上皮-肌成纤维细胞转化中的命运决定机制：Smad3的主要抑制作用

两个输入的刺激效应在CArG盒上收敛

接下来，我们试图确定负责LCM效应、TGF-β及其协同作用的关键启动子元件。SMA启动子的近端包含几个调控元件，包括两个CArG盒、两个SBE和一个TGF-？控制元件（TCE；图1 B). 正如我们和其他人进行的早期研究表明，LCM激活Rho通路(Fan等人，2007年;Busche等人，2008年)，我们假设LCM可能主要通过CArG盒发挥作用，而TGF-β的作用可能主要由SBE和/或TCE介导。为了表征这些元素的重要性，我们生成了一组荧光素酶报告子结构，其中含有SMA启动子的各种突变(图1 B). 用野生型（WT）或突变型SMA启动子质粒以及内部对照质粒pRL-TK转染细胞，并用TGF-β和/或LCM处理24 h(图1C). 与我们之前的结果一致(Masszi等人，2004年;Fan等人，2007年)TGF-β和接触性损伤均诱导启动子活性适度增加（分别为2.6倍和4倍），而联合治疗协同作用（13倍）。首先，我们研究了真正的TGF-β反应区域，即两个SBE和TCE位点的作用。有趣的是，这些元素单独或联合失活突变既不会抑制单独治疗的效果，也不会影响它们的协同作用。此外，当细胞受到LCM或联合治疗的攻击时，TCE中含有突变的启动子结构表现出明显高于WT的激活。相反，CArG位点的失活大大降低了所有处理的效果。CArG-A盒的突变具有强烈但不完全的抑制作用，而CArG-B和双突变体对LCM、TGF-β或其组合完全无反应(图1 C). 短的152-bp启动子片段包含两个完整的CArG盒，但缺少SBE1和E盒，对这两种刺激仍然敏感(图1 C，插图）。总之，这些发现表明，CArG盒不仅对接触性损伤（Rho/Rho激酶介导；Fan等人，2007年;Sebe等人，2008年)启动子的激活以及TGF-β触发的反应和这些刺激之间的协同作用。相反，所有真正的TGF-β元素（SBE和TCE）都是可有可无的。

TGF-β延长损伤诱导的MRTF核蓄积

鉴于两次点击的影响在CArG盒上收敛，我们希望确定这些刺激如何影响MRTF的核质转运。我们问他们的协同作用是否可以用他们对MRTF定位的协同作用来解释。为了解决这个问题，我们使用了免疫荧光显微镜(图2，A和B)核提取物的免疫印迹(图2、C和D). 这两种方法得到了相似的结果：在未经处理的完整融合单层细胞中，MRTF是细胞溶质。单用LCM可诱导MRTF快速（30分钟）和强劲的核移位(图2). 然而，这种反应是短暂的，因为在2小时时，核MRTF的细胞数量显著减少(图2，A和B)以及核MRTF总含量(图2、C和D). 此后，MRTF保持在这个略高于基底层的水平。仅TGF-β在最初2 h内未诱导任何MRTF易位，即使在6 h后，也仅在小部分细胞（～10%）中引起中度易位。这与我们之前的数据一致，即TGF-β本身无法诱导融合单层中SMA的表达(Fan等人，2007年). 重要的是，TGF-β诱导MRTF易位的无能并非由一般无反应性引起：TGF-(图2 E). 此外，当TGF-β与LCM一起添加时，具有强核MRTF易位的细胞数量和总核MRTF含量均高于LCM刺激后的峰值，重要的是，在研究期间（24小时），其显著高于LCM诱导的水平。值得注意的是，当与LCM联合使用时，TGF-β显著促进了核MRTF的积累，即使在单独使用时也没有影响。这些发现表明，尽管TGF-β是一种在完整上皮中诱导MRTF易位的非常弱的刺激物，但它增加并延长了接触损伤引起的MRTF的核积累。这种效应可能有助于组合刺激和随后的EMyT之间的协同作用。

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图2。

TGF-β增强并延长损伤诱导的MRTF核蓄积。（A） 将汇合单层暴露在指示的刺激物下不同时间，进行MRTF染色，并通过免疫荧光显微镜观察。棒材，30µm。（B） 图像被量化为MRTF核聚集清晰的细胞百分比。（C） 从如图所示处理的细胞中制备细胞核提取物。通过Western blotting从含有等量（5µg）蛋白质的提取物中观察核MRTF。组蛋白验证了等负荷（显示为LCM条件）。WCL，全细胞裂解物。（D） C的密度定量。数值是相对于加载在相同膜上的5µg WCL（100%）中MRTF信号的密度来表示的(n个≥ 3). （E） TGF-β诱导融合LLC-PK1细胞中Smad3的早期和稳健的核移位和磷酸化。从如图所示处理的细胞中制备核提取物，并用总抗体和磷酸-Smad3抗体进行探测。误差线表示平均值±SEM。

Smad3是MRTF的SMA诱导效应的强抑制剂：一个令人惊讶的发现

Smad3是TGF-β信号转导的中枢介质之一，已被证明直接与MRTF结合(Morita等人，2007a). 鉴于（a）LCM和TGF-β分别诱导MRTF和Smad3的核易位，（b）这些因素可以相互作用，（c）SMA诱导效应是通过CArG介导的，我们假设Smad3-MRTF复合物可能对CArG顺式元件产生增强效应。事实上，Smads通过非SBE位点的类似增强作用以前在其他启动子中也有描述(邱等，2003). 为了测试Smad3是否确实能够促进MRTF的转录效应，将细胞与765-bp（WT）SMA-Luc/renilla报告系统以及编码标记MRTF、Myc-tagged Smad3或两者的结构体共同转染(图3 A). 正如预期的那样，MRTF强烈诱导了SMA启动子。Smad3本身并不影响SMA启动子的活性（增加了1.4倍(图3 B). 令我们惊讶的是，当与MRTF共表达时，Smad3能有效抑制MRTF诱导的SMA启动子激活(图3 A). 这种效应对Smad3是特异性的，因为Smad2的过度表达不会抑制SMA启动子(图3 C). 为了确定Smad3是否可以通过影响两个SBE或TCE盒中的任何一个来抑制MRTF（即以CArG无关的方式），我们使用了我们的三-SMA启动子突变，在该突变中这些元件被灭活。Smad3也有效地抑制了MRTF诱导的该突变体的反应。此外，在152-bp启动子上观察到同样的抑制作用，这表明抑制不需要额外的上游元件（例如e盒）(图3 A). 这些发现表明Smad3干扰通过CArG介导的MRTF的刺激作用。

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图3。

Smad3强烈抑制MRTF诱导的SMA启动子刺激，这种作用需要CArG盒和Smad3 C末端。（A） 用WT或突变SMA-Luc和pRL-TK构建物以及空载体、MRTF和/或Smad3转染细胞48小时。（B）Smad3表达能有效刺激SBE4-Luc报告者。用空载体或Smad3和SBE4-Luc/pRL-TK系统共转染细胞。（C） 细胞与SMA-Luc和空载体、MRTF和/或Smad2共转染48小时。（D）细胞与空载体（无）、N-末端（N-末端；1-210个氨基酸）或C-末端（C-末端；211-425个氨基酸）Smad3构建体、SMA-Luc/pRL-TK系统和MRTF或空载体共转染，如图所示。（E） 通过对Myc标记进行免疫染色，可以观察到N端和C端Smad3结构的类似定位。棒材，20µm。误差线表示平均值±SEM。

Morita等人（2007a）据报道，MRTF与Smad3的C末端结合，但不与Smad2的N末端结合。为了评估Smad3的抑制作用是否依赖于同一区域，我们测试了N端和C端Smad3结构体的作用(图3 D). N端半未能抑制MRTF的作用，而C端半则重述了全长蛋白的作用。这种差异效应并不是这些Smad3蛋白独特的核定位的结果，因为对它们的Myc表位进行免疫染色显示，它们的表达相似，并且都定位在细胞核占优势的细胞质和细胞核中(图3E).

接下来，我们验证了Smad3过度表达不会抑制MRTF的核移位/保留，事实上促进了MRTF核移位/保持(图S2). 因此，Smad3可能有助于TGF-β刺激后MRTF的核滞留时间延长(图2，A–D)但它强烈抑制MRTF的启动子诱导作用。

肌源性（两次命中）条件下Smad3表达减少

我们的实验表明，Smad3是TGF-β信号转导的中枢介质，可能是SMA启动子的负调控因子。然而，我们也表明TGF-β对SMA表达是必要的。为了解决这个明显的差异，我们通过测量两种撞击条件下Smad3蛋白表达水平，研究了在EMyT期间Smad3的命运(图4 A). 有趣的是，LCM本身诱导Smad3减少50%。仅TGF-β在24小时后有边际效应，48小时后略有下降。当LCM和TGF-α联合使用时，Smad3表达显著下降，48小时之后下降90%。由于Smad2和Smad4的水平保持不变，这种效应对Smad3具有选择性(图4 B).

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图4。

肌源性（两次命中）条件导致Smad3的显著丢失，并减轻MRTF–Smad3相互作用。（A） 细胞按照二次点击方案处理指定时间，并通过Western blotting评估Smad3的表达。（B） Smad3降解是选择性的。施加各种刺激24小时。（C–E）Smad3在mRNA和转录后水平上受到调节。（C） 处理24小时后，用qPCR测定Smad3 mRNA含量，并将其归一化为GAPDH含量和对照样品。（D） 如图所示，将Flag-Smad3载体转染的细胞处理24小时。通过探测标签测量Flag-Smad3水平。（E） 用5µg/ml环己酰亚胺预孵育细胞，并按指示处理12 h。通过加载等量的蛋白质来补偿因抑制从头合成而导致的总蛋白质损失。（F） MRTF–二次命中模型中的Smad3关联。按照指示处理细胞1或24小时，然后用抗MRTF抗体进行免疫沉淀。探讨了MRTF和共沉淀Smad3的沉淀。（顶部）归一化为对照的共沉积Smad3的密度定量。注意，长期联合治疗消除了LCM触发的Smad3和MRTF相关性增加。误差条表示平均值±SEM。

为了解决Smad3蛋白降低的机制，我们首先测量了两次命中方案对Smad3 mRNA的影响。TGF-β显著降低了Smad3 mRNA，而LCM仅具有边际作用。联合治疗24小时后减少50%(图4C). 由于Smad3蛋白的总损失超过了这一水平，我们还使用两种方法研究了增强蛋白质降解的潜在贡献。我们表达由人工（巨细胞病毒）启动子驱动的Flag-Smad3，或用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺处理细胞，然后测试各种刺激是否可以（进一步）降低Smad3水平。LCM和联合治疗（但不是TGF-β）诱导Flag-Smad3蛋白的强烈降低(图4 D). 此外，即使在环己酰亚胺存在的情况下，联合处理也促进了内源性Smad3的丢失(图4 E). 这些结果表明，肌源性刺激通过转录和转录后机制诱导Smad3蛋白的显著丢失，并且这一过程先于SMA的表达。

二次命中模型中Smad3与MRTF的相互作用

我们的研究结果表明，TGF-β增强的Smad3降解可能是通过MRTF去抑制MF转变的重要贡献者。为了解决这个问题，我们首先检查了MRTF和Smad3之间的关联在两次命中模型的上下文中是否发生了变化(图4 F). 在静息状态下，内源性MRTF的免疫沉淀物含有一些内源性Smad3。短期（1小时）用LCM或其组合刺激，但不单独刺激TGF-β，增加了两种蛋白质之间的联系。重要的是，在仅用LCM处理的细胞中，24小时后相关性仍然很高或进一步增加。相反，在LCM和TGF-β存在的情况下，共沉淀Smad3的量下降到未刺激细胞中的水平。对这一发现最合理的解释是，由于Smad3降解，可用于结合的Smad3较少。总的来说，长期联合刺激导致细胞核中MRTF水平增加，而MRTF–Smad3相关性没有增加。

消除Smad3可增强SMA启动子的活性

到目前为止，我们发现Smad3过表达抑制了MRTF的作用，并且Smad3在二次打击模型中降解。在接下来的实验中，我们试图检验Smad3水平的降低是否确实在EMyT期间的基因重编程中起作用。我们首先确定在二次命中模型中观察到的Smad3降解水平是否与随后的SMA启动子激活相关。为此，我们根据双击方案（LCM、TGF-β或两者）处理细胞，并在刺激后的不同时间（2、6、12、24和48小时）制备裂解物。通过Western blotting测定每个样本中Smad3的表达图4 A在平行实验中，用765-bp SMA-Luc报告基因转染细胞，并进行Western blots处理，然后测量SMA启动子的活性。获得这两个数据集后，我们绘制了SMA启动子的激活与相应Smad3表达水平的关系图(图5 A). 得到的函数最好用双曲线拟合（另见线性化形式；第页²=0.93），表示Smad3水平与相应启动子反应之间的相互关系。

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图5。

Smad3表达减少会显著促进SMA启动子活性、SMA mRNA表达以及MRTF与内源性SMA启动因子之间的相互作用。（A） 在LCM或联合治疗后的不同时间（0-48小时），通过Western blotting测定Smad3的相对水平，并与相同治疗后平行测量的相应SMA启动子活性进行对比。每个点代表三次测定的平均值。幂函数拟合导致双曲线。（插图）利用启动子活性的倒数将关系线性化。（B） Smad3沉默的效率。（C） Smad3沉默强烈增强LCM诱导的mRNA表达。用NR或Smad3 siRNA处理细胞，不处理或暴露于LCM中3或6小时，然后处理以提取RNA。通过qPCR测定SMA mRNA，并将其标准化为GAPDH。数据表示为与对照相比的倍数变化（对数刻度）。（D） Smad3沉默增强MRTF与SMA启动子的结合。将细胞转染为B中的细胞，暴露于正常培养基或LCM中1 h，并使用抗MRTF抗体进行ChIP分析。（上图）抗体相关SMA启动子信号通过qPCR定量（显示为折叠周期阈值变化）。（中间）输入的30个PCR循环后琼脂糖凝胶上显示的扩增子和MRTF抗体沉淀。（底部）证实Smad3下调的蛋白质印迹。误差线表示平均值±SEM。

接下来，我们测试了Smad3的减少是否确实是导致内源性SMA启动子激活增加的原因。用Smad3 siRNA处理细胞（导致Smad3表达减少90%；图5 B)用LCM攻击3或6 h。随后，用定量PCR（qPCR）测定SMA mRNA含量；图5 C). 我们使用LCM作为刺激物，因为它仅部分减少Smad3，而它提供了足够的MRTF易位。在对照细胞中，LCM在6小时后诱导SMA mRNA增加10倍。在没有刺激的情况下下调Smad3也会导致类似的增加。有趣的是，在Smad3缺失后，LCM引起SMA mRNA的急剧上升（比基线水平高2500倍），与单独消除Smad3的效果相比，刺激达到250倍。

为了测试Smad3的减少是否确实影响了MRTF和内源性SMA启动子之间的相互作用，我们使用了染色质免疫沉淀（ChIP）分析(图5D). 用对照或Smad3 siRNA转染细胞，并暴露于正常培养基或LCM。对MRTF进行免疫沉淀，并用针对SMA启动子近端CArG盒的PCR探针分析沉淀(Elberg等人，2008年). 来自对照细胞的MRTF免疫沉淀物捕获了一些SMA CArG-A元素，LCM处理后其水平增加。仅通过Smad3消除，共沉淀CArG-A信号没有检测到增加；然而，LCM对Smad3缺失细胞的作用更强(图5D). 总的来说，这些发现表明刺激诱导或siRNA诱导的Smad3表达减少促进了MRTF和内源性SMA启动子的CArG-A盒之间的联系，刺激启动子并增加SMA mRNA。

抑制Smad3可增强SMA和其他CArGome蛋白的表达

为了研究Smad3的减少是否真的转化为SMA蛋白水平的升高，我们比较了在对照或Smad3-siRNA存在的情况下，根据两次命中方案处理的细胞中SMA的表达(图6 A). 尽管在对照细胞中，暴露于这些刺激48小时后，SMA才被检测到(Masszi等人，2004年)，在Smad3敲除组中，出现了稳定的SMA表达(图6 A). 此外，在Smad3下调细胞中，LCM本身足以刺激SMA蛋白表达。由于LCM本身并不会导致对照细胞中SMA的表达，这一引人注目的观察结果表明，Smad3的缺失使得TGF-β对SMA表达没有必要，并导致接触性损伤，作为一次撞击，足以产生MF。当使用另一种Smad3特异性siRNA时，获得了相同的结果（未公布的数据）。为了检测Smad3缺失细胞中SMA的表达是否仍然依赖于MRTF，将细胞与MRTF和Smad3 siRNA共转染。当LCM或LCM+TGF-β被用作刺激物时，MRTF的缺失也阻止了Smad3敲除细胞中SMA的表达(图6A). 这证实了Smad3的缺失并没有将肌源程序转移到另一种途径；相反，它提高了MRTF依赖机制的效率。重要的是，在BEAS-2B肺上皮细胞和人牙龈成纤维细胞中，还观察到Smad3的缺失使SMA表达增强(图6 B)这意味着这是一种普遍现象。Smad2沉默没有这种效果(图6 C). Smad3的缺失也促进了cofilin和SRF的表达，表明Smad3也可以抑制其他CArGome蛋白的表达(图6 D). 最后，E-钙粘蛋白下调在Smad3缺失细胞中不太稳定(图6、A和E)，这一发现与Morita等人（2007a）在MDCK细胞中。总之，这些结果表明消除Smad3强烈刺激EMyT，或者相反，Smad3充当MF生成的中断或延迟器。

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图6。

一击场景。Smad3沉默造成的损伤足以诱导MRTF依赖性SMA表达，并增强其他CArG依赖性基因的表达。（A） 根据双命中方案，将汇合单层暴露于NR、Smad3、MRTF或Smad3+MRTF siRNAs 24 h，然后进行48 h处理。制备细胞裂解物，并通过Western blotting检测所示蛋白。（B） 用NR或Smad3 siRNA转染人肺上皮细胞（BEAS-2B）和牙龈原代成纤维细胞（HGF），24 h后用TGF-β处理48 h。检测全细胞裂解物中的指示蛋白。（C） Smad2沉默不促进SMA表达。用抗Smad2的siRNA转染细胞，并在A中处理2 d。检测全细胞裂解物。（D） 按照指示转染细胞，使其未经处理或暴露于LCM中，并使用抗cofilin和SRF抗体进行Western blotting处理。（E） Smad3 siRNA细胞中E-cadherin缺失不太完整。通过密度测定法分析E-cadherin印迹，并将其归一化为对照值。误差线表示平均值±SEM。

Smad3干扰SRF–MRTF交互

为了深入了解Smad3抑制MRTF功能的分子机制，我们询问它是否干扰MRTF与SRF的相互作用。为了测试这一点，我们用Myc MRTF和HA-SRF转染细胞，并在沉默后跟踪它们的关联(图7 A)或Smad3过度表达(图7 B). 前者明显促进了SRF与MRTF的相关性，而后者则显著降低了SRF和MRTF之间的相关性。为了测试MRTF和Smad3之间的关联是否确实对Smad3诱导的抑制至关重要，我们删除了MRTF-B B1盒（ΔB1p；图7 C). 选择B1箱的这一部分是因为Morita等人（2007a）已说明B1盒对Smad3结合至关重要；然而，它对SRF–MRTF关联也很重要，因此ΔB1在转录上不活跃(Zaromitidou等人，2006年). 为了克服这个问题，我们只删除了B1的近端部分，它不包含LKYHQII序列，这是SRF结合的关键核心(Zaromytidou等人，2006年). 事实上，ΔB1p保留了大量SMA启动子诱导活性(图7 D)而它与Smad3的结合显著降低(图7 C). 重要的是，与WT相比，ΔB1p对Smad3的抑制作用不太敏感（抑制率为27%对78%；图7 D). 这些发现表明Smad3与MRTF的结合是Smad3介导的SMA启动子抑制的关键机制（见讨论）。

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图7。

Smad3干扰MRTF–SRF的相互作用。（A） 用Myc-MRTF和HA-SRF以及NR或Smad3 siRNA转染细胞。通过共免疫沉淀分析MRTF与SRF的相关性。在全细胞裂解物（WCL）中检测到Smad3沉默。免疫沉淀对照为无抗体反应（No AB）或Myc转染（No Tx）。（右）显示了三个实验的密度分析。（B） Myc-MRTF和HA-SRF与空载体或Smad3共转染。用抗Myc抗体免疫沉淀MRTF，如A中的对照细胞或LCM处理的细胞（1 h）。（C） B1区的7-aa序列对Smad3结合至关重要。SRF绑定核心部分下划线。预测的Smad3结合位点（S279-P285）以斜体显示。（顶部）删除后一个区域以生成ΔB1p突变体。与WT相比，协同免疫沉淀显示Smad3与ΔB1p的相关性降低。（D）ΔB1p突变显示对Smad3抑制的敏感性降低。将SMA-Luc、ΔB1p或WT-MRTF与空载体或Smad3一起转染细胞。48小时后进行荧光素酶检测。将结果归一化为对照组（顶部；相对于对照组的倍数增加）或表示为给定MRTF结构最大效果的百分比（底部）。*，P<0.05。误差条表示平均值±SEM。

细胞培养和治疗

LLC-PK1（氯₄)细胞是猪近端肾小管上皮细胞系（由田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院R.C.Harris提供），在37°C的潮湿空气（空气/CO）中，在添加10%胎牛血清和1%链霉素/青霉素溶液（Invitrogen）的低糖二甲醚（Invit罗gen）中培养₂比率19:1）与我们之前的研究相同(Masszi等人，2003年). 在各种处理之前，将细胞在无血清条件下培养至少3小时。为了诱导细胞接触分解，用PBS（Invitrogen）彻底清洗细胞，并在名义上无氯化钙的二甲醚（LCM；Invitrogen）中培养细胞。这种处理导致通过电压计测量的跨上皮电阻瞬间下降，并在～15分钟内通过相控显微镜观察到细胞接触中断。如有指示，用TGF-β处理细胞（生化实验为4 ng/ml，启动子荧光素酶分析为10 ng/ml）。人牙龈成纤维细胞(Pender和McCulloch，1991年)由C.McCulloch（加拿大安大略省多伦多市多伦多大学）提供，BEAS-2B从美国类型培养物收藏中心购买。

质粒和瞬时转染

p765-SMA-Luc报告基因结构包含pGL3-基本载体（WT）中大鼠SMA启动子近端765-bp部分，该结构在SBE1或SBE2位点（SBE1mut和SBE2mut；胡等，2003)，以及带有152-bp长SMA启动子片段的p152-SMA-Luc报告子结构由S.H.Phan（密歇根大学医学院，密歇根州安娜堡）提供。为了在某些顺式调控元件中产生额外的（或组合的）突变，进行了基于PCR的诱变。突变（括号中）和相应的引物对如下：灭活SBE1（C⁻⁵²⁴/T、 A类⁻⁵²⁵/C、 和C⁻⁵²⁸/A） ，5′-TACAGACTTC­ATTGACTAC­ACAAAGCTTCC­AGACTAC-3′和5′-GTATGTAGTC­TGGAAGCTTG­TGTAGTCAA­TGAAGTCT-3′；突变SBE2（C⁺¹⁵/T、 A类⁺¹⁶/G、 和G^+17个/C） ，5′-CACCCACTGCAGCAGTGGAAGCCAGC-3′和5′-CTGGGCTTCTCCACTGCGGTGGT-3′(胡等，2003); 突变TCE（T⁻⁵³/C、 G公司⁻⁵²/T、 和G⁻⁵⁰/C） ，5′-TGGGAAGCGTGCAGGGATCACCA-3′和5′-TTGGTCTGATCCCTGCAGCTCCCA-3′(Hu等人，2007年); 灭活CArG-A（C⁻⁷¹/A、 C类⁻⁷⁰/A、 G公司⁻⁶³/A、 和G⁻⁶²/A） ，5′-CACCCCTGTCT­TTGCTAATTGT­TTAAGAGCA­GTGGGAGG-3′和5′-CCTCCCCTC­GCTTCTTAAAC­AATTAGCAAG­ACAGGCTG-3′；并突变CArG-B（C⁻¹²¹/A、 C类⁻¹²⁰/A、 G公司⁻¹¹³/A、 和G⁻¹¹²/A） ，5′-GTTTGTGCT­GAGGTAACTAT­ATAATTGGTT­AGAGTGAAACG-3′和5′-CGTTCACTCT­AACACAATTAT­ATAGTACCTC­AGCACAAAAC-3′(清水等，1995年).

这些突变被证明有效地阻断了相应顺式元素的功能：Smad3与突变的SBE1或SBE2结合(胡等，2003)被废除，TCE失去了转录活性(Hu等人，2007年). Smad3应答型报告子结构SBE4-Luc由A.B.Roberts（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）提供。胸腺嘧啶激酶最小启动子驱动肾小球荧光素酶内部控制质粒pRL-TK购自Promega。N末端Myc-tagged人类Smad2和N末端Myc或Flag-taged Smad3表达结构（均位于pCMV5B主干中）由L.Attisano（多伦多大学）提供。从Myc-Smad3构建体中产生N-（aa 1-210）和C-末端（aa 211-405）表达构建体。Flag标记的MRTF-B质粒由E.N.Olson（德克萨斯大学西南医学中心，达拉斯，TX）提供。该结构在LLC-PK1细胞中的表达在160和110 kD时产生两条Flag阳性带。以Flag标记的MRTF-B为模板，生成C-末端Myc-标记的MRTF-B，并将MRTF序列克隆到pcDNA3.1/Myc–His A的Xho1–Apa1位点。整个结构通过测序进行验证。利用标准PCR方法，在MRTF-B的N末端设计一个双HA标签，从而产生HA–MRTF-B。通过测序验证了该结构。使用与特定缺失上游和下游区域互补的引物对，产生了HA标记MRTF-B的B1区域缺失突变。最终构造包含7-（S279-P285；含）或13-aa缺失（S279-K291；含）。使用Pfu Turbo（安捷伦科技公司）进行PCR反应。结果产物用Dpn1内切酶消化、转化，并通过限制性消化分析或使用缺失两侧的PCR引物筛选菌落。通过测序验证所选克隆。编码HA标记人类SRF的pCGN-SRF质粒由R.Prywes产生(Johansen和Prywes，1993年). 使用FuGENE 6或Lipofectamine 2000试剂转染细胞。为了免疫沉淀异源表达的蛋白质，在实验前48小时，用5µg Flag–MRTF-B和1µg Myc-Smad3载体转染生长在10-cm培养皿上的细胞。在三重转染实验中，用4µg Myc-MRTF、4µgHA-SRF和6µg Flag-Smad3载体转染10 cm培养皿上生长的细胞24小时。

荧光素酶报告分析

荧光素酶报告分析按照我们之前的研究进行(Masszi等人，2003年,2004). 简言之，将细胞接种到6孔板上，并在～60%的汇合处转染0.5µg/孔荧光素酶构建物、0.05µg/m孔pRL-TK和2µg/k孔空载体或表达载体的混合物。16小时后，细胞被血清饥饿3小时，如果没有其他指示，则处理24小时。最后，根据制造商的说明，对细胞进行裂解，并使用双荧光素酶报告分析系统试剂盒（Promega）和光度计（Lumat 9507；Berthold）测定荧光素酶活性。对于每种情况，重复进行治疗，并重复至少三次实验。从每个样本中，对应于特定启动子结构的萤火虫荧光素酶活性被归一化为同一样本的肾小球荧光素酶活性。结果表示为与作为一个单位的未经处理的对照组的平均萤火虫/肾小球比率相比的折叠变化。

RNA干扰

从LLC-PK1细胞获得猪MRTF基因的部分序列后，生成MRTF siRNAs。值得注意的是，通过RT-PCR获得的序列与MRTF-B高度同源，但与MRTF-A不同源，这表明前者是这些细胞中表达的主要且可能是唯一的亚型。使用siRNA靶标查找程序（Applied Biosystems）确定最佳靶标序列（5′-AACATGAGTAGACATT-3′和5′-AACACAGTGAAGATAGAGAG-3′）。针对猪Smad3的siRNAs（靶序列5′-AAGAGTTCACTCCACATTC-3′；基于GenBank序列登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_214137.1”，“term_id”：“47523073”}}NM_214137.1号)和Smad2（靶序列5′-AAATACGATAGATCAGTGGGA-3′；GenBank登录号。西北_001885794.1)使用target Finder工具（Applied Biosystems）设计人类Smad3（靶序列5′-AAGGCACCACCGCAGAAC-3′；NM_005902.3）。NR对照siRNA购自Ambion。LLC-PK1细胞在无抗生素生长培养基中培养，并使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）转染100 nM siRNA。对于EMyT诱导，细胞以60%的融合率转染。过夜培养后，细胞达到完全融合，并在两次撞击模型的适当条件下处理48小时。

蛋白质印迹

处理后，将细胞刮入补充有1mM Na的Triton裂解缓冲液（30mM Hepes，pH 7.4，100mM NaCl，1mM EGTA，20mM NaF和1%Triton X-100）中_三沃₄，1mM苯基甲基磺酰氟，和Complete Mini蛋白酶抑制剂混合物（Roche）。测定蛋白质浓度，并通过在Laemmli样品缓冲液中煮沸使样品变性（Bio-Rad Laboratories）。如前所述，对等量的蛋白质（10µg）进行SDS-PAGE和Western blotting(Masszi等人，2004年). 使用密度计（GS800；Bio-Rad Laboratories）和Quantity One软件（Bio-Read Laborations）进行密度测定。

蛋白质测定

使用BCA蛋白质分析法（赛默飞世尔科学公司）以牛血清白蛋白为标准测定非变性细胞裂解液中的蛋白质浓度。

免疫沉淀

细胞生长在10-cm培养皿上，经过适当处理后，在Triton裂解缓冲液中裂解。为了去除细胞碎片，将样品在4°C下以12000rpm旋转10分钟，并取全细胞裂解物的等分试样。用蛋白G琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific）预处理上清液（约1-2 mg蛋白质），并用适当的抗体（1µG/样品）孵育。为了捕获免疫复合物，将蛋白G琼脂糖珠添加到混合物中1 h。随后，用补充有1 mM Na的Triton裂解缓冲液将珠洗涤三次_三沃₄将捕获的蛋白质洗脱到Laemmli样品缓冲液（Bio-Read Laboratories）中，并通过Western blotting进行分析。

核提取

根据制造商的建议，使用NE-PER核提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific）从生长在6厘米培养皿上的LLC-PK1细胞汇合层中制备核提取物。收集核提取物，测定其蛋白质浓度，并通过Western blotting分析等蛋白含量（5µg）的样品。用抗组蛋白抗体检查核蛋白的载量是否相等。

ChIP分析

用于ChIP实验的试剂来自EZ ChIP试剂盒（Millipore），基本上按照制造商的说明进行分析。使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）将猪Smad3或NR对照siRNA转染LLC-PK1细胞。通过对从匹配平板制备的细胞裂解物与用于ChIP分析的细胞裂解液进行Western blotting，证实了下调的效率。下调后，对细胞进行适当处理，通过超声交联、裂解和剪切（450 Sonifer；Branson）。用5µg兔多克隆MRTF抗体对DNA片段进行免疫沉淀，并从回收的复合物中提取纯化的DNA。对于阴性对照，使用正常兔IgG作为免疫沉淀抗体进行平行实验。使用引物扩增猪SMA启动子的CArG区，通过SYBR基于绿色的实时PCR（IQ5 cycler；Bio-Rad Laboratories）分析每个样本的输入和纯化DNA。引物序列如下：5′-AGTTTGTGCTGAGGTCCCTATG-3′和5′-TTCCCCAAACAGAAAGA-3′。半定量PCR也通过在3%琼脂糖凝胶上运行产品来检测79-bp扩增子。

免疫荧光显微镜

在玻璃盖玻片上生长的细胞用4%多聚甲醛固定30分钟，然后用PBS强烈清洗，并用100 mM甘氨酸在PBS中孵育10分钟。细胞在含有1%Triton X-100和0.5%牛血清白蛋白的PBS中渗透20分钟，在PBS的3%BSA中封闭1小时，并与一级抗体再孵育1小时。彻底清洗后，用相应的荧光标记的二级抗体与Cy3染料孵育细胞（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。为了同时观察共转染的Myc和Flag-tagged蛋白，首先用抗Flag（M2；Sigma-Aldrich）和Cy3标记的抗鼠抗体孵育样品，并用与FITC（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）直接偶联的抗Myc抗体（9E10）染色。为了观察F-肌动蛋白，将固定细胞与罗丹明标记的卵磷脂（Invitrogen）孵育。为了进行核标记，用DAPI（Invitrogen）对细胞进行染色，并使用荧光固定介质（Dako）将盖玻片固定在玻片上。使用显微镜（IX81；Olympus）对样品进行分析，显微镜带有UPlan S-Apo 60×1.42 NA油物镜（Olympus），并与由成像软件（QED InVivo；Media Cybernetics）控制的摄像机（Evolution QEi Monochrome；Media Control）相耦合。使用ImagePro Plus软件（3DS 5.1；Media Cybernetics）和Photoshop（CS4；Adobe）处理图像。修改仅限于亮度/对比度的微小调整。MRTF分布如前所述进行了量化(Fan等人，2007年)，除了使用更严格的标准将MRTF表示为核。沿着穿过细胞的线测量染色强度，并确定细胞质和细胞核中的平均强度（通过DAPI染色验证）。如果核质比>1.5，则MRTF定位为核定位。该值对应于通过简单目视检查评估的清晰核聚积（在未刺激细胞中，平均比率为0.6；即存在明显的核排斥）。幻灯片由两名独立观察员进行评估，在三个实验中，对每种情况下至少10个随机选择的区域（>200个细胞）进行量化。

mRNA分析

用猪Smad3或NR siRNA转染LLC-PK1细胞54小时后，去除血清3小时，用TGF-β或LCM处理或不处理3或6小时。在其他实验中，将未转染细胞暴露在二次命中方案的四种条件下24小时。经过这些处理后，使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）提取RNA，并使用iScript逆转录（Bio-Read Laboratories）从1µg总RNA合成cDNA。以GAPDH为内源性对照，使用基于SYBR绿色的实时PCR评估PAI-1、SMA和Smad3的基因表达。针对已知猪序列设计的引物对如下：SMA，5′-TGTGACAATGGTTCGCTCTGT-3′和5′-TTCGTCACCAGTGTTTTT-3′；Smad3，5′-GCAGACGTCAACAGAGTGCAT-3′和5′-ATTCACGCACCTCGTCCTTCTT-3′；PAI-1，5′-CACTCGCTCTGGTGGTGGTAGA-3′和5′-GTCTCGATGGTGCTTT-3′；GAPDH，5′-GCAAGTGGACATGGTCGCCATCA-3′和5′-AGCTTCCCATTCAGCCTTGACTACT-3′。半定量PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行分析。

统计分析

数据以至少三个类似实验的斑点或图像或所示实验次数的平均值±SEM表示。统计显著性由Student’st吨酌情使用Prism软件（4.0版；GraphPad software，Inc.）进行方差测试或单向分析（Tukey post-hoc测试）。P<0.05被认为是显著的，用星号表示。

这项工作得到了加拿大卫生研究所（CIHR）、加拿大国家科学与工程研究委员会（A.Kapus）和加拿大肾脏基金会（A.Kapus和K.Szászi）的资助。A.Masszi拥有安大略省博士后奖学金，E.Charbonney拥有皮特斯基金会奖学金，K.Szászi是KRESCENT新研究员奖的获得者（加拿大肾脏基金会、加拿大肾脏学会和CIHR）。