表达H5N1高致病性禽流感病毒血凝素或神经氨酸酶蛋白的新城疫病毒载体疫苗对猴病毒攻击的保护作用^▿

非人灵长类动物的免疫和挑战。

所有灵长类动物实验均在Bioqual公司（马里兰州Rockville）进行，该公司是国际实验室护理评估与认证协会批准的一个场所，实验方案由NIAID动物护理与使用委员会批准。在Bioqual，Inc.批准的BSL-3设施中，灵长类动物感染了HPAIV。这些研究中使用的非洲绿猴（AGM）来自圣基茨岛上的自由种群，体重3.3至7.7 kg。这两只恒河猴（RM）来自南卡罗来纳州的摩根岛，体重分别为3.0和3.1 kg。在一项确定HPAIV攻击适当模型的初步研究中，我们用10⁷如前所述，流感病毒A/Vietnam/1203/04的每个部位的PFU(8)我们每天采集鼻拭子（NS）和气管灌洗液（TL）样本。使用HM5血液分析仪（加利福尼亚州联合市Abaxis公司）对部分全血进行全血计数。第4天，处死所有动物，并从鼻甲、气管、每个肺的肺门区域、每个肺叶、扁桃体、支气管淋巴结、脾脏、肝的两个叶和大脑的两个半球采集重复样本。然后将样品在细胞培养基中匀浆，并通过噬斑滴定法检测病毒，并将两个滴度取平均值以进行图形显示和计算组平均滴度。

第二项研究评估了疫苗的免疫原性和效力。四个组的AGM通过联合静脉和静脉途径免疫，共10个⁷如前所述，NDV空载体、NDV/HA、NDV/HA（RV）或NDV/NA的每个位点的PFU(8). 此外，第五组动物接种了4×10⁸由Aeroneb Pro雾化器管理的NDV/HA PFU（爱尔兰戈尔韦丹根Aerogen）。在本次免疫中，每只动物的一个独立雾化器单元在2×10的条件下接受2 ml NDV/HA⁸PFU/ml。将麻醉动物置于背部横卧状态，然后将一个标准的婴儿呼吸面罩附在雾化器呼吸回路上，覆盖在动物的鼻子和嘴上。然后启动雾化器，直到分配完整个2ml接种物（大约2分钟）。在为每只动物递送气雾剂疫苗后，将额外体积的输入接种物雾化到收集管中，对收集管进行滴度测定，以评估喷雾器单元之间递送的滴度的一致性。这4只动物因雾化而导致接种物滴度下降的百分比分别为31%、35%、29%和56%，这表明雾化器单元之间的差异很小。在第42天，五组中的每一组通过相同的途径使用相同数量的接种物接受第二次免疫。为了评估疫苗的脱落情况，如前所述采集了NS和TL样本(20).

在研究的第70天，所有动物都接受了联合静脉注射和静脉注射路线的挑战，共有10只⁷HPAIV A/越南/1203/04每个站点的PFU。在激发后1至4天采集TL和NS样本，以评估HPAIV的脱落情况。在挑战后的第4天，处死动物并收集组织。组织样品在干冰上快速冷冻，随后在细胞培养基中均质以进行病毒滴定，或转移到10%中性缓冲福尔马林中进行病理学和免疫组织化学（IHC）。将可比较的样本放置在Qiagen（Valencia，CA）RNAlater试剂中，并在4°C下培养过夜以分离RNA。

病毒学和血清学检测。

所有使用HPAIV或HPAIV感染动物组织的病毒学和血清学检测均在马里兰大学批准的BSL-3设施中进行。采用DF-1鸡胚成纤维细胞斑块滴定法测定免疫用新城疫病毒株的滴度或NS和TL样品中感染性新城疫病毒的滴度，采用Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞斑点滴定法测定HPAIV株的攻击滴度。通过限制MDCK细胞的稀释度来测定NS、TL或组织样本中的HPAIV滴度。

为了进行血凝抑制（HAI）检测，首先将25μl血清与50μl受体去甲酰化酶（纽约州韦斯特伯里市Accurate Chemical and Scientific Corp.）孵育。然后，血清接受25μl 5%柠檬酸钠，并在56°C下热灭活30分钟。热灭活后，通过与100μl填充红细胞（NDV用火鸡红细胞，HPAIV用鸡红细胞）孵育，从每个血清样品中去除非特异性凝集素。然后去除上清液，并在稀释剂中制备系列稀释液（磷酸盐缓冲盐水[pH7.2]，0.3%牛血清白蛋白）。将25μl体积的每种血清稀释液与25μl含有4个适当病毒血凝单位的稀释液混合，并在37°C下培养1小时。然后通过添加50μl 0.5%（vol/vol）红细胞来测试每个样品的残余血凝活性。如前所述，通过IgG等型特异性酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HPAIV HA蛋白的血清抗体(20). 报告的ELISA滴度为对数₂光密度至少为背景值的两倍且高于0.2的血清稀释倍数。HA-特异性抗体亲和力是通过修改已发表的方法进行评估的(53)除外，我们使用了4 M尿素洗涤液和基于过氧化物酶的ELISA，而不是最初报告的7 M尿素洗涤物和基于磷酸酶的ELSA。

在含有200 50%组织培养感染剂量（TCID）的100μl培养基的微中和试验中测量血清中抗HPAIV的中和抗体滴度₅₀)同源A/Vietnam/1203/04毒株（或等量的A/Hong Kong/213/2003毒株，H5N1，分支1′[58]或菌株A/egret/Egypt/1162-NAMRU3/06，H5N1，分支2.2），由美国疾病控制和预防中心鲁本·多尼斯（Ruben Donis）善意提供，首先与100μl系列稀释猴血清混合，然后在37°C下孵育1小时。将来自每个血清稀释液的50μl体积的病毒-血清混合物添加到约150μl残留培养基中，残留培养基位于96 well板中的MDCK细胞的四个孔中。然后将平板在37°C下培养72小时，并根据上清液中HA活性的存在对病毒感染进行评分（加或减）。滴度定义为血清稀释，使50%的微孔中的感染完全中和。在对该测定法进行修改以专门评估阻断病毒进入而非病毒传播的抗体时，允许病毒血清混合物在37°C下吸附1小时。然后用150μl新鲜培养基替换每个孔上的培养基，并在72小时后如上所述对病毒感染进行评分。

为了测量NA-抑制抗体，在酶缓冲液中制备40μl血清稀释液[33 mM 2-(N个-吗啉）乙磺酸，4 mM CaCl₂]与40μl预定量的NA源混合，导致NA活性读数比背景高10至20倍。NA来源是一种重组流感病毒attWF10:2H5ΔN1，在减毒禽流感病毒主干上含有a/Vietnam/1203/04 HA和NA（即HA和NA与NDV载体表达的HA和NA同源）(59). 将每个血清-NA混合物在37°C下培养1 h。然后将混合物添加到MicroFluor 2黑色平板（Thermo Scientific，Waltham，MA）中，该平板预加载10μl/孔12.5%的二甲基亚砜水溶液和30μl/井基质混合物[55 mM 2-(N个-吗啉）乙磺酸，3.3 mM CaCl₂，0.25 mM 2′-（4-甲基伞形花序基）-α-d日-N个-乙酰神经氨酸]。将平板在37°C下孵育15分钟。然后每个孔接收150μl终止缓冲液（14 mM NaOH，83%乙醇），并使用SpectraMax M5分光光度计（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件）测量荧光，其激发波长为355 nm，发射波长为460 nm。从12个独立井计算平均背景校正NA活性。每个样本的神经氨酸酶抑制（NAI）滴度被报告为最高血清稀释度，导致输入NA活性降低50%或更多。

HPAIV感染动物呼吸道组织的免疫组织化学和病理学评价。

福尔马林固定、石蜡包埋肺的组织切片（厚度为4至7μm）用苏木精和伊红（HE）染色，以进行组织病理学评估。IHC使用了类似的未染色截面。对于IHC，载玻片在二甲苯中脱蜡，并通过分级醇处理进行再水化。将内源性过氧化物酶活性在过氧化物溶液中猝灭10分钟，然后用10%的正常兔血清封闭10分钟。将一级抗体山羊抗H5N1流感病毒HA（BEI Resources）在组织切片上以1:1000的稀释度在室温下孵育60分钟。然后依次应用生物素化兔抗羊IgG（Vector Laboratories，Burlingame，CA）、亲和素结合辣根过氧化物酶大分子复合物（Vectors Laboratory，Burling ame，CA，）和二氨基联苯胺过氧化物酶底物（Biocare Medical，Concord，CA）检测一级抗体。切片用改良哈里斯苏木精复染，脱水，并用永久性培养基固定。

建立非人类灵长类H5N1型HPAIV感染模型：AGM支持HPAIV复制水平高于RM。

为了评估疫苗构建物对非人类灵长类动物的保护效果，我们首先需要确定现有物种对H5N1型HPAIV感染的敏感性。我们比较了两种非人灵长类动物RM和AGM。每种猴子中有两只感染了2×10⁷通过联合i.n.和i.t.途径对HPAIV进行PFU。在感染后第1天到第4天，在两种动物的NS和TL样品中检测到HPAIV的显著滴度，无论是通过限制稀释试验检测到的感染病毒（图。2A和B)或通过QRT-PCR作为病毒RNA（图。2C和D). 一个例外是一个RM的NS样本，其在所有时间点通过斑块滴定对HPAIV呈阴性，在第1天和第4天通过QTR-PCR呈阴性，但在第2天和第3天通过QTR-PCR呈阳性。这种差异可能与该动物上呼吸道中HPAIV颗粒的中和作用有关，其机制尚不明确。在任何时间点均未观察到任何动物出现病毒血症（数据未显示）。关于感染后第4天采集的组织，我们在RM和AGM的呼吸道组织和支气管淋巴结以及AGM的扁桃体中检测到感染性HPAIV（图。​（图2E）。第二版). 在肝脏、脾脏或大脑中未检测到病毒（未显示）。一般来说，AGM感染性HPAIV的滴度高于RM，TL样本中的脱落除外（图。​（图2B），2B型)和与食蟹猴的公布值相似或略低(三,55). 因此，选择AGM作为评价疫苗免疫原性和保护效力的模型。

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图2。

在RM和AGM中复制H5N1 HPAIV。每种猴子中有两只感染了2×10⁷通过联合i.n./i.t.途径对HPAIV进行PFU。在第1天、第2天、第3天和第4天采集鼻拭子（NS）和气管灌洗液（TL）样本，在第4天对动物实施安乐死，并进行尸检，以量化各种组织中的感染性HPAIV。（A至D）通过限制稀释度（A和B）测定NS（A和C）和TL（B和D）样品以测定感染性病毒，并通过QRT-PCR（C和D）测定HPAIV RNA。（E）通过组织匀浆的斑块滴定法测定尸检时取的各种组织中感染性H5N1 HPAIV的滴度。NT，鼻甲；T、 气管；LL H，左肺门；LL U，左肺上叶；LL L，左肺下叶；RL H，右肺门；RL U，右肺上叶；RL M，右肺中叶；RL L，右肺下叶；B淋巴结，支气管淋巴结。通过滴定每只动物的两个重复样品来计算每个组织的值。虚线表示检测极限。低于检测限的NS和TL样品的赋值为1.0 log₁₀TCID公司₅₀/ml（A和B）或1.0 log₁₀copies/ml（C和D）用于计算平均值。对于未检测到病毒的组织样本，值为2.0 log₁₀TCID公司₅₀/g（E）用于计算平均值。

在上述实验中，还对动物进行了疾病症状监测。感染后，一名RM表现出食欲差，第2、3和4天出现中度至重度嗜睡，没有发烧，第1至4天淋巴细胞计数下降，第1和2天中性粒细胞计数增加。另一个RM在第1天到第4天表现出体温轻微升高（0.6°C），中性粒细胞计数升高，淋巴细胞计数降低。一名AGM在第4天表现出轻微的嗜睡，与RM相似。两名AGM均在感染后第1天和第2天的体温升高0.6-1.7°C。昏昏欲睡的动物在感染后4天内淋巴细胞计数显著下降（3-5倍），中性粒细胞计数轻度升高。另一只动物在第1天至第4天淋巴细胞计数略有下降，中性粒细胞计数升高。因此，至少在感染的前4天，疾病症状轻微，这表明RM和AGM模型不适合评估HPAIV的发病机制。

液体或气溶胶形式的疫苗呼吸道输送。

我们接下来用2×10免疫4组AGM⁷通过组合的i.n.和i.t.路线对空NDV载体、NDV/HA、NDV/HA（RV）或NDV/NA的PFU进行检测。根据制造商的说法，我们还评估了使用喷雾器产生的雾化NDV/HA进行免疫接种，喷雾器的质量中值空气动力学粒子直径为2.1μm。通常认为直径小于3μm的颗粒很容易穿透小气道（参考文献45). 由于灵长类动物模型中向下呼吸道输送气溶胶颗粒的典型效率约为10%(13,16)，我们使用了20倍的高剂量（4×10⁸PFU），通过雾化器给药。第一次接种疫苗剂量后第2、4、6和8天采集的NS样本表明，除NDV/HA（气雾剂）组外，所有组的上呼吸道均无明显NDV脱落，其中中度脱落（≤2 log₁₀PFU/ml）。在同一天采集的TL样品中，我们观察到可比较的低水平脱落（≤2 log₁₀PFU/ml）（图。​（图3）。三). 42天后，通过相同的途径（液体或气雾剂）给每只动物注射第二剂相同的疫苗。在任何组中均未检测到NDV脱落，可能是由于第一次给药时宿主免疫介导的限制所致。我们在任何一组接种疫苗后均未观察到任何疾病症状，正如对这种高度减毒载体的预期。

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图3。

NDV疫苗在免疫后从AGM的呼吸道脱落。AGM（每组4只动物）感染2×10⁷空NDV载体的PFU，NDV/HA、NDV/HA（RV）或NDV/NA，通过联合i.n./i.t.途径或与4×10⁸雾化NDV/HA的PFU。通过菌斑试验测定鼻拭子（NS）（A）和气管灌洗液（TL）（B）样本中的感染性疫苗病毒滴度（平均值±标准误差）。虚线表示检测极限。未检测到病毒的NS和TL样本的值为0.5 log₁₀PFU/ml用于计算平均值。

NDV载体免疫后HPAIV和NDV特异性血清抗体反应。

在上述实验中，在第0天（第一次接种疫苗剂量时）、第42天（第二次接种时）和第70天（图。​（图4）。4). 在用NDV/HA或NDV/HA（RV）免疫的所有三组动物中，都检测到ELISA定量的大量HA特异性反应，但没有像预期的那样用空的NDV载体或NDV/NA检测到（图。​（图4A）。4A级). 第二剂疫苗显著增强了这些反应。正如预期的那样，仅在NA-表达结构中检测到NAI抗体（图。​（图4B4B类).

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图4。

HPAIV和NDV特异性血清抗体对免疫的反应。继续实验，结果如图所示。​图3，三，在第0天免疫的AGM组在第42天通过相同的途径第二次注射相同的病毒。在第0天、第42天和第70天采集血清样本。（A） 用ELISA分析纯化重组H5 HA蛋白的HPAIV HA特异性抗体。（B） 通过NAI分析分析HPAIV NA-特异性抗体。（注意，第0天和第70天的血清仅针对四只NDV或NDV/HA动物中的两只进行了检测，而第42天的血清仅针对NDV/NA动物进行了检测（D）通过微中和分析格式测量的HPAIV中和抗体，主要测量初始感染抑制。（E） 通过HAI分析测定HPAIV特异性抗体。（F） 通过HAI分析测定NDV特异性抗体。所有抗体滴度均表示为平均值±标准误差。为了计算平均值，低于检测限（虚线）的抗体滴度被赋值为4.2 log₂（A） ，2.0日志₂（B、C、D和E）或1个日志₂（F） ●●●●。各组之间的统计差异通过重复测量双向方差分析和Bonferroni事后分析确定。†，P（P）< 0.05; ‡,P（P）< 0.01; *,P（P）<0.001。垂直条（A、B、C、D和E）正上方的符号表示该组的值与前一时间点同一组的值之间存在统计上的显著差异。位于水平线（A、C、D和E）上方的符号在同一时间点显示了两组在每条线末端的统计显著差异。

通过微中和试验检测HPAIV中和抗体（图。​（图4C）。4摄氏度). 与我们之前的研究结果一致(20)，第一次给药后检测到少量或无HPAIV中和抗体。第二次给药后，用表达HPAIV抗原的NDV载体免疫的所有动物组中检测到大量的中和抗体，包括用NDV/NA免疫的动物的滴度稍低，将病毒-血清混合物接种到细胞单层上，并在检测期间保持在培养基上。因此，除了检测中和HPAIV的抗体外，该试验还可能检测抑制病毒细胞间传播的抗体。

我们改进了微中和分析，在吸附期后用新鲜培养基替换病毒-血清混合物，从而大大降低了后续培养期间出现的抗体浓度。这种形式对能够阻断初始感染的抗体更具特异性。使用此格式（图。​（图4D），4天)，我们观察到所有组的中和滴度都有类似的下降（约4倍），NDV/HA（气溶胶）和NDV/NA组的滴度仅略高于检测极限。应该注意的是，使用改进的检测方法，NDV/NA组包括两种滴度无法检测的动物和两种效度为1:20的动物。这些数据表明，所有疫苗构建物，包括NDV/NA，都诱导了能够阻止HPAIV初始感染和防止其传播的抗体，尽管NA-特异性抗体阻止初始感染的能力在动物之间存在差异。

HPAIV特异性抗体也通过HAI分析进行测量（图。​（图4E）。第四版). 与中和抗体一样，HPAIV特异性HAI抗体仅在第二剂疫苗接种后检测到，NDV/HA（气雾剂）和NDV/NA组的滴度略低。虽然HAI滴度通常与HA-特异性抗体反应有关，但据报道，NA-特异性的抗体也可以抑制血凝(25,40)推测是由于HA和唾液酸在红细胞表面相互作用的空间位阻(40). 还通过HAI试验测量了对NDV载体的抗体反应（图。​（图4F）。4楼). 与HPAIV特异性HAI抗体相反（图。​（图4E），第四版)，在第一次给药后观察到了载体（NDV）特异性HAI抗体的有效诱导。总的来说，这些研究结果表明，NDV/HA、NDV/HA（RV）和NDV/NA诱导的HPAIV特异性抗体滴度的大小可能与保护效果有关，并且当NDV/HA以可能具有临床可行性的雾化形式输送时，其免疫原性与静脉注射和静脉注射时相似。

缺乏多元性切割位点的HPAIV H5 HA至少与野生型HA一样具有免疫原性。

有趣的是，大多数血清学检测的结果如图所示。​图44证明了NDV/HA（RV），其中H5N1 HA多碱基裂解位点被非致病性H5N2流感病毒HA的裂解位点取代，尽管宿主中的载体复制水平相似，但诱导的H5N1 HPAIV特异性抗体水平高于NDV/HA。​（图3B）3B公司)以及更低水平的矢量特定HAI（图。​（图4F）。4楼). 特别是，对NDV/HA（RV）和NDV/HA反应的比较表明，针对前者的HA特异性抗体水平增加了9.2倍(P（P）<0.01）第40天和5.7倍(P（P）<0.05）。​（图4A），4A级)，2.6倍(P（P）<0.05），通过去除介质的中和法测量（图。​（图4D），4D（四维）)、和3.5倍(P（P）<0.05）。​（图4E）。第四版). 观察到对HPAIV异源株的中和活性存在类似差异（见下文）。

增强的抗体亲和力成熟有助于在第二次疫苗剂量后观察到的有效病毒中和。

如上所述，在任何一组中，在初始疫苗剂量后，我们都没有观察到显著的血清中和抗体反应（图。4C和D)尽管ELISA和NAI试验分别检测到HA特异性抗体和NA特异性抗体的显著滴度（图。4A和B). 我们假设第二次给药后中和活性增加可能部分是由于抗体亲和力成熟度增加。由于本研究中所有组均接种了两剂疫苗，因此我们使用了之前研究中的血清样本(20)其中一组动物在第0天接受单剂量NDV/HA，第二组动物分别在第0和42天接受两剂量NDV/HA。在第0天、第42天和第70天采集血清样本以评估抗体反应。我们还分析了本研究在免疫后相同时间点采集的血清样本，以进行比较。抗体亲和力是以对4M尿素洗涤有耐药性的ELISA抗体的比例来测量的。第42天和第70天的尿素耐药性抗体的百分比是根据每只动物3到6次重复检测的平均结果计算的。先前研究中的单剂量组和双剂量组的值如图所示。5A和B图中分别显示了当前研究中两个剂量组的药物。​图5C。5摄氏度我们还计算了各组在第42天到第70天之间的平均食欲变化（图。​（图5D）。第五天). 所有动物，包括单剂量组的动物，在免疫后第42天和第70天之间，都表现出HA特异性抗体亲和力增加（图。​（图5A，5A级、B和C）；然而，在此期间，两剂量组的平均亲和力增加百分比比一剂量组高90%(P（P）<0.05）（图。​（图5D）。第五天). 这些数据表明，第二剂疫苗显著增强了抗体亲和力成熟。应该注意的是，单剂量组没有产生显著的中和抗体滴度(20)，尽管抗体亲和力持续成熟。此外，尽管NDV特异性抗体对第一次给药反应强烈（图。​（图4F），4楼)，很可能第二剂疫苗确实在呼吸道组织中复制。病毒免疫动物呼吸道中呼吸道合胞病毒复制也存在类似现象，斑块试验无法检测到，但呼吸道组织的QRT-PCR分析可以检测到(4). 综上所述，这些结果表明，两个因素可能有助于在两剂量组中观察到的高中和滴度：（i）第二剂量疫苗引起的抗体滴度大幅增加，如ELISA所测，以及（ii）亲和力成熟增强。

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图5：。

HA特异性血清抗体亲和力是指ELISA抗体对4M尿素洗脱液的抗药性百分比。（a至C）我们在前一项研究的第42天和第70天测量了HPAIV HA特异性抗体的亲和力(20)（研究1），其中动物在第0天（a）接受单剂量NDV/HA，或在第0和42天分别接受两次剂量的NDV/HA（B）。我们还分析了本研究（研究2）的血清，其中动物分别在第0天和第42天接受了两次剂量的NDV/HA（C）。绘制每只动物的抗脲抗体百分比。（D） 计算每只动物在第42天到第70天期间的抗脲抗体百分比变化，并给出组平均值±标准误差。

疫苗接种并未在外周血中诱导显著的T细胞反应。

为了研究外周血T细胞对免疫的反应，我们在第0天（第一次免疫前）、第10天、第42天（第二次免疫之前）、第52天和第70天分离外周血单个核细胞，并分析CD4的数量⁺和CD8⁺分泌白细胞介素2（IL-2）和/或γ干扰素（IFN-γ）的T细胞（表达IL-2、IFN-γ或这两种细胞因子的细胞被视为阳性事件，并一起计算）对刺激的反应在体外具有跨完整H5N1 HA或NA蛋白的重叠肽库。有趣的是，尽管有上述稳健的抗体反应，但偶尔在外周血中检测到细胞介导的反应，并且仅在少数动物中检测到（数据未显示）。

疫苗接种为应对H5N1型人乳头瘤病毒挑战提供了高度保护。

在第70天（第二次给药后第28天），所有动物均接受大剂量（2×10）的激发⁷通过联合i.n.和i.t.途径获得同源H5N1 HPAIV毒株A/Vietnam/1203/04的PFU。激发后，在所有动物中均未观察到行为异常和食欲明显下降。我们确实观察到所有动物的体温都有适度升高，在第1天达到峰值，在第4天下降。除第3天NDV/HA免疫的动物外，所有接种组的平均温度均低于载体免疫的对照组；然而，由于动物间的高度变异性（未显示），未观察到显著差异。NS（图。​（图6A）6A级)和TL（图。​（图6B）6亿)在激发后第1、2、3和4天采集样本。我们在从空NDV载体组收集的所有标本中检测到显著的感染性HPAIV滴度。相反，在接受NDV/HA、NDV/HA（RV）或NDV/NA免疫的组中，检测到很少或没有感染性HPAIV的脱落（图。6A和B). 有趣的是，NDV/HA（RV）组在任何样本中均未检测到HPAIV攻击病毒脱落，这与HPAIV特异性抗体滴度最高的该组一致（图。​（图4）。4). 第4天，对动物实施安乐死，并进行尸检。对空NDV载体组组织样本的分析表明，在鼻甲、气管、肺门区和肺叶以及支气管和纵隔淋巴结中存在中到高滴度的感染挑战性HPAIV。相比之下，在任何免疫组中均未检测到挑战性病毒，但在接种NDV/NA的动物的零星组织样本中检测到非常低的滴度（图。​（图6C6摄氏度).

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图6。

保护免疫动物免受HPAIV挑战病毒复制。每组四只动物按照第0天和第42天的指示进行免疫接种，然后用2×10⁷第70天HPAIV的PFU。（A和B）第1天到第4天鼻拭子（NS）（A）和气管灌洗（TL）（B）样品中感染性HPAIV的含量。低于检测限（虚线）的NS和TL样品被赋值为1.0 log₁₀TCID公司₅₀/ml用于计算平均值。（C） 通过组织匀浆滴定法测定各种组织中的感染性HPAIV滴度。M LN，纵隔淋巴结。有关其他纸巾缩写，请参见图的图例。​图2E。第二版。低于检测限（虚线）的组织样本被赋值为2.0 log₁₀TCID公司₅₀/g用于计算平均值。显示了平均值±标准误差。

我们还对呼吸道不同组织中的HPAIV抗原进行了盲法IHC评估（图。​（图7）。7). 与最近发表的食蟹猴HPAIV感染评估一致(三)，在用空NDV载体免疫的所有四只动物的支气管和细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞中，以及同一组四只动物中的两只动物的I型和II型肺泡细胞中检测到丰富的挑战性病毒抗原（图。7A至D). 相反，在用NDV/HA或NDA/HA（RV）免疫的任何动物的任何组织样本中均未检测到挑战性病毒抗原，并且在NDV/NA免疫的动物中检测到很少或没有挑战性病毒抗体（图。​（图7E）。第7页). 对用NDV空载体免疫的猴子的肺部进行的盲法组织病理学检查（即大量挑战性HPAIV复制）表明，猴子患有严重的弥漫性支气管间质性肺炎，肺泡损伤显著，表现为大面积出血、纤维蛋白沉积、水肿和II型肺细胞增生。用NDV/HA（RV）免疫的动物仅表现出轻微的挑战后组织病理学变化，而用NDV/HA（液体或气雾剂）或NDV/NA免疫的动物则表现出更大的挑战后病理学变化（数据未显示）。然而，应该注意的是，每天收集TL样品，其中注入并回收了相对较大（30 ml）体积的磷酸盐缓冲盐水，这可能导致了所有组中观察到的病理变化。此外，一些病理变化可能反映了对HPAIV攻击的保护性初级和次级免疫反应。总之，这些数据证明了所有疫苗构建体的高保护效力，其中NDV/HA（RV）具有最高水平的保护效力。

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图7。

HPAIV攻击4天后对AGM组织进行IHC评估。（A至D）对用空NDV载体免疫的AGM组织进行IHC评估，并用HPAIV进行攻击，所有这些都证明存在支气管间质性肺炎的证据。用山羊抗HA多克隆抗体和辣根过氧化物酶检测系统检测挑战病毒HA抗原（染成棕色）。（A） 细支气管上皮（黑色箭头）、肺泡上皮（绿色箭头）和肺泡巨噬细胞（红色箭头）中的显著病毒抗原。由20倍物镜捕获。（B） 支气管末端分散的抗原阳性上皮细胞（箭头所示）。由40倍物镜捕获。（C） 支气管（中央），管腔内出血，炎症渗出物，细胞碎片，以及沿完整和剥落的上皮表面的显著免疫染色（箭头所示）。由20倍物镜捕获。（D） 肺泡，肺细胞（黑色箭头）和肺泡巨噬细胞（红色箭头）免疫染色显著。由40倍物镜捕获。（E） 半定量评估用所示构建物免疫的AGM中HPAIV HA抗原并用HPAIV攻击。抗原在支气管和细支气管上皮、支气管相关淋巴组织、肺泡I型和II型肺细胞以及肺泡巨噬细胞中的分布根据每高倍视野（放大倍数，×400）的抗原阳性细胞数进行评分：0，无细胞；1、1至2个细胞；2、3至10个细胞；3，>10个细胞。每个符号代表一个单独的动物，是总共四张幻灯片的平均值，分别代表左肺门、左肺外围、右肺门和右肺外围。水平条代表每组的平均值。

HPAIV攻击在对照动物中诱导了IFN-控制基因的强烈转录诱导，但在接种疫苗的动物中没有。

接下来，我们使用QRT-PCR比较了（i）NDV空载体免疫（未保护）组、（ii）NDV/HA-免疫（保护）组和（iii）激发后第4天收集的肺组织中选定宿主mRNA的水平另外四只动物组成的一组，它们既没有接种过HPAIV，也没有受到HPAIV的攻击，因此提供了基线值（图。​（图8；8; 值表示为日志₂相对于未免疫/无挑战组的水平变化）。测试的基因组包括I型、II型和III型干扰素、趋化因子和干扰素调节抗病毒因子。与未免疫、未激发组相比，空NDV载体免疫、未保护组（图。​（图8，8，黑条）显示出IFN-λ3（IL-28B，一种III型IFN）水平的强烈（11倍）增加，该水平上调了IFN-控制的抗病毒基因(5,46,74)在对抗流感病毒方面发挥重要作用(46). 我们观察到其他受试细胞因子和趋化因子水平的轻微变化（图。8A和B)在NDV和NDV/HA-免疫组中。HPAIV攻击对空NDV载体免疫（无保护）动物的效果最为显著，这表明CXCL10的诱导作用较强，为9-30倍（图。​（图8B）8B类)以及干扰素调节的抗病毒基因MX1、MX2、OAS-1、OAS-2和ISG56，它们是I型干扰素负反馈和细胞抗病毒反应的介体(44)（图。​（图8C）。8摄氏度). 空NDV载体免疫组中I型干扰素水平降低（图。​（图8A），8安)尽管在同一时间点（第4天）HPAIV滴度较高（图。​（图6C），6摄氏度)可能反映了激发病毒NS1干扰素拮抗剂对I型干扰素表达的抑制。鉴于这一明显矛盾的发现，即在该组中，干扰素诱导的抗病毒蛋白具有较强的mRNA诱导作用（图。​（图8C，8摄氏度，黑条），我们推测这种效应可能是由于早期诱导I型干扰素，随后在第4天被病毒表达的NS1抑制，或者可能由其他一些因子介导，这些因子是由挑战性HPAIV感染引起的差异诱导的，但此处未进行监测。

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图8。

HPAIV攻击后细胞因子（A）、趋化因子（B）和干扰素诱导的抗病毒基因（C）的诱导。对用空NDV载体（未受攻击保护）或NDV/HA（受保护）免疫的动物进行HPAIV攻击后第4天采集的肺组织样本进行QRT-PCR分析，以测量选定宿主基因的mRNA水平。使用ΔΔ计算基因表达相对于另外四只未感染、未受挑战的动物表达的变化^{计算机断层扫描}方法和表示为平均对数₂折叠变化。误差条表示通过将校准品阈值周期的标准误差（即未受免疫、未受挑战的动物）与实验组阈值周期标准误差相加而获得的绝对最大值和最小值。通过Tukey后验的单向方差分析计算统计差异。†，P（P）< 0.05; ‡,P（P）< 0.01; *,P（P）<0.001。垂直条正上方的符号表示与未接种/未挑战组的统计学显著差异。水平线上方的符号表示NDV空载体组和NDV/HA-免疫组之间的统计显著差异。

我们感谢马里兰大学Daniel R.Perez提供attWF10:2H5ΔN1流感病毒株，感谢美国疾病控制和预防中心Ruben Donis提供A/egret/Egypt/1162-NAMRU3/06 H5N1人乳头瘤病毒株。

该项目是NIAID内部项目和NIAID合同N01A060009的一部分，与马里兰大学合作。