EMBO J。 2010年1月6日; 29(1):209–221。
转录反应DNA-结合蛋白(TDP-43)敲除下调组蛋白脱乙酰酶6 , 1, 一 , 2 , 1 , 三 , 4 , 4 , 5 , 1 , 6 , 6 , 7 , 1 , 4 , 5 , 8 , 三 , 4 , 2 和 1, b条
Fabienne C Fiesel公司 1 德国杜宾根赫蒂临床脑研究所神经变性系功能神经遗传学实验室
亚伦·沃伊格特 2 德国亚琛RWTH亚琛大学医学中心神经病学系
斯蒂芬妮·斯韦伯 1 德国杜宾根赫蒂临床脑研究所神经变性系功能神经遗传学实验室
克里斯·范登·豪特 三 比利时鲁汶Katholieke大学分子与细胞医学系分子医学部神经生物学和基因治疗实验室
安德烈亚·沃尔登梅尔 4 德国慕尼黑Beckman Coulter生物医学股份有限公司
卡林·格纳 4 德国慕尼黑Beckman Coulter生物医学股份有限公司
马琳·安德森 1 德国杜宾根赫蒂临床脑研究所神经变性系功能神经遗传学实验室
珍妮·V·科恩 6 德国图宾根赫蒂临床脑研究所突触可塑性小组
托拜厄斯·M·拉塞 6 德国杜宾根赫蒂临床脑研究所突触可塑性小组
沃尔夫迪特·斯普林格 1 德国杜宾根赫蒂临床脑研究所神经变性系功能神经遗传学实验室
罗兰·基什内尔 4 德国慕尼黑Beckman Coulter生物医学股份有限公司
曼纽拉·诺伊曼 8 瑞士苏黎世苏黎世大学神经病理学研究所
韦勒·贝克兰特 三 比利时鲁汶卡托利克大学分子和细胞医学系分子医学部神经生物学和基因治疗实验室
玛丽安娜·阿隆尼·法布朗尼 4 德国慕尼黑Beckman Coulter生物医学股份有限公司
Jörg B Schulz公司 2 德国亚琛RWTH亚琛大学医学中心神经病学系
菲利普·J·卡勒 1 德国杜宾根赫蒂临床脑研究所神经变性系功能神经遗传学实验室
1 德国杜宾根赫蒂临床脑研究所神经变性系功能神经遗传学实验室
2 德国亚琛RWTH亚琛大学医学中心神经病学系
三 比利时鲁汶卡托利克大学分子和细胞医学系分子医学部神经生物学和基因治疗实验室
4 德国慕尼黑Beckman Coulter生物医学股份有限公司
5 德国图宾根大学微阵列设施
6 德国杜宾根赫蒂临床脑研究所突触可塑性小组
7 德国图宾根大学医学遗传学系
8 瑞士苏黎世苏黎世大学神经病理学研究所
收到日期:2009年5月28日; 2009年10月12日接受。
补充资料 补充图S1
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补充图S2
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补充电影S1
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补充图S4
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补充表S1
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补充信息
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审查过程文件
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摘要 TDP-43是一种RNA/DNA结合蛋白,参与转录抑制和mRNA处理。 TDP-43的内含物是额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化症的标志。 除了TDP-43的聚集外,在疾病中还观察到核定位丢失。 为了确定TDP-43的相关靶点,我们进行了表达谱分析。 因此,在人类胚胎肾HEK293E和神经元SH-SY5Y细胞中,发现了组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)对TDP-43沉默的下调,并在mRNA和蛋白质水平上得到了证实。 这伴随着主要HDAC6底物乙酰基-管蛋白的积累。 HDAC6水平通过依赖RNA结合和C末端蛋白相互作用域的TDP-43的重新表达而恢复。 此外,TDP-43与HDAC6 mRNA特异结合,支持直接的功能相互作用。 重要的是, 体内 TDP-43淘汰验证 黑腹果蝇 证实HDAC6的特异性下调。 HDAC6对于蛋白质聚集体的形成和降解是必需的。 事实上,在TDP-43沉默细胞中发现HDAC6依赖性的细胞聚集物形成减少和多聚Q扩增的ataxin-3细胞毒性增加。 总之,功能性TDP-43的缺失会导致HDAC6下调,从而可能有助于发病。
关键词: 额颞叶痴呆,HDAC6,微阵列,运动神经元疾病,TDP-43
介绍 反式反应DNA-结合蛋白(TDP-43)是一种43 kDa蛋白,广泛存在于大多数组织中,在哺乳动物和无脊椎动物中保存良好( 王 等 , 2004 ; 阿亚拉 等 , 2005 ). TDP-43包含两个RNA-再认识基序(RRM)和一个C末端富含甘氨酸结构域(GRD),最初被克隆为一种新的蛋白质,与人类免疫缺陷病毒1型内的反式激活物响应DNA序列结合,并作为一种强转录阻遏物( 欧点 等 1995年 ). 在小鼠中,TDP-43介导体细胞组织中精子特异性顶体蛋白SP-10的表观遗传转录抑制( 阿比扬卡 等 , 2007 ). 除了其强大的DNA结合和转录关闭活性外,TDP-43还与RNA结合,与异源核糖核蛋白(hnRNP)A/B协同调节囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)和载脂蛋白A2(APOA2)的外显子跳跃( Buratti和Baralle,2001年 ; 布拉蒂 等 , 2001 , 2005 ; 梅尔卡多 等 , 2005 ). TDP-43不仅介导外显子跳跃,而且还介导存活运动神经元蛋白2(SMN2)的外显子7内含物( Bose公司 等 , 2008 ).
据报道,TDP-43的功能主要是核,其中大部分蛋白质位于核内。 在细胞核内,小鼠TDP-43亚型以弥漫和间断模式定位( 王 等 , 2002 ). 标点结构被指定为T型体,建议用作连接核体(NB)的支架( 王 等 , 2002 ). 我们一致发现,人类TDP-43与RNA加工体的标记物共同定位,表明参与了前mRNA剪接,可能还参与了其他RNA加工事件。
确定TDP-43是具有泛素化内含物的额颞叶变性患者的神经病理学标志性病变的主要蛋白(FTLD-U,同时更名为FTLD-TDP( 麦肯齐 等 , 2009 ))在肌萎缩侧索硬化症(ALS)中,强调TDP-43的重要性( 诺依曼 等 , 2006 ). 不同的神经病理学特征区分了散发性和家族性FTLD-U和ALS的特定亚型,TDP-43免疫反应存在于营养不良的神经节和神经元胞质内含物以及神经元核内内含物中( Kwong公司 等 , 2007 ). 此外,常见或偶发的包涵体肌病(IBM)中描述了肌肉细胞中的TDP-43阳性细胞溶质聚集物( 韦尔 等 , 2008 ; 奥利韦 等 , 2009 ).
TDP-43的病理修饰包括泛素化、磷酸化和蛋白质片段化( 诺依曼 等 , 2006 ). TDP-43与疾病的关联在遗传学上得到了进一步证实。 同时,聚集在C末端GRD的30种不同TDP-43突变与运动神经元疾病、ALS和FTD(AD&FTD突变数据库)相关 http://www.molgen.ua.ac.be/FTDmutations网站 ).
最值得注意的是神经元( 诺依曼 等 , 2006 , 2007 )和肌肉纤维( 奥利弗 等 , 2009 ; 萨拉杰赫 等 , 2009 )细胞核TDP-43染色明显缺失。 有人认为TDP-43的细胞溶质再分布是散发性ALS的早期事件,先于不溶性聚集物的形成( 焦尔达纳 等 , 2009 ). 因此,FTLD-TDP中常见的神经病理学发现是“前内含物”——定义为缺乏核TDP-43但具有弥散/颗粒细胞质TDP-43染色的细胞体( 布兰德迈尔 等 , 2008 ). 因此,核TDP-43蛋白的丢失以及核功能的丧失可能导致病理条件下RNA加工缺陷。 有趣的是,只有最近另一种DNA/RNA-结合蛋白的突变与家族性ALS有关,该蛋白与肉瘤融合/脂肪肉瘤易位( 亚特科夫斯基 等 , 2009 ; 万斯 等 , 2009 ),进一步支持了RNA加工缺陷可能在FTLD/ALS中起中心作用的假设。 然而,目前已知的TDP-43靶mRNA并没有解决神经退行性疾病中TDP-43功能失调的机械效应。
为了进一步了解TDP-43的(病理)生理相关功能,我们通过RNA干扰耗尽TDP-43细胞。 为了鉴定TDP-43应答基因,我们对经siRNA处理的人类胚胎肾HEK293E细胞进行了差异微阵列分析 TDP-43型 在持续改变的基因中,我们确定了组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)。 在短暂和稳定沉默的非神经元和神经元细胞系中,HDAC6对TDP-43沉默的特异性下调在mRNA和蛋白质水平上得到证实。 伴随HDAC6的下调,TDP-43沉默导致主要HDAC6底物乙酰基-管蛋白的积累( 哈伯特 等 , 2002 ). 野生型(wt)TDP-43转染HDAC6后,HDAC6的下调可被逆转,但没有缺失RRM、GRD或核定位信号(NLS)的突变体。 在下拉和免疫沉淀实验中,我们发现TDP-43与HDAC6 mRNA特异结合 体内 在里面 黑腹果蝇 缺少TDP-43同源基因TBPH。 使用ataxin-3(Atx3)作为实验蛋白毒性蛋白,评估HDAC6表达降低对TDP-43沉默的病理后果。 在HDAC6依赖性方式下,HEK293E细胞中的TDP-43敲除减少了聚集物的形成,并增加了转染含有扩展polyQ域的Atx3后的细胞死亡。 因此,HDAC6减少,从而降低细胞溶质脱乙酰酶活性,可能有助于TDP-43损伤的发病机制。
结果 人类细胞系中内源性TDP-43主要定位于细胞核 为了表征内源性TDP-43的分布,我们首先在HEK293E细胞中进行了生化分级实验。 TDP-43主要在细胞核部分检测到,在胞质溶胶中检测到的很少( 补充图S1A ). 免疫染色进一步证实TDP-43在非神经元HEK293E细胞中的主要核定位( 补充图S1B )以及在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中( 补充图S1C ). 此外,在胞浆中观察到内源性TDP-43的弱但特异的颗粒染色。 因此,TDP-43是一种主要为核蛋白的蛋白质,在胞浆中只含有一小部分( 王 等 , 2008 ).
在细胞核内,内源性TDP-43以间断模式分布在整个染色质中,但不包括在核仁中。 大多数单元格显示离散数量的NB,TDP-43信号丰富。 为了进一步表征这些T体,我们对已知NB的内源性TDP-43和标记蛋白进行了双标记共焦荧光显微镜观察。 这些核糖体在小核核糖核蛋白生物生成中具有功能,如Cajal小体和Cajal小体(gems)的紧密相关双子,充当SC35斑点样剪接因子存储的位点,或在转录调控中发挥作用,如早幼粒细胞白血病(PML)核糖体(综述于 伯纳迪和潘多尔菲,2007年 ; 已在中审阅 柯林斯和佩妮,2009年 ). 在gem和Cajal体中观察到T体信号的大部分重叠( 补充图2A-F ). 注意,TDP-43完全埋藏在Cajal矿体中( 补充电影S1 ). 此外,T小体与SC35斑点密切相关,但许多SC35信号没有TDP-43免疫反应( 补充图2G–I ). 最后,与PML NB几乎没有重叠( 补充图2J–L ). 因此,与先前对转染小鼠TDP-43的描述基本一致( 王 等 , 2002 ),内源性人类TDP-43广泛分布于细胞核内,并在NB中富集,显示出与宝石和Cajal体的大量共存。 TDP-43的这种分布与其在转录和RNA加工中所报道的广泛功能相一致,也可能是作为核体支架蛋白。
TDP-43靶基因的鉴定 为了深入了解TDP-43的生理功能,我们在HEK293E细胞中进行了RNA沉默实验。 高达90%的TDP-43敲除并没有明显的细胞毒性,也没有改变TDP-43共定位NB的数量或形态(结果未显示)。 由于敲除实验不支持TDP-43的一般结构作用,我们通过微阵列表达谱筛选特定的mRNA靶点。 用针对TDP-43的siRNA处理四种独立培养的HEK293E细胞或对照干扰siRNA。提取总RNA,并在人类基因组U133+2.0阵列上进行杂交。 通过对用于RNA提取和杂交的相同样品进行western blot(WB)分析,同时评估敲除效率( 补充图S3 ).
我们首先检测了与FTD谱相关的基因( 库马尔·辛格和范·布勒克霍温,2007年 )和OMIM注释的ALS基因( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim ). 正如预期的那样,沉默后TDP-43 mRNA水平降低了三倍以上( ). 相比之下,已知FTD/ALS相关基因的表达在TDP-43敲除时仅发生轻微改变。 因此,TDP-43不会直接调节siRNA中已知FTD和ALS基因的表达 TDP-43型 -处理过的HEK293E细胞。
表1 HEK293E细胞TDP-43基因敲除对FTD和ALS候选基因的影响
候选基因 折叠更改 FTD相关基因 地图 +1.25 PGRN公司 +1.16 VCP公司 −1.15 CHMP2B公司 +1.08 ALS相关基因 SOD1标准 +1.04 ALS2型 +1.16 SETX公司 −1.05 FUS/TLS −1.27 VAPB公司 −1.31 ANG公司 +1.05 TARDBP(TDP-43) −3.26 图4 +1.08 新型TDP-43靶基因 HDAC6型 −2.04 与FTD和ALS相关的基因及其在基因芯片人类基因组U133+2.0微阵列中的信号变化一起列出。
已知的TDP-43拼接靶点、CFTR和APOA2( Buratti和Baralle,2001年 ; 梅尔卡多 等 , 2005 )在HEK293E细胞中表达低于有意义的检测阈值水平,排除了TDP-43敲除效应的分析。 TDP-43剪接靶SMN2的表达在TDP-43敲除后仅发生轻微变化,与原始报告一致( Bose公司 等 , 2008 ). 神经丝轻链表达的改变( 强大 等 , 2007 )未在siRNA中确认 TDP-43型 -处理过的HEK293E细胞。 同样,在HeLa细胞中进行的另一个微阵列研究报告的TDP-43靶点( 阿亚拉 等 , 2008 )无法在我们的实验系统中确认(数据未显示)。
我们在siRNA处理的细胞中共鉴定出402个差异表达基因 TDP-43型 与扰乱的siRNA对照相比( 补充表SI ). 我们使用四种不同的TDP-43特异性siRNAs通过RT-PCR进一步验证了15个改变的转录物( 补充图S4 ). 然而,60%的测试转录本没有通过采用的高严格性验证标准,因此被视为可能的非目标效应。 其他转录物由四种TDP-43导向的siRNA中的每一种调节(参见 补充图S4 详细信息)。 其中一个有吸引力的候选人是HDAC6。
HDAC6是一种罕见的脱乙酰酶,具有细胞质定位、泛素结合能力以及对微管蛋白和肌动蛋白细胞骨架的影响( 布瓦约 等 2007年a ). 此外,HDAC6与聚集蛋白的自噬降解有关,并被证明可以挽救脊髓性肌萎缩苍蝇模型中的神经退化( 潘迪 等 , 2007 ). 与含缬氨酸蛋白(VCP)一起,另一个与特定形式的FTD相关的基因( 瓦茨 等 , 2004 ),HDAC6决定多泛素化蛋白质的命运( 布瓦约 等 , 2006 )因此,推测在蛋白病中具有重要作用。 由于其调节与神经退行性疾病相关的易聚集蛋白周转的功能,我们选择HDAC6进行进一步验证。
通过TDP-43击倒验证HDAC6下调 为了验证TDP-43敲除对HDAC6的下调作用,我们用相同的siRNA处理HEK293E细胞 TDP-43型 并对微阵列杂交进行了加扰控制,另外还使用了两个针对TDP-43的siRNA( ). 半定量qRT-PCR显示,所有siRNAs均降低TDP-43的表达,并显著下调HDAC6 mRNA( ; 补充图S4 )并通过实时RT-PCR进行定量( ). 这种作用在蛋白质水平上得到了证实:TDP-43蛋白的强烈敲除一直伴随着WB上HDAC6蛋白的减少( ). HDAC6酶的功能衰竭表现为乙酰-管蛋白的伴随增加( ),主要细胞HDAC6基质( 哈伯特 等 , 2002 ). 此外,双激光共聚焦显微镜在单细胞水平证实了TDP-43沉默导致HDAC6下调。 表达低水平TDP-43的有效沉默细胞也显示出低水平HDAC6,而相邻的未转染细胞则显示出TDP-43和HDAC6的强劲表达( ).
验证TDP-43沉默HEK293E细胞中HDAC6下调。 ( A类 )TDP-43位点内siRNA序列的位置。 方框代表外显子(金色,编码;粉红色,非编码)。 ( B类 —— D类 )模拟转染HEK293E细胞(m),用打乱(scr)siRNA或指示的TDP-43定向siRNA处理。 提取总RNA,并使用扩增TDP-43、HDAC6和看家基因卟啉原脱氨酶(PBGD)的引物对进行半定量RT-PCR(B),如图所示。 TDP-43(黑条)和HDAC6(灰条)mRNA的相对qRT-PCR定量(C)归一化为PBGD。 值表示三个独立实验的平均值。 与模拟转染相比,TDP-43敲低显著降低了TDP-43和HDAC6-qRT-PCR信号( ** P(P) <0.002; *** P(P) <0.0001). (D) 如图所示,对细胞裂解物进行western blot,并用TDP-43、HDAC6、总α-微管蛋白和乙酰-管蛋白抗体进行检测。 ( E类 —— G公司 )用siRNA转染HEK293E细胞 TDP-43型 B,用小鼠抗TDP-43(E,红色)和兔抗HDAC6(F,绿色)染色。 箭头指向含有强烈TDP-43敲除的转染细胞,星号标记的细胞几乎没有敲除。 细胞核用Hoechst 33342(蓝色)复染; 合并后的图像显示在右侧(G)。 尺寸棒=10μm。
非神经元和神经元细胞系中TDP-43稳定慢病毒敲除后HDAC6降低的验证 为了排除瞬时转染引起的急性细胞应激导致的人为因素,我们用稳定整合的shRNA验证了HDAC6在HEK293E细胞中的下调作用 TDP-43型 慢病毒转导后。 以剂量依赖性的方式,TDP-43敲除伴随HDAC6蛋白下调( ). 甚至HEK293E细胞的部分转导(载体稀释1:1024)也导致TDP-43敲低( )双激光共聚焦显微镜观察到,在单细胞水平上,HDAC6强烈下降,乙酰-管蛋白随之增加( ). shRNA的稳定克隆 TDP-43型 -处理后的HEK293E细胞显示出强烈的TDP-43敲除以及强烈的HDAC6 mRNA( )和蛋白质减少( ). HDAC6底物乙酰-管蛋白的伴随积累与特定HDAC6抑制剂tubacin的效果相当( 哈格蒂 等 , 2003 ) ( ).
HDAC6在稳定的TDP-43沉默细胞中下调。 ( A类 )用系列稀释的lent-shRNA处理HEK293E细胞 TDP-43型 (车道1,1:4;车道2,1:16;车道3,1:64;车道4,1:256;车道5,1:1024;车道6,1:4096)或未经处理(−)。 如图所示,从细胞裂解液中制备WBs,并用TDP-43、HDAC6、α-微管蛋白和乙酰-管蛋白抗体进行检测。 ( B类 , C类 )用抗TDP-43(B)或抗HDAC6和抗乙酰基-管蛋白(C)对用第五稀释液(载体颗粒的1:1024)转导的HEK293E细胞进行染色。 表观荧光显示绿色荧光蛋白(GFP)通过病毒载体盒表达。 注意,即使在低剂量转导后,成功转导的HEK293E细胞(GFP阳性)对TDP-43(B)也有相当强的下调作用,并显示HDAC6减少,乙酰-管蛋白增加(C中箭头所示)。 比例尺=10μm。 ( D类 —— G公司 )shRNA的单细胞克隆 TDP-43型 -对处理过的HEK293E(D,F)或SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞(E,G)进行RNA和蛋白质水平分析。 从亲本细胞系(−)和单个克隆中提取(D,E)RNA,并使用针对TDP-43、HDAC6和看家基因PBGD的引物对进行半定量RT-PCR。 如图所示,从蛋白裂解物制备(F,G)WBs,并用TDP-43、HDAC6、总α-微管蛋白和乙酰-管蛋白抗体进行检测。 一些培养物用指定浓度的托巴辛处理5小时。
我们进一步使用SH-SY5Y细胞在神经元细胞类型中进行验证。 TDP-43对shRNA慢病毒转导的稳定沉默 TDP-43型 在SH-SY5Y细胞中,克隆也持续引起HDAC6 mRNA的下调( )和蛋白质( ). 因此,TDP-43敲除下调HDAC6 mRNA和蛋白的表达,并降低非神经元和神经元细胞中HDAC6酶的活性。
wt TDP-43再次感染恢复HDAC6表达 为了证明HDAC6对TDP-43沉默的减少是一种特殊的作用,我们使用了一种siRNA,其靶向TDP-43的3′UTR(siRNA TDP-43型 B类; 看见 ),因此可以有效地重新感染TDP-43 cDNA。 HDAC6 mRNA( )和蛋白质( )在再次感染wt TDP-43后可以恢复,显示HDAC6水平对TDP-43的特定依赖性。 然而,仅TDP-43 wt的过度表达并没有导致HDAC6的进一步增加,这表明内源性TDP-43数量已经达到HDAC6表达的饱和。
HDAC6的表达通过TDP-43再转染而特异性恢复。 ( A类 —— D类 )模拟转染HEK293E细胞(m),用打乱(scr)siRNA或siRNA处理 TDP-43型 B.24小时后,用空载体(−)或突变体或wt-Flag-TDP-43转染细胞,如图所示。 (A、C)。 提取总RNA并进行半定量RT-PCR,扩增内源性TDP-43、总TDP-43和HDAC6以及看家基因PBGD,如图所示。 (B、D)。 从细胞裂解物制备WBs,并用TDP-43、HDAC6、总α-微管蛋白或GAPDH抗体进行检测,如图所示。 ( E类 , F类 ). 稳定沉默的shRNA TDP-43型 用空载体(−)或指示的Flag-TDP-43结构体再次感染HEK293E细胞。 提取的RNA用于半定量RT-PCR(E),蛋白质裂解物用于WBs(F),如上所述。 ( G公司 , H(H) )模拟转染HEK293E细胞(−)或转染siRNA TDP-43型 B.24小时后,用空载体(−)或wt或C末端截短(ΔGRD)Flag-TDP-43转染细胞。 提取的RNA用于半定量RT-PCR(G),WB(H)的蛋白裂解物,如上所述。 ( 我 )模拟转染HEK293E细胞(m),用打乱(scr)或siRNA处理 TDP-43型 B.24小时后,用空载体(−)、Flag-TDP-43 wt或指示的点突变体转染TDP-43沉默细胞。 提取总RNA并进行如上所述的半定量RT-PCR。
TDP-43包含两个参与特定RNA处理功能的RRM域。 我们已经生成了缺失RRM1(ΔRRM1)、RRM2(△RRM2)和两个RRM(△RRM1/2)的删除结构。 这些缺失结构未能恢复短暂稳定沉默的HEK293E细胞中TDP-43敲除时HDAC6 mRNA和蛋白质水平( ). 此外,核定位受损的TDP-43突变变异体(NLSmut)( 温顿 等 , 2008 ) ( )或缺少C端子GRD(ΔGRD)( )两者都未能恢复HDAC6级别。 GRD被证明负责与hnRNP的相互作用,并且对于CFTR的外显子跳跃功能是必要的( Buratti和Baralle,2001年 ). 因此,TDP-43的核定位及其核酸和蛋白结合能力是HDAC6调节的重要决定因素。
为了评估TDP-43基因临床突变的影响,我们进行了拯救实验,将一些全长TDP-43错义突变体转染到沉默细胞中。 在这些实验中,大多数与疾病相关的TDP-43突变体表现为wt,这与未能检测到全长蛋白背景下临床TDP-43突变的显著CFTR报告剪接改变一致( 野中弥弥 等 , 2009 ). 然而,[D169G]TDP-43始终显示出救援能力降低的趋势,R361S突变( 卡巴夏 等 , 2008 )完全损害TDP-43恢复HDAC6 mRNA表达的能力( ). 有趣的是,R361S突变位于TDP-43的最小hnRNP A2相互作用域内( 丹布罗焦 等 , 2009 ).
TDP-43特异性结合HDAC6 mRNA 观察到的TDP-43对HDAC6表达的影响可能是由于转录和/或mRNA处理/稳定事件。 为了显示TDP-43对HDAC6 mRNA的直接影响,我们测试了TDP-43是否直接与HDAC6的mRNA结合。为此,我们生成了包含HDAC6编码序列(CDS)的cDNA构建物,其中包含和不包含3′UTR 在体外 转录。 生物素标记的RNA与转染Flag-TDP-43或载体控制的HEK293E细胞的裂解物孵育,用紫外线交联,然后进行免疫沉淀和WB分析。 标记-TDP-43免疫沉淀物(而非对照免疫沉淀物质)显示存在生物素化的HDAC6 mRNA残余物,如与辣根过氧化物酶(HRP)结合的链霉亲和素探针所示( ). 反向下拉实验证实了TDP-43和HDAC6 mRNA之间的相互作用。生物素化HDAC6的mRNA被链霉亲和素结合珠拉下。 转染的Flag-TDP-43和重要的内源性TDP-43均在生物素化HDAC6 mRNA沉淀物中特异检测到( )与HDAC6 3′UTR的存在无关。 为了显示这种相互作用的特异性,DNA和RNA-结合蛋白SMN( Lorson和Androphy,1998年 )作为对照蛋白,未被HDAC6 mRNA拉下( ). 作为RNA特异性的补充控制,我们使用HDAC1,HDAC家族的另一个成员。 与HDAC6相比,生物素化的HDAC1没有降低TDP-43( ). 接下来,我们测试了RRM缺失突变体与HDAC6 RNA结合的能力。TDP-43ΔRRM1和TDP-43△RRM1/2不能与HDAC6RNA结合( ). 有趣的是,TDP-43ΔRRM2能够与类似于TDP-43重量的HDAC6 mRNA结合。因此,直接HDAC6 RNA结合依赖于TDP-44的RRM1,而不依赖于RRM2。 然而,如前面CFTR所示,可能需要后者来实现正确的复杂结构和功能( Buratti和Baralle,2001年 ; 阿亚拉 等 , 2005 ). 这也可以解释TDP-43ΔRRM2无法恢复HDAC6水平的原因( ).
TDP-43与HDAC6 mRNA特异性结合 在体外 转录/生物素化并与瞬时转染载体控制物wt或突变Flag-TDP-43的HEK293E细胞的裂解物混合,如图所示。 样品进行紫外线交联,用RNase短暂处理,并用抗Flag珠沉淀( A类 )或链霉亲和素-琼脂糖( B类 —— F类 ). 阴性对照沉淀物来自未添加HDAC6 RNA(−)或生物素化HDAC1 RNA的细胞裂解物,如图所示。 (A) 如图所示,用链霉亲和素-HRP探测标记免疫沉淀菌的WB,以显示生物素化HDAC6 mRNA残余物和抗TDP-43。 星号表示非特异性条带; 箭头指向TDP-43波段。 如图所示,使用抗Flag(B,E,F)、抗TDP-43(C,D)或抗SMN(C)检测链霉亲和素下拉物的(B–F)WBs。 生物素化的HDAC6 RNA可降低标记的TDP-43 wt(B)和内源性TDP-43,但不能降低SMN(C)。 相反,生物素化HDAC1 RNA并没有有效地降低TDP-43(D、E、左车道)。 HDAC6 RNA没有与缺乏RRM1结构域的TDP-43结合(E,右车道)。 取3′端逐渐缩短的HDAC6 RNA片段,通过反标记(F)检测TDP-43的存在。 WB分析未转染和Flag-TDP-43转染HEK293E裂解物的TDP-43蛋白输入,证实所有实验均为均匀加载。 每个实验都进行了几次,结果相似。
此外,我们在HDAC6 mRNA的CDS上粗略定位了TDP-43结合位点 在体外 交联实验。 超过约1000个核苷酸(nt)的片段有效地结合Flag-TDP-43,而仅包含前663或994个核苷酸的片段不能有效地拉下Flag-TDP-43( ). 因此,TDP-43似乎优先与HDAC6 RNA的3′CDS结合,可能在nt~1000-1500范围内。 这表明TDP-43效应涉及但可能不限于HDAC6 mRNA内这些500 nt的结合。
TDP-43敲除降低黑腹果蝇HDAC6 mRNA 验证TDP-43敲除的效果 体内 ,我们删除了TBPH基因的整个CDS,即 D.黑腹果蝇 ( ). 与最近描述的TBPH基因部分缺失相反( 费金 等 , 2009 ),我们无法获得成虫,因为TBPH −/− 个体作为二龄幼虫死亡。 为了验证TBPH的缺失和降低对HDAC6的影响,我们测量了成人TBPH中TBPH和HDAC6 mRNA的水平 +/− 苍蝇( ). 如预期,TBPH +/− 与对照组相比,苍蝇TBPH的mRNA水平降低。 值得注意的是,TBPH中HDAC6的水平也降低了 +/− 飞头,提供 体内 TDP-43调节HDAC6 mRNA水平的证据。 为了确认HDAC6蛋白、TBPH裂解物的特异性下调 +/− 苍蝇和对照组使用抗 D.黑腹果蝇 HDAC蛋白( 潘迪 等 , 2007 ). TBPH中HDAC6水平降低,但HDAC1水平没有降低 +/− 飞行头与控制装置的比较( ).
TBPH基因敲除苍蝇中HDAC6 mRNA下调的验证。 ( A类 )的示意图 D.黑腹果蝇 TBPH基因座(白盒,非编码;黑盒,编码)和TBPH的大小 无效的 删除。 P元素插入 P{SUPor}(西班牙语) KG08578公司 和 P{SUPor}(西班牙语) KG08129公司 在第二条染色体的60A区域显示(三角形)。 TBPH公司 无效的 删除,删除整个TBPH编码序列,是由P元件切除/重组的组合事件产生的,包括 P{SUPor}(西班牙语) KG08578公司 和 P{SUPor} KG08129公司 . ( B类 )从成年苍蝇(对照组和TBPH各10只雌性和10只雄性)中制备总RNA +/− )并使用引物对扩增进行RT-PCR D.黑腹果蝇 如图所示,TDP-43(TBPH)、HDAC6和看家基因actin5C。 ( C类 )从成年苍蝇头(对照组和TBPH各10只雌性和10只雄性)中制备总蛋白裂解物 +/− )并使用抗体进行WB分析 D.黑腹果蝇 HDAC6、HDAC1和α-微管蛋白,如图所示。 ( D类 )从一龄幼虫(黑条,对照 n个 =4; 灰色条,TBPH −/− n个 =4)并传输到AmpliGrids。 在RNA提取和限制性消化残留污染基因组DNA后,使用扩增TBPH、dmHDAC6和看家基因actin5C的引物对进行qRT-PCR。 TBPH中未检测到TBPH的表达 −/− 幼虫脑在45个扩增周期内。 TBPH中dmHDAC6的RNA水平显著降低 −/− 与对照组相比。 TBPH和dmHDAC6的表达归一化为actin5C水平( ** P(P) <0.002; *** P(P) <0.000001).
从组织中获取测量值 D.黑腹果蝇 完全缺乏TBPH,我们从一龄幼虫的大脑中建立了qRT-PCR。 TBPH的个体大脑 −/− 将对照幼虫转移到AmpliGrid载玻片上的单个反应中心。 对照显示TBPH和HDAC6 mRNA的qRT-PCR信号( )显示这两个基因在一龄幼虫大脑中的表达。 如预期,TBPH中未检测到TBPH mRNA −/− 幼虫的大脑。 此外,在TBPH中,HDAC6 mRNA水平显著降低 −/− 幼虫脑( ). 因此,HDAC6表达在 D.黑腹果蝇 缺少TDP-43正交曲线。
TDP-43敲除介导的HDAC6下调导致蛋白质毒性 HDAC6减少对TDP-43敲除的潜在细胞后果之一是聚集蛋白的周转受损。 众所周知,HDAC6能结合错误折叠的泛素化蛋白,并将其连接到逆行微管运输机制,最终将聚集蛋白传递给自噬降解( 川口 等 , 2003 ). HDAC6缺乏会减少这种有害的形成,反而会增加蛋白毒性物种的细胞浓度。 为了验证TDP-43介导的HDAC6下调降低蛋白毒性聚集物周转的假设,我们使用了超长polyQ-expended Atx3作为实验模型蛋白( 比切梅尔 等 , 2007 ). 控制并稳定沉默shRNA TDP-43型 用增强型绿色荧光蛋白(eGFP)标记的Atx3瞬时转染HEK293E细胞,Atx3含有15(Atx3-Q15–eGFP或148(Atx3-Q148–eGFP)长聚谷氨酰胺束或空载体对照。 eGFP单独或未扩张的Atx3-Q15–eGFP均未形成不同的聚集物,而超长polyQ扩张的Atx3-Q148–eGFP确实形成了较大的聚集物( ). 在稳定沉默的shRNA中 TDP-43型 与亲代细胞相比,聚集性细胞的百分比显著降低至50%( ). Myc–HDAC6的表达导致对照HEK293E细胞中聚集物的百分比略有增加,重要的是,在稳定沉默的shRNA中完全恢复了聚集物的形成 TDP-43型 单元格( )相反,通过瞬时转染亲本HEK293E和HDAC6特异性siRNA(siRNA HDAC6型 ) ( ). 对照WBs显示了siRNA的非常强的急性击倒效率 HDAC6型 在Atx3-Q148–eGFP聚集实验的关键时期,HDAC6蛋白水平仍然受到抑制,即使在后期有一些siRNA耗竭( ). 这些结果表明,TDP-43缺陷以HDAC6依赖的方式损害了攻击性形成。
TDP-43敲除介导的HDAC6下调减少蛋白质聚集并增加蛋白质毒性。 ( A类 )亲代HEK293E细胞(左面板)和稳定沉默的shRNA TDP-43型 用eGFP、Atx3-Q15–eGFP或Atx3-Q148–eGFP96小时瞬时转染细胞(右侧面板)。表观荧光(绿色)显示转染细胞中存在eGFP(融合蛋白),用抗Atx3(红色)免疫染色证实。 用Hoechst 33342对细胞核进行复染。 合并的图像显示在右侧。 箭头指向Atx3-Q148–eGFP内含物。 比例尺=10μm。 ( B类 )如上所述,将细胞与Myc–HDAC6或空载体对照(−)一起转染。 96小时后,在三个独立的实验中对具有可见聚集物的细胞进行计数。 与对照HEK293E细胞相比,shRNA显著减少 TDP-43型 细胞含有聚集体,HDAC6转染显著恢复了聚集体的形成,达到对照水平( ** P(P) <0.003). ( C类 )HEK293E细胞模拟转染(m)或瞬时转染打乱(scr)或HDAC6定向siRNA。24小时后,细胞转染Atx3-Q148-eGFP。 再96小时后,对可见Atx3聚集的细胞进行计数,并将其归一化为未转染HEK293E细胞的聚集细胞数。 与这些相比,siRNA显著减少 HDAC6型 -含有聚集体的处理细胞( * P(P) <0.03). 用siRNA治疗48小时后评估敲除效率 HDAC6型 在120小时实验程序结束后,使用抗HDAC6和抗GAPDH对蛋白质提取物进行WB分析。 稳定沉默的shRNA TDP-43型 单元格( D类 )或瞬时转染siRNA HDAC6型 ( E类 )转染eGFP、Atx3-Q15–eGFP或Atx3-Q148–eGFP-以及Myc–HDAC6(浅灰色条)或空载体对照(深灰色条)。 在DNA转染后96小时测量LDH释放值,并将其归一化为平行的非沉默HEK293E转染(黑条)。 值表示六(D)或七(E)个独立实验的平均值( * P(P) <0.04).
聚集形成被认为是一种细胞防御机制,可以隔离有毒、错误折叠的蛋白质。 因此,TDP-43沉默细胞中Atx3-Q148–eGFP模型蛋白聚集物的形成减少可能伴随着蛋白毒性物种数量的增加。 Atx3前种的聚集体是不可见的微聚集体,无法进行微观分析( 柴 等 , 2001 ). 然而,我们注意到稳定沉默的shRNA TDP-43型 Atx3-Q148-eGFP转染后HEK293E细胞“受损”。 因此,我们通过稳定沉默的shRNA的乳酸脱氢酶(LDH)释放来量化细胞死亡 TDP-43型 瞬时转染eGFP、Atx3-Q15–eGFP或Atx3-Q148–eGFP-的HEK293E细胞。 与亲代HEK293E细胞相比,稳定的TDP-43沉默细胞更容易受到eGFP单独或未扩增的Atx3-Q15–eGFP的瞬时转染,这可能反映了TDP-43敲除导致总体生存能力降低。 重要的是,用扩增的Atx3-Q148-eGFP转染使稳定沉默的shRNA的细胞死亡显著增加三倍 TDP-43型 细胞与对照HEK293E细胞的比较( ). 用siRNA瞬时转染亲代HEK293E细胞也获得了类似的结果 HDAC6型 ( ). Myc–HDAC6的共转染显著提高了shRNA中的细胞活力 TDP-43型 ( )和siRNA HDAC6型 -处理过的( )HEK293E电池。 因此,由于TDP-43缺乏,HDAC6下调似乎减少了有毒聚集蛋白的细胞周转,从而可能有助于发病。
讨论 TDP-43参与了FTLD-TDP、ALS和IBM的发病机制,因为TDP-43蛋白是所有这些疾病内含物的关键成分。 在神经退行性疾病中,TDP-43在病理上被加工成C末端片段并磷酸化( 诺依曼 等 , 2006 )支持异常磷酸化、分裂和聚集导致TDP-43获得毒性功能的情况。 值得注意的是,含有胞浆TDP-43内含物的神经元和肌肉细胞缺乏通常的核TDP-43信号( 诺依曼 等 , 2006 ; 奥利弗 等 , 2009 ). 此外,在FTLD-U的不同脑区中经常发现的特征是细胞质局部颗粒TDP-43染色以及缺乏核TDP-43( 布兰德迈尔 等 , 2008 ). 这些发现指向了核功能机制的丧失,而不是毒性功能障碍的增加。 假设主要的核蛋白TDP-43参与mRNA加工事件,如其与参与剪接和mRNA代谢的NB重叠的定位所示,我们通过瞬时沉默的HEK293E细胞的表达谱来筛选相关的TDP-43靶mRNA。
发现一些与遗传病相关的mRNA没有显著改变( ). 在402个转录本中,siRNA改变了两倍以上 TDP-43型 对HEK293E细胞进行治疗后,我们发现HDAC6的表达在TDP-43敲除时下调。 在非神经元HEK293E和神经元SH-SY5Y细胞中,mRNA和蛋白质水平的多重siRNA和慢病毒shRNA沉默一致证实了这一点。 乙酰-管蛋白水平的增加证明了TDP-43敲除的HDAC6活性减弱。 此外,通过用wt TDP-43 cDNA重新感染沉默细胞,HDAC6水平下降可以恢复到正常水平。 相反,RRM和NLS突变体未能恢复HDAC6水平,表明核和RNA-结合TDP-43对HDAC6 mRNA水平有直接影响。 此外,其他(hnRNP)蛋白可能是HDAC6 mRNA调节所必需的,因为缺少C末端GRD的截断TDP-43无法恢复HDAC6的mRNA和蛋白水平。 有趣的是,大多数致病性TDP-43点突变体能够恢复HDAC6水平,类似于wt蛋白,这与之前关于CFTR剪接的报告一致( 野中弥弥 等 , 2009 ). 我们注意到所有测试的错义突变体的TDP-43蛋白稳态水平、聚集或细胞分布没有明显变化。 然而,两个突变显示恢复HDAC6水平的能力持续降低(D169G)或降低(R361S),表明HDAC6降低可能发生在具有特定遗传改变的个体中。
交联实验显示了wt TDP-43与HDAC6 RNA的特异性相互作用。 删除RRM1而不删除RRM2将取消HDAC6 RNA的结合,这表明RRM2可能不需要用于结合,而是用于HDAC6 RNA上TDP-43的活性,类似于CFTR的描述( Buratti和Baralle,2001年 ; 阿亚拉 等 , 2005 ). 通过粗略作图,我们可以显示TDP-43优先与HDAC6 RNA的3′CDS序列结合。因此,TDP-43对HDAC6的影响至少部分是通过编码区内mRNA的直接结合介导的。
引人注目的是,我们提供了证据表明TDP-43对HDAC6的调节也发生了 体内 在成人TBPH中检测到dmHDAC6 mRNA和蛋白质水平降低 +/− 苍蝇头部,而dmHDAC1蛋白保持不变。 在完全缺乏TBPH的果蝇的一龄幼虫脑中,dmHDAC6 mRNA显著减少。 总之,TDP-43对于维持HDAC6 mRNA的生理水平是必要的 体内 .
HDAC6具有多种细胞功能,主要通过对肌动蛋白和微管蛋白细胞骨架的作用来控制细胞内的运输和细胞运动(综述于 瓦伦苏埃拉·费尔南德斯 等 , 2008 ). 此外,HDAC6通过介导错误折叠蛋白沿微管的转运、其有害形成和自噬机制的补充,在自噬介导的错误折叠蛋白降解中发挥着关键作用( 川口 等 , 2003 ; 布瓦约 等 2007年b ). 在这个过程中,HDAC6与VCP一起以微调平衡的方式发挥作用。 当VCP促进聚集蛋白的蛋白酶体降解时,HDAC6促进攻击性形成和自噬( 布瓦约 等 , 2006 ). 值得注意的是,VCP在遗传上与IBMPFD相关( 瓦茨 等 , 2004 )FTD的一种形式,以大脑中的TDP-43病理学为特征( 诺依曼 等 , 2007 )和肌肉( 韦尔 等 , 2008 ). 引人注目的是,病理突变的显性负性VCP导致错误折叠蛋白的攻击性形成功能障碍,HDAC6过度表达可以挽救这种功能障碍( Ju公司 等 , 2008 ). 相反,HDAC6的减少可能导致类似的蛋白质降解障碍( 歌曲 等 , 2008 ). 使用扩展的polyQ Atx3-Q148–eGFP作为模型蛋白,我们可以证明TDP-43敲除减少了大聚集体的形成,但增强了蛋白质毒性,这两种蛋白都特别依赖于HDAC6。 因此,疾病中TDP-43核功能的丧失可能导致HDAC6下调并继而损害毒性蛋白的周转,从而导致TDP-43蛋白病的发病过程。
材料和方法 克隆和诱变 从人脑cDNA文库(Clontech)中扩增出全长TDP-43、HDAC1和HDAC6。 HDAC1和HDAC6通过 Bgl公司 二/ 不是 我加入了pCMV–Myc(Clontech)。 从逆转录酶(RT)反应中扩增HDAC6 3′UTR,并通过内部EcoRV位点与HDAC6 CDS融合( 生态 RV汽车/ 不是 一) ●●●●。 将HDAC1和HDAC6(无或有3′UTR)亚克隆到pPD129.36( Bgl公司 二/ 不是 一) 在T7启动子的控制下,分别产生pPD129.36 HDAC1、HDAC6−UTR和HDAC6+UTR。 TDP-43在框架中克隆( 巴姆 HI(高)/ Hin公司 dIII)到pcDNA3.1(−)(Invitrogen)中,带有5′-Flag标签( 不是 我/ 生态 RI)。 通过定点突变产生突变TDP-43 cDNA。 如前所述,克隆了带有突变NLS的TDP-43(aa 82–84变为Ala-Ala-Ala)( 温顿 等 , 2008 )并子克隆到pcDNA3.1-Flag中。
Atx3包含15或148个CAG重复( 比切梅尔 等 , 2007 )已通过子克隆 萨克 我/ 阿帕 I进入pEGFP-N2(Clontech),导致Atx3–eGFP融合。 使用BigDye Terminator v.3.1和ABI 3100遗传分析仪(Applied Biosystems)对所有过度表达和沉默结构(见下文)进行序列验证。 引物序列可根据要求获得。
细胞培养和RNA沉默 HEK293E细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中生长,SH-SY5Y细胞在DMEM-F12培养基(均为Biochrom培养基)中生长。DMEM-F1培养基在37°C,添加10%胎牛血清(PAA),加湿5%CO 2 /空气。 根据制造商的说明,使用FuGene6(罗氏)进行DNA转染。 使用HiPerfect和5 nmol加扰(均为Qiagen)或TDP-43/HDAC6特异性siRNAs:siRNA进行瞬时siRNA转染 TDP-43型 A、 5′-CAAUAGCAAUAGACAGUUA-3′; 小干扰RNA TDP-43型 B、 5′-CACUACAAUUGAUACAA-3′(均为Qiagen); 小干扰RNA TDP-43型 C、 5′-GAATCAGGGTGTTGGTGT-3′; 小干扰RNA TDP-43型 D、 5′-GAAAACAAUCAAGUAGUAA-3′(双西格玛); 小干扰RNA HDAC6型 ,5′-CCGUCAGCUGCAUGGAA-3′(恰根)。
通过用不同数量的携带shRNA的慢病毒载体颗粒处理产生稳定沉默的HEK293E和SH-SY5Y细胞 TDP-43型 24小时后分离单个细胞克隆。 一些培养物用HDAC6抑制剂tubacin处理5小时。
SDS-PAGE和WB分析 收集细胞并在裂解缓冲液(50 mM Tris(pH 7.4)、50 mM NaCl、1%NP-40、0.1%脱氧胆酸盐和0.1%SDS、1×完整蛋白酶抑制剂(Roche))中进行裂解。 蛋白质浓度是通过使用双钦酸(皮尔斯生物技术公司)测定的。 使用10或12%聚丙烯酰胺凝胶或4–12%Bis–Tris NuPAGE梯度凝胶(Invitrogen)对蛋白质进行SDS–PAGE,并转移到硝化纤维素上。 将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜,然后与HRP结合的二级抗体孵育(1:15000;Jackson ImmunoResearch Laboratories)。 使用ImmobilonWestern化学发光HRP基板(Millipore)在Hyperfilm ECL高性能化学发光(GE Healthcare)上观察带。 使用NIH Image 1.63版软件进行密度分析。
免疫染色 细胞被镀到涂有PDL(Sigma)和胶原(Cohesion)的玻璃盖玻片上,用4%(w/v)多聚甲醛固定,并用1%Triton-X-100渗透。 用一级抗体培养细胞,然后用二级抗体培养抗小鼠IgG Alexa Fluor-488或-568,以及稀释1:2000的抗兔Alexa Fluor-488-568或-647(分子探针)。 细胞核用稀释1:5000的Hoechst 33342(分子探针)染色。 使用荧光安装介质(Dako)将盖玻片安装在显微镜载玻片上。 使用配备ApoTome成像系统(蔡司)的AxioImager显微镜拍摄共聚焦荧光图像。
抗体 以下抗体用于WB分析或免疫荧光(IF):兔抗TDP-43(WB/IF,1:2000;ProteinTech Group)、小鼠抗TDP-44; 西格玛,克隆B-5-1-2),小鼠抗Flag(WB,1:100 000;西格玛(Sigma,克隆M2),小鼠抗GAPDH(WB;1:2000;BioTrend),兔抗组蛋白H3(WB:1:1000;细胞信号),兔抗热休克蛋白90(WB:1:35 000;Stressgen),鼠抗SMN(WB/IF:1:5000;BD Transduction Laboratories),鼠抗毒蛋白(IF:1:5000,BD Transucation Laboratory), 小鼠抗PML(IF,1:100;Abcam)、小鼠抗SC35(IF,1:5000;Sigma)、兔抗Atx3(IF,1:500; 施密特 等 1998年 ),兔抗dmHDAC1(WB,1:2000; 潘迪 等 , 2007 ),抗dmHDAC6(WB:1:2000; 潘迪 等 , 2007 ).
编码shRNA慢病毒载体的制备 TDP-43型 TDP-43特异性shRNA是在siRNA的基础上设计的 TDP-43型 B具有miRNA23(5′-CTTCCTGCA-3′)的环结构。 shRNA TDP-43型 通过将退火寡核苷酸连接到 Xba公司 我/ Bsi公司 mU6的WI站点-[ Xba公司 我/ 巴西 WI]-CMV-eGFP-IRES-Hygro修饰转移质粒(pHR'COMBI)( 巴克兰特 等 , 2002 ). 慢病毒载体由6×10的三重瞬时转染产生 6 293T细胞中含有20μg转移质粒、10μg包装质粒(pCMVΔR8.91)和5μg包膜质粒(pLP/VSVG),使用聚乙烯亚胺作为转染试剂( 劳尔斯 等 , 2007 ). 隔夜培养后,更换培养基。 收集转染后48至72小时的培养基,并使用50kDa vivaspin-15浓缩器(Sartorius)将培养基中的载体颗粒浓缩至100倍。 将病媒等分样品冷冻并保存在−80°C下,直至使用。
RNA交联程序 紫外线交联 在体外 根据 万巴卡 等 (2008) 根据 鹿岛和曼利(2003) .pPD129.36编码HDAC6−UTR、HDAC6+UTR或HDAC1用线性化 不是 I.HDAC6片段是通过线性化pPD129.36 HDAC6−UTR和 Sca公司 我接着是HDAC6编码区内的摘要:片段1(bp 1–633), 斯图 我; 片段2(bp 1–994): Xho公司 我; 片段3(bp 1–1506), 千磅 我; 片段4(bp 1–2123), 阿帕 我; 片段5(bp 1–3131; 生态 RV)。 琼脂糖凝胶纯化1μg DNA后 在体外 根据制造商的说明,使用生物素16-UTP(生物素RNA标记混合物)和T7 RNA聚合酶(均为罗氏)转录/生物素化。 通过在37°C下添加2μl无RNase DNase(Promega)15分钟进行DNA酶消化,并通过添加1μl 0.5 M EDTA停止反应。 通过在260nm处测量吸光度来测定RNA浓度,并通过琼脂糖凝胶电泳检查RNA大小和纯度; 1 pmol生物素–RNA与250μl RNA结合缓冲液(20 mM Hepes(pH 7.5)、5 mM MgCl孵育 2 、50 mM KCl、150 mM NaCl、0.5 mM EGTA、0.5 mM二硫苏糖醇、10%甘油)和500μg HEK293E裂解液,在30°C下保持20分钟。 HEK293E裂解物由单独转染载体或Flag-TDP-43的HEK293A细胞产生,并在RNA-结合缓冲液+0.5%Triton-X-100中裂解。 在冰上以0.120焦耳/厘米的速度进行紫外线照射10分钟 2 在Bio-Link BLX设备(Vilber-Lourmat)中。 在简短的RNase A消化(10μg/ml,Sigma)15分钟后,添加Flag-或Streptavidin-beads(Sigma。 珠子用RNA结合缓冲液+0.5%Triton-X-100洗涤,并在95°C下用1×Lämmli缓冲液洗脱。 洗脱液和输入液用10%SDS-PAGE分离,在硝化纤维素上印迹,并分别用抗体和链霉亲和素(SA)-HRP(WB,1:5000;Amersham)进行检测。
RNA提取和RT-PCR 按照制造商的指示,使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取细胞RNA。 RNA来自 D.黑腹果蝇 用Trizol(Invitrogen)分离。 对于半定量RT-PCR实验,使用转录因子高保真cDNA合成试剂盒(Roche)和锚定寡核苷酸引物逆转录600 ng总RNA。 以RT反应(2μl)为模板,与5μl 5×GoTaq缓冲液、0.1μl GoTaq聚合酶(Promega)和2μM引物在25μl反应中进行转录扩增。 扩增的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色。
对于细胞qRT-PCR,使用与上述相同的条件逆转录1000 ng总RNA; 将1/10稀释液与0.2μM引物和5μl LightCycler 480 SYBR Green I Master分三次进行10μl反应,并在LightCyscler 480系统(Roche)上的384孔区执行qPCR。 通过二阶导数方法获得TDP-43、HDAC6和PBGD的绝对转录水平。 相对转录水平以TDP-43/PBGD或HDAC6/PBGD比率计算,并归一化为模拟转染对照的相对表达水平。 可根据要求提供引物序列。
用于一龄幼虫大脑、大脑和腹神经节的qRT-PCR测量 白色 幼虫和TBPH −/− 幼虫在含有核糖核酸酶抑制剂(发酵剂)的水中解剖。 在分析之前,将单个组织样本转移到AmpliGrid载玻片(Advalytix)上,风干并冷冻。 玻片的半透明性使我们能够对微小脑组织的最佳转移进行精确的视觉监控。 此外,AmpliGrid平台允许低容量PCR反应,非常适合少量模板的扩增。
用0.5μl蛋白溶解混合物(细胞提取试剂盒;Advalytix)和5μl密封溶液覆盖幼虫大脑,以防止在60°C下蒸发30分钟。 将0.5μl Alu I酶(0.66 U/μl)(NEB BioLabs)添加到37°C下的裂解混合物中,切割可能的残留基因组DNA 3小时,然后在95°C下切割2分钟。 通过添加1μl主混合液(10μl:2μl 5×RT缓冲液、0.4μl dNTP混合液(10mM)、0.4μl酶混合液、0.2μl RNase抑制剂、1.6μl 5 x Q溶液、1μl 4重RT-primer混合液(3μM)(定量反向引物Advalytix),直接在AmpliGrid反应位点上进行RT(一步RT-PCR,Qiagen) 与1:10稀释的ETSSB(NEB生物实验室)和H混合 2 O(4.4微升))。 在58°C的AmpliSpeed Cycler上进行RT反应30分钟。对于qPCR,添加TBPH、HDAC6或actin5C引物对,制备四种不同的主混合物( http://www.advalytix.com/primer_design_1519.htm )(6μM库存各20μl)至100μl 2×Brilliant II SYBR Green(Stratagene)和60μl H 2 O.从每个主混合物中,向1μl预稀释(1:3)RT混合物中添加9μl。 qPCR在Stratagene热循环器中进行四次。 Ct值由Stratagene软件计算。 通过2(−Delta Delta C(T))方法获得相对定量( Livak和Schmittgen,2001年 ).
TBPH基因敲除苍蝇的产生 TBPH公司 无效的 如前所述,删除是由P元素调动产生的( 沃伊格特 等 , 2002 ). 简言之,将转座子源引入到转基因w中; P{SUPor} KG08578公司 /P{SUPor}(西班牙语) KG08129公司 苍蝇。 子代中的切除事件通过丢失 白色 + P元素的眼睛颜色标记。 相应的苍蝇与 青色 建立稳定的库存。 准备基因组DNA并测序(GenterPrise GmbH),以确定缺失的断点。 所有使用的苍蝇种群均来自布卢明顿库存中心。
Atx3聚集和毒性分析 为了进行毒性测量,每种条件下的8个孔被转染Atx3-Q15–eGFP、Atx3-Q148–eGFP或空载体结合Myc–HDAC6或空载体对照,并在转染后96小时进行分析。 八个孔中的四个孔作为100%LDH释放/细胞死亡的阳性对照,并在按照制造商的说明使用CytoTox96非放射性细胞毒性试验(Promega)测定LDH前1小时,用Triton-X-100进行最终浓度为1%的处理。 每种情况均以四倍为单位进行测量,并将其归一化为相应的Triton-X-100对照组。 在每种情况下,将所得商数归一化为未沉默的HEK293E细胞。 转染后96小时分析Atx3的聚集。 细胞固定、渗透并用抗Atx3染色。 在三个独立的实验中,对转染Atx3的细胞(>200)进行包涵体形成计数。 WB分析证实在亲代和沉默的HEK293E细胞中Atx3和HDAC6的过表达相同。
统计分析 使用配对、双侧Student’s t吨 -测试。 误差条表示s.e.m。
致谢 我们感谢Elena Hausher和Susann Klein首次克隆HDAC6,感谢Stuart Schreiber捐赠tubacin,感谢Marc Hild捐赠抗体 果蝇属 HDAC蛋白质,Petra Füger帮助苍蝇大脑准备,Claudia Schulte提供有用的建议。 这项工作得到了德国能力网络退化性痴呆症、亥姆霍兹老龄化社会心理健康联盟和赫蒂基金会的支持。 作者的贡献如下:FCF进行了大多数实验; SSW和MLA提供了技术援助和帮助; MW进行微阵列杂交和分析; CVH产生的慢病毒; AV创造了空苍蝇; AV、AW、KG、JVK和PJK操纵和测量苍蝇; RK设计的定量苍蝇引物; TS为Atx3实验提供了工具和建议; FCF和PJK构思和设计了实验; WS、MN、MB、JBS、MA-F、TMR和VB提供了智力和/或财务支持; FCF和PJK撰写了论文; PJK是首席研究员。
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