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.2008年12月11日；27(58):7235-47.
doi:10.1038/onc.2008.337。 Epub 2008年9月15日。

Smad3的配体依赖性泛素化受酪蛋白激酶1γ2（TGF-β信号传导抑制剂）调节

X郭 1, D S瓦德尔, W Wang女士, Z Wang（Z王）, N T利伯拉蒂, S Yong先生, X刘, X-F王
附属公司

Smad3的配体依赖性泛素化由酪蛋白激酶1γ2调节，酪蛋白激酶1γ2是TGF-β信号传导的抑制剂

X郭等。 癌基因. .

摘要

转化生长因子β（TGF-β）主要通过两个关键转录因子Smad2和Smad3介导的信号级联引发多种细胞活动。存在许多调节机制来控制Smad3的活性，从而调节TGF-β反应的强度和特异性。为了通过酵母双杂交筛选寻找Smad3的潜在调节因子，我们确定酪蛋白激酶1γ2（CKIgamma2）是一种新型Smad3相互作用蛋白。在哺乳动物细胞中，CKIgamma2选择性和组成性地结合Smad3，但不结合Smad1、-2或-4。在功能上，CKIgamma2抑制Smad3介导的TGF-β反应，包括诱导靶基因和细胞生长停滞，这种抑制依赖于CKIgama2激酶的活性。从机制上讲，CKIgamma2不会影响Smad蛋白的基础水平或受体的活性。相反，CKIgamma2通过直接磷酸化其在Ser418的MH2结构域，优先促进活化Smad3的泛素化和降解。重要的是，在存在TGF-β的情况下，Ser418突变为丙氨酸或天冬氨酸会分别导致Smad3活性的增加或减少。CKIgamma2是已知的第一个标记激活Smad3进行破坏的激酶。鉴于CKIgamma2在TGF-β信号转导中的负功能以及其在人类癌症中的过度表达，CKIgama2可能在肿瘤发生过程中起到癌蛋白的作用。

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数字

图1
图1。CKIγ2与Smad3组成性和选择性相互作用
(一)293T细胞转染了所示的构建物。细胞在添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（ULB）的通用裂解缓冲液中进行裂解+)转染后24h进行抗HA免疫沉淀。2SD，S423/425D；KD，激酶死亡；WCL，全细胞裂解物。(b条)标记的全长Smad结构体与GFP-CKIγ2（WT）共表达。按照(一). 箭头表示Flag抗体（M2）的重链（hc）。(c（c）)用10µM MG-132预处理亲代HaCaT细胞1小时，然后用或不用100μM MG-131预处理亲本HaCaT米TGF-β再作用2 h。用山羊多克隆抗CKIγ2抗体（C-20）沉淀内源性CKIγ，用单克隆抗Smad1/2/3抗体印迹内源性Smad蛋白。共沉淀Smad3用箭头表示。用一种不相关的山羊多克隆抗体（IgG）作为阴性对照。(d日)野生型Smad3和CKIγ2在MEF中共表达20h。然后用100p处理细胞米TGF-β用于指示的时间过程，然后进行裂解以进行抗标记免疫沉淀。CKIγ2、酪蛋白激酶1γ2；HA、血凝素；MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞；TGF-β，转化生长因子-β。
图2
图2。CKIγ2抑制Smad3介导的转录
(一)CKIγ2 shRNAs的验证。Flag CKIγ2（1µg）与所示的pSuperRetro质粒（pSR，3µg）共转染293T细胞。pSR-GL2含有抗荧光素酶的shRNA，用作非靶向对照。转染后24小时对细胞进行裂解，并对总细胞裂解物进行Flag-CKIγ2印迹。在本实验和大多数后续实验中，使用γ-管蛋白作为负荷控制。(b条)HepG2细胞中SBE-Lux荧光素酶测定。荧光素酶报告子（0.5µg）在TGF-β（100 p米)或添加了车辆。数据显示为平均值±标准差(c（c）和d日). 使用MBE-Lux报告器在HepG2细胞中进行类似荧光素酶分析(c（c）)或ARE-Luc记者(d日以及等量的FoxH1）。将报告构建物（1µg）和指示的pSuperRetro质粒（4µg pSR-GL2或pSR-CKIγ2-R1和-R2的组合，各2 mg）共同转染细胞。20小时后，用TGF-β（100 p米)或TβRI抑制剂SB431542（10µ米)，在分析前再持续16小时。(e（电子）)HaCaT稳定系中的3TP-Luc荧光素酶分析（见材料和方法）。用报告构建物（1µg）瞬时转染细胞，并用或不用TGF-β（100 p米). 值得注意的是，在CKIγ2-WT细胞（泳道3）中，通过连续三次转染pSuper CKIγ2，过表达的CKIγ2被瞬时敲低。各HaCaT系CKIγ2蛋白水平如下图所示。肌动蛋白被印迹以显示裂解物的等负荷。CKIγ2、酪蛋白激酶1γ2；shRNA、短发夹型RNA；转化生长因子β；TβRI、TGF-β受体I。
图3
图3。CKIγ2损伤Smad3依赖的TGF-β活性
(一)HaCaT细胞的细胞增殖试验。用不同浓度的TGF-β处理所示的HaCaT稳定系24 h三未处理细胞中的H-胸腺嘧啶核苷归一化为100%。(b条)TGF-β治疗后，在HaCaT稳定系中检测到内源性c-myc蛋白下调（100 p米). 抗肌动蛋白印迹法证实了样品的等量装载（数据未显示）。(c（c）和d日)TGF-β在HaCaT稳定系中诱导内源性p21蛋白。注意，较低浓度的TGF-β（10 p米)用于证明CKIγ2敲除细胞的反应性增强(d日). (e（电子）)经SB431542（10µ米)或TGF-β（100 p米). 星号（*），P（P）≤0.01。(（f）)野生型或激酶缺失型CKIγ2在MEF中瞬时表达。TGF-β治疗后（50 p米)，全细胞裂解物（ULB+)对指示的蛋白质进行了印迹。CKIγ2、酪蛋白激酶1γ2；MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞；TGF-β，转化生长因子-β。
图4
图4。CKIγ2促进活化Smad3的蛋白酶体降解
(一)CKIγ2不调节Smad蛋白的基础水平。用SB431542（10µ米)隔夜，用western blotting检测内源性Smad2、-3和-4。(b条)用TGF-β（50p）短暂刺激HaCaT细胞系米)如图所示。测定内源性Smad2和Smad3的C末端磷酸化。(c（c）)用TGF-β（100 p米)在不存在（左）或存在（右）20µ米MG-132型。显示激活Smad3的水平。(d日)用TGF-β（100 p米)对于所指示的时间过程，测定内源性Smad2和Smad3的总水平。(e（电子）)MEF在与TGF-β（50p米)用于指定的时间进程。测定内源性Smad2和Smad3的C末端磷酸化。(（f）)在SB431542（10µ米，‘−’）或TGF-β（100 p米在SDS裂解缓冲液中收集细胞（见材料和方法），免疫沉淀内源性Smad3，并通过抗泛素印迹分析泛素化Smad3物种。(克)用SB431542（10 m）处理表达载体控制或野生型CKIγ2的MEF米，‘−’）或TGF-β（100 p米，“+”）在20µ的存在下保持2 h米MG-132型。通过联合免疫沉淀法测定内源性Smad3与β-TrCP之间的相互作用。CKIγ2、酪蛋白激酶1γ2；MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞；TGF-β，转化生长因子-β。
图5
图5。CKIγ2在Ser418磷酸化Smad3
(一)CKIγ2在体外激酶分析。从293T细胞裂解物中免疫沉淀的标记CKIγ2（WT或KD）以及细菌纯化的His-CKIγ2中，分别与α-酪蛋白（阳性对照）或GST-Smad3（WT）在含有[32P] -γ-ATP。通过放射自显影术观察磷酸化蛋白。注意CKIγ2经历了显著的自磷酸化。(b条)His-CKIγ2与GST单独孵育，GST-S3C（WT）或GST-S3C（S418A）在类似的激酶分析中与(一). 考马斯蓝染色证实蛋白质底物负载量相等（数据未显示）。CKIγ2不磷酸化GST部分。(c（c）)所示标记的Smad3片段与载体控制或野生型CKIγ2在MEF中共同表达，而不抑制蛋白酶体功能。分析总细胞裂解液中Flag-S3NL（MH1+Linker）和Flag-S3C（MH2）的水平。CKIγ2、酪蛋白激酶1γ2；GST、谷胱甘肽S公司-转移酶；KD，激酶头；MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞；WT，野生型。
图6
图6。在TGF-β治疗后，Ser418磷酸化调节Smad3的稳定性和活性
(一)表达Smad3（WT或S418D）的MEF用TGF-β（50 p米)在没有或存在20µ米毫克-132。显示了Smad3靶基因的诱导和Smad3尾部磷酸化。(b条)用Smad3（WT或S418A）和CKIγ2（或载体对照）转染MEF。TGF-β（50 p米)对指示时间进程的处理、Smad3靶基因的诱导和Smad3尾部磷酸化进行了分析。(c（c）)Smad3-null MEF与SBE-Lux报告子和载体对照或指示的Smad3变体共同转染。用SB431542或100 p处理后测量荧光素酶活性米转化生长因子-β。(d日)表达载体对照或所示Smad3变体的HepG2细胞接受或不接受TGF-β（200 p米)显示了每种条件下的生长抑制程度（参照未经处理的细胞）。MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞；转化生长因子β；WT，野生型。
图7
图7。Smad3的“生命周期”和Smad3泛素化的调节器
Smad3泛素化在决定TGF-β信号的强度和持续时间方面具有重要作用。稳定态Smad3在Axin、GSK3-β和CKIα的调节下不断被蛋白酶体降解。另一方面，蛋白酶体降解活化的Smad3需要CKIγ2磷酸化，这可能发生在细胞质或细胞核中，也可能同时发生在两者中。CKIγ2、酪蛋白激酶1γ2；TGF-β，转化生长因子-β。
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