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临床投资杂志。2009年11月2日；119(11): 3395–3407.
2009年10月5日在线发布。 数字对象标识：10.1172/JCI39703
PMCID公司：PMC2769177型
PMID：19809159

的标识FGFR4公司-激活人类横纹肌肉瘤突变促进异种移植模型转移

詹姆斯·泰勒六世,1 亚当·卓克,2 帕特里夏·S·曾,2 钟俊勇,三 年轻的K.Song,2 克鲁帕·德赛,1 于燕林,4 陈庆荣,2,5 库沙尔·沙阿,1 维多利亚·扬布拉德,1 Jun Fang先生,6 苏英金（Su Young Kim）,7 Choh Yeung（周扬）,7 李·赫尔曼,7 阿努尔福·门多萨,8 吴吴,9 路易斯·M·斯塔特,9 Jun S.Wei（魏军）,2 Chand Khanna公司,8 丹尼尔·卡奇普尔,10 斯蒂芬·J·夸曼,11 斯蒂芬·休伊特,三 格伦·梅里诺,4 斯蒂芬·查诺克,6和官员扎维德2
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补充资料

摘要

横纹肌肉瘤（RMS）是一种起源于骨骼肌的儿童癌症，在存在转移性疾病的情况下，患者的生存率很低。很少有决定转移发展的因素被确定。受体酪氨酸激酶FGFR4公司在RMS组织中高度表达，表明其在肿瘤发生中起作用，尽管其功能重要性尚未明确。在这里，我们报告了在FGFR4公司在人类RMS肿瘤中导致其激活，并有证据表明其在RMS中作为癌基因发挥作用FGFR4公司RMS肿瘤的表达与晚期癌症和低生存率相关，而FGFR4公司当将人RMS细胞系移植到小鼠体内时，敲除该细胞可减少肿瘤生长和实验性肺转移。此外，6FGFR4公司在94例原发性人类RMS肿瘤中，有7例（7.5%）发现酪氨酸激酶结构域突变。突变体K535和E550在小鼠RMS细胞系中表达时增加了自身磷酸化、Stat3信号传导、肿瘤增殖和转移潜能。这些突变体还转化NIH 3T3细胞，并导致转移表型增强。最后，表达K535和E550的鼠RMS细胞系FGFR4公司与表达空载体或野生型的对照细胞系相比，突变株在药物FGFR抑制剂的存在下更容易发生凋亡FGFR4公司。总之，我们的结果表明，突变激活FGFR4公司作为一个癌基因，我们认为这是RMS受体酪氨酸激酶的第一个已知突变。这些发现支持RMS中FGFR4的潜在治疗靶向性。

介绍

横纹肌肉瘤（RMS）是一种起源于骨骼肌的儿童肉瘤，大多数患者可分为肺泡RMS（ARMS）和胚胎RMS（ERMS）。在老年患者中观察到ARMS，它与染色体易位相关，产生一个融合基因，涉及FOXO1A公司13号染色体和圣像牌基因家族。ERMS的特征是杂合性丢失和基因组印迹模式改变(1). 尽管在过去40年中整体预后显著改善，但转移性RMS患者的长期生存率仍然很低（<30%）(2). 导致肿瘤进展和转移性疾病的因素尚不清楚。

对RMS基因表达模式的分析提高了诊断准确性，并对转移调节因子（包括SIX1和EZRIN）的可能机制有了新的见解(三–5). 我们和其他人已经报道了FGF受体4(FGFR4公司)，受体酪氨酸激酶（RTK）成员FGFR公司基因家族，在RMS中高度表达，其mRNA表达与蛋白质水平相关(三,4,6). FGFR4也是肌源性分化和损伤后肌肉再生的关键调节因子，尽管在分化的骨骼肌中不表达(7–9). 这些观察结果增加了FGFR4不仅是肿瘤特异性标记物的可能性，而且还可能作为RMS中的癌基因发挥作用。

FGFRs在癌症生物学中具有相当大的兴趣，因为它们调节包括细胞生存、运动、发育和血管生成在内的基本过程(10). 完整FGFR编码区的比较表明FGFR1、-2、-3和-4中的氨基酸保守度较高的片段。这些副记录中的种系突变被描述为几种罕见的孟德尔骨骼疾病，包括软骨发育不良(11,12). RTK也可能通过点突变在人类癌症中被激活，例如在多形性胶质母细胞瘤、子宫内膜癌和肺癌中观察到的FGFR酪氨酸激酶（TK）结构域内的体细胞突变(13–17). 然而，FGFR4公司在这些和其他癌症中很少发生突变(13,18,19). 也有报道称，一种异常的FGFR4亚型促进了垂体腺瘤的肿瘤发生，尽管这种转录物的表达机制不是由于体细胞突变，而是被认为是由另一种启动子调控的(20). 自FGFR4公司在RMS和肌发生过程中高度表达，但在成熟骨骼肌中不表达，我们假设通过过度表达或突变的构成性FGFR4激活将促进RMS的侵袭性表型。

结果

FGFR4在RMS中的表达与FGFR4蛋白、晚期、ARMS组织学和低生存率有关。

因为我们之前表现得很高FGFR4公司RMS肿瘤中的表达(三)，我们首先使用可用的RMS表达微阵列数据集研究了其表达是否与侵袭性临床行为有关(三,5,6). 我们确认高度FGFR4公司原发性RMS肿瘤中的表达与儿童肿瘤和正常组织的独立样本进行比较（图​（图1A）。1A） ●●●●。与先前的观察结果一致，mRNA过度表达与高FGFR4蛋白相关（补充图1；本文在线提供补充材料；doi:10.1172/JCI39703DS1) (三). 对临床随访可用的RMS数据集的分析表明FGFR4公司与1期相比，4期转移性肿瘤的信使RNA高2倍(P（P）=0.003），尽管两组之间的表达范围有一些重叠（图​（图1B）1B）(6). 与非ARMS肿瘤相比，ARMS也有较高的表达（图​（图1C；1C类；P（P）=1.39 × 10–9). 不同FGFR4表达四分位数的Kaplan-Meier分析显示，随着高表达，生存率显著降低（补充图2），肿瘤的总体生存率显著下降具有更高的FGFR4公司表达式（图​（图1D；1D类；P（P）=0.03) (6). 对该数据集的进一步单变量分析证实，高分期和ARMS组织学也与较低的生存率相关（表​（表1）。1). 然而，Cox比例风险多变量分析表明，只有临床分期与早期死亡相关（表​（表1；1; 危害比=9.17；P（P）=0.002），表明FGFR4公司临床分期和ARMS组织学表现。为了进一步验证表达增加与晚期疾病的相关性，我们还重新检查了来自小鼠ERMS自发模型的细胞系的基因表达数据(5,21)并发现显著更高Fgfr4级高转移潜能肿瘤中的表达（图​（图1E；1E；P（P）=0.01).

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高FGFR4公司RMS的表达与晚期、ARMS组织学和低生存率有关。

(A类)日志2以中位数为中心的表达数据显示FGFR4公司与其他儿童肿瘤和人类肿瘤正常组织相比，RMS肿瘤的表达。EWS、Ewings肉瘤；NB，神经母细胞瘤；急性淋巴细胞白血病；其他,其他小儿肿瘤；正常组织。(B类)阶段4 RMS与显著较高的中位数相关FGFR4公司根据Davicioni等人（Mann-Whitney检验）的数据分析，表达高于阶段1 RMS(6). (C类)FGFR4公司与所有其他组织学RMS亚型相比，ARMS的表达显著增高（Mann-Whitney试验）。(D类)基于中值截断的Kaplan-Meier分析FGFR4公司表达水平较高的患者（前2个四分位数）的死亡率显著高于后2个四分位数；P（P）=0.03，对数库测试）。(E类)小鼠RMS细胞系（来源于参考文献。5,21)转移潜能高的患者中位数明显较高Fgfr4级mRNA比非定向细胞系(P（P）=0.01，Mann-Whitney试验）。

表1

子分析FGFR4公司RMS生存表达

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因为DNA扩增或获得可以导致mRNA表达水平增加，我们接下来检查FGFR4公司一组94个RMS肿瘤的DNA拷贝数，并测量拷贝数变化增加的那些样品的mRNA水平（>2.5，n个=15). 我们无法证明高拷贝数变异与mRNA表达之间的相关性FGFR4公司(第页2= 0.0127,P（P）=NS；补充表1）。这表明FGFR4公司表达不是由于基因组水平的扩增。

FGFR4抑制抑制RMS肿瘤生长和肺转移。

描述FGFR4公司在促进RMS肿瘤进展和转移的表达中，我们稳定地引入了一种针对RMS肿瘤的诱导shRNAFGFR4公司进入人类ARMS细胞系RH30。shRNA的诱导使FGFR4蛋白表达降低了近92%（图​（图2A）2A） 但在组织培养中长达4天的体外生长没有减少（图​（图2B）。2B） ●●●●。然而，下降了41%(对=0.002）在长时间培养13天后生长（图​（图2C）。2C） ●●●●。然后我们继续研究体内FGFR4表达减少的表型后果。与对照组相比，肌肉注射SCID米色小鼠31天后，FGFR4抑制导致肿瘤显著缩小（图​（图3，三、A和B；P（P）=0.002). 通过活体内视频显微镜（IVVM）对注射24小时后肺部转移细胞的早期阻滞进行量化，结果显示具有FGFR4抑制的RH30细胞显著减少（图​（图3，三、C和D；P（P）=0.008). 在高转移鼠RMS细胞系RMS33中观察到IVVM早期肺转移的类似减少Fgfr4级抑制（补充图3；P（P）=0.02) (5). 值得注意的是，静脉注射诱导型RH30细胞74天后，FGFR4抑制的肺转移也较少（图​（图3E）。三E） ●●●●。为了证实这种差异不是由于细胞生长速度降低所致，我们通过计算肺部肿瘤信号与盆腔肿瘤信号的比率，对生长速度进行标准化，并发现FGFR4抑制后显著降低（图​（图3F；三F；对=0.02).

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FGFR4被诱导的shRNA击倒导致体外生长减少。

(A类)Western blot证实了多西环素诱导RH30细胞中shRNA抑制FGFR4。(B类)诱导shRNA靶向RH30细胞株的生长曲线FGFR4公司在长达96小时的生长速度上没有可测量的差异。(C类)经过或不经过强力霉素处理的具有针对FGFR4的诱导shRNA的RH30细胞株的细胞计数显示，随着培养时间的延长，在13天时生长显著降低（降低41%）（Mann-Whitney试验）。

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FGFR4抑制可抑制体内生长和肺转移。

(A类)肌肉注射RH30和诱导性抗-FGFR4公司利用生物发光成像技术，shRNA在第31天使FGFR4抑制小鼠的肿瘤显著缩小(n个=每组6只小鼠，Mann-Whitney试验）。(B类)第31天肌肉注射的代表性小鼠。表达荧光素酶的肿瘤细胞的强度被量化为光子/秒/厘米2/立体（p/s/cm2/sr）。(C类)典型的IVVM图像显示，当FGFR4被抑制时，24小时肺部RH30细胞减少。(D类)在1小时和24小时对IVVM早期肺转移的定量显示，在FGFR4抑制的情况下，肺中残留的恶性细胞显著减少（标准化平均值±SEM；n个=每组5只小鼠；Mann-Whitney试验）。(E类)静脉注射的代表性小鼠在第74天表现出FGFR4抑制的肺部肿瘤信号降低。(F类)静脉注射相同细胞后，在第74天，FGFR4抑制小鼠的肺部损伤显著减少（通过计算肺部与盆腔肿瘤信号的比值，肿瘤生长率正常化；n个=每组10只小鼠，Mann-Whitney试验）。

人类RMS肿瘤中FGFR4 TK域突变的鉴定。

到目前为止，我们的结果表明FGFR4公司活性可能有助于RMS的肿瘤进展和转移疾病。因此，我们寻找激活FGFR4公司使用all双向测序进行突变同一94例RMS肿瘤中的蛋白质编码外显子及其内含子/外显子边界（补充表2）。我们发现了14个错义变体，其中6个聚集在TK域中（图​（图4A）。4A） ●●●●。四个TK域突变定位于密码子535和550（表​（表2；2; 图​图4，4，A–C；和补充图4）。这些TK错义替换都没有出现在人类基因突变数据库、COSMIC或RTK基因的大规模测序调查中(18). 这些肿瘤中的一个子集（94例中的50例）具有配对生殖系DNA。因此，三分之三的TK域突变仅在肿瘤中发现，而在生殖系DNA中未发现，因此是体细胞突变（补充表2）。我们没有观察到FGFR4公司9个人类RMS细胞系中的TK域。

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FGFR4公司RMS中的TK结构域突变。

(A类)在RMS肿瘤中发现的FGFR4 TK结构域中6个错义替换位点(n个=94). 蛋白质结构域的氨基酸边界由NCBI保守域数据库（NCBI CD-search）的搜索结果定义。红色，信号肽；蓝色，跨膜结构域。IG，免疫球蛋白样结构域；S、 二硫键。(B类)N535K突变的野生型和纯合突变等位基因。(C类)V550E的野生型和突变等位基因。

表2

FGFR4公司在原发性RMS中观察到TK域突变

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我们通过对2个基因进行额外的双向测序，证实这些TK域突变在健康人群中不存在FGFR4公司1030名多民族对照中与密码子507至607相对应的外显子（补充表2）。这些发现表明TK结构域突变的总体发生率为7.5%（94个肿瘤中有7个；95%置信区间，4.7%-10.2%；表​表2）2)1030名健康对照者中仅观察到一个R529Q单核苷酸变异等位基因（0.1%；对=2.0 × 10–7肿瘤与对照组）。

FGFR4突变的预测分析。

为了确定这些突变的重要性，我们对单个氨基酸替换进行了多重预测分析（见方法和补充表3）。这表明4FGFR4公司密码子535和550处的错义替换最有可能导致蛋白质功能的中断（补充表3）(22–26). 此外，密码子535和550突变映射到FGFR4 TK结构域模型上铰链区域内的相邻位点（图​（图5A）。5A） ●●●●。密码子535突变预计会消除FGFR4 R组氢键，这些氢键抑制受体的自磷酸化或调节副FGFR2磷酸化期间的构象动力学（图​（图5，5，B–D）(27,28)而密码子550的密码子会改变ATP结合间隙(29,30).

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的结构建模FGFR4公司密码子535和550突变。

(A类)FGFR4激酶结构域模型上的密码子535和550突变（红色）。密码子529和554的突变位点也为红色。激活环（A环）为黄色，催化环为黑色，核苷酸结合环为蓝色。(B类)野生型密码子535的预测氢键。(C类和D类)密码子535突变可能会破坏密码子536与残基H530和I533之间的R组氢键（红色虚线）。中的插图B类–D类是用PyMOL创建的(http://www.pymol.org).

突变可促进FGFR4的自动磷酸化、Stat3磷酸化以及细胞周期和DNA复制途径的激活。

我们对这4个TK结构域突变中的2个（K535和E550）进行了功能表征，以确定它们是否会导致组成型受体激活。我们转基因了野生型人类FGFR4公司或将K535和E550突变为小鼠RMS细胞系RMS772，该细胞系以前来源于ERMS小鼠模型中发生的自发性肿瘤(5,21). 选择RMS772是因为其转移潜能低且无法检测到Fgfr4级信使核糖核酸(5). 我们确认了FGFR4公司在RNA和蛋白质水平的转基因细胞系中，FGFR4蛋白水平与2个人类RMS细胞系相当（图​（图6，6、A和B）。值得注意的是，这两种突变均导致FGFR4受体显著的自动磷酸化（图​（图6C）。6C） ●●●●。

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FGFR4公司突变促进FGFR4自身磷酸化、STAT3磷酸化以及细胞周期和DNA复制途径的激活。

(A类和B类)高水平RNA(A类)和蛋白质(B类)对于野生型人类FGFR4公司,FGFR4公司K535，以及FGFR4公司E550稳定导入小鼠RMS细胞系RMS772后。蛋白质水平与人类RMS细胞系RH41和RH28相当。(C类)免疫沉淀后FGFR4和磷酸-FGFR4的免疫印迹显示FGFR4的突变形式是组成性的自磷酸化。(D类)免疫印迹法观察到FGFR4突变细胞株中的总Stat3和磷酸化-Stat3增加，而突变细胞的磷酸化-Akt也降低。所有表达人FGFR4的转导子也具有较少的磷酸化Erk1/2。(E类)具有代表性的GSEA显示在表达细胞周期基因的小鼠RMS细胞中富集FGFR4公司突变。底部列出的基因名称位于表达富集分数排名的基因前沿，这些基因也属于细胞周期KEGG基因集。

已知FGFR下游信号分子的Western blot分析发现，Stat、Akt和Mapk/Erk通路中存在显著差异，两个突变株系中的总Stat3和磷酸化-Stat3增加（图​（图6D）。6D） ●●●●。有趣的是，突变细胞系在两种野生型中的磷酸化Akt也减少，Mapk通路中的差异明显，磷酸化Erk1/2减少FGFR4公司和突变型电导子与载体控制相比（图​（图6D）。6D） ●●●●。其他信号分子，包括mTor、S6k、4Ebp1和Gsk3β，在转导体之间没有显著差异（补充图5）。

然后，我们使用基因表达谱检测了在RMS772细胞中表达这些人类突变的全球下游效应。基因集富集分析表明，突变体显著上调了细胞周期和DNA复制基因通路（错误发现率[FDR]<0.01），而细胞粘附通路和肌肉分化标记物减少（表​（表3三和图​图6E）。6E） ●●●●。

表3

在表达FGFR4公司GSEA引起的TK域突变

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FGFR4突变体增加增殖、侵袭和转移潜能。

高等教育协会FGFR4公司晚期和低存活率的表达以及细胞周期基因的上调导致我们假设FGFR4公司活化将与RMS的生长增加有关，并导致RMS的转移表型。与野生型相比，K535和E550突变在体外生长的RMS772细胞系中引起显著更高的生长率FGFR4公司72小时（图​（图7A；7A；P（P）=分别为0.0071和0.0090）。与这些数据一致，在裸鼠皮下注射RMS772转导体后18天，突变体的肿瘤体积迅速增加（图​（图7B；7B；二者都P（P）=0.0079），为体内生长增加提供了证据。

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FGFR4公司突变加速生长并促进转移表型。

(A类)培养突变体RMS772细胞系的生长速度显著提高(*P（P）<0.01与野生型，Mann-Whitney试验）。(B类)FGFR4公司RMS772细胞中的突变体在裸鼠皮下注射后显著增强体内生长(*P（P）<0.001与野生型，Mann-Whitney试验）。(C类)FGFR4公司通过改良的Boyden室分析，RMS772突变体显示出3倍高的侵袭性（与载体对照标准化）(t吨Welch校正测试）。(D类)左：典型的IVVM图像显示肺部存在RMS细胞（显示1小时和24小时的时间点）。右图：1小时和24小时肺部病变的量化显示，2个突变体转导的RMS细胞持续存在（在每个时间点归一化为载体对照；n个=每组5只小鼠；Mann-Whitney试验）。(E类)第21天RMS772细胞的总肺转移（使用Student’st吨测试）。(F类)左图：Kaplan-Meier生存分析显示，静脉注射2个突变体转导的RMS772细胞系的小鼠生存率明显较低。右图：显示注射突变体的代表性动物的肺部病变。

使用改良的Boyden腔侵袭试验，我们发现侵袭性增强3倍与FGFR4公司突变细胞系与载体对照或野生型的比较FGFR4公司在RMS772中（图​（图7C；7C类；P（P）=0.002用于矢量与K535；P（P）=E550为0.005）。静脉注射荧光标记的RMS772转导物后，IVVM检测小鼠肺部细胞阻滞和早期转移。注射后1小时的IVVM显示，所有4种传感器的细胞数量相等。然而，尽管野生型人类FGFR4引起的病灶数量略有增加（2.6倍），但只有突变显著增强了24小时后肺部病灶的存在（K535和E550分别是载体控制的46倍和22倍）（图​（图7D）。7D） ●●●●。确定这些生长和侵袭的差异是否会对体内产生影响表达野生型人类RMS772细胞的转移潜能FGFR4公司或通过静脉将突变导入裸鼠体内。在3周时，突变细胞系与野生型细胞系相比，产生了明显更多的总肺转移FGFR4公司（图​（图7E）。7E） ●●●●。在后续实验中，Kaplan-Meier生存分析表明，注射突变细胞系的小鼠早期死亡（图​（图7F；7F；P（P）<趋势的log-rank检验为0.0001；中位生存期：E550，19天；K535，29天；野生型，59天；病媒控制，78天）。尸检证实，由于转移性疾病，肺部有大量肿瘤负担（图​（图7F）。7F） ●●●●。

为了在独立细胞系中验证这些结果，我们用相同的结构转导NIH 3T3细胞，并重复体内皮下生长和静脉实验转移试验。我们再次观察到接受皮下NIH 3T3细胞转导的小鼠的快速生长FGFR4公司K535或E550，而对照组在18天时没有生长（图​（图8A）。8A） ●●●●。静脉注射3T3细胞系同样会导致接受突变株的动物因转移性疾病而提前死亡FGFR4公司单元格（图​（图8B；8B类；P（P）<0.0001（通过趋势的对数-秩检验）。

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FGFR4公司突变转化3T3细胞。

(A类)FGFR4公司突变体转化NIH 3T3细胞并促进裸鼠皮下注射后体内肿瘤生长(*P（P）<0.001与野生型，Mann-Whitney试验）。第18天显示了注射了用相应结构转导的3T3细胞的代表性动物。在这些动物中，在5只小鼠中的4只（K535）和5只小鼠（E550）中观察到肿瘤。(B类)静脉注射带有野生型和突变FGFR4的NIH 3T3细胞后小鼠的Kaplan-Meier生存分析(n个=每组5只小鼠）。

突变对细胞周期、凋亡和FGFR抑制的影响。

我们的结果预测了致癌途径的突变激活。因此，我们测试了这些突变是否会在不利条件下提高生存率，以及RMS肿瘤细胞是否依赖于FGFR4公司激活以生存，这可能使它们对FGFR抑制剂更敏感。尽管在10%血清中生长的突变细胞系增殖率增加（图​（图7A），7A） ，与空载体或野生型相比，细胞周期中的分布没有差异FGFR4公司（图​（图9A）。9A） ●●●●。然而，与突变细胞系相比，在血清饥饿条件下，载体和野生型对照组的凋亡细胞比例明显高于突变细胞系，如G1亚组分增加所示（图​（图9B）。9B） ●●●●。

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癌基因依赖性和抑制FGFR4公司.

(A类)10%血清中RMS772的细胞周期分析。(B类)无血清的细胞周期分析显示，载体和野生型的凋亡细胞（G1亚组分）增加FGFR4公司RMS772细胞系。(C类)PD173074治疗3小时后FGFR4磷酸化的抑制。(D类)使用PD173074治疗48小时后RMS772的存活率。集成电路50给出了RMS772矢量控制、野生型FGFR4、K535和E550的值。(E类)用20μM PD173074治疗24小时后，突变RMS772细胞株的G1亚组分增加。(F类)用20μM PD173074处理24小时后，FGFR4突变体RMS772细胞系的胱天蛋白酶-3激活增加。

为了证明癌基因对FGFR4突变激活的依赖性，用FGFR抑制剂PD173074处理4个细胞系(29,31). 我们证实PD173074治疗降低了K535和E550突变体的磷酸化-FGFR4（归一化为总FGFR4）（图​（图9C）。9C） ●●●●。IC50治疗48小时后，病媒控制组和野生型组分别从12.7μM和11.8μM下降FGFR4公司K535和E550的细胞系分别为8.2μM和5.9μM（图​（图9D）。9D） ●●●●。PD173074增加的凋亡在两种突变细胞系中都很明显，如增加的SubG1分数所示（图​（图9E）9E） 并增加激活的caspase-3（图​（图9F）。9F） ●●●●。

讨论

RMS是一种由骨骼肌前体引起的侵袭性儿童癌症。虽然接受RMS治疗的患者的总体生存率已取得显著进展，但转移性疾病仍然是一个相当大的挑战，尽管进行了积极的多模式治疗，但存活率仍不到30%(2). 因此，迫切需要开发针对晚期RMS患者的靶向治疗药物。

我们和其他人之前曾报道过FGFR4公司RMS中mRNA和蛋白的过度表达(三,4,6)尽管这些研究都没有阐明其在RMS发病机制中的功能重要性或作为治疗的分子靶点的潜力。FGFR4公司在正常发育过程中的成肌细胞、损伤后的再生肌肉中也表达，但在成熟骨骼肌中不表达(6–8,32). PAX3和PAX7直接诱导FGFR4公司表达，导致胚胎祖细胞进展为肌源性程序(7). 此外，PAX3/7-FOXO1A嵌合转录因子存在于大多数ARMS中(33)与野生型PAX3或PAX7相比，它们增加了靶基因的表达(34). 这预示着这些由染色体易位产生的嵌合融合产物可能是FGFR4公司在ARMS中。

这些报告表明，FGFR4通路激活可能通过增强RMS的增殖和阻断末端分化而导致横纹肌母细胞表型。因此，我们假设FGFR4激活可能是RMS的致癌性，并代表一个潜在的新治疗靶点。这里，我们展示了FGFR4公司表达与蛋白水平、ARMS组织学、转移性疾病和不良生存率显著相关。然而，在多变量回归分析中，FGFR4公司mRNA表达并不独立于高分期或ARMS组织学，因为这两个参数都与预后较差和高FGFR4公司表达式(35). 如果FGFR4公司是PAX3/7-FOXO1A融合转录因子的直接靶点。此外，我们发现抑制野生型FGFR4可显著降低异种移植模型中的局部生长，减少早期和晚期肺转移。

癌基因活化被描述为通过过度表达、基因扩增或突变发生(36–39). 我们的结果表明，过度表达可能导致活性增加，并导致我们假设激活FGFR4公司RMS中也可能存在突变(5,6). 在这项研究中，我们证实了FGFR4公司TK域激活7.5%RMS肿瘤的突变，正常人群中不存在。此外，所有FGFR4公司TK域突变是具有肿瘤DNA突变和配对生殖系DNA样本的RMS患者子集中的体细胞突变。这并不排除生殖系的存在FGFR4公司如果要调查更大的群体或谱系，除了体细胞突变之外的突变。然而，考虑到这些突变的主导作用，该基因的种系突变似乎不太可能导致正常发育。

对这些TK结构域突变的计算分析预测，正如我们的研究所证实的那样，它们可能导致FGFR4的自磷酸化，并导致下游通路激活。值得注意的是，观察到Stat3激活显著增加。Stat3激活以前与RMS和其他癌症中的细胞生长和存活有关，已知发生在FGFRs下游(40–43). 有趣的是，对Akt途径的研究表明FGFR4公司突变抑制了磷酸化Akt。这与之前的发现一致，即生殖系激活FGFR2型突变导致磷酸化AKT的抑制，而非活性AKT可以促进侵袭和转移(44–46). 我们推测FGFR4突变激活的表型结果是由Stat3的致癌和转移效应介导的。还需要进一步的研究来确定这些细胞改变中的哪些决定了转移表型。

被点突变激活的RTK被证明是肿瘤发生的驱动因素，是理想的治疗靶点(36–39,47). 以前发现的可用于治疗的RMS突变包括PAX3/7-FOXO1A公司仅在ARMS和RAS错义突变中发现基因易位/融合(美国国家科学院,KRAS公司，以及人力资源管理系统)，在少数ERMS中报告(33,48–50). 然而，靶向融合转录因子仍然是一个重大挑战，在仅调查了少数ERMS肿瘤的研究中发现了RAS基因的突变。重要的是，这是首次报道激活两种组织学类型RMS常见的RTK突变。

更广泛地说，我们的研究表明FGFR4公司人类癌症中报告的TK域突变，而其他大规模癌症基因组筛查发现在FGFR4公司(13,18,19,51–54). 此外，本研究中发现的错义突变均未在肺腺癌中发现，肺腺癌的发病率最高FGFR4公司迄今为止报告的突变（1.8%）(13,51). 此外，已知发生在密码子535和550的4个突变中的2个在FGFR旁系（FGFR1、-2、-3和RET）和单个高突变乳腺癌样本的FGFR4中发生突变(11,12,14,16,17,19,55,56).

功能上这些FGFR4公司突变似乎比野生型更有效FGFR4公司过度表达促进生长和转移，它们是NIH 3T3成纤维细胞体内肿瘤生长所必需的。这些发现与之前的工作一致，之前的工作表明野生型的引入和过度表达FGFR4公司不转化成纤维细胞或支持FGF诱导的BaF3细胞生长(20,41,57). 相反，FGFR1–FGFR3都能够通过单独过度表达或通过FGF刺激过度表达来转化不同的细胞(57,58)表明FGFR4与FGFR同源序列相比具有独特的信号和生物反应。最重要的是，在我们的小鼠RMS模型中，这些突变增加了侵袭性，促进了转移表型和不良生存率。先前的关联研究表明，FGFR4的一个常见变体G388R与未检测到FGFR4激活的肿瘤进展相关，这可能是由于FGFR4作为肿瘤抑制因子的作用(59–61). 然而，我们的观察表明FGFR4公司突变激活导致致癌表型，这与其他人提出的观点一致FGFR4公司是致癌基因(13,20).

我们的数据表明，FGFR4是晚期RMS患者靶向治疗的最佳候选药物。此外，我们显示7.5%的RMS肿瘤具有预测的激活突变，并且我们确认其中2个是驱动突变，导致对小分子抑制剂的敏感性增强。这些结果为RMS和其他癌症中FGFR4途径的治疗靶向提供了合理的基础。总的来说，我们的研究结果对转移性RMS的快速转化为辅助治疗有直接意义，因为转移性RMS的长期预后仍然很差。

方法

样品和细胞系。

从合作人类组织网络（CHTN）和Westmead儿童医院获得94个原发RMS肿瘤进行基因组DNA提取。这些原发性RMS肿瘤中有50个具有匹配的生殖系基因组DNA，也是从CHTN获得的。44个未配对和50个配对肿瘤的人口统计数据见补充表4。所有肿瘤都有FGFR4公司TK域突变受RT-PCR检测PAX-FOXO1型融合基因如前所述，使用3′修饰FOXO1系列底漆，ATGAACTTGTGTAGGGACAG(62). RT-PCR产品(PAX3/FOXO1=172 bp和PAX7/FOXO1系列=160 bp）在安捷伦生物分析仪2100上进行解析，并使用DNA 1000 Lab-on-chip软件（安捷伦科技）进行分析。健康的匿名对照组包括284名欧洲人/欧裔美国人、30名北非人、333名非洲人/非裔美国人、143名中东人、175名亚洲人和65名西班牙裔/土著美国人。使用匿名人体组织样本不需要NIH人体研究办公室的机构审查委员会批准。用于DNA测序的人类RMS细胞系为A673、RD、RH4、RH5、RH28、RH30、RH36和RH41。

RNA和基因组DNA纯化。

将高达70毫克的冷冻原发肿瘤在0.7毫升Trizol（Invitrogen）中均质化。小鼠肿瘤细胞系生长到80%的汇合处，用PBS洗涤，然后在Trizol中重新悬浮。用miRNEasy试剂盒（Qiagen）纯化RNA。Genfind（Agencourt）用于从与单个肿瘤样本配对的白细胞制剂中纯化肿瘤DNA和基因组DNA。

DNA测序。

17的PCR引物FGFR4公司蛋白质编码外显子见补充表5。根据SNP500癌症数据库，使用PCR和PCR清理（虾碱性磷酸酶/核酸外切酶I）条件，通过PCR扩增基因组DNA(http://snp500cancer.nci.nih.gov)以及65°C的均匀退火温度。在ABI平台（3100和3730型）上使用大染料终止剂化学（ABI）和M13正向或反向引物对扩增的DNA进行测序，并使用Sequence Analysis 3.7（ABE）和Sequencer 4.5软件（Gene Codes Corp.）进行分析。20%的样本进行了重复测序，所有错义或单一突变均通过重复PCR/测序反应进行了确认。

定量RT-PCR。

按照制造商的说明，使用3毫克随机六聚体和上标II逆转录酶（Invitrogen）逆转录两毫克总RNA。将得到的cDNA在水中稀释为1:20，并在ABI 7000序列检测系统（ABI）上进行实时PCR。按需分析（ABI）用于评估FGFR4公司表达水平（引物Hs00242558m1），折叠变化通过归一化为GAPDH公司（Hs99999905_m1）。

FGFR4突变的预测分析。

每个FGFR4公司使用4种方法计算分析错义突变对蛋白质功能的预测影响。将不容忍者与容忍者进行排序（SIFT；http://sift.jcvi.org/)用于计算SIFT概率分数，以确定突变影响蛋白质功能的可能性(26). 尽管SIFT阳性分数中约有20%表示预测为假阳性，但预测0.05或更低的分数会影响蛋白质功能。多态性表型（PolyPhen；http://coot.embl.de/PolyPhen公司)还使用了，根据替代位点的特征、预测的二级蛋白质结构或可用的三维蛋白质结构预测未知（预测数据不足）、良性、可能破坏或可能破坏的突变(24,25). 第三种方法使用SNPs3D的剖面模型(网址：http://www.snps3d.org)这是基于氨基酸位置的保守性和在蛋白质同源家族中观察到该位置变异的可能性(22,23). SNPs3D使用支持向量机确定剖面得分，其中负值与有害突变相关。大约10%的负支持向量机分数被预测为假阳性。最后，蛋白质多态性的多元分析（MAPP；http://mendel.stanford.edu/SidowLab网站/)通过对FGFR4同源序列和特定氨基酸变化所代表的相应物理化学性质的比较分析，用于预测每个非同义变体的影响(63). 使用ClustalW2的标准程序，对9个FGFR4同源基因（NP_998812_human、XP_001087243_macaque、XP_518127_chimpanzee、NP_032037_mouse、NP_001103374_rat、XP_ 414474_chicken、XP_001498550_horse、XP_546211_dog和SP_602166_cow）进行了比对和系统发育树构建(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)在使用MAPP进行分析之前。P（P）特定氨基酸替代值小于0.05表示那些可能损害蛋白质功能的突变。在dbSNP中查询突变(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP网站)，人类基因突变数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和癌症体细胞突变目录（COSMIC；http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/宇宙). FGFR4蛋白结构域的氨基酸边界如图所示​图44由NCBI保护域数据库（NCBI CD-search；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi). FGFR4 TK领域结构模型（基于NP_998812使用SWISS-MODEL生成非磷酸化FGFR2c TK结构域，PDB加入2psqA）(http://swissmodel.expasy.org/)并使用MBT蛋白质车间进行可视化（图​（图5A；5A；网址：http://www.rcsb.org)和PyMOL（图​（图5，5，B–D；http://www.pymol.org).

结构和细胞系转导子。

全长人FGFR4公司（pOTB7中的克隆ID 4121396；Invitrogen）被亚克隆到pMSCVpuro载体的XhoI位点（克隆技术实验室）。去除polyA尾部后，通过测序确认基因插入的方向。通过定点突变引入密码子K535或E550的突变。野生型和突变型FGFR4公司pMSCVpuro中的克隆经测序证实。用PT67细胞系（Clontech）包装病毒，然后用RMS772细胞系包装病毒(5)用野生型转染FGFR4公司,FGFR4公司K535，FGFR4公司E550，或在嘌呤霉素选择下的空病毒载体（对照）。表达萤火虫荧光素酶的pMSCVzeo逆转录病毒载体（由美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心的B.Clary提供）随后被转导到这些RMS772细胞系中。用四环素诱导的shRNA（寡核苷酸序列：AGCTAAAAGCCGTCAAGATGCTTCAAAGACTCCTCTTGAAGTCTGAGCTACTTGAGCGCGCGG）转导带有转导的四环素阻遏物的RH30细胞系FGFR4公司如前所述(64). 最高的RH30子克隆FGFR4公司敲除（克隆H11.5）用荧光素酶进一步转导，然后用于所有后续研究。

RMS细胞系的细胞培养和体外特性。

RMS33和RMS772细胞在RPMI1640（Quality Biological Inc.）、2 mM L-谷氨酰胺（Qualite Biological Inc）和1%青霉素/链霉素（Quality-Biology Inc.）以及0%–10%FBS（HyClone）中培养。RH30、NIH 3T3和PT67细胞系在添加10%FBS、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM（Quality Biological Inc.）中生长。对于生长特性，用PBS清洗RMS772，胰酶消化，收集，然后对细胞进行计数。根据制造商的建议，在Cultrex 96-well Boyden腔室中进行侵入检测，该腔室具有8微米的跨膜孔、0.5倍的基底膜提取物和0.5%至1%的血清梯度（Trevigen）。细胞接种24小时后读取平板。

体外shRNA RH30细胞生长。

实时细胞电子传感（ACEA Biosciences Inc.）技术用于实时监测细胞生长。RH30 H11.5电池（3.0×10三)在96 well E-plate设备的每个井中播种。接种后20小时，用25 ng/ml多西环素处理细胞。接种细胞后，对添加或不添加强力霉素的RH30 H11.5细胞的生长进行总共96小时的监测。细胞计数测量是通过将1000个细胞接种到6孔板的每个孔中进行的。接种后20小时，用25 ng/ml多西环素处理细胞。每3天更换一次含或不含强力霉素的培养基。13天后，使用或不使用强力霉素测量最终RH30 H11.5细胞数。

免疫印迹法。

对在10%FBS中培养的细胞进行免疫印迹，并在添加了1%蛋白酶抑制剂（皮尔斯生物技术）和1%磷酸酶抑制剂（皮尔斯生物技术）的RIPA缓冲液中进行裂解。在免疫印迹之前，RH30 H11.5细胞在存在或不存在强力霉素（25 ng/ml）的情况下培养48小时。在FGFR4免疫沉淀（FGFR4[C-16]抗体；Santa Cruz Biotechnology Inc.）后，用蛋白A/G琼脂糖珠进行FGFR4自身磷酸化免疫印迹。在4%–12%双三凝胶（Invitrogen）上分离20微克蛋白质，并通过iBlot（Invit罗gen）转移到硝化纤维素膜上。对于FGFR4磷酸化免疫印迹，用PBS中的5%脱脂奶粉和0.1%吐温-20（PBST）封闭膜，并用抗磷酸酪氨酸抗体（克隆4G10；Millipore）和人FGFR4（C-16；Santa Cruz Biotechnology Inc.）探测膜。对于通路分析，用5%脱脂奶粉在TBS和0.1%吐温-20（TBST）中封闭膜，并用以下抗体（除非另有规定，否则所有来自细胞信号的抗体）进行探测：Akt、phospho-Akt（Ser473）、phosphal-Gsk3β、phosphen-mTor、S6k、phospon-S6k、4Ebp1、phosoph-4Ebpl、Erk1/2、phosp-Erk1/2、Stat3、，phospho-Stat3和Gapdh（Chemicon International）。用HRP缀合的抗小鼠或抗兔二级抗体（Pierce Biotechnology/Thermo Fisher Scientific）检测特定分子，并用SuperSignal化学发光试剂盒（Pierce Biotechnology）增强。在柯达Biomax MR X射线胶片（柯达）上检测到信号。

细胞周期分析。

BrdU Flow Kits（BD Biosciences-Pharmingen）用于细胞周期分析。简言之，培养细胞在有或无血清的情况下生长，或在10%FBS中用FGFR抑制剂PD173074（CalBiochem）处理，用1 mM BrdU脉冲30分钟，并用抗BrdU抗体染色，然后按照制造商指南进行7-AAD染色。使用CellQuest软件（BD Biosciences）分析FACS。

微阵列基因表达分析。

人类FGFR4公司来自已发布数据集的表达使用来自人类U133A基因芯片（Affymetrix）的探针X204579_at。相对FGFR4公司表达式(Fgfr4级表达，对于小鼠）如图所示​图1，1A–C和E，通过对数的中位数居中计算2已发布微阵列数据集的表达水平(http://home.ccr.cancer.gov/nocology/oncogenomics网站/和http://ntddb.abcc.ncifcrf.gov/cgi-bin/nltissue.pl). 用于微阵列实验的RMS772细胞在提取RNA之前按照所述在0%FBS中培养。使用小鼠基因组430 2.0阵列（Affymetrix）进行基因表达谱分析，并在PM-only模型中使用DNA芯片分析仪（dChip）对表达数据进行归一化。The effect of theFGFR4公司根据基因集富集分析（GSEA；http://www.broad.mit.edu/gsea)，其中将K535和E550细胞的表达数据合并，并与载体对照进行比较(65). FDR小于0.01的基因集被认为是重要的。

体内生长、转移和成像分析。

使用RMS772和NIH 3T3构建物的动物研究使用了8至10周龄的雄性NU/NU-Fox1努裸鼠（Charles River Laboratories）被安置在无病原体的环境中。使用8至10周龄CB17.B6-Prkdc对RMS33和RH30 H11.5细胞进行研究科学情报部Lyst公司背景/Crl（SCID米色）小鼠（Charles River Laboratories），包括那些接受正常或强力霉素饮食的小鼠（Harlan Teklad）。动物护理和实验程序由NIH动物护理和使用委员会批准。使用RMS772或NIH 3T3转导体与106将细胞（0.1毫升）皮下注射到每只小鼠的侧面。每隔一天对小鼠进行监测，并用卡尺测量肿瘤尺寸。肿瘤体积按以下公式计算：（长轴×短轴2) / 2. 对于RH30 H11.5实验，3×106将细胞（在25 ng/ml多西环素中放置48小时后）肌肉注射到SCID米色小鼠中。对于所有RH30 H11.5实验，治疗组在注射前48小时开始Doxycyline饮食，并在实验期间持续这种饮食。肿瘤体积通过荧光素酶光子通量和Xenogen IVIS 100成像系统进行评估。对于FGFR4敲除试验，SCID米色小鼠静脉注射106连续4天每天RH30 H11.5细胞（在25ng/ml多西环素中48小时后）。用对照组或多西环素饮食治疗小鼠，用Xenogen成像检测肺转移。对于其他实验性转移检测和生存分析，106RMS772电池或105如前所述，将表达或不表达荧光素酶的NIH 3T3细胞静脉注射到裸鼠的尾静脉中(5). 如前所述，在尾静脉注射后1小时和24小时，用IVVM检测用CMFDA（Invitrogen）荧光标记的细胞的早期转移(66). 通过尸检观察（第21天）评估肺组织中的肿瘤总数，以进行终点转移分析。为了进行生存分析，每周用Xenogen IVIS 100成像系统对小鼠进行两次成像，直到实验结束时，小鼠出现虚弱和生病。

PD173074治疗的体外反应。

蛋白TK抑制剂PD173074购自CalBiochem，并在DMSO中重新悬浮。如上所述，将RMS772转导的细胞系接种在96-well板中的全培养基和10%血清中过夜。以0μM至20μM的不同浓度添加抑制剂。每隔24小时用Cell Titer Glo（Promega）分别测定细胞数。使用PE-Active Caspase-3凋亡试剂盒（BD Biosciences-Pharmingen）测定Caspase-3活性。

统计。

使用Instat和Prism 4（均来自Graph Pad软件）进行统计分析。连续数据与P（P）成对值t吨测试或Mann-WhitneyU型测试，视情况而定。生存率分析采用Kaplan-Meier曲线比较法，采用log-rank检验和多元Cox比例风险分析。集成电路50这些值是根据等压线图计算的，该等压线比较了RMS772载体控制细胞（无抑制剂）的细胞增殖百分比和使用CompuSyn（ComboSyn Incorporated）的药物剂量。

补充材料

补充数据：
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致谢

作者感谢Bryan Clary的pMSCVzeo逆转录病毒荧光素酶基因构建，感谢Kent Hunter（NCI）和Mauro Tiso（美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学）的有益讨论。这项工作在一定程度上得到了由NCI资助的合作人体组织网络以及NIH内部项目（NHLBI和NCI）的支持。

脚注

利益冲突：J.Khan、A.T.Cheuk和J.G.Taylor VI被提名为美国国立卫生院的发明人，为治疗过度表达癌症的临时专利申请FGFR4公司或窝藏FGFR4公司突变。

本文引文： 临床杂志。投资。 119:3395–3407 (2009). doi:10.1172/JCI39703。

斯蒂芬·J·夸尔曼去世。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会