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神经科学杂志。2009年1月14日；29(2): 529–542.
数字对象标识：10.1523/j欧洲科学.5303-08.2009
预防性维修识别码：下午744209
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院87392
PMID：19144853

多梳组基因Bmi1公司通过抑制调节神经元的抗氧化防御第53页抗氧化活性

瓦西姆Chatoo,1,* 穆罕默德·阿卜杜赫,1,* 乔斯琳·大卫,1 Marie-Pier香槟,1 何塞·费雷拉,2 弗朗西斯·罗德尔,4和吉尔伯特·伯尼尔通讯作者1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

衰老可能由遗传程序和/或分子损伤的累积速率决定。线粒体代谢产生的活性氧（ROS）被认为是分子损伤的主要来源，细胞内ROS水平与抗氧化防御水平之间的失衡是大脑老化的一个特征。然而，衰老如何改变自由基浓度并增加患大多数神经退行性疾病的风险尚不清楚。在这里，我们表明，Polycomb组和癌基因Bmi1在神经元中是必需的，以抑制细胞凋亡和诱导以抗氧化防御降低为特征的早衰样程序。断奶前，Bmi1公司−/−小鼠表现出进步型的眼和脑表型，而Bmi1公司+/−老鼠虽然看起来很正常，但寿命却缩短了。神经元中Bmi1缺乏导致p19增加阿尔夫/p53水平、异常高的ROS浓度和对神经毒性药物的超敏反应。大多数Bmi1公司神经元氧化代谢的功能与抑制第53页促氧化活性，也在生理条件下起作用。在Bmi1公司−/−神经元、p53和共抑制因子在抗氧化基因启动子处积累，与染色质被抑制状态和抗氧化基因下调相关。这些发现提供了一种分子机制来解释Bmi1公司调节自由基浓度并揭示Bmi1公司神经元存活和衰老不足。

关键词：Bmi1、p53、神经细胞死亡、活性氧、抗氧化剂、衰老

介绍

线粒体是细胞有氧呼吸所必需的，但也是细胞内活性氧（ROS）的主要来源，ROS被认为是大多数氧化损伤的原因，随着年龄的增长而累积(Balaban等人，2005年;哈里维尔，2006年;Lin和Beal，2006年). 活性氧和抗氧化剂分子之间的平衡对于确定氧化损伤累积的速率，以及可能的细胞和生物体寿命至关重要(Harman，1956年).

p53基因在机体衰老和细胞氧化代谢中的作用仍然存在很大争议。研究表明，p53的组成活性形式在小鼠中诱导早衰样表型，而p53的显性阴性形式在小鼠的中枢神经系统中表达果蝇属被证明可以延长寿命，这两者都表明第53页活动促进衰老(Tyner等人，2002年;Bauer等人，2005年). 在细胞系中，p53过度表达也可以抑制谷胱甘肽秒-转移酶α1（GSTα1）、NAD（P）H醌氧化还原酶（NQO1）和胱氨酸/谷氨酸转运体（xCT)表达，并干扰Nrf2激活的抗氧化防御(Faraonio等人，2006年). 相反，转基因小鼠表达了额外剂量的第53页和第19页阿尔夫基因降低了肿瘤发病率，延长了中位寿命但不是最长寿命，并显示出对百草枯的耐药性增加(Matheu等人，2007年). P53被提议通过激活Sestrin1和Sestrin2来降低活性氧来调节这些生物效应(Sablina等人，2005年;Matheu等人，2007年). 因此，p53是一种促衰老还是抗衰老基因，其活性是抗氧化还是抗氧化，仍然是一个悬而未决的问题。

Bmi1公司是Polycomb组家族的成员。多梳组蛋白形成大的多元复合物，通过修饰染色质组织沉默特定的靶基因(Valk-Lingbeek等人，2004年).Bmi1公司−/−小鼠出现轴向骨骼缺损，小脑发育和退化受损(Jacobs等人，1999年).Bmi1公司是造血和神经干细胞增殖所必需的(Lessard和Sauvageau，2003年;Molofsky等人，2003年;Park等人，2003年).Bmi1公司-缺乏的干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）由于细胞因子墨水4a/Arf轨迹(Jacobs等人，1999年;Molofsky等人，2003年). 这个墨水4a/Arf基因座编码两种肿瘤抑制蛋白：p16墨水4a和第19页阿尔夫第16页墨水4a是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，通过阻止Cdk4/6与细胞周期蛋白D的结合来阻止其活性，从而导致Rb磷酸化不足和细胞周期阻滞或衰老。第19页阿尔夫结合并抑制E3泛素连接酶小鼠双分钟2（Mdm2）的活性，该酶阻止p53靶向蛋白酶体降解(谢尔，2001;夏普莱斯等人，2004年).

我们发现Bmi1在眼组织和中枢神经系统有丝分裂后神经元中表达。Bmi1公司−/−小鼠表现出进步型的眼和脑表型，而Bmi1公司+/−老鼠的寿命缩短了。Bmi1公司−/−神经元对几种神经毒性物质过敏。它们还表现出异常高的ROS浓度，p19增加阿尔夫/p53水平和抗氧化防御能力的显著降低。遗传和分子分析表明，大多数Bmi1公司对神经元氧化代谢的影响与抑制第53页促氧化活性，也在生理条件下起作用。

材料和方法

老鼠

Bmi1公司−/−小鼠（背景为C57BL/6）是M.van Lohuizen（荷兰阿姆斯特丹荷兰癌症研究所）赠送的礼物。第53页杂合子小鼠（B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J）购自杰克逊实验室。野生型（WT）C57BL/6近交系小鼠（Charles River）在我们的设施中饲养，并按照Maisonneuve-Rosemont医院研究中心动物护理委员会的要求使用。

神经细胞培养。

胚胎第18.5天，通过将皮层机械分离成单细胞悬浮液建立皮层神经元培养。细胞在1.5×10的条件下培养5poly上的单元/孔-我-赖氨酸包被的八周培养载玻片（BD Biosciences）在无血清培养基中，含有Neurobasal-A培养基（Invitrogen）、Glutamax-I培养基（Invitrogen。对于β-淀粉样蛋白转染实验，人类β-淀粉状蛋白（1-42型）（从1953年到2081年；GenBank登录号。NM_201413号)用人视网膜RT-PCR克隆cDNA，并将其插入DUAL-IRESGFP质粒。通过超速离心在氯化铯柱上纯化质粒。根据制造商的说明，使用小鼠神经元细胞核因子试剂盒（Amaxa Biosystems）用质粒DNA对神经元进行核感染。在这些实验中，电穿孔效率为～10%。

小鼠胚胎成纤维细胞。

从第14天（MEFs）或第18天（MELFs）胚胎开始建立培养物，并在含10%FBS和庆大霉素（50μg/ml；Invitrogen）的DMEM中以3%或20%的氧气浓度培养。细胞在建立后的第一代传代后被冷冻，此时被认为是群体倍增零（PD 0）。测定细胞数，计算每一代细胞数的倍增率。MEF（PD 0）隔夜感染编码GFP或GFP的高滴度慢病毒天然气22，p53的一种基因抑制元件[有关所用慢载体的详细信息，请参阅Beauséjour等人（2003）]. 调节慢病毒滴度以感染>90%的细胞，并通过免疫组织化学验证感染率。

免疫标记。

为了固定，将组织在室温下浸泡在4%多聚甲醛（PFA）/3%蔗糖溶液中1 h米磷酸盐缓冲液，pH 7.4。样品在PBS中清洗三次，在PBS/30%蔗糖中冷冻，并在CRYOMATRIX包埋介质（CEM）（Thermo-Shandon）中冷冻。否则，根据标准方案，将组织固定在10%的福尔马林缓冲液中，并嵌入石蜡中。将5至7微米厚的切片安装在Super Frost载玻片（Fisher Scientific）上，并进行免疫荧光或免疫组织化学染色处理。为了进行免疫荧光标记，切片在4°C的加湿室中与一级抗体溶液孵育过夜。在PBS中清洗三次后，在室温下用二级抗体孵育切片1小时。将载玻片安装在含DAPI的安装介质（Vector Laboratories）的盖玻片上。为了进行免疫组织化学标记，根据制造商说明，使用Vectastain ABC试剂盒（Vector）分析福尔马林固定石蜡包埋切片。所用的过氧化物酶底物是Vector VIP（粉红色）（Vector）和DAB（棕色）（Sigma）。在荧光显微镜（Leica DMRE，Leica Microsystems）下进行观察，并使用数码相机（Retiga EX；QIMAGING；OpenLab，3.1.1版软件）拍摄图像。本研究中使用的抗体是羊抗Chx10（Exalpha Biologicals）；兔抗Pax6、兔抗MAP2、鼠抗NeuN和兔抗GFAP（DAKO）；兔抗裂解caspase-3（细胞信号传导）；小鼠抗小鼠Bmi1、小鼠抗人Bmi1和兔抗人Bmic1（美国生物）；兔抗p19阿尔夫（Abcam）；和鼠抗BrdU（Sigma）。所用的二级抗体为FITC-偶联驴抗鼠和罗丹明偶联驴抗兔（Millipore生物科学研究试剂）和AlexaFluor633-偶联驴抗羊（Invitrogen）。

实时RT-PCR。

所有引物均设计为侧翼单个外显子，并在RT中进行PCR检测+和RT−对照提取物。使用TRIzol试剂（Invitrogen）分离总RNA。使用1μg总RNA和MML-V逆转录酶（Invitrogen）进行逆转录（RT）。使用HotStar TAQ聚合酶（Invitrogen）进行PCR扩增。PCR的运行方式如下：94°C 10分钟，然后在94°C下进行30个周期的变性，在57°C下退火，并在Applied Biosystems热循环器中在72°C下延伸。使用铂金SYBRGreen SuperMix（Invitrogen）和实时PCR仪器（Bio-Rad）进行实时PCR。引物组合如下：Bmi1（F）5′-GGAGACCAGCAGAGTATTGCCTATTTG-3′；（R） 5′-CTTACGATGCCCAGCAATG-3′，第16页墨水4a（F） 5′-CAACGCCCCGAACTCTTC-3′；（R） 5′-GCAGAGAGCTGCTACGTGAAC-3′，第19页阿尔夫（F） 5′-ggctagagagatcttgagagagg-3′；（R） 5′-GCCATCATCACCTCCAGG-3′，bcl2l2（F）5′-GACGAGTTGAGCCTCGTT-3′；（R） 5′-ATCAATCCTTGCACTTGCC-3′，Noxa（F）5′-AGTTCGCTCACTCACTG-3′；（R） 5′-GCCGTAAAATTCACTTCTCC-3′，美洲狮（F）5′-CAAGAGAGCAGCATCGACA-3′；（R） 5′-TAGTTGGCTCCCATTTCTTGG-3′，Apaf1（F）5′-TGCTCGCGATAAGGT-3′；（R） 5′-TCCAGAGCTTGGAGAGAA-3′，xCT（F）5′-TGGAGGTCTTGGTCCTTTG-3′；（R） 5′-CGAGGATGTAGCAGTCAAAT-3′，GST-1α（F）5′-CGCACAAAATATCTCT-3′；（R） 5′-CCATGGCTCTTCAACACTT-3′，NQO1（F）5′-TTCTCTGGCCGATCAGT-3′；（R） 5′-GAGTGGGCAATGTAA-3′，Sod1（F）5′-CGGAGAGAGGCATT-3′；（R） 5′-CACCTTTGCCCAAGTCAT-3′，Sod2（F）5′-GGCCAGAGGAGTTACAA-3′；（R） 5′-GTTGATAGCCTCAGAAC-3′，Sestrin1（F）5′-TCGGTGCACTCCTGAAAG-3′；（R） 5′-TACGCGGTATATGCTCAG-3′，Sestrin2（F）5′-CCTCTGTGTTGTGCTGT-3′；（R） 5′-ACGGTTCCCATTCTCCCTT-3′和hprt（F）5′-ACTGTAATGATCAGTCAACGTC-3′；（R） 5′-GGCCTTGTATCCAACATTGG-3′。

蛋白质印迹。

WT和Bmi1公司−/−神经元在裂解缓冲液中均匀化（10m米Tris，10米米氯化钠，3米米氯化镁20.5%NP-40和蛋白酶抑制剂混合物）。在4°C下以10000 rpm离心10分钟后，将含有细胞核的颗粒溶解在再悬浮缓冲液（10 m）中米HEPES，0.4米米氯化钠，1.5米米氯化镁2，1米米EDTA，1米米DTT和蛋白酶抑制剂）。样品在4°C下以55000 rpm超速离心10分钟，并通过免疫沉淀分析含有核提取物的上清液。否则，在缓冲液K（20 m）中制备总蛋白提取物米磷酸钠，pH 7.0，150 m米KCl，30米米焦磷酸钠，0.1%NP-40，5 m米EDTA，10米米氟化钠，0.1米米纳三VO（旁白）4和蛋白酶抑制剂）。使用Bradford试剂定量蛋白质含量。对于免疫沉淀，我们使用羊抗p53多克隆抗体（EMD Biosciences）和鲑鱼精子DNA蛋白a/G珠（Millipore）。用缓冲液K清洗带有结合免疫复合物的珠子，用Laemmli缓冲液热洗脱结合蛋白。洗脱后的蛋白质通过SDS-PAG电泳分离，并转移到硝化纤维印迹膜（Pall）上，该膜暴露于抗乙酰化赖氨酸抗体（细胞信号传递）。对于总蛋白提取物的Western blot，使用的主要抗体为兔抗p53多克隆抗体、抗Nrf2多克隆抗体和抗PGC-1α多克隆抗体（圣克鲁斯生物技术公司）、抗Sirt1多克隆抗体以及抗磷酸氢istone H2A。X单克隆抗体（Millipore）和抗β-肌动蛋白单克隆抗体。用相应的辣根过氧化物酶结合二级抗体（Sigma）处理膜，并使用Immobilon Western（Millipore）进行开发。

染色质免疫沉淀。

使用ChIP测定试剂盒（Millipore）进行染色质免疫沉淀（ChIP）。简而言之，1–1.5×106对固定细胞进行声波剪切染色质，并使用小鼠抗p53（DO-1）、山羊抗N-CoR（Santa Cruz）、兔抗H3Me2Lys9、兔抗-H3Me2Lys27（细胞信号）、兔抗大鼠抗HDAC1、兔抗乙酰基H4和鼠抗IgG（Millipore）抗体进行免疫沉淀。使用引物对x-CT、Sod2和β-主链扩增启动子片段，如下所示：x-CT（−193至+15）；（F） 5′-ATCACATTGGAGCAACCCACA-3′和（R）5′-AGCTGAGCGTGGTGTAATG-3′和Sod2（−537至+23）；站点1和站点2分别为（F1）5′-CAACCTGCGACAGTGGAGTTA-3′，（R1）5′-AGCTGCAAGCTCCACTCT-3′，（F2）5’-AATTTGCACAGGAGC-3′和（R2）5′-GGCCCACACACACATT-3′；β-major（F）5′-CAGTGAGCACAGCAT-3′。

微阵列分析。

使用TRIzol试剂（Invitrogen）制备总RNA，并使用RNeasy MiniElute Cleanup kit（Qiagen）从5 WT和5 WT纯化总RNABmi1公司−/−神经元培养。使用BeadChip小鼠基因组（Illumina）的微阵列分析在魁北克基因组创新中心（加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学）进行。使用FlexArray软件分析数据。

衰老相关β-半乳糖苷酶检测。

如前所述，在pH 6下用组织化学方法检测衰老相关（SA）β-半乳糖苷酶染色(Dimri等人，1995年). 简单地说，将组织切片固定在含有1%甲醛、0.4%戊二醛和0.02%免疫球蛋白的PBS中。三次清洗后，将切片暴露于X-gal溶液中（1 mg/ml X-gal；5 m米K（K）三铁（CN）6; 5米米K（K）4铁（CN）6; 1米米氯化镁2，单位为PBS；pH值6.0）。在显微镜下安装载玻片并进行观察（徕卡DMRE、徕卡微系统），使用数码相机（Retiga EX；QIMAGING；OpenLab 3.1.1版软件）拍摄图像。

细胞活力分析。

对于凋亡，IHC使用兔抗裂解caspase-3抗体（细胞信号）进行激活caspase-2染色。为了定量半胱天冬酶-3非依赖性细胞死亡（即空泡化），IHC使用兔抗MAP2（细胞信号传导）观察神经元的整体形态。根据细胞内液泡密度，根据经验确定液泡化程度。测量结果本质上是定性的（I级，少量小液泡，即接近但不正常；II级，更多液泡：明显异常；III级，充满液泡：接近自溶）。

ROS和脂质过氧化水平。

在均质之前在冰上制备皮层，而在胰蛋白酶处理（TrypLE Express，Invitrogen）后收集培养的胚胎神经元。样品在Potter-Elvehjem均质器中均质5 m米Tris-HCl缓冲液，pH 7.4（默克）。二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA；Sigma）染色法用于活性氧生成的定量(Radák等人，2004年). 将染料添加到匀浆中，以达到最终浓度25μ米使用荧光多孔板读取器（Perseptive Biosystems）在485 nm激发和530 nm发射下监测荧光强度。另一方面，根据硫代巴比妥酸反应底物（TBARS）法，通过测量丙二醛（MDA）浓度来测试匀浆的脂质过氧化(Buege和Aust，1978年). 将匀浆混合到0.6%TBA混合物中并煮沸30分钟。在冰上冷却后，在分光光度计（Beckman）中在535 nm处读取显色反应。数据标准化为每个样本的蛋白质数量。

统计分析。

使用Student的t吨未配对样品的测试。ANOVA和Dunnett检验用于与一个对照组的多次比较。对于非参数数据分析（即白内障发病现象），χ2进行了测试。重要性标准(第页值）设置为如图所示。

结果

Bmi1在成熟CNS的眼组织和有丝分裂后神经元中表达

在啮齿类动物的眼睛中，所有视网膜细胞在出生后第25天（d）都是有丝分裂后的，我们在d25和9个月大的小鼠的视网膜神经元、睫状体上皮（CBE）和晶状体细胞中观察到了强劲的Bmi1表达(图1A类，数据未显示）。使用针对谱系特异性标记Chx10和Pax6的抗体的双重免疫荧光显示，在视网膜中，Bmi1在双极细胞和神经节细胞以及无长突细胞亚群中表达。在小鼠和人类光感受器中也检测到Bmi1(图1A类，数据未显示）。在小鼠大脑中，Bmi1在上皮层和海马的细胞中表达，但在白质中不表达(图1B类，数据未显示）。人类和小鼠的大多数CNS神经元都表达Bmi1(图1B类,C类)而只有小鼠的部分星形胶质细胞有(图1C类). 这些数据表明，Bmi1在小鼠和人类发育和成年CNS的眼组织和几乎所有有丝分裂后神经元中都有强烈表达。

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Bmi1在中枢神经系统有丝分裂后神经元中表达。A类，来自d25 WT的冻结眼截面和Bmi1公司−/−采用免疫荧光法对窝友进行分析。在中未检测到特定的Bmi1标记Bmi1公司−/−样品。B类d25 WT和Bmi1公司−/−同窝婴儿被分析为A类.C类用免疫组织化学方法分析小鼠和人类大脑切片（Bmi1为棕色；MAP2、NeuN和GFAP为粉红色）。比例尺，20μm。onl，外核层；inl，内核层；gcl，神经节细胞层。

Bmi1公司缺乏导致早衰样眼部表型

在我们的研究过程中，我们发现Bmi1公司−/−老鼠(n个＝10，第页=0.001）在C57BL/6遗传背景中，在第20天至第25天出现双侧晶状体白内障(图2A类); 剩余的Bmi1公司−/−小鼠患有单侧白内障(n个= 2). WT的室友在这么小的时候没有发现白内障(n个= 10). 晶状体白内障是公认的衰老生物标志物(意大利-美国白内障研究小组，1991年;Wolf等人，2005年). 在细胞分离分析中，我们还发现Bmi1公司−/−与野生型小鼠相比，小鼠对蛋白酶处理更敏感，野生型小鼠经蛋白酶处理8分钟后，细胞活力≥90%(n个=5），蛋白酶处理6 min 50 s时，细胞存活率≥90%Bmi1公司−/−(n个= 3,第页= 0.04). 这表明Bmi1缺乏损害了CBE细胞外基质的结构完整性。在老年哺乳动物的眼睛中发现细胞外基质改变(Ihanamäki等人，2001年). 为了评估所观察到的白内障是由于发育缺陷还是加速衰老所致，我们测试了眼睛中SAβ-半乳糖苷酶的活性，这是一种细胞衰老的酶生物标志物(Dimri等人，1995年). 我们观察到晶状体中SAβ-半乳糖苷酶活性的强染色，以及Bmi1公司−/−老鼠(图2A类). 神经退行性疾病和中枢神经系统损伤以及人类和小鼠正常衰老过程中均可观察到视网膜和大脑中的反应性胶质增生(Silver和Miller，2004年). 同样，Bmi1公司−/−d25时，小鼠视网膜出现反应性胶质增生(图2B类). p16上调墨水4a和第19页阿尔夫基因与正常组织老化相关体内，我们可以通过分析蛋白质和基因表达在衰老小鼠和人类的中枢神经系统中证实这一点（数据未显示）(Krishnamurthy等人，2004年). 我们从WT和Bmi1公司−/−第25天的室友，第16天评估墨水4a和第19页阿尔夫基因表达。与WT小鼠相比，这两个基因在大多数眼科结构中的表达增加Bmi1公司−/−小鼠，包括视网膜(图2C类). 这些发现表明Bmi1公司缺乏导致早衰样眼部表型。

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百万分之一缺乏导致眼睛出现早期阿金样表型。A类，透镜来自Bmi1公司−/−小鼠出现可见的白内障（顶部面板）。WT和Bmi1公司−/−对同窝小鼠进行SAβ-半乳糖苷酶活性染色（箭头）。B类、3周龄WT的免疫荧光分析和百万分之一−/−用GFAP抗体标记的小鼠视网膜切片。GFAP（红色）在Bmi1公司−/−视网膜。onl，外核层；inl，内核层；gcl，神经节细胞层；C.B.睫状体。比例尺，20μm。C类，通过RT-PCR分析WT中的基因表达，Bmi公司+/−、和Bmi1公司−/−眼睛结构。高功率放射治疗用作内部标准。

Bmi1基因剂量调节寿命

Bmi1公司+/−与之相反，老鼠是可生育的，而且看起来很正常Bmi1公司−/−断奶前出现生长缺陷和致死率超过75%的小鼠(Jacobs等人，1999年). 然而，我们注意到Bmi1公司+/−小白鼠在断奶时患上了晶状体白内障，与之形成鲜明对比的是，小白鼠的窝友在这么小的时候没有白内障。这表明Bmi1基因剂量可能影响细胞衰老和生物体寿命。为了评估Bmi1基因剂量在寿命调节中的潜在作用，我们分析了WT和Bmi1公司+/−C57BL/6基因背景小鼠36个月。一般来说，百万分之一+/−小鼠与其同窝野生型小鼠无法区分。然而，在15个月大时，它们逐渐呈现出与22至24个月大的C57BL/6 WT小鼠相似的特征，例如脱发覆盖了20%以上的体表、晶状体白内障和运动活动减少。Kaplan-Meyer分析显示，一个Bmi1等位基因的缺失使中位寿命和最大寿命降低了约35%(图3A类). 这些数据表明，Bmi1基因剂量可以调节寿命。

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Bmi1公司调节中枢神经系统的寿命和神经元凋亡。A类WT生存曲线的Kaplan-Meyer表示Bmi1公司+/−小鼠（每组19只小鼠）。使用与WT相关的对数秩检验评估统计显著性；第页< 0.0001.B类d25 WT的皮层切片和Bmi1公司−/−标记有p19的同窝伙伴阿尔夫和NeuN抗体。箭头表示神经元表达p19阿尔夫.比例尺，20μm。C类，实时PCR分析Bmi1公司−/−皮质（相对于WT）。结果为平均值±标准偏差(n个=4组大脑**第页< 0.01).D类、WT和Bmi1公司−/−用抗caspase-3抗体标记的脑切片。数据表示为caspase-3的百分比+细胞核超过苏木精染色的细胞核总数。结果为平均值±标准偏差(n个= 5; **第页< 0.01).

损失Bmi1公司导致中枢神经系统神经元p53依赖性凋亡级联反应的激活

与大多数有丝分裂后皮层神经元中的Bmi1表达一致，我们发现第16页墨水4a(174.9 ± 33.7,第页= 0.004),第19页阿尔夫(5.3 ± 0.7,第页=0.002），以及p21蛋白Cip1号机组(1.9 ± 0.2,第页=0.006）在百万分之一−/−老鼠(n个=3）P20时，与WT窝友相比(n个=4），通过定量RT-PCR测定。免疫染色也显示出强大的p19阿尔夫单个皮层神经元（NeuN+)第页，共页Bmi1公司−/−老鼠，但不是WT同窝鼠(图3B类). 第19页阿尔夫通过抑制Mdm2介导的p53降解增加p53活性(Sherr，2006年). p19增加阿尔夫在视网膜和皮层神经元中的表达Bmi1公司−/−因此，预测小鼠会增加p53活性。p53可能促进中枢神经系统老化的一种方式是使神经元更容易凋亡。研究表明，p53在小鼠皮层神经元中的异位表达可诱导细胞凋亡第53页−/−神经元对拓扑异构酶I抑制剂和DNA损伤剂喜树碱诱导的凋亡具有抵抗力(Fortin等人，2001年;Cregan等人，2004年). 我们量化了与大脑皮层细胞凋亡相关的p53靶基因的表达Bmi1公司−/−老鼠。Puma、Noxa、Bcl2l2和Apaf1表达显著增加(图3C类). 此外，对活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（凋亡标记物）进行免疫染色显示，与WT相比，Bmi1公司−/−小鼠大脑皮层和海马的凋亡增加了三到五倍(图3D类).

评估p53在WT和Bmi1公司-空白小鼠，我们使用抗p53抗体对皮层提取物进行Western blot分析。在这些条件下，无法检测到p53。我们认为这可以用稀释效应来解释。为了验证这一点，我们首先分析了e18.5时胚胎皮层中Bmi1的表达，并发现皮层神经元中有稳定的表达(图4A类). 然后，我们从e18.5 WT和Bmi1公司-空窝友，其中在7天后出现的细胞中>95%是有丝分裂后神经元，表达神经元标记物MAP2和Bmi1(图4B类). 正如预期，第16页墨水4a和第19页阿尔夫在培养基中表达水平增加Bmi1公司−/−神经元(图4C类). 我们在培养第7天通过Western blot测定了总p53水平。我们在百万分之一−/−神经元中，p53的总量在正常氧分压下增加了近3.5倍（数据未显示）。为了进一步验证我们的发现，我们培养了WT和Bmi1公司−/−神经元在3%的氧浓度下，减少氧化应激。使用这些条件，我们观察到总p53在Bmi1公司−/−神经元与WT的比较(图4D类). 一种与p53激活相关的翻译后修饰是赖氨酸乙酰化，最近的研究表明，p53乙酰化（而非磷酸化）对其生长抑制和凋亡活动是必不可少的(Vaziri等人，2001年;Tang等人，2008). 我们发现乙酰化形式的p53在Bmi1公司−/−正常氧分压下的神经元(图4D类). 因为Bmi1公司缺乏可能通过p19诱导p53激活阿尔夫-通过增加DNA损伤等独立途径，我们通过Western blot和免疫荧光测定γH2AX水平。γH2AX是一种DNA损伤传感器，也有助于维持基因组完整性，DNA损伤后，γH2AX病灶在细胞核中积聚。WT和Bmi1公司−/−Western blot未检测到神经元γH2AX的表达，免疫荧光也未观察到差异(图4E类，数据未显示）。总之，这些结果表明Bmi1公司导致大脑皮层中p53依赖性凋亡级联激活，并揭示p19阿尔夫培养细胞中p53的表达以及总水平和p53激活状态增加Bmi1公司−/−神经元。

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P53表达水平和激活状态在Bmi1公司−/−神经元。A类,B类，Bmi1在胚胎皮层神经元中表达。A类使用Bmi1抗体通过IHC分析小鼠胚胎（e18.5）切片。Bmi1在上皮层神经元中高度表达。B类，胚胎（e.18.5）神经元培养在聚-我-赖氨酸底物在含有NGF和BDNF的无血清培养基中。7天后，用Bmi1和MAP2抗体标记并进行免疫荧光分析。Bmi1（绿色）与神经元标记物MAP2（红色）（箭头）共存。比例尺，20μm。C类，实时PCR分析表明第16页墨水4a和第19页阿尔夫在培养的细胞中表达水平增加Bmi1公司−/−神经元。与设置为1的WT水平相比，结果为平均值±SD(n个=3-4个独立的细胞培养*第页< 0.05, **第页< 0.01).D类Western blot分析表明，培养基中总p53和乙酰化p53的表达水平增加Bmi1公司−/−神经元。数据计算为p53水平与β-肌动蛋白水平的比值。比率inBmi1公司−/−将样本与设置为1的WT样本中的比率进行比较(n个=3种独立文化；第页=0.02，用于p53表达分析，以及第页=0.001（乙酰化p53表达分析）。E类培养WT的Western blot分析和Bmi1公司−/−使用抗γH2AX抗体的神经元表明，在这些条件下未检测到γH2AX。以照射10Gy的WT神经干细胞作为阳性对照。

抑制P53可以拯救Bmi1公司−/−MEF衰老和增殖表型

之前的工作表明Bmi1公司−/−MEF在第3代增殖不良并过早衰老(Jacobs等人，1999年). 评估p53对肿瘤表型的特异性贡献Bmi1公司−/−细胞，我们抑制了其在Bmi1公司−/−使用逆转录病毒表达p53显性阴性形式的MEF(GSE22标准). 在小鼠中，环境氧气（20%）浓度足以通过积累氧化损伤和诱导p53诱导MEF衰老(Parrinello等人，2003年). 为了测试氧浓度也可能影响Bmi1公司−/−表型，我们在3%和20%氧气浓度下培养MEF(图5A–D). 我们发现p53的失活Bmi1公司−/−在3%或20%的氧张力下，MEFs导致生长能力的逐渐但几乎完全恢复，这表明单独的p53失活足以挽救由百万分之一在MEF中。

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早衰和慢增殖表型Bmi1公司−/−MEF依赖于p53。A类,B类、重量和Bmi1公司−/−MEF在3%或20%的氧气浓度下培养，计算每一代的群体倍增率（PD）。用编码GFP（-GFP）或GSE-22（-GSE）的对照逆转录病毒在PD 0感染细胞，GSE-22是一种使p53失活的显性阴性肽。谷胱甘肽E可挽救小鼠早衰表型Bmi1公司−/−MEF公司。C类,D类，BrdU掺入试验（暴露1 h）表明GSE可以恢复Bmi1公司−/−MEF增殖率接近WT-GFP或WT-GSE MEF。结果为三倍的平均值±SD（数据代表4种独立细胞培养物**第页< 0.01).

Bmi1公司−/−神经元对神经毒素超敏反应具有p53依赖性

为了说明在CNS中观察到的凋亡特征Bmi1公司−/−小鼠对神经元具有细胞自主性和p53依赖性，我们采用神经元培养。两种基因型的神经元均接受1μ米喜树碱及其时间过程分析(Cregan等人，2004年). 我们的数据显示，24小时时，约45%的Bmi1公司−/−神经元从培养物中消失，而WT神经元仅为～12%(图6). 在48小时时发现了类似的趋势(图6). 在治疗24小时后，使用抗caspase-3活化形式的抗体对细胞进行免疫染色，结果显示Bmi1公司−/−样本与WT比较(图6A类). 为了测试p53在这种情况下的作用，我们用一种腺病毒感染神经元，这种腺病毒表达p53的显性阴性形式（DNp53），可以阻断p53四聚体和DNA结合依赖性转录活性(Ferbeyre等人，2002年). WT和Bmi1公司−/−神经元，DNp53拯救喜树碱诱导的细胞凋亡(图6A类)，表明了这一点百万分之一缺乏导致p53依赖性增加对拓扑异构酶I抑制引起的DNA损伤的敏感性。

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Bmi1公司−/−神经元对神经毒素过敏。A类，用喜树碱（CA；1μ米)用MAP2和caspase-3抗体标记。数据表示为MAP2的百分比+/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3+单元格超过总MAP2+细胞。结果为平均值±标准差(n个= 5; *第页< 0.05; **第页<0.01）（左侧面板）。在CA暴露后0、24和48小时计算WT和Bmi1公司−/−神经元生成时间进程图。结果为平均值±标准偏差(n个= 3; **第页与WT相比<0.01）（右侧面板）。B类，神经元用H治疗2O（运行）2(5 μ米)细胞死亡被分析并表示为空泡化MAP2的百分比+单元格超过总MAP2+细胞。结果为平均值±标准偏差(n个= 5). 真空度反映神经元受到影响的程度；I级，轻度受累；二级，中度影响；III级，严重受损（左侧面板）。可行WT和Bmi1公司−/−在不同的H下计算神经元2O（运行）2定义EC的浓度50值。使用三种独立的细胞培养物计算数据。括号内的数值为EC50值（右侧面板）。C类，用质粒电穿孔神经元，以驱动Aβ的表达42，或Aβ42缺少第一个ATG（控制）。两个Aβ42并且对照构建体携带GFP转基因。我们通过计算MAP2双阳性神经元的总数来进行分析+和GFP+不同时间点染色。数据表示为相对于对照质粒转染WT神经元的百分比。结果为平均值±标准偏差(n个= 3; *第页< 0.05; **第页< 0.01).

外源性添加H2O（运行）2主要通过激活MST/FOXO信号通路诱导神经元死亡(Lehtinen等人，2006年). 测试的电阻Bmi1公司−/−神经元对这种氧化剂，我们用5μ米H（H）2O（运行）216小时后，我们分析了细胞数量、caspase-3激活和细胞形态。WT和Bmi1公司−/−神经元(图6B类). 此外，添加DNp53病毒并没有拯救WT或Bmi1公司−/−神经元的生存能力。这些数据表明Bmi1公司缺陷不会改变神经元对H的敏感性2O（运行）2.

Bmi1公司−/−小鼠在中枢神经系统表现出进步型表型，年龄是发生阿尔茨海默病的主要危险因素。基于此，我们假设Bmi1公司−/−神经元对β淀粉样蛋白毒性更敏感。细胞外Aβ42肽在阿尔茨海默病患者大脑的老年斑块中积累，但证据表明细胞内Aβ42也积累在神经元中，Aβ42-p53介导神经元诱导的细胞死亡(Zhang等人，2002年;Ohyagi等人，2005年;LaFerla等人，2007年). 我们电穿孔WT和Bmi1公司−/−质粒驱动Aβ表达的神经元42/GFP或缺乏第一个ATG的突变形式。电穿孔后48、72和96小时的细胞存活时间过程分析表明Bmi1公司−/−神经元对细胞内Aβ的敏感性显著增加42肽毒性高于野生型神经元(图6C类).

百万分之一−/−神经元对线粒体毒素过敏

线粒体是细胞内活性氧的主要来源。测试是否Bmi1公司−/−神经元对这些代谢物更敏感，我们用琥珀酸脱氢酶抑制剂3-硝基丙酸（3-NP）处理神经元。3-NP暴露阻断线粒体呼吸链复合体II，生成线粒体ROS，并导致Nrf2激活II期抗氧化反应基因(Calkins等人，2005年;Shih等人，2005年). 3-NP处理诱导胱天蛋白酶3依赖性（凋亡）和胱天蛋白酶3非依赖性（空泡化）神经元细胞死亡(图7A类).Bmi1公司−/−神经元对这两种形式的3-NP诱导的细胞死亡都比WT神经元敏感(图7A类,B类). DNp53拯救了WT和Bmi1公司−/−来自caspase-3依赖性细胞死亡的神经元，但仅被挽救Bmi1公司−/−caspase-3非依赖性细胞死亡的神经元(图7B类). 这些结果表明Bmi1公司-这种缺陷可能会影响神经元清除线粒体活性氧的能力。

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Bmi1公司−/−神经元对线粒体毒素3-NP过敏。A类,B类，E18.5重量和Bmi1公司−/−神经元暴露于3-NP（2 m米)持续16小时。A类用caspase-3（棕色）和MAP2（粉红色）抗体标记神经元，并进行IHC分析。3-NP暴露后，大多数Bmi1公司−/−神经元出现caspase-3依赖性（箭头）或caspase-3-非依赖性（空泡化；箭头）细胞死亡。不表达MAP2的Caspase-3阳性细胞核代表死亡星形胶质细胞或成纤维细胞的残余。比例尺，20μm。B类，数据表示为MAP2的百分比+/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3+单元格超过总MAP2+细胞（左侧面板）或空泡化MAP2的百分比+细胞超过总MAP2+单元格（右侧面板）。真空度等级如图6B类.结果为平均值±SD(n个= 5; *第页< 0.05; **第页< 0.01).

新的标识Bmi1公司-神经元中的调节分子通路

要识别Bmi1公司-调节的分子途径，可以解释Bmi1公司−/−我们对培养的胚胎皮层神经元进行了DNA显微分析。因为Bmi1是一种转录抑制因子，我们首先关注上调基因。我们的数据显示Bmi1公司−/−神经元，大多数先前确定的Bmi1靶基因上调，包括p16墨水4a，第21页Cip1号机组和Hox基因（Hoxa5、Hoxd8和Hoxa7），以及以前未标记的Bmi1调节同源盒基因（Engraided 1和Tal1）(表1) (Molofsky等人，2003年). 涉及神经发生（树突蛋白、核心蛋白和神经蛋白）、细胞存活（Eda2r、Gria3和α-突触核蛋白）或神经功能（AMPA3、GABA）的新的潜在Bmi1调节基因A类和神经降压素）也得到了鉴定。值得注意的是，我们确定了四个参与抗氧化防御的基因，这些基因在Bmi1公司−/−神经元（Nrf1、GST-1α、Aldh6a1和Sestri1），表明氧化代谢可能受到Bmi1公司不足(表1).

表1。

在培养基中表达受到调控的基因列表Bmi1公司−/−神经元

加入折叠第页价值定量聚合酶链式反应
上调基因
    细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A（Cdkn2a），mRNANM_001040654号5.430.001285.5 ± 12.0
    去蛋白（Dcn），mRNA纳米_0078333.920.01701.8 ± 0.1
    细胞周期素依赖性激酶抑制剂1A（P21）（Cdkn1a），mRNANM_0011110993.480.00111.5 ± 0.1
    同源框A5（Hoxa5），mRNA纳米_0011110993.350.0068第
    神经紧张素（Nts），mRNANM_024435号3.270.0245第
    基因工程1（En1），mRNANM_010133号3.130.0044第
    树突状蛋白（Ddn），mRNANM_0010137413.070.03701.9 ± 0.1
    同源盒D8（Hoxd8），mRNANM_0082762.870.0031第
    T细胞急性淋巴细胞白血病1（Tal1），mRNANM_0115272.830.0001第
    Ectodysplasin受体（Eda2r），mRNANM_1755402.520.03434.1 ± 0.6
    同源盒A7（Hoxa7），mRNA纳米_0104552.420.0089194.3 ± 31.1
    硫酸肝素d日-葡糖戊3-O（运行）-硫转移酶-2（HS3ST2），mRNANM_0010813272.360.0415第
    钾电压门控通道，Shaw相关亚家族，成员4（Kcnc4），mRNANM_1459222.330.0012第
    结晶蛋白，μ（Crym），mRNANM_0166692.310.0004第
    G蛋白信号转导调节因子4（Rgs4），mRNANM_009062号2.310.0175第
    鸟嘌呤脱氨酶（Gda），mRNANM_010266号2.300.0313第
    神经炎蛋白1（Nrn1），mRNANM_1535292.300.0010第
    类化石抗原2（Fosl2），mRNANM_008037号2.300.0035第
    谷氨酸受体，离子性，AMPA3（α3）（Gria3），mRNA纳米_0168862.290.0010第
    突触核蛋白，α（Snca），mRNANM_009221号2.260.01831.9 ± 0.2
    RAS蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子1（Rasgrf1）mRNA纳米_0112452.250.0057第
    环氧水解酶1，微粒体（Ephx1），mRNANM_010145号2.210.0205第
    生长分化因子10（Gdf10），mRNANM_145741号2.170.0119第
    精氨酸琥珀酸合成酶1（Ass1），mRNANM_007494号2.120.0032第
    GABA公司A类受体，β1亚单位（Garb1），mRNANM_0080692.090.0097第
    细胞周期素依赖性激酶抑制剂2B（p15，抑制CDK4）（Cdkn2b），mRNANM_0076702.070.0014第
    接触蛋白相关蛋白4（Cntnap4），mRNANM_1304572.040.0148第
    胰岛素样生长因子2（Igf2），mRNA纳米_0011227372.020.0010第
    甘氨酸受体α2亚单位（Glra2）mRNANM_1834272.020.0162第
下调基因
    核呼吸因子1（Nrf1），mRNANM_010938号0.820.02450.5 ± 0.1
    类似谷胱甘肽秒-转移酶，mRNAXM_001473911号0.800.04110.3 ± 0.1
    Sestrin 1（Sesn1），mRNANM_0010133700.720.00140.6 ± 0.1
    醛脱氢酶家族6，亚家族A1（Aldh6a1），mRNANM_134042号0.720.0389第

nd，未确定。

抗氧化防御能力降低Bmi1公司−/−神经元与p53活性有关

为了测试以下可能性Bmi1公司调节神经元的氧化代谢，我们量化了ROS水平。值得注意的是，我们发现培养基中的ROS浓度增加了两倍Bmi1公司−/−神经元与WT的比较(图8A类). 感染DNp53腺病毒（或补充抗氧化剂N个-乙酰半胱氨酸）有效地将ROS浓度恢复到WT水平，表明ROS在百万分之一−/−神经元依赖于p53活性的增加(图8A类). 因为DNp53也可能干扰其他蛋白质的功能，包括p53家族成员p63和p73(Jacobs等人，2006年)，我们通过使用第53页击倒小鼠。重量，Bmi1公司−/−,第53页−/−、和Bmi1公司−/−/第53页−/−胚胎用于建立皮层神经元培养。1周后，我们量化了ROS水平，发现第53页也可以防止ROS在Bmi1公司−/−神经元(图8B类). 这些结果表明Bmi1公司−/−神经元，p53被稳定或激活，导致ROS浓度升高。

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抗氧化防御能力不足Bmi1公司−/−神经元。A类用荧光染料DCFDA测定ROS浓度。将数据归一化为蛋白质含量，并表示为相对于WT的折叠变化。结果为平均值±标准偏差(n个=3种独立文化*第页< 0.05; **第页< 0.01).B类，ROS水平Bmi1公司−/−和Bmi1公司−/−/第53页−/−神经元。按中所述进行测量A类.C类,D类，通过实时PCR分析基因表达水平Bmi1公司−/−，DNp53感染Bmi1公司−/−、和Bmi1公司−/−/第53页−/−神经元。虚线表示WT神经元中测得的基础基因表达水平（标准化为1）。结果为平均值±标准偏差(n个=5种独立文化*第页< 0.05; **第页< 0.01).E类神经元提取物Sirt1、Nrf2、PGC-1α总形式和乙酰化形式表达的Western blot分析。对于PGC-1α检测，使用抗PGC-1抗体免疫沉淀蛋白质，并使用抗PGCα抗体（总PGCα）或抗乙酰化赖氨酸（K acet.）进行蛋白质印迹。β-肌动蛋白作为加载参考。F类，用WT和百万分之一−/−神经元提取物。使用针对x连续油管,草皮2（2个位点），和β-专业发起人。结果为平均值±标准偏差(n个=3种独立文化*第页与设定为1的WT中的值相比<0.05）。

解决如何Bmi1公司缺乏导致活性氧浓度升高，我们评估了几个抗氧化基因的表达，包括那些以前与第53页WT中GSTα1、NQO1、xCT、Sestrin1、Sestring2、Cu/Zn超氧化物歧化酶（Sod1）和Mn超氧化物岐化酶（Sod2）的活性，Bmi1公司−/−,Bmi1公司−/−/第53页−/−，或DNp53感染Bmi1公司−/−培养神经元(Sablina等人，2005年;Dhar等人，2006年;Faraonio等人，2006年;Matheu等人，2007年). 我们发现，与WT相比，所有测试基因的表达在Bmi1公司−/−而这种减少对II期基因来说最为显著(图8C类). 重要的是，DNp53可以将大多数基因的表达恢复到WT水平Bmi1公司−/−神经元，类似于基因消融第53页(图8C类,D类). 我们也在3%氧气浓度下培养神经元。我们发现降低氧气浓度对Bmi1公司−/−和Bmi1公司−/−/第53页−/−神经元(图9A类，数据未显示）。这些结果表明抗氧化基因异常表达Bmi1公司−/−神经元与第53页活动。

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第53页在培养的神经元和CNS中是前氧化剂。A类WT中的ROS水平和第53页−/−在3%或20%氧气浓度下培养的神经元。数据表示为相对于WT样本的折叠变化。结果为平均值±标准偏差(n个= 3; *第页<0.05）（左侧面板）。抗氧化基因的表达水平第53页−/−通过实时PCR分析神经元。虚线表示WT神经元中测得的基础基因表达水平（标准化为1）。结果为平均值±标准偏差(n个=3种独立文化*第页< 0.05; **第页<0.01）（右侧面板）。B类WT和第53页−/−小鼠胚胎肺成纤维细胞（MELFs）分析如下(A类) (n个= 3; *第页< 0.05; **第页< 0.01).C类，工作模型。我氧化应激时，Nrf2和PGC-1α被招募到抗氧化基因启动子中以诱导转录。ii（ii）在生理条件下，p53可能与Nrf2和PGC-1α在启动子处竞争或不竞争，从而建立平衡。三,Bmi1公司缺乏导致启动子处p53积累增加，并通过共抑制因子的招募导致基因抑制。p53阻遏物复合物可以或不可以取代启动子中的Nrf2和PGC-1α。

为了进一步探讨潜在的分子机制，我们比较了Sirt1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化因子-1α（PGC-1α）和Nrf2在WT和WT中的表达Bmi1公司−/−神经元。PGC-1α和Nrf2是神经元抗氧化防御基因的激活剂，Sirt1可以通过去乙酰化促进PGC-1的活性(Calkins等人，2005年;Shih等人，2005年;St-Pierre等人，2006年;Kim等人，2007年). Sirt1、PGC-1α和Nrf2蛋白水平在Bmi1公司−/−而乙酰化形式的PGC-1α略微减少(图8E类). 通过定量RT-PCR未发现基因表达的显著变化（数据未显示）。因此，PGC-1α、Nrf2和Sirt1的表达水平在Bmi1公司−/−神经元。

为了测试抗氧化基因被p53主动抑制的可能性Bmi1公司−/−神经元，我们在xCT公司和草皮2发起人。与WT相比，我们发现p53在x连续油管和草皮2发起人Bmi1公司−/−神经元，这与受抑制的染色质状态有关，如赖氨酸9和27处的双甲基化组蛋白H3的积累所示(图8F类) (Sparmann和van Lohuizen，2006年). 乙酰化组蛋白H4（活性染色质的标记）未发现变异。我们还评估了p53在染色质这些区域的积聚是否伴随着辅压因子的存在。HDAC3/N-CoR和HDAC1/Sin3a共升压复合物已在各种系统中进行了描述(杰普森和罗森菲尔德，2002年;Karagianni和Wong，2007年). 我们发现HDAC1和N-CoR在x连续油管和草皮2发起人Bmi1公司−/−神经元。在β-珠蛋白发起人，用作内部控制(图8F类). 这些发现表明Bmi1公司由于p53对抗氧化基因表达的抑制作用（参见图9C类).

第53页在生理条件下，是神经元和中枢神经系统中的前氧化剂

在生理条件下，第53页被认为在大多数组织和原代细胞系中具有抗氧化活性，例如在胚胎肺成纤维细胞中(Matheu等人，2007年). 然而，我们发现第53页在里面Bmi1公司−/−神经元可以将活性氧恢复到正常水平，这表明第53页在这种病理学背景下是促氧化剂。探索以下可能性第53页也是生理条件下神经元中的前氧化剂，我们从WT和第53页−/−3%和20%氧气浓度下的胚胎。在电镀后第7天（神经元）或第1代（肺成纤维细胞），我们测量ROS水平并比较基因表达。尤其是，第53页−/−与WT相比，两种氧浓度下神经元的ROS水平均降低(图9A类). 相反，第53页−/−在相同条件下，肺成纤维细胞表现出ROS浓度增加(图9B类). 一致地，第53页神经元缺陷导致x连续油管,消费税α1,NQO1号机组、和塞斯特林1与WT比较时的表达式，但以下情况除外塞斯特林2，表达适度减少(图9A类). 相反，消费税α1,NQO1号机组、和塞斯特林2表达在第53页−/−肺成纤维细胞，而塞斯特林1表达增加(图9B类). 通过改变神经元中的氧浓度，观察到ROS水平几乎没有变化，但MELFs中没有变化(图9A类,B类). 验证这些观察结果体内，我们比较了WT和第53页−/−2个月大的室友。脂质过氧化是细胞膜累积氧化损伤的结果，因此反映了活性氧水平的不平衡。老年人分析第53页-由于这些动物体内肿瘤的快速发展，不可能有零小鼠。当与WT相比时，我们发现肝和肺的脂质过氧化水平要高得多第53页−/−小鼠和大脑中显著降低（42%）(表2). 此外，实时PCR分析显示抗氧化基因在大脑皮层的表达水平显著高于第53页-与WT同窝鼠相比，无鼠(表2). 因此，与建议的一般抗氧化功能形成鲜明对比的是第53页(Matheu等人，2007年)，我们的结果表明第53页在病理和生理条件下，是哺乳动物神经元和中枢神经系统中的前氧化剂（参见图9C类).

表2。

第53页是中枢神经系统中的抗氧化剂

组织
肝脏肺Cortex公司
MDA加合物一1.58 ± 0.13*1.91 ± 0.11*0.58 ± 0.04*
基因表达水平b条
    x连续油管0.24 ± 0.01*0.35±0.04*1.65±0.11*
    消费税1.70 ± 0.19*0.78 ± 0.09*1.78 ± 0.03*
    核质量办公室0.94 ± 0.030.43 ± 0.08*1.37 ± 0.07*
    Sesn1号机组0.85±0.03*0.31 ± 0.06*1.53 ± 0.17*
    Sesn2号机组0.24 ± 0.01*0.27 ± 0.04*1.48 ± 0.04*
    草皮10.90 ± 0.030.87 ± 0.03*1.42 ± 0.04*
    草皮20.78 ± 0.03*0.61 ± 0.03*1.00 ± 0.09

一在p53中检测脂质过氧化−/−肝、肺和脑匀浆中MDA的浓度。将数据归一化为样品蛋白质含量，并表示为相对于设置为1的WT样品的折叠变化。结果为平均值±标准偏差(n个= 3–5; *第页< 0.05).

b条实时PCR分析p53中抗氧化基因表达水平−/−肝、肺和脑。数据表示为相对于设置为1的WT样本的折叠变化。结果为平均值±标准偏差(n个= 3–4; *第页< 0.05).

讨论

Bmi1癌基因因其在维持细胞增殖中的作用而被广泛研究(Sparmann和van Lohuizen，2006年). 然而，Bmi1也广泛表达于有丝分裂后的眼组织和成人中枢神经系统的神经元中（本研究）。在这里，我们揭示了百万分之一通过抑制第53页促凋亡和促氧化活性。这些发现对理解正常的中枢神经系统老化和与年龄相关的神经退行性疾病具有重要意义。

Bmi1和p19阿尔夫/p53途径

我们已经证明了这一点体内,第19页阿尔夫RNA和蛋白质表达水平在Bmi1公司−/−神经元，下游p53凋亡级联被激活。体外,百万分之一−/−神经元增加了总的和激活的p53蛋白水平，对喜树碱诱导的凋亡非常敏感，可以被DNp53病毒拯救。这些数据表明，p53介导了大多数细胞凋亡表型Bmi1公司−/−神经元。我们还发现Bmi1公司−/−神经元也表现出异常高的自由基浓度，对线粒体毒素过敏，这意味着Bmi1公司线粒体氧化代谢的调节。基因失活第53页揭示了氧化代谢的放松Bmi1公司−/−神经元大部分（如果不是全部）由第53页观察到抗氧化基因水平Bmi1公司−/−/第53页−/−神经元（xCT和GST具有超生理水平）与在第53页−/−神经元（比较图8D类具有图9A类). 然而，总活性氧水平在Bmi1公司−/−/第53页−/−和第53页−/−神经元（比较图8B类具有图9A类). 这些观察表明，大多数但可能不是全部Bmi1公司功能通过抑制第53页活动。这些附加功能可由p19解释阿尔夫-通过Mdm2对p63和p73蛋白变体的介导作用，这些蛋白变体也在中枢神经系统神经元中表达(Jacobs等人，2006年).

P53与中枢神经系统老化

突变积累后，p53促进癌前组织的凋亡或衰老，以防止致癌(Sherr，2001年;Sharpless等人，2004年). p53在分裂细胞中促进线粒体介导的细胞死亡的一种方法是通过抑制抗氧化基因来增加ROS浓度(Dhar等人，2006年;Faraonio等人，2006年). 自相矛盾的是，有人提出p53通过对Sestrin（s）的积极作用在生理条件下刺激各种器官的抗氧化防御，从而通过降低细胞内ROS水平保护基因组免受突变的累积(Sablina等人，2005年;Matheu等人，2007年). 在开发过程中，第53页具有消除多余神经元和神经元祖细胞的功能(Jacobs等人，2006年). 后来，第53页是防止祖细胞/干细胞、少突胶质细胞或星形胶质细胞肿瘤发展所必需的。然而，成年神经元显然不需要p53活性，因为成年神经元是有丝分裂后的神经元，不易发生肿瘤。相反，所有证据都表明神经元中的p53活性是病理性的(Zhang等人，2002年;Bae等人，2005年;Ohyagi等人，2005年;奈尔，2006;Nair等人，2006年;Kieran等人，2007年).

我们发现，与其他器官和培养的肺成纤维细胞相比，第53页是脑组织和培养神经元中的前氧化剂。我们的数据表明第53页与其他细胞类型形成鲜明对比的是，它在神经元中始终活跃到促氧化水平。值得注意的是，p53的显性负性形式在果蝇属结果表明，p53基因在昆虫神经元中的有害功能是保守的(Bauer等人，2005年). 这些观察结果可能解释为什么转基因小鼠具有额外的第53页和第19页阿尔夫尽管可以避免肿瘤负担，但最大寿命不会延长(Matheu等人，2007年). 在这些动物中，增加p53基因剂量预计会增加CNS中的氧化损伤累积，这不太可能促进寿命延长。

Bmi1公司衰老和神经退行性疾病

的功能Bmi1公司抗氧化防御系统似乎只与前列腺素C-1α.第1页α−/−小鼠大脑中Sod1、Sod2和过氧化氢酶基因的基本表达水平仅略有下降，但前列腺素C-1α−/−当受到氧化剂的挑战时，细胞激活抗氧化基因表达的效率很低(St-Pierre等人，2006年). 相反，Bmi1公司−/−神经元对大多数抗氧化基因的基础表达水平异常低，但仍能通过激活II期基因表达对3-NP治疗作出反应，尽管效率较低（数据未显示）。这些观察结果表明Bmi1公司缺乏导致抗氧化基因的构成性抑制（模型图9)，而前列腺素C-1α缺乏导致抗氧化基因在急性氧化应激时激活缺陷。与…对比Bmi1公司−/−神经元，前列腺素C-1α−/−细胞对H的作用也更敏感2O（运行）2重要的是，过氧化氢酶可以清除H2O（运行）2，主要存在于非线粒体细胞质和过氧化物酶体中，因此可能对外源性H具有更强的保护作用2O（运行）2而不是线粒体活性氧。过氧化氢酶是我们测试的唯一一种抗氧化基因，在Bmi1公司−/−神经元。

衰老的自由基理论认为线粒体活性氧产生的细胞和DNA损伤是细胞和生物体衰老的原因(哈曼，1956年)，我们在这里显示了百万分之一导致抗氧化防御能力显著降低，同时ROS浓度也随之增加。此外，Bmi1公司−/−与WT神经元相比，神经元对神经毒素药物过敏，在无毒条件下自发凋亡水平较高。总之，这些结果提供了一个最合理的机制来解释为什么Bmi1公司-缺陷小鼠和神经元过早老化。在正常衰老的背景下，我们的发现带来了减少BMI1公司人脑神经元的表达可能有助于与年龄相关的抗氧化防御能力的降低，导致氧化损伤的累积和神经元功能障碍。的活动Bmi1公司抗线粒体活性氧也可能与年龄相关的神经退行性疾病有关，其中细胞死亡显然是由氧化损伤介导的，例如帕金森病(托马斯和比尔，2007年).百万分之一对抗p53介导的神经元凋亡的活性可能与阿尔茨海默氏症和亨廷顿舞蹈症有关。阿尔茨海默病大脑中P53表达增加，其转录被细胞内Aβ激活42p53抑制可阻止Aβ42-诱导神经元细胞死亡(Zhang等人，2002年;Ohyagi等人，2005年). 我们在这里发现Bmi1公司缺陷使神经元对细胞内Aβ诱导的凋亡敏感42肽。由于该系统远离生理条件，需要做更多的工作来评估BMI1在阿尔茨海默病中的可能影响。在亨廷顿病大脑中，复合物II活性降低，3-NP给药导致啮齿动物和灵长类动物纹状体运动障碍，类似亨廷顿氏病(Lin和Beal，2006年). 值得注意的是，p53被突变的亨廷顿蛋白激活(Bae等人，2005年). 我们发现了Bmi1公司缺乏能显著增加神经元对3-NP毒性的易感性，抑制p53可以挽救这种表型。我们的研究揭示了Bmi1公司有丝分裂后的神经元需要阻断促凋亡和促氧化分子老化程序的诱导，主要由第53页.

脚注

这项工作得到了加拿大卫生研究院、加拿大自然科学和工程研究委员会以及Turmel家族黄斑变性研究基金会的资助。F.R.得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Program）向朱迪思·坎皮西（Judith Campisi）提供的项目拨款AG017242的支持。G.B.由魁北克省圣雷切基金会支持。W.C.是蒙特利尔大学眼科学研究基金会的学者。我们感谢M.van Lohuizen提供的Bmi1+/−老鼠，G.Ferbeyre代表DNp53病毒，E.Drobetsky，E.Milot和L.Levin代表批判性阅读这份手稿。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会