑接种家禽疫苗以控制禽流感病毒(11). 此外，据报道，在一项实地研究中，给鸡接种H5灭活疫苗成功阻断了病毒传播(12). 最近，中国已接受接种疫苗作为其AIV控制计划的一部分。因此，中国的所有家禽人口都将接种疫苗(13).
作为我们开发针对AIV和新城疫病毒（NDV）具有双重特异性的疫苗的方法的一部分，我们在此报告了禽H5流感病毒的构建，其中禽神经氨酸酶（NA）的外域被NDV的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白的外域取代。后一种蛋白质是NDV的主要抗原，已证明它能引起鸡的保护性免疫反应(14,15). 通过使用参考文献中描述的反向遗传学技术，该病毒的构建成为可能。16最近还报道了一种表达副流感HN外结构域的二价流感病毒(17).
我们开发二价疫苗的第二种方法是基于NDV平台。NDV是该属的一种高传染性禽疾病媒介腮腺炎病毒属，属于家庭副粘病毒科而且毒力可能不同(18). 包括家禽在内的250多种鸟类容易感染NDV(19). 在未接种疫苗的家禽群中，高致病性NDV或HPAI感染的死亡率可高达100%。因此，开发针对禽流感病毒和新城疫病毒的联合疫苗将有利于家禽业，并通过将接种过疫苗的家禽中的HPAI载量降低到对人的传播水平以下来改善公共卫生。
我们和其他人已经建立了反向遗传学系统来操纵NDV的基因组(20,21,31,32)允许产生表达外源蛋白的重组NDV（rNDV）。我们之前已经证明，表达流感病毒A/WSN/33（H1N1）病毒（WSN）血凝素（HA）蛋白的rNDV免疫可以保护小鼠免受致命剂量WSN的攻击(21). 在这些结果的基础上，我们首次尝试通过使用表达WT HPAI H7 HA蛋白（rNDV/B1-H7）的非致瘤rNDV载体来开发抗NDV和HPAI H7病毒的二价疫苗。然而，用这种rNDV/B1-H7免疫鸡只会诱导对HPAI和强毒力NDV的部分免疫(22). 在这里，我们开发并评估了一种针对禽流感病毒和新城疫病毒的双价候选疫苗，该疫苗基于表达嵌合HA蛋白的融合性rNDV载体。在鸡的挑战模型中，这种疫苗对这两种病原体都有更好的保护作用。
结果
产生一种表达流感病毒和NDV抗原的病毒。
为了获得对H5禽流感和NDV都有保护作用的候选活二价疫苗病毒，我们构建了一种带有嵌合片段的转染流感病毒（命名为VN/HN病毒），其中负责NA活性的编码NA外结构域被NDV HN蛋白（cHN）的外结构域取代(A类). 因为它们在感染病毒形成中的重要性(23,24)流感NA蛋白的胞质尾部和跨膜结构域被保留。大量报道表明，H5 HA和H7 HA蛋白的多基裂解肽对鸡的高致病性是必需的(25). 因此，作为一种在保留H5抗原的同时减弱转染病毒的策略，我们去除了多核苷酸切割位点，并用来源于无毒H5 HA菌株的共有序列取代它。在编码无毒H5流感毒株HA切割肽的核苷酸序列中引入腺苷残基与自发转化为毒力有关。这种引入被认为是通过聚合酶滑移机制发生的(26); 因此，为了尽可能减少腺苷残基重新引入的机会，我们改变了裂解肽区域的密码子用法，从而形成无毒的HA共识序列，命名为HAlo。基于cDNA的Fodor拯救改良版本产生了含有HAlo和cHN表达片段的转染病毒，这些片段来自编码这些改变的结构体等。(16).
产生含有嵌合NA-HN片段的转染流感病毒。(A类)编码流感病毒NA NDV HN嵌合片段的病毒RNA（vRNA）示意图。vRNA由WSN NA vRNA的前127个核苷酸组成，其中包括非编码区的19个核苷酸和编码细胞质尾部、跨膜结构域和NA柄起点的核苷酸。该结构域之后是编码NDV HN蛋白51–576氨基酸的核苷酸，包括HN外结构域和串联终止密码子（TAG-TAG）。最后一个结构域表示WSN NA ORF 5′端的185个核苷酸（157个核苷酸）及其5′非编码区（28个核苷酸）。(B类)纯化的重组VN/HN病毒的vRNA。从重组WT WSN和VN/HN病毒中提取的RNA通过含有7M尿素的2.8%聚丙烯酰胺凝胶分离，并通过银染进行可视化。显示了聚合酶（Ps）、HA（WSN）、HAlo（VN 1203）、NP、M和NS片段的位置。编码NA蛋白的RNA在VN/HN病毒中缺失。显示了一条污染的18S核糖体RNA带。(C)cHN蛋白的表达。MDCK细胞被流感病毒VN/HN或WT WSN感染。感染细胞在37°C下培养16小时，固定并用甲醇渗透。用抗NDV HN单克隆抗体（7B1）、抗H1流感HA单克隆抗体和多克隆抗H5流感HA血清通过免疫荧光法检测病毒中的特异性抗原。
为了用作疫苗，病毒必须在鸡蛋或细胞培养物中高效生长。在10天龄的鸡胚中扩增出重组病毒，并生长到8.0 log的滴度10鸡蛋50%感染剂量（EID50)每毫升。在Madin–Darby犬肾（MDCK）细胞培养中，病毒生长到5×10的滴度8每毫升的斑块形成单位，产生的斑块约为WSN大小的三分之二。
用纯化病毒粒子RNA的丙烯酰胺凝胶电泳检测病毒RNA（vRNA）与嵌合病毒粒子的结合。观察到8个病毒片段的存在，嵌合HN片段的预测大小为1911nt，在PA和HAlo片段之间迁移(B类). HA和cHN片段的同源性通过RT-PCR得到确认，并使用片段特异性引物对片段进行测序。通过纯化病毒核糖核酸的丙烯酰胺凝胶电泳，在鸡胚中的八代中，cHN片段的结合被证明是稳定的（数据未显示）。此外，通过免疫荧光证实了重组HAlo和cHN蛋白在病毒感染期间的表达。感染VN/HN病毒的MDCK细胞在感染16小时后表达HAlo和cHN蛋白，而在感染对照WSN的细胞中，HA而非HN蛋白表达(C).
融合性rNDV突变体的产生。
以前，一种表达H7 HA蛋白的非致溶血性rNDV病毒（rNDV/B1）无法产生所需的免疫原性，以完全保护鸡免受H7 HPAI和高毒力NDV的侵害(22). 为了克服这一局限性，我们开发了两种rNDV突变体，rNDV/F2aa和rNDV/F3aa，其中F蛋白的裂解位点被含有一个或两个额外精氨酸残基的蛋白取代(A类). 这些裂解位点可以被furin家族普遍表达的蛋白酶激活(27). 用rNDV/F2aa和rNDV/F3aa感染鸡胚成纤维细胞（CEF），而不感染rNDV/B1，导致在缺乏外源性蛋白酶的情况下形成合胞体（有助于病毒传播的巨大多核细胞）(B类). 此外，与rNDV/F2aa相比，rNDV/F3aa在CEF细胞中诱导合胞体的速度更快。因此，据推测，病毒在免疫动物中传播的改善可能会增强对插入的外源蛋白的免疫原性。因此，我们选择融合源rNDV/F3aa作为骨干载体，开发了一种二价疫苗，旨在保护家禽免受禽流感病毒和新冠病毒的感染。
rNDV F蛋白裂解位点的修饰。(A类)rNDV/B1基因组的示意图，其F蛋白的裂解位点有两个或三个氨基酸变化。已知这些修饰的切割位点被普遍存在的蛋白酶识别。F蛋白中被裂解的肽键用斜线表示。(B类)用修饰F蛋白感染rNDV的CEF细胞中的合胞体形成。CEF细胞感染rNDV/B1、rNDV/F2aa和rNDV/F3aa病毒，感染倍数为0.001。感染细胞在37°C下孵育，然后通过免疫荧光分析每24小时监测细胞融合的病毒传播。
鸡胚中rNDV平台载体的平均死亡时间（MDT）分析。
根据NDV对鸡的致病性，可将其分为高毒力（速原性）、中等毒力（中源性）或低毒力（致肠性）。由于已知具有多碱基裂解位点的融合蛋白（F蛋白）的存在是NDV毒力因子，因此我们用改良的F蛋白评估了10日龄鸡胚中rNDV的致病性。NDV感染鸡胚的MDT与毒力相关体内(19). 导致鸟类无症状感染的透镜菌菌株的特征是MDTs大于90小时；引起鸟类呼吸道疾病的中基因菌株在60至90小时内出现MDT；和在鸟类中引起严重疾病的快速毒株的MDT小于60小时。rNDV/F2aa的MDT表明是一种透镜状毒株，而rNDV/F3aa是典型的中基因毒株。这两个菌株都没有典型的强毒力（速生）菌株的MDT(). 根据这些数据，rNDV/F3aa载体对鸟类的威胁较小，因此适合作为开发保护家禽免受AIV和NDV感染的二价疫苗的骨干。
表1。
| 病毒 | 胰蛋白酶需要量（细胞培养） | 接种，EID50 | MDT，小时 |
|---|
| rNDV/B1型 | 是的 | 10 | 113 |
| | 1 | 122 |
| rNDV/F2aa型 | 不 | 10 | 100 |
| | 1 | 104 |
| rNDV/F3aa型 | 不 | 10 | 80 |
| | 1 | 84 |
| rNDV/B1-H7型 | 是的 | 10 | 活着 |
| | 1 | 活着 |
| rNDV/F3aa型- | 不 | 10 | 128 |
| 嵌合H7 | | 1 | 140 |
表达AIV HA蛋白外体的融合rNDV载体的构建。
为了构建嵌合HA基因以插入融合型rNDV，将来自a/chicken/NY/13142-5/94（H7N2）的H7 HA蛋白的外结构域与来自NDV F蛋白的跨膜结构域和细胞质尾部区域融合。然后将该嵌合H7 HA基因插入rNDV/F3aa载体的P和M基因之间，形成rNDV/F3aa-嵌合H8(A类). rNDV/F3aa-嵌合H7病毒通过使用参考文献中描述的方法从cDNA中解救出来。21.通过RT-PCR和测序（数据未显示）证实病毒基因组中存在插入的嵌合H7 HA基因。比较rNDV/F3aa嵌合H7在鸡胚中的生长动力学(B类). 表达嵌合H7 HA蛋白的病毒比没有插入物的病毒生长更慢，并且最大滴度低约一个对数。有趣的是，这种病毒的MDT是一种致肠菌株的MDT（≈128–140小时）(). 感染36小时后，通过感染Vero细胞的Western blotting证实rNDV/F3aa嵌合H7中H7 HA嵌合蛋白的表达(C).
表达HPAI H7 HA蛋白的融合性rNDV载体的构建和鉴定。(A类)rNDV/F3aa-嵌合H7 cDNA构建的示意图。H7 HA蛋白的外结构域与NDV F蛋白的跨膜结构域和胞质尾部融合。该嵌合H7 HA基因插入rNDV/F3aa载体的P和M基因之间。(B类)病毒生长动力学的比较。用每种病毒的100个形成斑点的单位接种10日龄鸡胚，并在不同时间点（接种后24、48和72小时）收集尿囊液。病毒滴度（组织培养50%感染剂量，TCID50)用抗NDV兔血清和抗兔IgG FITC标记的抗体（DAKO）通过免疫荧光测定法测定Vero细胞中的抗体。(C)在感染rNDV的细胞中表达WT H7 HA蛋白或H7 HA嵌合蛋白。感染后36小时收集感染细胞，并使用细胞裂解物进行免疫印迹分析。(D类)与WT H7 HA蛋白相比，H7 HA嵌合蛋白在rNDV病毒中的掺入量增加。从感染的鸡胚尿囊液中纯化出rNDV/B1-H7和rNDV/F3aa-嵌合H7。在SDS/10%聚丙烯酰胺凝胶上分离rNDV/B1-H7或rNDV/F3aa嵌合H7的病毒蛋白。将病毒蛋白转移到硝化纤维素膜上，用抗鸡H7-HA多克隆抗体和抗鸡IgG过氧化物酶标记抗体（Jackson ImmunoResearch）通过化学发光检测H7-HA蛋白。
改良AIV H7 HA蛋白并入rNDV病毒。
我们假设含有NDV F蛋白异源跨膜和细胞质尾部区域的嵌合H7 HA蛋白的表达与增强并入rNDV病毒有关。为了解决这个问题，按照材料和方法用抗鸡禽流感病毒H7多克隆抗体或抗兔NDV多克隆血清，通过Western blotting检测rNDV/B1-H7或rNDV/F3aa嵌合H7中H7 HA蛋白或NDV病毒蛋白的含量。正如预期的那样，与WT H7 HA蛋白相比，rNDV病毒中嵌合H7 HA蛋白质的掺入量显著增加(D类). 这些数据表明，NDV F蛋白的跨膜和细胞质尾部区域在外源蛋白更好地融入病毒表面方面起着重要作用。
鸡的免疫和挑战。
用rNDV/F3aa嵌合H7接种一次或两次后，50-80%的接种鸡对H7禽流感病毒有血凝抑制（HI）滴度，90-100%的鸡对NDV有HI滴度(). 相反，所有用亲本NDV/B1（pNDV）免疫两次的鸡对NDV具有HI滴度，但没有一只对H7 AIV具有滴度。所有无菌组织培养基（假）感染的鸟类对任何一种病毒都缺乏HI滴度。当用NDV强毒株（快速繁殖NDV，vNDV）攻击时，rNDV/F3aa-嵌合H7-和pNDV免疫的鸡100%受到保护。相比之下，90%的rNDV/F3aa嵌合H7疫苗接种鸡受到了HPAI H7病毒的保护，但没有一只pNDV疫苗接种鸡得到了保护。相比之下，病毒性新城疫病毒（vNDV）和人乳头状瘤病毒（HPAI H7）分别感染了100%和70%的假感染鸟类，导致它们死亡。幸存者出现了一种记忆反应，证明各自挑战病毒的HI滴度增加了4倍或更多，但sham-HPAI H7-病毒挑战组中的三名幸存者没有感染的血清学证据。
表2。
| 疫苗组* | 激发前HI血清学（GMT）
| 挑战病毒 | 幸存者人数 | 激发后14天HI血清学（GMT）
|
|---|
| 禽流感病毒/H7抗原 | NDV抗原 | AIV/H7抗原 | NDV抗原 |
|---|
| rNDV/F3aa-嵌合体H7，1× | 8/10 (11) | 10/10 (49) | vNDV（虚拟NDV） | 10/10 | 9/10 (15) | 10/10 (416) |
| rNDV/F3aa-嵌合体H7，1× | 7/10（10） | 10/10 (49) | 高致病性禽流感病毒 | 9/10 | 9/9 (2,048) | 9/9 (37) |
| rNDV/F3aa-嵌合体H7，2× | 8/10 (13) | 9/10 (56) | vNDV（虚拟NDV） | 10/10 | 7/10 (17) | 10/10 (315) |
| rNDV/F3aa-嵌合体H7，2× | 5/10 (9) | 9/10 (60) | 高致病性禽流感病毒 | 9/10 | 8/8 (955) | 8/8 (30) |
| pNDV，2× | 0/10 | 10/10 (34) | vNDV（虚拟NDV） | 10/10 | 0/10 | 10/10 (294) |
| pNDV，2× | 0/10 | 10/10 (56) | 高致病性禽流感病毒 | 0/10 | 不适用 | 不适用 |
| 假的，2× | 0/10 | 0/10 | vNDV（虚拟NDV） | 0/10 | 不适用 | 不适用 |
| Sham，2倍 | 0/10 | 0/10 | 人类免疫缺陷病毒 | 3/10 | 0/3 | 0/3 |
讨论
在家禽中接种AIV疫苗可以在减少病毒脱落和提高感染和传播阈值方面发挥重要作用。据信，接种高质量的AIV疫苗可以成为有效控制计划的一部分。结合扑杀、检疫、改进的血清学监测和高生物安全性，控制禽类中高致病性禽流感的暴发以及防止高致病性禽类向人类传播是可能的。因为在许多国家，对家禽接种NDV活疫苗是强制性的(19)应优先发展二价疫苗。与单独接种相比，这种疫苗将减少疫苗生产和管理的负担。由于这些原因，我们专注于开发活的二价病毒，这些病毒具有作为主要经济病原体AIV和NDV疫苗的潜力。
首先，通过反向遗传学，我们产生了一种流感病毒（VN/HN），该病毒表达NDV HN蛋白的外域，取代流感病毒NA。NDV的HN已被证明是引起鸡保护性免疫反应的主要抗原(14,15). 我们推断，HN蛋白将提供对NDV的保护，并在缺乏内源性NA蛋白的情况下提供必要的NA活性。VN/HN病毒在鸡胚中高效生长并稳定表达cHN片段，这两个特征是成功疫苗的基本要求。然而，使用VN/HN对2周龄白来亨鸡进行疫苗接种的初步试验表明，该病毒可能过于减弱体内诱导鸡产生高度保护性免疫反应（数据未显示）。需要进行实验来检测VN/HN在鸡胚免疫后诱导保护性反应的能力在ovo中这种方法需要一种比孵出的鸡接种疫苗所用疫苗株更弱的疫苗株。
接下来，我们选择NDV作为二价疫苗载体，因为它具有一些特性，适合用于病毒疫苗开发。病毒的RNA基因组没有整合到宿主细胞DNA中。此外，rNDV载体可以通过多次传代稳定地结合插入的外源基因，并且由于它是一种呼吸道病毒，因此可以为家禽的快速、高效和经济的大规模免疫提供一个方便的平台。在多价疫苗的情况下，这些益处成倍增加；一次免疫可以防止两种或多种病原体感染。虽然如果一种病毒的存在干扰了另一种的生长或免疫原性，同时接种多种减毒活病毒可能会导致并发症，但这些问题完全可以通过使用单一的二价病毒疫苗来解决。因此，我们建议，通过使用最近开发的反向遗传学技术(20,21)有可能开发出新一代有效、经济、方便的二价减毒活疫苗。
2003年，荷兰爆发了高致病性禽流感H7N7疫情，3000万只鸡被宰杀，导致H7N7~89人感染，导致一名兽医死亡。此外，2004年加拿大出现了一种HPAI H7N3病毒，该病毒也传播给人类(2,三). 因此，在本研究中，我们生产了表达H7 HA蛋白的rNDV，目的是保护家禽免受HPAI H7和NDV的感染，并在鸡中显示了其功效。我们建议，来自HPAI H5N1或HPAI H7N7病毒遗传变异以及其他潜在大流行毒株（如H9N2）的HA可以插入rNDV融合载体中，以开发针对这些AIV毒株和NDV的双价疫苗。此外，rNDV载体可能携带两种不同亚型的HA作为额外的转录单位，这为开发保护家禽免受多种HPAI毒株感染的二价疫苗开辟了可能性。
使用常规AIV或NDV疫苗的一个限制是，接种疫苗的家禽经常无法与自然感染的家禽区分开来，这使得血清学监测难以进行。然而，用rNDV/F3aa-chimericH7等二价疫苗接种鸟类，它诱导鸡对H7 HA和NDV产生免疫反应，使对禽流感进行血清学监测成为可能，因为接种疫苗的动物缺乏对整个流感中存在的抗原的免疫反应。因此，我们的二价疫苗适合用作“区分感染动物和接种动物”（DIVA）疫苗。基于NDV透镜株的NDV疫苗在家禽中广泛使用。嵌合NDV/AIV二价疫苗将以与常规NDV疫苗相同的方式接种，但将提供对NDV和AIV的保护。
Velogenic NDV株能够在缺乏外源蛋白酶的情况下，在感染多种细胞后有效地传播到邻近细胞。这种特性部分由病毒的F蛋白介导。NDV的F蛋白被合成为一种非活性前体（F0），需要裂解成异二聚体（F1–F2）才能发挥功能。F蛋白的裂解由识别F1和F2亚基之间裂解位点的宿主蛋白酶介导。当F1–F2异二聚体在感染细胞表面表达时，它诱导感染细胞与邻近细胞融合，从而形成合胞体。由于合胞体的诱导有助于病毒在细胞间传播，因此在家禽中使用具有快速NDV衍生F裂解位点的疫苗可能会引起潜在的安全问题。然而，当我们在高度减毒的rNDV/B1的F蛋白中引入一个多碱基切割位点时，所产生的病毒并没有获得在鸡胚中MDT＜60小时的致绒菌株的典型特征。
我们推测，增强H7 HA蛋白与rNDV病毒的结合可能提供更好的体液免疫反应，从而提高鸡对高致病性AIV的保护水平。然而，以前曾观察到rNDV表达的流感病毒WSN HA蛋白的病毒粒子掺入量低于流感病毒表达的同源HA蛋白(21). 如果H7 HA蛋白包含NDV包膜糖蛋白（F）的细胞质尾部和跨膜结构域，这是高效病毒组装所必需的，而不是其自身，则会导致HA增强并入病毒颗粒中，并提高病毒的免疫原性。事实上，使用一种改进的NDV载体，增强了细胞间传播，并允许将禽HA有效地并入病毒颗粒中，从而使其对A型HPAI毒株的攻击具有90%的保护作用，并完全保护其免受快速NDV的攻击。
总之，使用反向遗传学系统构建嵌合流感或NDV病毒为保护家禽免受现有和新出现的HPAI病毒以及NDV病毒的侵害提供了一种实用的策略。预计这些方法也将被证明有助于开发针对其他病原体的二价疫苗。
材料和方法
细胞和病毒。
293T和Vero细胞用10%的FBS保存在DMEM中。CEF细胞由10天龄的特定无色素胚胎（Charles River Laboratories，SPAFAS，Preston，CT）制备，MDCK细胞用10%FBS保存于Eagle's MEM中。WSN由基于质粒的反向遗传学生成，如参考文献所述。16，并在MDCK细胞中繁殖。我们之前已经生成了NDV的全长感染性克隆pT7NDV/B1(21). rNDV在鸡胚中增殖。
甲型流感病毒/越南/1203/04（H5N1）vRNA表达质粒的构建。
通过RT-PCR从A/越南/1203/04（H5N1）型流感病毒RNA（由美国亚特兰大疾病控制和预防中心特伦斯·坦佩善意提供）中提取的cDNA，在PolI启动子和pPolI-SapI-RT质粒中的三角肝炎病毒核酶之间克隆(28). 使用能够随后将全长病毒片段克隆到pPolI-SapI-RT中的引物，通过PCR扩增出A/越南/1203/04（H5N1）流感病毒八个病毒片段中七个病毒片段的全长cDNA，从而产生准确的负义vRNAs。通过这种方法，将A/Vietnam/1203/04（H5N1）流感病毒的七个片段克隆到pPolI-SapI-RT中()，对应于NDV HN外结构域的区域（即氨基酸51–576），然后是串联终止密码子，通过PCR扩增并插入WSN NA vRNA的前127个核苷酸和最后185个核苷酸之间。
HA的改性以去除多基裂解肽。
pPolIVN1203-HAlo被设计用于产生HA vRNA，其中HA编码序列的核苷酸1014–1038被改变为基于无毒禽流感a H5毒株的一致序列。核苷酸序列从CAA AGA GAG AGA AGA AAA AAG AGA GGA改变为CAG CGG GAG ACG GGA。对该区域的密码子用法进行了修改，以减少核苷酸序列中腺苷残基的存在，并通过聚合酶滑移将腺苷残基重新引入的机会降至最低，从而将碱性残基引入HA蛋白裂解位点(26). 因此，该区域的编码氨基酸序列与QRERRRKR发生了改变↓G至QRETR↓G（箭头表示解理位点）。
转基因流感病毒的产生。
为了产生表达NDV HN外结构域的嵌合流感病毒，将15个质粒中的每个质粒转染到293T细胞单层中。每个转染包含用于A/Vietnam/1203/04PA、PB1、PB2、HAlo、NP、M和NS片段的vRNA表达质粒；cHN片段；以及来自WSN的蛋白表达质粒pCAGGS-PA、PB1、PB2、NP、HA、NA和NS1(29). 在转染后48小时，收集上清液，并将转染病毒传递到10天龄的鸡胚中。转染病毒的RNA片段如参考文献所述。30.
F蛋白中具有修饰裂解位点的rNDV的产生。
为了产生rNDV/F3aa，使用引物（重叠区域用下划线表示）F3aa-1（+），5′-GGA TCC CGG TTG GCC TCC AGG-3′和F3aa-1,5′生成了两个PCR片段-AAa GCG CCt CTG TCT CCg CC公司C TCC AGA TGT AGT CAC AG-3′；和F3aa-2（+），5′-GGc GGA GAC AGa GGc GCt TT公司标签GCG CCA TTA TTG G-3′与F3aa-2（−）5′-CCA TAT TCC CAG CTA GAT TGT-3′；以及pT7NDV/B1作为模板。对小写的核苷酸进行突变，以修改NDV/B1株（GGRQGR）F蛋白裂解位点的氨基酸序列↓五十） 至G对RQ（请求）对对↓F类（修饰的氨基酸以斜体显示）。使用引物F3aa-1（+）和F3aa-2（−）通过PCR将这些重叠片段组合在一起。将得到的PCR片段克隆到pSLF3aa中。将pSLF3aa的StuI–NotI片段（核苷酸4646–4952）切除，以替换pT7NDV/B1质粒中的相应片段，从而形成pT7NNDV/F3aa质粒，该质粒用于通过反向遗传学产生rNDV/F3A病毒。为了产生rNDV/F2aa，采用上述相同的策略，用引物F2aa-1（+），5′-GGA TCC CGG TTG GCC TCC AGG和F2aa-1-AAG GCG CCt CTG TCT CCg CC公司C TCC AGA TGT AGT CAC AG-3′；和F2aa-2（+），5′-GGc GGA GAC AGa GGc GCC TT公司带有F2aa-2（−）5′-CCA TAT TCC CAC CAG CTA GAT TGT-3′的标签GCG CCA TTA TTG G-3′；以pT7NDV/B1为模板。使用引物F2aa-1（+）和F2aa-2（−）通过PCR将两个重叠的PCR片段结合在一起，从而改变GGRQGR的裂解位点↓L到G对RQ（请求）对对↓L。
表达嵌合H7 HA蛋白的融合rNDV载体的构建。
为了构建H7 HA嵌合基因作为rNDV/F3aa的外转录单位，首先利用引物HpaNDV F（TM+CYTO）P，5′-cg GTT AAC CTC ATT ACC TAT ATC GTT TTG ACT-3′，通过PCR产生NDV F基因的跨膜（TM）和胞质尾部（CYTO；和SacNhe NDVF（TM+CYTO）M，5′-cg GAG CTC AAG CTA GCT TAT CAC ATT GTA GTG GCT CTC ATC TG-3′；NDV F基因作为模板。该PCR产物经SacI和HpaI消化后，克隆到具有NDV基因末端和基因启动信号的质粒pNhe-NDV-GE/GS中，产生质粒pNhe-NDV-GE/CS-NDVF（TM+CYTO）。下一步，利用引物SpeH7（ECTO）P，5′-cg ACT AGT CCA CCA TGA ACA CTC AAA TTC TGG CAT TCA T-5′，通过PCR扩增H7 HA外结构域编码区，使其与NDV F的TM和CYTO区相连接；HpaH7（ECTO）M，5′-cgG TTA ACG TCT TTG TAT CCA CTC AAT TTC AC-3′；以A/chicken/NY/13142–5/94（H7N2）中的H7 HA基因为模板。该PCR产物用SpeI和HpaI消化，然后插入盒式质粒pNhe-NDV-GE/GS-NDVF（TM+CYTO）。在最后一步中，用NheI消化盒式质粒，以切出嵌合的H7 HA基因。该DNA片段被克隆在pT7NDV/F3aa的P基因和M基因之间，形成pT7NDV/F3aa-嵌合H7。然后使用反向遗传学从pT7NDV/F3aa-嵌合H7中拯救表达嵌合H7 HA蛋白的rNDV/F3aa病毒(21).
病毒生长动力学。
将rNDV（每个鸡蛋100个斑点形成单位）接种到10天龄的鸡胚中。采集尿囊液以测定不同时间点（24、48和72小时）的病毒滴度。组织培养50%感染剂量（TCID50)用免疫荧光法测定尿囊液中的每种病毒。
免疫荧光分析。
将感染流感病毒转染的MDCK细胞固定并用冰镇甲醇渗透。用抗新城疫病毒HN单克隆抗体（7B1）、抗流感H1 HA单抗（2G9）和抗流感H5 HA多克隆血清检测病毒抗原。为了分析NDV的生长，汇合的Vero细胞被rNDV感染，分别在24、48和72小时收获。感染细胞用含有0.1%Triton X-100的2.5%甲醛固定。用抗兔NDV多克隆抗体处理固定细胞，洗涤并用FITC-结合抗兔免疫球蛋白（DAKO）染色。
MDT。
为了检测鸡胚中rNDV的致病性，测定了MDT。简单地说，五个10天龄的鸡胚被连续10倍稀释的病毒感染。鸡蛋在37°C下孵化，每天监测两次，持续7天。记录了杀死胚胎的时间。杀死所有胚胎的最高稀释度被确定为最低致死剂量。MDT被计算为杀死胚胎的最小致死剂量的平均时间。
西方印迹法。
融合Vero细胞的培养皿（直径100 mm）被rNDV感染，感染倍数为1。感染后36小时，在RIPA缓冲液（0.15 mM NaCl/0.05 mM Tris·HCl，pH 7.2/1%Triton X-100/1%脱氧胆酸钠/0.1%SDS）中制备细胞提取物。用SDS/PAGE分析等量蛋白质。用抗兔NDV多克隆或抗鸡AIV H7多克隆血清免疫印迹H7 HA和NDV衍生蛋白。通过Western blotting检测H7 HA蛋白与病毒的结合。对于此Western blot，通过蔗糖垫纯化感染鸡胚尿囊液中的病毒颗粒，并使用Bradford检测试剂盒（Bio-Rad）测量每种病毒的总蛋白量。如上所述，通过免疫印迹法分析等量的蛋白质。
鸡的免疫和挑战。
在结膜囊内滴眼液给白来亨鸡接种一次或两次105.7–6.1平均鸡肉EID50rNDV/F3aa-chimericH7或两次105.7–6.3电子数据交换50pNDV，或在2周龄和4周龄时用无菌组织培养基（sham）培养两次。在6周龄时，用vNDV（105.1电子数据交换50每只鸟）或A/Human/Steele/59（H7N7）HPAI（105.1电子数据交换50每只鸟）。幸存者在挑战后14天流血身亡。使用标准程序测定HI血清学滴度。根据美国农业部的指导方针，所有挑战实验都是在佐治亚州雅典的美国农业部家禽研究实验室进行的。
致谢
我们感谢Neva Morales和Joan Beck提供的专家技术援助。这项工作得到了美国国立卫生研究院P01 AI58113-02（发给A.G.-S）、U54 AI057158-03（发给P.P.）和R01 AI18998-25（发给P.P）的支持；东北生物防御中心职业发展计划；以及美国农业部农业研究服务部（D.S.）。P.P.是埃里森医学基金会的高级研究员。
缩写
| 高致病性禽流感 | 高致病性禽流感 |
| AIV公司 | 禽流感病毒 |
| 净现值 | 新城疫病毒 |
| 不适用 | 神经氨酸酶 |
| 海南 | 血凝素-神经氨酸酶 |
| rNDV公司 | 重组NDV |
| 哈 | 血凝素 |
| 无线传感器网络 | 流感A/WSN/33（H1N1）病毒 |
| 立方厘米 | 嵌合体HN |
| 电子数据交换50 | 鸡蛋50%感染剂量 |
| MDCK公司 | Madin–Darby犬肾 |
| vRNA | 病毒RNA |
| 首席执行官 | 鸡胚成纤维细胞 |
| MDT公司 | 平均死亡时间 |
| F类 | 融合蛋白 |
| 夏威夷群岛 | 血凝抑制 |
| pNDV病毒 | 父母NDV |
| vNDV（虚拟NDV） | 快速NDV。 |
脚注
利益冲突声明：西奈山医学院拥有负链RNA病毒（A.G.-S.和P.P.）反向遗传学的专利地位。
工具书类
1Horimoto T.、Kawaoka Y。自然修订版微生物。2005;三:591–600.[公共医学][谷歌学者] 2Koopmans M.、Wilbrink B.、Conyn M.、Natrop G.、van der Nat H.、Vennema H.、Meijer A.、van Steenbergen J.、Fouchier R.、Osterhaus A.、Bosman A。柳叶刀。2004;363:587–593.[公共医学][谷歌学者] 三。Tweed S.A.、Skowronski D.M.、David S.T.、Larder A.、Petric M.、Lees W.、Li Y.、Katz J.、Krajden M.和Tellier R.等人。突发感染。数字化信息系统。2004;10:2196–2199. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Chen H.、Smith G.J.、Li K.S.、Wang J.、Fan X.H.、Rayner J.M.、Vijaykrishna D.、Zhang J.X.、Zhang L.J.、Guo C.T.等人。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2006;103:2845–2850. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6肖特里奇K.F。塞明。回复。感染。1992;7:11–25.[公共医学][谷歌学者] 7陈海、史密斯·G.J.、张世勇、秦凯、王杰、李国胜、韦伯斯特·R.G.、佩里斯·J.S.、关毅。自然。2005;436:191–192.[公共医学][谷歌学者] 9Lipatov A.S.、Govorkova E.A.、Webby R.J.、Ozaki H.、Peiris M.、Guan Y.、Poon L.、Webster R.G。J.维罗尔。2004;78:8951–8959. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Ellis T.M.、Leung C.Y.H.C.、Chow M.K.W.、Bissett L.A.、Wong W.、Guan Y.、Malik Peiris J.S。鸟类病理学。2004;33:405–412.[公共医学][谷歌学者] 14Boursnell M.E.、Green P.F.、Samson A.C.、Campbell J.I.、Deuter A.、Peters R.W.、Millar N.S.、Emmerson P.T.、Binns M.M。病毒学。1990;178:297–300.[公共医学][谷歌学者] 15Edbauer C.、Weinberg R.、Taylor J.、Rey-Senelonge A.、Bouquet J.F.、Desmettre P.、Paoletti E。病毒学。1990;179:901–904.[公共医学][谷歌学者] 16Fodor E.、Devenish L.、Engelhardt O.G.、Palese P.、Brownlee G.G.、García-Sastre a。J.维罗尔。1999;73:9679–9682. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Maeda Y.、Hatta M.、Takada A.、Watanabe T.、Goto H.、Neumann G.、Kawaoka Y。J.维罗尔。2005;79:6674–6679. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18梅奥医学硕士。架构（architecture）。维罗尔。2002;147:1655–1663.[公共医学][谷歌学者] 19亚历山大·D·J。新城疫和其他禽副粘病毒科感染。艾姆斯：爱荷华州立大学出版社；1997[谷歌学者] 20Romer-Oberdorfer A.、Mundt E.、Mebatsion T.、Buchholz U.J.、Mettenleiter T.C。《病毒遗传学杂志》。1999;80:2987–2995.[公共医学][谷歌学者] 21Nakaya T.、Cros J.、Park M.S.、Nakaya Y.、Zheng H.、Sagrera A.、Villar E.、GarcíA-Sastre A.、Palese P。J.维罗尔。2001;75：11868–11873。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Swayne D.E.、Suarez D.L.、Schultz-Cherry S.、Tumpey T.M.、King D.J.、Nakaya T.、Palese P.、García-Sastre a。禽疾病。2003;47:1047–1050.[公共医学][谷歌学者] 23弗兰多弗·A·、加西亚·萨斯特雷·A·，巴斯勒·C·F·，帕莱斯·P·。J.维罗尔。2003;77:9116–9123. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Barman S.、Adhikary L.、Chakrabarti A.K.、Bernas C.、Kawaoka Y.、Nayak D.P。J.维罗尔。2004;78:5258–5269. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Webster R.G.、Bean W.J.、Gorman O.T.、Chambers T.M.、Kawaoka Y。微生物。版次。1992;56:152–179. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Perdue M.L.、Garcia M.、Senne D.、Fraire M。病毒研究。1997;49:173–186.[公共医学][谷歌学者] 27de Leeuw O.S.、Hartog L.、Koch G.、Peeters B.P。《病毒遗传学杂志》。2003;84:475–484.[公共医学][谷歌学者] 28Pleschka S.、Jaskunas R.、Engelhardt O.G.、Zurcher T.、Palese P.、García-Sastre a。J.维罗尔。1996;70:4188–4192. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Niwa H.、Yamamura K.、Miyazaki J。基因。1991;108:193–199.[公共医学][谷歌学者] 31Peeters B.P.、de Leeuw O.S.、Koch G.、Gielkens A.L。J.维罗尔。1999;73:5001–5009. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Krishnamurthy S.、Huang Z.、Samal S.K。病毒学。2000;278:168–182.[公共医学][谷歌学者] 
