许多信号转导途径依赖可逆的化学修饰来传递细胞内和细胞间的信息。泛素样蛋白SUMO通过共价修饰蛋白质底物介导信号转导1在促进不同细胞功能的过程中,如核转运、胞质分裂、染色体分离和转录调控等2,3虽然SUMO结合有助于调节许多途径,但控制SUMO修饰在任何特定底物上何时何地发生的机制仍不清楚。
SUMO结合与泛素结合系统在机制上有相似之处,两者都利用级联因子,包括E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶4-6虽然泛素途径包括几十个E2,但在SUMO途径中只有一个E2被利用,即Ubc9(参考文献。7). 因此,Ubc9是SUMO途径中的一个关键节点,因为它与迄今为止确定的所有SUMO靶点相互作用并催化结合。一些SUMO衬底通过一致序列ψ-K-x-E与Ubc9相互作用8-12(其中ψ是疏水氨基酸,K是SUMO附着的赖氨酸,X是任何氨基酸,E是酸性残基)而其他SUMO底物需要SUMO E3连接酶或SUMO相互作用基序(SIMs)来增强与SUMO共有位点的结合或将结合重定向到非感觉位点13-17.
最近在作为SUMO结合和脯氨酸定向激酶底物的几种蛋白质中发现了一个扩展的一致序列ψ-K-x-E-x-S-P18-19(). 因为丝氨酸残基的磷酸化导致SUMO结合水平的增加20,这个扩展的SUMO一致性位点被命名为PDSM,用于磷酸化依赖性SUMO基序21PDSM最初在哺乳动物热休克因子(HSF)中鉴定,随后在其他几个蛋白质中鉴定,包括转录因子心肌细胞增强因子2(MEF2)、GATA-1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)21-23(). 在这些情况下,激酶信号调节包含这些扩展PDSM序列的底物的SUMO修饰。
磷酸化依赖性SUMO结合由SUMO E2介导。(一)扩展SUMO共识基序,突出底物赖氨酸和磷酸化丝氨酸残基。(b条)包含人类MEF2家族成员磷酸化依赖性SUMO结合基序(PDSM)的20个氨基酸、HSF1、HSF4、GATA-1、PPARγ、人类Elk1的负电荷氨基酸依赖性SUMO结合基元(NDSM)和包含p53 SUMO共有基序的15个氨基酸的序列比对。每个C末端残基的氨基酸数在括号中表示。(c(c))上面板;插图显示了SUMO与MEF2结合的SDS-PAGE分析和荧光检测示例P(P)和MEF2,底物浓度为80μM。中提供的动力学分析中用于绘制曲线的原始数据子集的其他示例补充图1和2.下面板;左图显示了初始反应速率与底物浓度的关系。图右侧的条形图表示个体特异性常数(k个2/K(K)d日)用于野生型Ubc9介导的SUMO与MEF2的偶联P(P)(红色)和MEF2(黑色)。条形图(右)表示MEF2的折叠偏好P(P)(灰色)表示为MEF2P(P)(k个2/K(K)d日)/MEF2型(k个2/K(K)d日). (d日)HA-SUMO1在293T细胞中与野生型GAL4-MEF2A和GAL4-MEF2A-S408A结合。左侧面板;HA转染293T细胞的GAL4免疫沉淀物-SUMO1公司和野生型,K403R或S408A突变型GAL4-甲基安非他明使用所示抗体进行免疫印迹。用抗微管蛋白抗体对总裂解物进行免疫印迹(作为负荷控制)。右侧面板;条形图显示,与按照方法计算的GAL4-MEF2A-S408A相比,HA-SUMO1改性野生型GAL4-MEF2A的增强程度为4.08±1.48。生化分析一式三份。误差线为±1标准偏差。
MEF2蛋白是突触发生期间哺乳动物大脑中大量表达的转录因子24SUMO修饰将MEF2A从转录激活物转化为转录阻遏物形式,促进神经元的突触成熟23,25SUMO修饰的MEF2A在以颗粒神经元树突末端爪状结构的形态发生为特征的过程中驱动小脑皮层突触后树突分化。颗粒神经元树突状爪是与苔藓纤维终末和高尔基体神经元轴突突触接触的场所23.MEF2A的SUMO修饰主要发生在作为PDSM一部分的赖氨酸残基上(),一个高度保守的遗址秀丽线虫给人类23这些数据表明MEF2的磷酸化、SUMO结合和生物学功能之间存在重要的功能联系。
虽然SUMO结合在PDSM磷酸化反应中增强,但这种作用的分子基础尚不清楚21,26-28在本研究中,我们检测了SUMO与人类PDSM底物、MEF2和HSF1磷酸化和非磷酸化形式的结合。生化研究表明,磷酸化依赖性SUMO偶联是E2依赖性的,核磁共振滴定实验表明磷酸化和非磷酸化MEF2底物与Ubc9以类似于其他Ubc9底物复合物的延伸构象相互作用。对Ubc9结构的检查表明,Lys65、Lys74和Lys76侧链组成一个带正电或碱性的补丁,可以与带负电的磷酸化丝氨酸侧链相互作用。定点突变结合生物化学和动力学分析表明,E2表面对于增强SUMO与磷酸化MEF2和HSF1底物的结合很重要,但对于与非磷酸化MEF2或HSF1或非PDSM底物p53的结合不重要。Ubc9基因突变导致PDSM辨别障碍在体外在瞬时转染试验中也破坏了磷酸化MEF2底物的SUMO修饰体内在器官型小脑片树突状爪发育的检测中,对破坏MEF2 PDSM修饰的Ubc9突变进行功能分析,结果显示Ubc9活性之间有很强的相关性在体外以及观察到的体内.
结果
PDSM磷酸化增强E2依赖性结合
为了确定对PDSM序列中磷酸化反应的SUMO结合途径的成分,我们从两个定义明确且均一的20个氨基酸MEF2肽底物开始分析。一个包含非磷酸化扩展SUMO共识基序(MEF2),另一个包含磷酸化Ser408的MEF2A PDSMP(P)) (). 多重转换条件下E2介导的结合物的生化分析表明磷酸化MEF2是SUMO结合的较好底物(补充图1在线)。通过质谱法证实了SUMO与两种底物中的共有赖氨酸残基的结合(数据未显示)。
在单一周转条件下进行的反应可以计算表观结合常数和速率常数。在这些分析中,K(K)d日表示表观结合常数和k个2表观速率。对于野生型Ubc9,确定MEF2P(P)是比MEF2更好的底物(和补充图1在线)和在室温下K(K)d日和k个2对于MEF2P(P)分别为240±30μM和0.054±0.002 s-1,分别在K(K)d日和k个2MEF2为440±60μM和0.010±0.001s-1分别是。野生型Ubc9的特异性常数高出10倍(k个2/K(K)d日)对于MEF2P(P)(230±30米-1秒-1)与MEF2相比(23±4 M-1秒-1) (和). 在这种情况下,结合受到2倍的影响,而速率相差5倍。由于结合受到的影响小于速率常数,这些数据表明磷酸化底物可能以稍微不同但更有利的构象与Ubc9相互作用,以促进E2活性位点内的催化作用。先前研究表明,赖氨酸残基在SUMO E2活性位点内的精确定位主要通过改变催化速率在共轭过程中发挥重要作用12我们设想在本例中观察到的效应背后有一个类似的机制。
表1
SUMO与MEF2、HSF1或p53偶联的催化常数
Ubc9变体 | 基底 | K(K)d日(微米) | k个2(个)-1) | k个2/K(K)d日(百万)-1秒-1) |
---|
Ubc9野生型 | MEF2型P(P) | 240 ± 30 | 0.054 ± 0.002 | 230 ± 30 |
| MEF2型 | 440 ± 60 | 0.010 ± 0.001 | 23 ± 4 |
优步9-K59A | MEF2型P(P) | 240 ± 40 | 0.046±0.002 | 190 ± 30 |
| MEF2型 | 650 ± 90 | 0.0139 ± 0.0009 | 21 ± 3 |
Ubc9-R61A型 | MEF2型P(P) | 300±50 | 0.020 ± 0.001 | 70 ± 10 |
| MEF2型 | 600 ± 100 | 0.0073 ± 0.0008 | 12 ± 3 |
Ubc9-K65A型 | MEF2型P(P) | 430 ± 60 | 0.0125 ± 0.0007 | 29 ± 4 |
| MEF2型 | 400 ± 40 | 0.0126 ± 0.0006 | 32 ± 4 |
Ubc9-K74A型 | MEF2型P(P) | 900 ± 200 | 0.0034 ± 0.0004 | 4 ± 1 |
| MEF2型 | 800 ± 100 | 0.0050 ± 0.0004 | 6 ± 1 |
Ubc9-K76A型 | MEF2型P(P) | 270±40 | 0.0067 ± 0.0004 | 25 ± 4 |
| MEF2型 | 400 ± 60 | 0.0052 ± 0.0003 | 13 ± 2 |
Ubc9-S89A型 | MEF2型P(P) | 440 ± 60 | 0.0068 ± 0.0004 | 15±2 |
| MEF2型 | 1000 ± 300 | 0.0011 ± 0.0002 | 1.1 ± 0.4 |
Ubc9-T91A型 | MEF2型P(P) | 500 ± 100 | 0.0096 ± 0.0008 | 19 ± 4 |
| MEF2型 | 400 ± 60 | 0.0052 ± 0.0003 | 13 ± 2 |
Ubc9野生型 | 高铁1号线P(P) | 263 ± 33 | 0.078 ± 0.004 | 296 ± 37 |
| 高铁1号线 | 457 ± 87 | 0.018 ± 0.002 | 23 ± 4 |
Ubc9-K65A型 | 高铁1号线P(P) | 532 ± 94 | 0.028 ± 0.002 | 52 ± 4 |
| 高铁1号线 | 546 ± 10 | 0.022 ± 0.002 | 41±8 |
Ubc9野生型 | 第53页 | 68 ± 10 | 0.018±0.001 | 265 ± 40 |
Ubc9-K65A型 | 第53页 | 42 ± 3 | 0.012 ± 0.003 | 280 ± 20 |
观察到的与磷酸化底物结合的偏好在体外与观察到的情况相似体内而没有Ubc9的过度表达(参考文献。23和). 因此,目前没有理由在鉴别PDSM磷酸化状态的过程中调用E3。与该假设一致的数据包括观察到SUMO E3 PIASx与MEF2A相互作用,而不依赖于Ser408磷酸化25虽然SUMO结合的野生型MEF2A在外源性PIASx的存在下增加,但SUMO接合仍然依赖于磷酸化,这表明PDSM的区分以依赖于E2的特异性的方式发生。换句话说,磷酸化对SUMO结合很重要,与细胞中是否存在PIASx无关25作为进一步证明该过程依赖E2的证据,Nup358/RanBP2的SUMO E3 IR1*结构域增加了与两种底物的共轭在体外,对磷酸化MEF2的偏好保持在与E2介导反应中观察到的相似的比率(补充图2在线)。
Ubc9结合MEF2P(P)和MEF2在类似构象中
人类Ubc915N标记并隔离使用,以根据先前保存的分配获得非脯氨酸残基的几乎完整分配10(方法和补充图3在线)。然后在非磷酸化和磷酸化MEF2底物浓度增加的情况下评估Ubc9的核磁共振化学位移扰动(补充图3在线)。MEF2和MEF2的化学位移扰动P(P)Ubc9表面的地图对于识别含有SUMO共有位点的底物非常重要(补充图3、4和5在线),包括从晶体学研究中获得的Ubc9和RanGAP1之间的配合物9,11,12以及通过核磁共振溶液研究和生化分析确定的Ubc9与p53和c-Jun肽模型之间的复合物9,10,12这些数据表明,非磷酸化和磷酸化MEF2底物采用与其他Ubc9底物类似的延伸构象。
比较MEF2或MEF2存在时Ubc9化学位移扰动P(P)对于含有SUMO共有位点的底物,在先前表征的E2结合表面内部和附近几乎没有差异(补充图4、5). 当Ubc9:MEF2和Ubc9:MEF2P(P)对化学位移差异进行了比较,发现Ala5、Asp66、Cys75、Ser89、Val92、Leu94和Tyr134的一些最大差异。Val92和Leu94紧邻Ubc9 E2活性位点半胱氨酸(Cys93),而Tyr134靠近SUMOψ-K-x-E共有基序中疏水侧链的结合位点。Ser89是含有Thr91和Lys74的亲水性正电荷袋的一部分(). 这些氨基酸侧链参与与SUMO共识基序谷氨酸侧链的氢键相互作用,如与RanGAP1复合物中Ubc9的结构所观察到的。虽然Ubc9:MEF2和Ubc9:MEF2之间的化学位移幅度有所不同P(P),对于涉及底物结合的残基的化学位移扰动,未观察到方向上的变化。这些数据表明,MEF2 PDSM底物中的Ψ-K-x-E SUMO基序在Ubc9表面占据类似的结合囊,与它们的磷酸化状态无关。
E2 Ubc9识别PDSM的模型。(一)靠近RanGAP SUMO共有基序的Ubc9的表面表征和静电势(ψ-K-x-E SUMO一致基序,从之前描述的RanGAP和Ubc9之间的复合体获得;PDB ID 2GRN)。三个C末端氨基酸(包括磷酸化丝氨酸残基)的位置是从之前描述的Pin1和磷酸化肽(PDB ID 1F8A)之间的复合物中获得的,并与RanGAP SUMO共识序列结合以模拟PDSM。本文中讨论的相关氨基酸在Ubc9表面上或其附近使用三位字母编码进行标记。蓝色表示基本表面,而红色表示酸性表面。(b条)Ubc9:PDSM复合体的模型。Ubc9的结构显示在带状表示中,PDSM残基显示在棒状表示中。SUMO共有基序和三个C末端残基如一使用PyMol对所有结构进行图形化描述30.
SUMOψ-K-x-E共有基序中的谷氨酸侧链由Ser89和Thr91协调(参考文献。9,12). 由于磷酸化的丝氨酸侧链和谷氨酸均带负电,我们推断,如果谷氨酸侧链结合囊在结合时取代谷氨酸侧环,则谷氨酸侧键结合囊可能会协调磷酸化的PDSM丝氨酸侧环。为了验证这一假设,我们将Ser89或Thr91替换为丙氨酸,并分析这些突变亚型辨别PDSM磷酸化状态的能力。Ubc9-S89A和Ubc9-T91A与MEF2底物的SUMO共轭减少,尽管Ubc9-T 91A对MEF2保持约3倍的偏好P(P)而Ubc9-S89A对MEF2的偏好为14倍P(P)(补充图2在线)。
PDSM识别需要Ubc9基本补丁在体外
核磁共振分析没有揭示负责PDSM识别的Ubc9残基的精确身份,因此我们检查了Ubc9结构中位于活性位点和SUMO共有基序结合囊侧的残基。Lys65、Lys74和Lys76的侧链从延伸ψ-K-x-E共有基序内的谷氨酸盐在Ubc9表面7-12μ上形成带正电荷的补丁,如果PDSM采用某种程度但不是完全延伸的构象,则与E2活性位点保持适当的距离,以调节与磷酸化丝氨酸侧链的互补作用(模型见).
Lys65、Lys74和Lys76产生了单独的丙氨酸取代,并对产生的蛋白质进行活性分析。Ubc9-K74A和Ubc9-K76A对非磷酸化MEF2底物的修饰活性降低了2-4倍,而Ubc9-K 65A的活性与野生型Ubc9相似。当检测Ubc9-K65A、Ubc9-K74A和Ubc9-K 76A与磷酸化MEF2底物的SUMO偶联时,特异性常数仍然很低,接近于非磷酸化底物的特异性常数(和补充图1在线)。这些数据表明Ubc9-K65A和Ubc9-K74A失去了区分MEF2的能力P(P)和MEF2,以便MEF2的首选项P(P)从野生型Ubc9的10倍降至Ubc9-K65A的0.9倍和Ubc9-K74A的0.6倍。Ubc9-K76A也失去了大部分区分底物的能力,尽管它对MEF2的偏好是前者的2.0倍P(P)(). 我们确定Nup358/RanBP2 IR1*SUMO E3不能用MEF2修复Ubc9-K65A的缺陷P(P)基板(和补充图1和2在线)。
参与PDSM识别的Ubc9氨基酸残基的动力学和突变分析。(一)上部面板;插图显示了Ubc9-K65A介导的SUMO与MEF2结合的SDS-PAGE分析和荧光检测示例P(P)和MEF2,底物浓度为80μM。下面板;左边的图显示了初始速率与底物浓度的关系,右边的条形图显示了特异性常数(k个2/K(K)d日)Ubc9-K65A介导的SUMO与MEF2偶联P(P)(红色)和MEF2(黑色)。(b条), (c(c))和(d日)与中类似的数据一,但分别针对Ubc9-K74A、Ubc9-K76A和Ubc9-K59A。(e(电子))条形图指示MEF2的折叠首选项P(P)(灰色)表示为MEF2P(P)(k个2/K(K)d日)/MEF2型(k个2/K(K)d日)适用于野生型Ubc9、Ubc9-K65A、Ubc9-1K74A、Ubc9-K76A和Ubc9-K59A。红色虚线表示Ubc9-介导的SUMO与MEF2结合具有同等偏好P(P)和MEF2。生化分析一式三份。误差线为±1标准偏差。
表2
在通用SUMO E3 Nup358/RanBP2 IR1存在下SUMO偶联到MEF2或Elk1的催化常数*
Ubc9变体 | 基底 | K(K)d日(微米) | k个2(个)-1) | k个2/K(K)d日(×104)(百万)-1秒-1) |
---|
Ubc9野生型 | MEF2型P(P) | 1.1 ± 0.1 | 0.103 ± 0.004 | 9.4 ± 0.9 |
| MEF2型 | 6 ± 1 | 0.089 ± 0.008 | 1.5 ± 0.3 |
Ubc9-K65A型 | MEF2型P(P) | 4.8 ± 0.3 | 0.161 ± 0.004 | 3.4±0.2 |
| MEF2型 | 9 ± 1 | 0.18±0.01 | 2.0 ± 0.2 |
Ubc9野生型 | 麋鹿1 | 14 ± 2 | 0.066 ± 0.003 | 4.8 ± 0.7 |
Ubc9-K59A型 | 埃尔克1 | 21 ± 3 | 0.052 ± 0.004 | 2.4 ± 0.4 |
Ubc9-K65A型 | 麋鹿1 | 33 ± 7 | 0.068 ± 0.007 | 2.1 ± 0.5 |
我们将注意力转向扩展的Elk1-SUMO共有基序,该基序包含一个ψ-K-x-ESUMO结合位点,其后是三个酸性残基(). 这个基序被命名为NDSM,用于负电荷氨基酸依赖的SUMO结合基序28NDSM和PDSM序列包含带负电荷的元素C末端到ψ-K-x-E SUMO共有位点,因此NDSM底物中的酸性残基可以替代PDSM中磷酸化的丝氨酸侧链,以维持SUMO结合的组成活性基序。以前的报告确定Ubc9 Lys59和Arg61是有助于识别Elk1转录因子内NDSM的残基28只要将Lys59和Arg61替换为谷氨酸,SUMO结合活性就会降低。这些Ubc9表面也被认为在MEF2A的SUMO修饰中起作用28.
我们还发现,只要Ubc9-K59A和Ubc9-R61A与MEF2保持较高的共轭水平,Lys59和Arg61侧链对PDSM辨别没有贡献P(P)与MEF2基板相比(,,补充图1和6). 这些结果与以下事实一致:Lys59和Arg61离E2底物结合面太远,即使PDSM采用完全延伸构象,也无法促进与ψ-K-x-E SUMO共有位点和磷酸化丝氨酸残基的同时相互作用(). 先前的研究结果利用谷氨酸同时替代Lys59和Arg61(参考文献。28)根据Arg61与Glu41和Glu78的盐脊相互作用以及与Asn39的氢键相互作用,我们预测这些位置的谷氨酸取代可能会实质性改变Ubc9的性质(和补充图6在线)。这些结果表明,赖氨酸65、74和76在Ubc9上形成的基本表面对MEF2A底物的PDSM鉴别很重要在体外().
为了测试Ubc9表面是否也在区分另一种PDSM底物的磷酸化和非磷酸化形式中发挥作用,我们对热休克因子1(HSF1;),主要转录因子,负责哺乳动物细胞对热应激的转录反应。与MEF2A的结果类似,野生型Ubc9对磷酸化HSF1的偏好是非磷酸化底物的8倍(和). Ubc9-K65A对非磷酸化HSF1保持几乎野生型的活性,同时失去了对磷酸化HSF1的偏好。(和). 这些结果与MEF2和MEF2的结果相似P(P)并提示Ubc9 Lys65有助于区分PDSM磷酸化状态在体外用于MEF2A和HSF1。值得注意的是,MEF2A和HSF1在各自的PDSM序列之外没有序列守恒(),表明PDSM元素足以调节与E2的相互作用。
Ubc9 Lys65对HSF1的PDSM鉴别很重要,但对非PDSM底物p53不重要。(一)上面板;插图显示野生型Ubc9介导的SUMO与HSF1结合的SDS-PAGE分析和荧光检测示例P(P)和HSF1,底物浓度为80μM。下部面板;左边的图显示了初始速率与底物浓度的关系,右边的条形图显示了特异性常数(k个2/K(K)d日)野生型Ubc9介导的SUMO与HSF1结合P(P)(红色)和HSF1(黑色)。(b条)与中类似的数据一,但适用于Ubc9-K65A。(c(c))上面板;插图显示了16μM底物浓度下野生型Ubc9介导的SUMO与p53结合的SDS-PAGE分析和荧光检测示例。下面板;左边的图显示了初始速率与底物浓度的关系,右边的条形图显示了特异性常数(k个2/K(K)d日)用于野生型Ubc9介导的SUMO与p53结合。(d日)与中类似的数据c(c),但适用于Ubc9-K65A。生化分析一式三份。误差线为±1标准偏差。
我们的生化分析表明,野生型Ubc9和Ubc9-K65A在其非磷酸化状态下与MEF2A和HSF1的SUMO结合率相当(图。,、和). 由于Lys65侧链对与非磷酸化PDSM底物的相互作用并不重要,我们假设该侧链不会促进包含简单SUMO共有基序的底物的SUMO共轭。为了验证这一点,我们使用非PDSM底物(在本例中为p53的C末端结构域)进行了单循环SUMO结合分析。野生型Ubc9和Ubc9-K65A催化的结合活性比较显示SUMO与p53的结合率相似(参考文献。11,12) (和). 因此,Ubc9-K65A对SUMO与非PDSM底物或非磷酸化状态下的MEF2A或HSF1的结合没有明显影响。
因为PDSM和酸性NDSM SUMO共轭基序具有类似于SUMOψ-K-x-E基序的负静电性质()接下来,我们将Ubc9-K59A和Ubc9-K65A与模型Elk1底物在共轭反应中进行比较,以确定这些侧链是否有助于与NDSM底物的相互作用(方法和补充图7在线)。我们的数据显示,与野生型Ubc9相比,SUMO与Elk1结合的Ubc9-K65A的特异性常数略微降低了2倍(). 当评估Ubc9-K59A时,特异性常数与Ubc9-K65A的特异性常数相似(). 这些数据表明,与Lys65在区分MEF2或HSF1-PDSM底物的磷酸化状态中的作用相比,Lys65对NDSM底物如Elk1的识别贡献较小。
PDSM识别需要Ubc9基本补丁体内
Ubc9氨基酸替代对消除PDSM歧视的影响在体外接下来,通过外源性表达HA-SUMO1或HA-SUMO2、Myc-Ubc9或各自的突变等位基因和GAL4-MEF2A在293T细胞中进行转染试验,对其进行研究(见方法)。与不表达外源性Ubc9的细胞相比,相应突变Ubc9蛋白的表达导致SUMO结合物水平的增加,这与是否表达HA-SUMO1或HA-SUMO2无关(). 这些数据表明,无论测试的点突变如何,每个Ubc9亚型都能够识别细胞中的大部分SUMO底物。尽管在表达外源性Myc-Ubc9亚型的细胞中观察到SUMO结合物的水平存在一些差异,但与内源性Ubc9存在时表达HA-SUMO1或HA-SUMO2的细胞相比,每个Myc-Ubc9突变亚型的表达导致SUMO接合物的水平更高(外源性Myc-Ub9表达的载体控制;).
构成Ubc9基本表面的氨基酸侧链对MEF2的PDSM鉴别很重要体内. (一)转染HA的293T细胞全细胞裂解物的SDS-PAGE分析-SUMO1公司(左侧面板)或HA-SUMO2公司(右侧面板)和野生型Myc-UBC9公司或使用抗HA、抗Myc或抗管蛋白抗体(负载控制)进行免疫印迹的所示突变亚型。(b条)上面板;转染HA的293T细胞GAL4免疫沉淀物的SDS-PAGE分析-SUMO1公司,表示Myc-UBC9公司等位基因和GAL4-MEF2A公司用抗HA和抗GAL4抗体以及抗myc和抗tubin抗体进行免疫印迹(负荷对照)。下面板;条形图显示了SUMO修饰对野生型GAL4-MEF2A和GAL4-MEF2-S408A的偏好比率,这两种野生型和突变型Ubc9亚型是通过三种独立转染获得的(方法),但Myc-Ubc9-K59A除外,因为技术困难,它是通过两个独立实验计算得出的。SUMO结合比率(GAL4-MEF2A/GAL4-MEF2A-S408A)分别为9.40±3.67、1.24±0.35、0.78±0.43、2.03±1.39和8.30±1.89,适用于Myc-Ubc9、Myc-Ub9-K65A、Myc-Unbc9-K74A、Myc-Ubc9-K76A和Myc-Ub29-K59A。生化分析一式三份。误差线为±1标准偏差。(c) 293T细胞中SUMO2与MEF2A结合。HA转染293T细胞的GAL4免疫沉淀物-SUMO2公司和指示的Myc突变亚型-UBC9公司和GAL4-MEF2A公司用HA和GAL4抗体进行免疫印迹。用myc-Ubc9的myc抗体和作为SDS-PAGE分析的负载对照的微管蛋白抗体对总裂解物进行免疫印迹。
先前的研究表明,大约一半外源表达的GAL4-MEF2A在Ser408上磷酸化(参考文献。23). 在不表达外源性Myc-Ubc9的细胞中,与HA-SUMO1结合GAL4-MEF2A-S408A(一种Ser408不能磷酸化的底物)相比,HA-SUMO3结合GAL4-MEF2A的能力提高了约5倍(). 当外源Myc-Ubc9-WT表达时,两种底物的HA-SUMO1结合都增强了。在这种情况下,与GAL4-MEF2A-S408A相比,GAL4-MEF2A的HA-SUMO1共轭大约高出9倍(比较具有).
接下来,我们评估了Myc-Unbc9-K65A、Myc-Ubc9-K74A、Myc-Unbc9-K76A和Myc-Unc9-K59A区分MEF2A-PDSM磷酸化状态的能力体内.与观察到的活动一致在体外与GAL4-MEF2A-S408A相比,Myc-Ubc9-K65A和Myc-Ub9-K74A的表达导致HA-SUMO1结合的GAL4-MEF2A选择性丢失,而Myc-Ubc9-K76A的表达与GAL4-MEF2A-S408A相比较,保持了对GAL4-MEF2A约2倍的偏好(). 相反,Myc-Ubc9-K59A在区分GAL4-MEF2A和GAL4-MEF2A-S408A的能力方面与Myc-Ub9-WT相当。
在一级近似下,获得的数据体内获得的回波数据在体外对于Ubc9、Ubc9-K65A、Ubc9-K74A、Ubc9-K76A和Ubc9-K59A,即:1)Ubc9-K65A失去了区分PDSM磷酸化状态的能力,但保持了在几乎野生型水平上将SUMO偶联到GAL4-MEF2A-S408A的能力,2)Ubc9-K74A失去了区分底物的能力,但对GAL4-MEF2A和GAL4-MEF2A-S408A的结合活性都较低,3)与GAL4-MEF2A-S408 a相比,Ubc9-K76A对GAL4-MEF2A保持轻微的偏好,4)Ubc9-K59A侧链对区分PDSM磷酸化状态并不重要。因为在全细胞提取物中没有观察到HA-SUMO1结合的整体缺陷()我们认为,HA-SUMO1与GAL4-MEF2A结合的缺陷是由于相应的Ubc9突变亚型无法区分MEF2 PDSM磷酸化状态。
我们还检测了Ubc9突变亚型是否能够区分表达外源性HA-SUMO2的细胞中MEF2A-PDSM磷酸化状态。内源性Ubc9存在时无法检测到GAL4-MEF2A的HA-SUMO2结合物(),与之前的观察结果类似29然而,与GAL4-MEF2A-S408A相比,在存在外源表达的Myc-Ubc9-WT的情况下,可以观察到HA-SUMO2对GAL4-MEF2A的修饰。此外,在存在HA-SUM02的情况下突变体Ubc9亚型Myc-Unc9-K65A、Myc-Unb9-K74A和Myc-Unbc9-K76A的表达导致HA-SUMO_2结合的GAL4-MEF2A选择性丢失。Myc-Ubc9-K59A保持其区分GAL4-MEF2A和GAL4-MEF2A-S408A的能力(). 用HA-SUMO2和相应的Myc-Ubc9亚型进行转染实验的结果与用HA-SUMO1获得的结果一致。
因为内源性Ubc9仍然存在于编码各自Myc的质粒转染的细胞中-UBC9公司等位基因,我们的数据表明,Myc-Ubc9-K65A、Myc-Unbc9-K74A或Myc-Unc9-K76A的过表达可以通过质量作用阻断内源性Ubc9的活性来抑制SUMO与GAL4-MEF2A的结合(Myc-Unc 9亚型的表达水平比内源性Ub9高5-10倍;数据未显示)。因此,外源表达的Myc-Ubc9可能与内源性Ubc9竞争SUMO E1激活或与同源E3结合,或阻断内源性Ubc9识别磷酸化的MEF2 PDSM。
Ubc9碱性斑块对树突状形态发生至关重要
小脑皮层突触后树突形态发生需要磷酸化依赖性SUMO结合MEF223,25.确定Lys65、Lys74或Lys76侧链是否有助于PDSM辨别体内在突触后树突状爪发育的形态学分析中,我们表达了外源性Flag-Ubc9和相应的突变亚型,并评估了它们对大鼠小脑皮层树突状爪子分化的影响(). 从出生后第9天(P9)或P10大鼠幼崽制备小脑片,并在四天后用对照pcDNA3载体Flag转染小脑片-UBC9公司-重量,标志-UBC9公司-K65A,旗帜-UBC9公司-K74A,旗帜-UBC9公司-K76A或旗帜-UBC9型-K59A和GFP表达质粒。
缺乏PDSM辨别能力的Ubc9突变体在小脑皮层中也缺乏树突爪分化能力。(一)GFP阳性颗粒神经元表达载体(左)、Flag-Ubc9-WT(中)或Flag-Ub9-K65A(右)的典型共焦图像。箭头和箭头分别表示树突爪和轴突。插图显示了树突末端的高清晰度视图。主比例尺为20微米;插入比例尺为4微米。星号表示未图示的神经元轴突。(b条)量化Ubc9和Ubc9突变体对大鼠小脑片树突状爪分化的影响。与表达Flag-Ubc9-WT的神经元相比,表达Flag-Ubc9-K65A、Flag-Ubc9-K74A和Flag-Ubc9-K76A的颗粒神经元的树突爪数量显著减少(p<0.001;ANOVA,然后是Bonferroni-Dunn事后检验)。表达Flag-Ubc9-WT和Flag-Ubc9-K59A的颗粒神经元彼此之间没有显著差异。(c(c))用293T细胞转染编码Flag的表达质粒获得的裂解物进行SDS-PAGE分析和免疫印迹-UBC9公司WT或指示UBC9公司突变等位基因。误差线为±1标准偏差。
将小脑切片固定,并使用GFP抗体进行免疫组织化学染色,以观察小脑皮质中的颗粒神经元。在转染对照载体和Flag的小脑切片中,在颗粒神经元树突末端经常观察到爪状突起-UBC9公司-重量23,25(、左侧和中间面板)。相反,小脑切片转染Flag-UBC9公司-K65A的颗粒神经元树突状爪明显较少。相反,表达FLAG-Ubc9-K65A的颗粒神经元的许多树突经常显示球状或锥形末端(,右侧面板)。与转染Flag的小脑切片一样-UBC9公司-K65A,转染Flag的切片-UBC9公司-K74A和旗帜-UBC9公司-K76A还具有明显较少的带有爪子的颗粒神经元树突。重要的是,小脑切片中的颗粒神经元转染了Flag-UBC9公司-K59A与转染Flag的切片中的树突状爪数量相似-UBC9型-WT或控制矢量(). 为了控制突变对Flag-Ubc9表达的影响,293T细胞也转染了每个表达质粒,但没有观察到明显的差异().
与我们之前的转染实验一样,内源性Ubc9仍然存在于用编码各自的质粒转染的神经元中UBC9公司等位基因。因此,我们的数据表明,抑制树突状爪分化是由于对内源性Ubc9活性的主要影响,无论是通过E1阻断激活,还是通过阻断对过度表达Flag-Ubc9-K65A、Flag-Ubc9-K74A和Flag-Ub9-K76A的细胞中磷酸化MEF2-PDSM的识别。有趣的是,Flag-Ubc9-WT或Flag-Ubc9-K59A的过度表达对树突状爪分化没有明显影响,这表明Ubc9在爪分化过程中不是一个速率限制因子。综上所述,Ubc9-催化的SUMO共轭结果之间的高度相关性(相关系数>0.95)获得在体外Ubc9突变体对小脑皮层树突状爪分化的影响表明,Ubc9 Lys65、Lys74和Lys76在区分MEF2A磷酸化和非磷酸化形式中起着重要作用体内().
讨论
磷酸化依赖性SUMO结合整合了两条重要的信号转导途径。通过生物化学、结构和生物学分析,我们已经证明Ubc9表面上保守的碱性批次负责Ubc9区分MEF2A和HSF1中磷酸化和非磷酸化PDSM基序的能力在体外和MEF2A体内本分析为SUMO共轭的进化提供了一个独特的视角。不像泛素途径中更常见的那样,将底物磷酸化与E3介导的相互作用结合起来,一些SUMO底物通过将负责识别SUMO共有基序的E2表面与识别PDSM共有基模中磷酸化丝氨酸所需的表面结合,形成了在两个位点与SUMO E2结合的能力。
磷酸化丝氨酸残基仅位于延伸ψ-K-x-E-x-x-S-P-SUMO基序中谷氨酸残基下游的两个残基,其位置在其他含有PDSMs的底物中高度保守。由于Ubc9上相同的基本表面对于MEF2A的PDSM识别似乎很重要(在体外和体内)和HSF1(在体外),我们的数据表明,E2介导的对其他PDSM底物(如GATA-1和PPARγ)的识别也会以类似的方式发生。本文对磷酸化依赖性SUMO偶联到MEF2A的分析有助于建立E2依赖性偶联到PDSM底物的分子机制,该底物调节包括突触发育和可塑性在内的多种生物过程。