微管理血管生物学：微小微RNA发挥大作用

摘要

介绍

分子生物学的中心法则是，DNA复制其核苷酸（nt）序列中包含的遗传信息，并将其转录为RNA，在RNA中编码信使核糖核酸的产生。信使核糖核酸基本上是通过剪接和从细胞核转移到细胞质来处理的。mRNA携带nt编码信息到核糖体。核糖体翻译蛋白质合成的密码。RNA中的绝大多数nts携带合成蛋白质的代码吗？不。然而，几乎所有的基因鉴定方法都假设基因编码蛋白质。核心教条没有考虑到遗传密码的重要部分，而遗传密码已经隐藏了几十年。非编码RNA（ncRNA）基因产生功能性RNA分子，而不是编码蛋白质。几个不同的系统筛选已经鉴定出数量惊人的ncRNA基因。ncRNAs似乎在需要高度特异性核酸识别而无需复杂催化的作用中特别丰富，例如在指导基因表达的转录后调控或指导RNA修饰方面。虽然人们普遍认为大多数遗传信息是由蛋白质处理的，但最近的证据表明，哺乳动物和其他复杂生物体的大多数基因组实际上转录成了非编码RNA，其中许多是选择性剪接和/或加工成较小的产物[1]. 这些RNA（包括来自内含子的RNA）似乎包含迄今为止隐藏的内部信号层，控制生理和发育中的各种基因表达水平，包括染色质结构/表观遗传记忆、转录、RNA剪接、编辑、翻译和转换。内部信号的这一隐藏层现在正变得如此重要，以至于缺乏对这一层的考虑会给我们理解健康和疾病的分子基础的能力带来严重的风险[1–4]. 在所有生命形式中，ncRNA包括核糖体、转移、小核仁和小核仁RNA、干扰RNA（RNAi）、短干扰RNA（siRNA）和micro-RNA（miRNA）。

miRNAs是基因表达的强大调节器，可以微调由大量基因编码的蛋白质的合成[Baek，2008#257；Selbach，2008#1588]。据估计，大约3%的人类基因编码miRNAs[5]. miRNAs约为22-核糖核苷酸长的ncRNAs，具有识别序列互补和RNA-结合蛋白指导的多个mRNA靶点的潜力。最近的证据表明，人类中独特的miRNA基因数量超过1000个[6]. miRNAs及其靶基因的数量比我们之前认为的要多得多[7]. miRNA的功能是多功能的，主要通过靶向mRNA的3′-非翻译区（UTR），具有特异性抑制翻译起始或延伸以及诱导mRNA失稳的能力。简言之，miRNA通过常规机制转录于细胞核并输出到细胞质[8]其中，经过生物处理后，它们形成成熟的miRNA，可以通过RNA-RNA结合与匹配的mRNA相互作用。这种结合在RNA诱导的沉默复合物的协助下，导致作用模式，导致mRNA降解或翻译抑制(图1) [9]. 这种作用机制称为转录后基因调控。与植物相反，在动物中，miRNA与其靶mRNA之间没有100%的nt匹配，导致了一种导致mRNA翻译抑制的作用方式[10]以及mRNA失稳[Baek，2008#257，Selbach，2008#258]。miRNA与其匹配的mRNA之间的相互作用通过miRNA中的匹配种子元件发生在miRNA的5′-UTR和mRNA的3′-URT区域之间。利用这些数据，计算预测方法估计miRNA可以靶向30%的人类基因组[5,11–13]. 其他估计表明，超过50%的人类蛋白编码基因可能受miRNAs调控[14]. 此外，一个miRNA可以调节数百个基因[14]一个基因可以被许多miRNAs调控。miRNA表达的组织特异性增加了miRNA在发育生物学以及细胞和组织表型中的作用[15–17]. 组织依赖性miRNA生物发生和靶点选择过程的复杂性目前正在研究中[7].

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图1

血管生物学中的miRNAs。pri-miRNA由RNA pol II在细胞核内合成。然后，通过RNA内切酶Drosha及其辅因子DGC48，pri-miRNA被切割成约70 nts长的前miRNA。该产物通过Exportin 5被输出到胞浆中，在胞浆中再次被第二个RNA内切酶Dicer裂解，形成约20–22-nt长的成熟miRNA。然后其中一个ds-miRNA被并入RNA诱导沉默复合物（RISC）中，其中，通过与mRNA的3′UTR端碱基匹配，它将捕获复合物中的目标mRNA，从而通过核糖体抑制其翻译。取决于任何给定miR靶向的特定mRNA(表1)，血管生物学的几个方面可能会受到影响。EC=内皮细胞。

阻断miRNA生物发生对血管的影响

2005-2008年，第一系列的观察结果证实了miRNA在哺乳动物血管生物学调控中的关键意义，这些观察结果来自于阻止miRNA生物生成以耗尽血管组织和细胞的miRNA库的实验研究[26–29]. Dicer是核糖核酸酶III家族的一员，将双链RNA底物加工成约21到27-nt的产物，通过RNA干扰触发序列定向基因沉默。Dicer对RNA的识别和长度特异性切割机制已经建立。Dicer是参与miRNA生物生成的关键酶[30]. 在胚胎血管生成的研究中，有报道称Dicer基因在11天的胚胎中显著表达，并在胚胎第17天保持不变，在整个胚胎组织中均匀表达[26]. 这个掷骰子的人^例1/2缺少前两个外显子的突变小鼠掷骰子的人该蛋白的功能至关重要，它是一种对胚胎血管生成有启发作用的工具。值得注意的是，这些突变小鼠的Dicer功能处于亚形态，并不代表Dicer空态。纯合子突变小鼠无法存活，因此对胚胎进行了检查。从胚胎第11.5天开始，几乎所有掷骰子的人^例1/2与野生型或杂合子的幼崽配偶相比，胚胎的生长发育受到抑制。在此阶段仍能存活的胚胎具有较薄且发育不太理想的血管，这为miRNAs参与血管生成提供了第一证据[26]. 对突变胚胎的卵黄囊进行显微镜检查后发现，卵黄囊中的血管较少掷骰子的人^例1/2与对照卵黄囊相比，这些血管薄而小，组织性较差。这些观察结果表明，miRNA的双依赖性生物发生是胚胎发生期间血管发育所必需的。

体外研究也支持miRNAs参与血管生成[31]. 对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中miRNA表达的大规模分析发现，在那些高表达的miRNA中，有15个可能以血管生成因子受体为靶点。特别是，miR-221和miR-222被鉴定为调节c-Kit表达以及c-Kit配体的血管生成特性：干细胞因子。miR-221/2和c-Kit相互作用是一个复杂电路的组成部分，该电路控制内皮细胞形成新毛细血管的能力[31]. 抑制c-kit导致血管内皮生长因子（VEGF）表达降低[32]. 此外，我们知道c-kit与新生血管形成有关[33,34]. 除了Dicer，Drosha是miRNA成熟所需的一种miRNA加工酶。通过Dicer介导的处理维持和调节内源性miRNA水平对内皮细胞基因表达和功能至关重要[28]. 据报道，Dicer和Drosha在体外促进血管生成中的意义[27,28]. Dicer和Drosha的沉默显著减弱内皮细胞的毛细血管萌芽和管状形成活性。转染Dicer siRNA的细胞中内皮细胞的迁移显著减少，而Drosha siRNA没有影响。Dicer的沉默，而Drosha的沉默，在体外减弱内皮细胞的血管生成反应。let7家族和miR-27b被认为是内皮细胞血管生成反应的关键调节因子。

几项研究表明，NADPH氧化酶衍生的活性氧（ROS）作为信号信使在驱动血管生成中发挥着核心作用[35–38]. 血管生成的这种氧化还原控制是否受miRNA的调节尚待确定。我们实验室最近的一项研究首次证明，细胞氧化还原状态是细胞信号传导的关键驱动因素，受miRNAs调控。在这项工作中，使用Dicer敲除方法来测试miRNA在调节人类微血管内皮细胞（HMEC）氧化还原状态和血管生成反应中的重要性。通过Dicer敲除降低miRNA含量可诱导VEGF表达，但通过细胞迁移和Matrigel管形成降低HMEC的血管生成反应。外源性低微摩尔H挽救了Matrigel血管生成反应的这种损伤₂O（运行）₂当被佛波酯、肿瘤坏死因子（TNF）-α或VEGF激活时，双敲除HMEC显示出较低的ROS诱导生成。通过抗氧化治疗或NADPH氧化酶击倒途径限制活性氧的产生，会损害血管生成反应。旨在确定Dicer敲除如何限制ROS生成的实验显示，这些细胞中p47phox蛋白的表达较低。这降低了细胞miRNA含量诱导的转录因子HBP1的表达，HBP1是一种负向调节p47phox表达的抑制转录因子。敲除HBP1可恢复miRNA-缺陷HMEC的血管生成反应[29,39]. 这项研究的结果导致了miRNA调节伤口血管生成并因此可能影响伤口愈合结果的假设。另一项独立的研究表明，miRNA在伤口愈合中可能发挥作用，该研究检查了精氨酸蛋白的功能。argonautes（Agos）代表进化上保守的蛋白质骨干，它们直接与miRNA功能相关，并且是miRNA功能所必需的。核心miRNA-核糖核蛋白复合物由miRNA和Ago蛋白组成，其功能是作为一种高度可修饰的支架，通过结合的miRNA与特定的mRNA结合，并促进多种辅助蛋白的局部活性[40]. Ago-2的表达在哺乳动物RNAi中至关重要，它由表皮生长因子受体（EGFR）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路调节。MAPK激酶的药理抑制剂U0126或针对EGFR的siRNA限制Ago-2的表达[41]. 在体外伤口愈合环境中Ago-2过度表达可增强细胞增殖、减弱细胞间粘附并增加细胞迁移[41].

Dicer1缺失等位基因在小鼠中的早期胚胎致死性限制了我们解决Dicerl在正常小鼠生长发育中的作用的能力。具有低形态Dicer1等位基因（Dicer）的小鼠突变体的研究_日/日)证明Dicer1缺乏导致女性不育。雌性Dicer的这种缺陷_日/日小鼠是由黄体不足引起的，至少部分是卵巢中新毛细血管生长受损所致。miR17-5p和let7b代表两种特异性miRNAs，它们通过调节抗血管生成因子组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1的表达参与血管生成。Dicer卵巢注射miR17-5p和let7b_日/日小鼠部分正常化TIMP-1表达与黄体血管生成[42]. 最近的证据支持内皮细胞miRNAs调节出生后的血管生成，并且VEGF诱导miRNA的表达，与调控综合血管生成反应有关[43]. Dicer细胞特异性失活导致内皮miRNA减少，可减弱出生后对各种刺激的血管生成反应，包括外源性VEGF、肿瘤、肢体缺血和伤口愈合[43].

复杂基因调控网络的出现

在一个环境中，一个miRNA可以调节数百个基因[14]一个基因可以被许多miRNAs调控，一个主要问题是提高对调控miRNA-miRNA以及miRNA-mRNA相互作用的调控环的认识。此外，需要了解有助于控制诱导或抑制miRNA表达的因素。目前，我们还远远没有理解这些过程的复杂性。特别是，miRNA与其他调节分子（如转录因子）的协同表达是一个正在开发的领域。当HUVEC中的miRNA 221和222被耗尽时，这些细胞中的整个miRNA谱受到影响。9个miRNA上调，23个miRNA下调。这些观察结果导致了一个复杂网络的概念，其中包括共同表达的miRNA和受单个miRNA变异影响的转录因子[44]. miRNA是p53转录网络的重要组成部分。全球miRNA表达分析确定了一组在DNA损伤后表现出p53依赖性上调的miRNA。其中一种miRNA，miR-34a，在人类癌症中普遍缺失，在胰腺癌细胞中经常缺失[45]. miR-34a初级转录物和启动子的特征表明，该miRNA由p53直接反式激活。miR-34a的表达导致基因表达的重新编程并促进细胞凋亡。与已知的p53调节基因集很相似，miR-34a应答基因高度富集，用于调节细胞周期进展、凋亡、DNA修复和血管生成。因此，p53启动的基因表达程序的调节和微调可能是miR-34a的重要功能[45]. 由致癌转录因子c-myc诱导的miRNA多顺反子参与了异常结构的相互作用网络。该网络包括相同分子E2F1转录因子的看似矛盾的转录诱导和翻译抑制。这种miRNA簇与抑制增殖、抑制凋亡和促进血管生成有关[46].

最近的证据为细胞因子如何调节miRNA的生物生成提供了新的线索。配体特异性SMAD蛋白对miRNA生物生成的调控对于血管平滑肌细胞表型的控制以及转化生长因子（TGF）-β和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路介导的SMAD4诱导依赖性反应至关重要。TGF-β和BMP生长因子家族在成人组织（包括血管系统）的发育和体内平衡中协调基本的生物过程。TGF-β和BMPs诱导人血管平滑肌细胞收缩表型是由miR-21介导的。miR-21下调PDCD4（程序性细胞死亡4），PDCD4反过来作为平滑肌收缩基因的负调控因子。TGF-β/BMP信号通过转录后步骤快速增加成熟miR-21的表达，促进Drosha（也称为RNASEN）复合物将miR-21（pri-miR-21）的初级转录物加工成前体miR-21。TGF-β和BMP特异性SMAD信号传感器被招募到与RNA解旋酶p68（也称为DDX5）复合物中的pri-miR-21，该复合物是Drosha微处理器复合物的一个组成部分[47].

肿瘤血管生物学

目前关于miRNA的绝大多数文献都涉及癌症和发育生物学。miRNAs可能在基因调控网络的分子结构中充当癌基因和/或抑癌基因，从而促进癌症的发展。对假定miRNA结合位点的生物信息学分析已经确定了癌相关miRNA的几个新的潜在基因靶点，这些靶点在细胞粘附、新生血管形成和组织侵袭方面发挥作用。已有研究表明，miRNAs调节E-cadherin、整合素αvβ3、低氧诱导因子-1α、syndecan-1、赖氨酸氧化酶、adamalysin金属蛋白酶-17、TIMP-3、c-Met和CXCR-4，这些是与恶性肿瘤相关的组织结构变化的基础[48]. miRNA的异常表达发生在人类慢性淋巴细胞白血病中，其中miRNA的特征与特定的临床表现相关。miRNAs也在人类乳腺癌中异常表达。总体miRNA表达谱清楚地将正常组织与癌组织分开，其中最显著的被解除调控的miRNA是miR-125b、miR-145、miR-21和miR-155。在乳腺癌组织中，miRNAs调节肿瘤血管侵袭[49]. 肿瘤细胞向血管系统和/或淋巴管内灌注是肿瘤转移的关键阶段。miR-378通过抑制融合抑制因子（Sufu）的表达来提高细胞存活率，降低caspase-3活性，并促进肿瘤生长和血管生成，融合抑制因子是miR-37八和Fus-1的潜在靶点，Fus-1是革兰氏阴性厌氧菌产生β-内酰胺酶的基因，但也可能具有其他功能[50].

人类腺癌通常包含K-Ras和Myc原癌基因以及TP53抑癌基因的突变。这三种遗传性病变都有潜在的促血管生成作用，因为它们能维持VEGF的产生。有趣的是，Kras转化的缺乏p53的小鼠结肠细胞形成了惰性的、血管化不良的肿瘤，而用编码Myc的逆转录病毒进行额外的转导可以促进血管化和生长[51]. 此外，血管内皮生长因子水平不受Myc的影响，但新生血管增强与抗血管生成性血小板反应蛋白-1（Tsp1）和相关蛋白（如结缔组织生长因子（CTGF））的下调相关。Tsp1和CTGF都被预测为miR-17-92 miRNA簇的阻遏靶点，该簇在共表达K-Ras和c-Myc的结肠细胞中上调。miR-17–92基因敲除部分恢复了Tsp1和CTGF的表达。此外，用miR-17–92编码的逆转录病毒转导Rasonly细胞可降低Tsp1和CTGF水平。用miR-17-92（也称为Oncomir-1）转导的细胞形成更大、灌注更好的肿瘤。这些发现确立了miR-17-92簇在非细胞自主Myc诱导的肿瘤血管生物学中的作用[51–53]. 最近的研究表明，VEGF调节多种miRNA的表达，包括簇miR-17-92。用血管内皮生长因子治疗诱导的miR-17-92簇成分转染内皮细胞，挽救了Tsp1的诱导表达和Dicer缺失引起的内皮细胞增殖和形态发生缺陷[43]. miR-17-92簇由7个成熟miRNAs（miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92-1）组成，位于C13orf25基因13q31.3的内含子3中，在肺癌中显著且频繁过度表达，偶尔出现基因扩增，特别是在小细胞肺癌组织学中[54].

基因组雌激素受体（ER）与其他转录因子如激活蛋白-1复合体、核因子-κB和特异性蛋白（Sp）联合调节配体依赖性基因的表达。转录因子Sp家族成员对基因转录具有不同的影响。例如，Sp1和Sp4作为转录激活物，而Sp3通过竞争启动子占用来对抗Sp1激活。Sp1、Sp3和Sp4在肿瘤中过度表达，并有助于与癌细胞相关的增殖和血管生成表型[55]. Sp1、Sp3和Sp4在一组ER-阳性和ER-阴性乳腺癌细胞系中表达，并受miR-27a的调节，miR-27a-也在这些细胞系中表示，并据报道调节锌指ZBTB10基因，即一种推测的Sp阻遏物。采用反义方法对miR-27a进行实验性下调，增加了ZBTB10 mRNA的表达，并在mRNA和蛋白质水平上降低了Sp1、Sp3和Sp4的表达，还降低了含有Sp1和Sp3启动子插入物的转染细胞的活性。这些反应伴随着Sp依赖性生存和血管生成基因的表达降低，包括survivin、VEGF和VEGF受体1[55]. 因此，miR-27a支持乳腺癌中的血管生成。

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）是第八种人类疱疹病毒。根据国际病毒分类委员会的规定，其正式名称为HHV-8。这种病毒会导致卡波西肉瘤，一种常见于艾滋病患者的癌症，以及原发性渗出性淋巴瘤和一些类型的多中心卡斯特曼病。KSHV编码的miRNAs通过下调Tsp1（细胞粘附、迁移和血管生成的主要调节因子）直接参与发病[56]. 在稳定表达KSHV编码miRNAs的细胞中进行的基因表达谱研究已经确定了一组81个基因，其表达受miRNAss控制。对于其中三个基因，miRNA-依赖性调节的特征导致观察到Tsp1蛋白水平下降了10倍以上。已知Tsp1在卡波西肉瘤病变中下调，并作为一种有效的肿瘤抑制因子和抗血管生成因子发挥作用，通过激活潜在形式的TGF-β发挥部分抗血管生成作用。病毒miRNA存在时Tsp1表达减弱，转化为TGF-1β活性降低，表明TGF-β功能受miRNA控制[56].

同源异型盒是在基因中发现的一种DNA序列，参与动物、真菌和植物的发育模式或形态发生的调控。具有同源盒的基因称为同源盒基因，形成同源盒基因家族。同源域蛋白中研究最多、最保守的是Hox基因，它控制发育过程中的片段模式；然而，并非所有同源域蛋白都是Hox蛋白。同源异型盒基因GAX抑制血管生成并诱导血管内皮细胞中p21（WAF1/CIP1）的表达。GAX通过多个上游AT-rich序列激活p21（WAF1/CIP1）[57]. miR-130a主要通过调节GAX和HOXA5的表达来调节血管内皮细胞的血管生成表型[58]. HOXA5具有抗血管生成作用并调节血管模式[59].

血管疾病

miRNAs是一种治疗增殖性血管疾病的新靶点，如动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄、移植性动脉病和中风。描述miRNAs在血管疾病中作用的第一个证据来源于微阵列分析，该分析表明，在球囊损伤后，miRNA在血管壁中异常表达[52,60]. 通过反义介导的敲除调节异常过度表达的miRNA miR-21，减弱新生内膜损伤的形成。在体外，miR-21在去分化的血管平滑肌细胞中的表达高于新分离的分化细胞。miR-21的耗竭以剂量依赖的方式导致细胞增殖减少和细胞凋亡增加。在气球损伤的大鼠颈动脉中，miR-21介导的细胞效应在体内得到进一步证实。PTEN和Bcl-2参与miR-21介导的细胞效应。

miRNAs还与+1166 A/C多态性可导致血管紧张素II（AngII）1型受体（AT1R）密度增加和可能的心血管疾病的机制直接相关[61]. 人类AT1R基因的沉默多态性（+1166 A/C）与心血管疾病有关，可能是由于AT（1）R活性增强所致。由于这种多态性发生在人类AT1R基因的3′-UTR中，这种突变的生物学重要性一直受到质疑。最近，人们观察到一个由miR-155识别的顺调控位点出现+1166 a/C多态性。当+11166C等位基因存在时，碱基配对互补性中断，miR-155与顺式调节位点相互作用的能力降低。因此，miR-155不再有效地衰减平移。成熟miR-155在与AT1R相同的细胞类型中大量表达（例如内皮细胞和血管平滑肌）。人原代血管平滑肌细胞miR-155表达下调诱导内源性AT1R表达和AngII诱导ERK1/2活化[61]. 与Wistar-Kyoto大鼠相比，miR-155在成年自发性高血压大鼠主动脉中的表达降低，并与血压呈负相关，提示miR--155可能参与高血压的发生和病理过程。16周龄自发性高血压大鼠主动脉中miR-155的表达显著低于年龄匹配的Wistar-Kyoto大鼠。此外，miR-155的表达与血压呈负相关。miR-208在主动脉中的表达也与血压和年龄呈负相关[62]. 大鼠主动脉中miR-208表达的年龄依赖性变化是否影响老年人的血管发育，目前仍是一个悬而未决的问题。

干细胞生物学的miRNA调控

血液和血管壁中的干细胞具有修复内皮细胞广泛缺失后的能力。干细胞自我更新和分化是由转录、表观遗传控制和转录后调节因子（包括miRNA）之间的动态相互作用定义的，miRNA在干细胞生物学中的关键作用才刚刚出现[63,64]. 干细胞的一个关键特征是它们具有长期自我更新的能力。在这方面，干细胞类似于癌细胞，癌细胞也有逃避细胞周期停止信号的能力。一些miRNAs在干细胞中特异表达，并通过对干细胞中某些关键基因的表达进行负调控来控制干细胞的自我更新和分化[65]. miRNAs参与了生殖系干细胞（GSC）分裂的正确控制黑腹果蝇对dicer-1（dcr-1）（miRNA生物生成所必需的双链RNaseIII）GSCs突变体的分析显示，生殖系囊肿生成率显著降低。这些dcr-1突变体GSC表现出正常表型，但在细胞周期控制方面存在缺陷。根据细胞周期标记和遗传相互作用，可以理解dcr-1突变体GSC在G1-S转换中延迟，这依赖于细胞周期依赖性激酶抑制剂Dacapo，这表明干细胞需要miRNAs才能绕过正常的G1/S检查点。因此，miRNA途径可能是一种机制的一部分，使干细胞对环境信号不敏感，而环境信号通常会使细胞周期停止在G1/S转换[66]. 此外，miRNAs信号细胞命运[67]和干细胞表型[68].

miRNAs是控制小鼠造血的分子电路的组成部分。在早期的一项研究中，发现了三种在造血细胞中特异表达的miRNAs。这些miRNAs的表达在早期造血和谱系承诺期间受到动态调节。其中一种miRNAs，miR-181，优先在小鼠骨髓的B淋巴细胞中表达，其在造血干/祖细胞中的异位表达导致组织培养分化试验和成年小鼠的B系细胞比例增加[69]. 一些人类miRNAs与白血病有关：在B细胞慢性淋巴细胞白血病患者中，miR-15a/miR-16基因座经常被删除或下调，在侵袭性B细胞白血病患者中发现miR-142位于易位位点[70]. miRNAs 221和222通过试剂盒受体下调抑制正常红细胞生成和红白血病细胞生长[71]. miRNA-155转导显著降低正常人CD34+造血干祖细胞的髓系和红系集落形成[72]. 总之，miRNA-介导的转录后调控影响血细胞的发育和功能。

miRNA靶向巨核细胞转录因子并调节巨核细胞生成。巨核细胞分化与miR-10a、miR-126、miR-106、miR-10b、miR-17和miR-20的下调有关。miR-130a以参与GPIIB启动子激活的转录因子MAFB为靶点，GPIIB是血小板生理学的关键蛋白。在分化的巨核细胞中，miR-10a的表达与HOXA1的表达相反，HOXA1是miR-10a的直接靶点[73]. 用编码内源性miRNAs靶序列的慢病毒载体对小鼠进行免疫接种表明，miRNA能够高效地在不同组织间分离基因表达。含有miR-142–3p靶序列的载体的转基因表达有效抑制了血管内和血管外造血谱系，而在非造血细胞中保持表达[74]. 骨髓间充质干细胞参与心肌梗死后的心肌修复。然而，由于梗死心肌缺乏存活率，其体内修复能力有限。靶向CXCR4和SDF-1α的腺病毒miRNA阻断了间充质干细胞向损伤部位的移植，并损害了新生血管生成[75]. 这些观察结果强调了CXCR4和SDF-1α的miRNA-依赖性调节在影响心肌梗死部位新肌血管生成中的重要性。

基于miRNA的血管疾病治疗机会

对特定miRNAs的计算预测靶基因进行生物验证的工作正在进行中。为了检测小RNA在转录水平上的调节作用，设计并合成了针对人类基因的选定启动子区域E-cadherin、p21（WAF1/CIP1）和VEGF的21-nt dsRNA。将这些dsRNAs转染到人类细胞系可导致靶基因的长期和序列特异性诱导[76]. 适度和亚极端缺氧是血管生成的提示[77]. miRNAs似乎已成为该线索的重要组成部分。在人类癌症中，有很大一部分对低氧敏感的miRNAs也过度表达，表明其在肿瘤发生中起作用。目前的证据表明，低氧敏感性miRNAs可能影响诸如凋亡、增殖和血管生成等重要过程。几种低氧敏感性miRNAs的表达是在低氧诱导因子激活的反应下诱导的，从而将其靶基因库扩展到翻译基因之外[78]. 具体来说，miR-210是缺氧诱导的，通过下调其靶基因ephrin受体A3来支持内皮细胞的血管生成特性[79]. Ephrin受体A3，也称为EPHA3，是一种人类基因，属于蛋白酪氨酸激酶家族的Ephrin-受体亚家族。已知可溶性EPHA受体可抑制体内肿瘤血管生成和进展[80]. EPHA3编码一种结合EPHA配体的蛋白质。miR-210在内皮细胞中的过度表达刺激了Matrigel和VEGF驱动的细胞迁移上毛细血管样结构的形成。相反，miR-210阻断可抑制缺氧刺激的毛细血管样结构的形成，并减少VEGF引起的细胞迁移[79].

含硝酸盐化合物用于医药用途已有150多年的历史。如今，一氧化氮（NO）被广泛认为是一种主要的血管信号分子，具有舒张平滑肌、抑制血小板和白细胞聚集、促进血管生成和抑制血管平滑肌细胞增殖等功能。NO影响O的两个关键方面₂供应和需求。它通过激活血管平滑肌中的可溶性鸟苷酸环化酶调节血管张力和血流，并控制线粒体O₂通过抑制细胞色素c氧化酶消耗[81]. 20世纪80年代末，人们描述了一种从L-精氨酸产生NO的酶。1990年，第一种此类酶被纯化。今天，一氧化氮合酶（NOS；EC 1.14.13.39）是研究得最好的酶之一，主要是因为它对健康和疾病的影响。NOS催化L-精氨酸、O生成NO和L-瓜氨酸₂和NADPH衍生电子存在于几种特定的辅因子和修复基团中，如硫代血红素、FAD和FMN、钙调素和钙²⁺（仅适用于组成型NOS），以及（6R）-5,6,7,8-四氢-l-双蝶呤（四氢生物蝶呤；BH4）。在哺乳动物物种中，三种类型的NOS调控L-精氨酸产生NO，即nNOS（神经元型NOS或NOS1）、iNOS（诱导型NOS or NOS2）和eNOS（内皮型NOS orNOS3）[82,83]. 内皮在维持血管稳态中起着关键作用，血管疾病中氧化应激的增加导致NO生物利用度降低和阻力血管内皮依赖性舒张受损。NOS3的表达对内皮功能至关重要。许多生理和病理生理刺激通过改变稳态NOS3 mRNA水平的机制调节NOS3的表达。这些机制包括NOS3基因转录速率的改变以及NOS3 mRNA加工和稳定性的改变。内含子4中的重复序列（27个nts）在NOS3启动子活性中起到顺作用。NOS3中基于内含子的miRNAs诱导显著的基因特异性转录抑制，这可能是NOS3表达的有效负反馈调节因子[84]. 可溶性CD40配体（sCD40L）包含在血小板颗粒中，因此其在血液中的存在是血小板活化的标志。通过与内皮细胞和平滑肌细胞上发现的CD40相互作用，sCD40L触发炎症介质的释放，导致基质金属蛋白酶活性增加和凝血级联激活。在研究sCD40L对人冠状动脉内皮细胞和猪冠状动脉环内皮功能障碍的影响和机制的研究中，已经注意到sCD40L通过涉及miRNA的机制降低eNOS水平[85].

尽管下调miRNA-处理酶Dicer和Drosha可损害血管生成，但目前仅发现少数靶向内皮细胞功能和血管生成的特异性miRNAs[86]. miR-221和miR-222通过靶向干细胞因子受体c-Kit并间接调节eNOS表达，在体外阻断内皮细胞迁移、增殖和血管生成。miR-17-92簇已经建立了促血管生成功能，可以促进体内肿瘤血管生成。let7f和miR-27b的表达有助于体外血管生成。miR-126调节内皮细胞对VEGF的反应。这在小鼠胚胎干细胞衍生的内皮细胞和发育中的小鼠胚胎中观察到。斑马鱼miR-126基因敲除后，胚胎发育过程中出现血管完整性丧失和出血。miR-126的这种血管生成作用是通过直接抑制VEGF信号通路的负调控因子介导的，如Sprouty-related protein 1（SPRED1）和磷酸肌醇-3激酶调节亚单位2[87]. SPRED1负调控VEGF诱导的ERK激活。SPREDs还通过负调控VEGF-C/VEGFR-3信号通路在血管发育中发挥重要作用[88]. 斑马鱼SPRED1表达增加或VEGF信号抑制导致类似miR-126敲除的缺陷[87]. 在内皮细胞中，miR-126介导体内发育性血管生成。增强VEGF和成纤维细胞生长因子的血管生成功能，并通过抑制SPRED1的表达促进血管形成。小鼠体内miR-126的靶向缺失会导致血管渗漏、出血和部分胚胎死亡，原因是血管完整性丧失以及内皮细胞增殖、迁移和血管生成缺陷。存活的突变动物亚群显示心肌梗死后心脏新生血管缺陷。miR-126突变小鼠的血管异常类似于血管生成生长因子（如VEGF和成纤维细胞生长因子）信号减弱的结果[89].

诱导性粘附分子表达的负调控是miR-126发挥抗炎作用的一种机制。在内皮细胞中，miR-126负调节可诱导VCAM-1的表达。据报道，降低miR-126的表达可以增强TNF-α刺激的VCAM-1的表达。相反，miR-126前体的过度表达增加了miR-126的水平，随后降低了可诱导VCAM-1的表达。在功能上，降低内源性miR-126水平会增加白细胞对内皮细胞的粘附[90]. E-选择素，也称为CD62E，是一种仅在细胞因子激活的内皮细胞上表达的细胞粘附分子。与其他选择素一样，CD62E在炎症中起着重要作用。抑制E-选择素表达的miRNA构建有效地减少白细胞向活化内皮细胞的募集[91]. 所测试的结构由补充人类E-选择素cDNA的miRNAs（miR-E1和miR-E2）组成。将这些构建物交付给人主动脉内皮细胞（HAEC）表明，E-选择素启动子在TNF-α的作用下被充分激活，miR-E1和miR-E2有效抑制诱导的E-选择蛋白表达，从而显著抑制白细胞粘附[91].

虽然大多数miRNAs都是从它们自己的专用基因转录而来的，但一些miRNA映射到“宿主”转录物的内含子，其生物学意义尚不清楚。来自组织特异性转录物的内含子miRNAs，或其天然缺失，对细胞基因表达和表型起着重要作用。这些发现也为组织特异性miRNA治疗打开了大门[92]. 前列腺细胞天然缺乏EGF样结构域7（Egfl7）转录物，也缺乏由其第九内含子的剪接和加工产生的miR-126*。使用重组和合成的miRNAs或特异性抗病毒药物确立了miR-126*在沉默非内皮细胞中的前列腺素中的作用。翻译抑制所需的前列腺素mRNA的3′-UTR中的两个miR-126*-结合位点已被定位。前列腺素是最近描述的一种以前列腺特异性方式在mRNA水平表达的分子。将合成miR-126*转染到前列腺癌LNCaP细胞中可显著降低前列腺素的翻译。前列腺素表达缺失与LNCaP细胞迁移和侵袭减少相关[92]. 识别调控血管生成特定方面的更为特异的miRNAs将有助于制定有效策略，通过基于miRNA的工具控制血管生成结果。

基于miRNA的治疗工具

基于miRNA的治疗方法现在是当今生物技术市场的主要商业热点之一[93]. 作为基因表达调节器的miRNAs的发现为设计可改变疾病基因表达的治疗药物创造了新的选择。体内调节miRNA活性的能力可能会对疾病治疗和体内研究机会产生巨大影响。这方面的方向实际上已经确定。基本上，有两种可能的治疗方法：过度表达或沉默预期的miRNA。对于前者，以（siRNA-like）dsRNA的形式提供正确的合成miRNA将是有益的。如果由mRNA异常抑制（例如由于miRNAs过度表达或关闭miRNA）衍生出的疾病表型为阳性，则可以设计与成熟miRNA或其前体互补的寡核苷酸，从而阻止miRNA，无法补充靶mRNA。这些治疗性寡核苷酸的基本性质（用于上调或下调miRNA活性）将是体内传递、避免降解、特异性和对RNA的高结合亲和力。这可以通过修饰nts来实现，特别是在2′-羟基上添加化学基团，它被证明能有效抑制特定miR的功能。三种化学修饰的寡核苷酸可用于沉默miRNAs[94]. 其中包括2′-O（运行）-甲基基团（OMe）修饰的2′寡核苷酸-O（运行）-与OMe类似物相比，甲氧乙基（MOE）修饰的寡核苷酸对RNA具有更高的亲和力和特异性，以及锁定核酸（LNA）修饰的低聚核苷酸（LNA-antimiR），其中2′-O（运行）-氧通过亚甲基连接物桥接到4′-位置，形成一个刚性自行车，锁定在C3′-内切（RNA）糖构象中。最近，在非人灵长类动物中报告了显著的数据，证明LNA-抗miR技术的治疗功效。在非人类灵长类动物中，简单全身输送未结合PBS配制的LNA-抗miR可以有效对抗肝脏表达的miR-122。通过静脉注射3或10 mg/kg LNA-antimiR急性给非洲绿猴，导致灵长类肝细胞细胞质中LNA-atin-miR的摄取，并在LNA-atimiR和miR-122之间形成稳定的异倍体。伴随着成熟miR-122的耗竭和血浆胆固醇的剂量依赖性降低。灵长类动物通过三次剂量的10 mg/kg LNA-抗miR可有效沉默miR-122，导致血浆总胆固醇的长期可逆降低，而研究动物中没有任何LNA-相关毒性或组织病理学变化的证据[95].

特异性miRNA沉默是通过反义靶向实现的。遗传方法包括小鼠中miRNA基因的敲除、蛋白质编码基因中miRNA靶位点的突变以及miRNA处理基因的条件等位基因骰子1导致所有成熟miRNA的缺失。非基因方法利用OMe修饰的寡核苷酸，经过进一步的修饰以兼容体内给药。使用名为“antagomirs”的修饰寡核苷酸在体内成功证明了该方法[96,97]. 已经设计了化学修饰的、胆固醇结合的单链RNA类似物，以补充miRNAs，即antagomirs。它们是从羟脯氨酸连接的胆固醇固体载体和2′-OMe磷酰胺开始合成的。Antagomirs具有优化的硫代磷酸修饰，需要大于19-nt的长度才能获得最高效率，并且可以区分靶向miRNA的单个nt错配。小鼠肝脏中不同化学保护的miRNA/antagomir双工体的降解和antagomirs在不同于加工体的细胞溶质室中的定位表明，降解机制独立于RNAi途径。Antagomirs虽然在全身注射时不能沉默中枢神经系统中的miRNAs，但在局部注射到小鼠皮层时，可以有效地靶向miRNA[98]. Antagomir治疗可有效抑制体内肿瘤生长，尤其是对难治性神经母细胞瘤[99]. 静脉注射antagomir-122可特异性降低miR-122水平。Antagomir-122导致miR-122信号的完全丧失，并且在注射后长达23天内检测不到miR-122水平。Antagomir-16使除大脑外的所有身体组织中的miR-16沉默。因此，当使用antagomirs时，可以有效地沉默体内几乎所有组织中的miRNAs。在神经母细胞瘤的病例中，沉默miR-122导致胆固醇生物合成基因发生变化，HMGCR（3-羟基-3-甲基戊二酸-基-CoA-还原酶）（内源性胆固醇生物合成的速率限制酶）下调。经抗戈米尔-122治疗的动物的血浆胆固醇水平下降了40%以上。此外，安替戈米尔注射液似乎没有任何毒性作用。这些证据证实了抗戈麦尔在体内的疗效，并将有助于未来研究沉默miRNAs以进行功能分析和临床相关设置。

另一种形式的修饰寡核苷酸，即2′-MOE硫代磷酸修饰反义寡核苷酸（ASO），也已成功在体内沉默miRNAs[100]. 使用这种方法，仅通过腹膜内注射ASO就成功地使miR-122沉默。miR-122四个靶基因mRNA水平的增加证明了miR-122的沉默。在用对照ASO治疗的小鼠中未观察到靶mRNA的变化，表明肝脏中miR-122活性受到了特异性抑制。这项研究又向前迈进了一步，将这项技术应用于小鼠肥胖疾病模型。喂食高脂饮食19周的C57BL/6小鼠接受miR-122 ASO治疗。与对照组小鼠相比，阻断miR-122导致血浆胆固醇水平降低35%，尽管作者解释说，沉默miR-122的效果有一个最大缓解阈值。体内可以实现miRNA的过度表达[101]. 预（pre）-miR-1型将正侧翼序列亚克隆到–MHCclone26或–MHCclone32载体中并导入小鼠。转基因小鼠的Northern杂交证实它们表达miR-1。接下来，进行转基因心脏的蛋白质印迹。与非转基因窝友相比，Hand2蛋白水平显著降低，而mRNA水平无变化手2。这些观察结果证实了手2是体内miR-1的靶点，使用其前体上调单个miRNA可以提高特定蛋白质水平。

靶向非编码基因，如miRNAs，这些基因具有调节大量编码基因的能力，代表着基因治疗的未来。以单个编码基因为靶点以获得理想的临床结果产生了非常有限的结果，主要局限于单一基因突变引起的疾病。体内的功能结果通常由大量协同作用的基因产物调节。例如，过度输送VEGF可能无法有效刺激功能性血管生成，并可能最终表现出不利结果，例如血管渗漏加剧。由于单个miRNAs调节着大量的基因簇，因此专注于miRNA-directed基因治疗似乎是谨慎的。

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