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生物化学杂志。2009年7月24日；284(30): 20329–20339.
2009年5月22日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M109.010264
预防性维修识别码：PMC2740458型
PMID：19465477

TDP-43本质上易于聚集，肌萎缩侧索硬化症相关突变加速聚集并增加毒性*

布赖恩·S·约翰逊，‡ 大卫·斯奈德，§ 乔纳森·J·李，‡ J.迈克尔·麦卡弗里， 詹姆斯·肖特，§,1和亚伦·D·吉特勒‡,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

含有TDP-43及其C末端片段的非淀粉样、泛素化细胞质内含物是肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理特征，ALS是一种致命的运动神经元疾病，以及具有泛素阳性内含物的额颞叶变性（FTLD-U）。重要的是，TDP-43突变与散发性和非SOD1家族性ALS有关。然而，TDP-43并不是疾病相关内含物中唯一的蛋白质，TDP-43是错误折叠还是仅仅被其他聚集成分隔离尚不清楚。在此，我们报告称，在缺乏其他成分的情况下，TDP-43自发形成聚集体，与ALS FTLD-U患者退化神经元中的TDP-43沉积物具有显著的超微结构相似性。TDP-43的C末端结构域对自发聚集至关重要。该域中的几个ALS-连锁TDP-43突变（Q331K、M337V、Q343R、N345K、R361S和N390D）增加了TDP-43聚集体的数量并促进毒性体内重要的是，促进毒性的突变体内加速纯TDP-43的聚集在体外因此，TDP-43本质上是聚集型的，其毒性错误折叠轨迹的倾向因特定的ALS连锁突变而加剧。

TDP-43是一种广泛表达且高度保守的后生动物核蛋白(1)，包含两个RNA识别基序（RRM）三以及其C末端结构域中富含甘氨酸的区域（参见图1一个). TDP-43的功能尚不确定，但它可能在前mRNA剪接和转录抑制中发挥重要作用(2，三). 在ALS和FTLD-U中，TDP-43从细胞核中耗竭并积聚在泛素化的细胞质内含物中(4). TDP-43病理学的这些和其他情况，包括某些形式的阿尔茨海默病和帕金森病，现在被称为TDP-43蛋白病(5). 重要的是，TDP-43基因突变(TARDBP公司)与散发性和非SOD1家族性ALS有关，这意味着TDP-43异常可能是疾病的原因之一(6——11). 然而，尽管这种病理学和遗传学的综合，TDP-43可能导致疾病的机制仍然未知且有争议(12，13).

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TDP-43和TDP-43片段的聚集在体外. 一个TDP-43的结构域结构图显示了RNA识别基序（RRM1和RRM2）和富含甘氨酸的C末端结构域。B类、TDP-43或指示的TDP-43片段（1–275或188–414）（3μ米)在25°C下孵育，搅拌0–120分钟。聚集程度由浊度确定。数值代表平均值±S.D(n个= 3).C类，WT TDP-43的聚合，如B类通过沉降分析进行评估。数值代表平均值±S.D(n个= 3).D类、His-TDP-43或Sup35-NM（5μ米)在25°C下搅拌培养0 min（可溶性蛋白）或2 h（聚集蛋白）。然后处理刚果红粘合剂的反应。数值代表平均值±S.D(n个= 3).E类、TDP-43或Sup35-NM（5μ米)在25°C下搅拌孵育0分钟（可溶性蛋白）或2小时（聚集蛋白）。然后处理反应以获得硫黄素-T荧光。数值代表平均值±S.D(n个= 3).

一个尚未解决的关键问题是，TDP-43是天生的聚集蛋白，还是TDP-43被其他聚集成分隔离，仅仅是疾病的标志物(13——16). 事实上，在FTLD-U患者的Sarkosyl不可溶组分中发现除TDP-43外的多种蛋白质(14). 此外，去卷积成像显示，TDP-43似乎被排除在ALS中泛素化内含物的某些区域之外(15).

在这里，我们在没有其他成分的情况下评估TDP-43聚合。然后，我们定义了TDP-43的哪些结构域对这一过程很重要，并确定了几个与ALS相关的TDP-43突变对TDP-43错误折叠和毒性的直接影响。我们的发现揭示了TDP-43和ALS连接的TDP-43突变体的几个内在特性，这些特性可能在异常的TDP-43蛋白稳定中发挥重要作用(17)这有助于ALS、FTLD-U和其他TDP-43蛋白病的发病机制。

实验程序

酵母菌株、培养基和质粒

酵母细胞生长在富培养基（YPD；酵母/蛋白胨/葡萄糖）或缺乏尿嘧啶且含有2%葡萄糖（SD/-Ura）、棉籽糖（SRaf/-Ura。

从Invitrogen获得了TDP-43网关入口克隆，在载体pDONR221中包含全长人类TDP-43。为了生成C末端YFP标记的TDP-43结构体，我们使用PCR扩增TDP-43，无需终止密码子，并结合SpeI和HindIII限制位点以及Kozak共识序列。将所得PCR产物克隆到SpeI/HindIII-digested pRS416GAL-YFP中，以生成CEN TDP-43YFP融合构建物。使用QuikChange®定点突变系统（Stratagene），以pRS416GAL-TDP-43-YFP为模板，生成每个ALS-连接的TDP-43突变体结构。所有结构均通过DNA测序进行验证。CEN质粒构建物(例如pRS416GAL-TDP-43-YFP）转化为BY4741(马塔·希斯勒夫会见了15乌拉).

酵母转化和斑点检测

酵母程序按照标准方案进行。我们使用聚乙二醇/醋酸锂方法将酵母转化为质粒DNA。对于斑点分析，酵母细胞在含有SRaf/-Ura的液体培养基中在30°C下培养过夜，直到达到对数或中长期。然后对培养物进行标准化一个600纳米将其连续稀释并用Frogger（V&P Scientific）斑点于含有葡萄糖（SD/-Ura）或缺乏尿嘧啶的半乳糖（SGal/-Ura）的合成固体培养基上，在30°C下培养2-3天。

酵母存活试验

如前所述，我们进行了存活率分析(18). 简言之，在2%半乳糖中诱导空载体、野生型（WT）或突变型TDP-43后，在指定的时间点通过在一个600纳米将这些细胞按1:1000稀释，并将300μl这些细胞镀在含有2%葡萄糖的合成培养基上（抑制TDP-43表达）。将平板在30°C下培养2天。然后测定菌落形成单位。

免疫印迹法

酵母裂解物经过SDS-PAGE（4-12%梯度，Invitrogen）并转移到聚偏二氟乙烯膜（Invitrogen）。在室温下用5%脱脂奶粉在PBS中封闭膜1小时或在4°C下过夜。在室温下进行一级抗体培养1h。用PBS洗涤后，在室温下用辣根过氧化物酶偶联二级抗体培养膜1h，然后用PBS加0.1%吐温20（PBST）洗涤。用Immobilon Western HRP化学发光底物（Millipore）检测蛋白质。抗GFP单克隆抗体（Roche Applied Science）以1:10000使用，磷酸甘油酸激酶1抗体（Invitrogen）以1:500使用。以1:5000的比例使用HRP结合的抗小鼠二级抗体。

免疫细胞化学

在免疫细胞化学实验中，表达未标记TDP-43结构的酵母细胞被培养到最终一个6000.2–0.8，然后用3.7%甲醛固定1 h。通过2000 rpm离心5 min收集细胞，并在PBS中清洗。细胞稀释并清洗一次，然后在1 ml溶液A（0.5 m米氯化镁2, 1.2米山梨醇，40米米K（K）三人事军官4pH 6.5）。将细胞与10μl 2-巯基乙醇和25μl 10 mg/ml解构酶在37°C下孵育15分钟。以4000 rpm的转速收集球形细胞5 min，用溶液A洗涤两次，用PBS洗涤一次，然后在PBS+BSA（1×PBS，1 mg/ml牛血清白蛋白）中重新悬浮。将球形体按1:5稀释，并在用1 mg/ml聚赖氨酸处理的特氟隆覆盖的载玻片上培养。在室温下用PBS+BSA封堵油井30分钟。使用1:200抗TDP-43小鼠多克隆抗体（Novus）在室温下进行一级抗体孵育1.5小时。用PBS+BSA清洗后，在室温下用1:2000 Alexa 488 nm驴抗鼠多克隆抗体（Invitrogen）孵育孔1.5 h。在用PBS+BSA清洗后，在荧光显微镜下进行可视化之前，用含有1.5μg/ml 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（Vector Labs）的Vectashide固定培养基孵育微孔5分钟。

沉降分析

我们按照之前的研究进行了沉积分析(19). 表达YFP标记的TDP-43结构体或CFP标记的聚谷氨酰胺扩增亨廷顿结构体的细胞在1×天然酵母裂解缓冲液（30 m）中裂解4或6 h米HEPES，pH 8.0，150 m米氯化钠、1%甘油、1 m米二硫苏糖醇，0.5%Triton X-100，1 m米苯甲基磺酰氟，50米米 N个-乙基马来酰亚胺，1×蛋白酶抑制剂混合物（罗氏应用科学公司）。细胞在4°C的搅拌棒中破碎3分钟。通过6000×离心去除细胞碎片克在4°C下保持5分钟。将酵母裂解物分离为总馏分和颗粒馏分。在颗粒部分以16000×克或85000 rpm，在TLA 100.1转子中，在4°C下保持30分钟，回收上清液并指定为可溶部分。通过在50μl 1×SDS样品缓冲液中煮沸，重新溶解颗粒部分。在等体积的4×SDS样品缓冲液中煮沸总馏分和可溶性馏分。20%的颗粒组分和10%的可溶性和总组分通过SDS-PAGE进行分离，然后用抗GFP抗体进行免疫印迹。

荧光显微镜

对于荧光显微镜实验，酵母菌株的单菌落分离物在30°C的SRaf/-Ura培养基中生长到中对数期。分离培养物并将其重新悬浮在相同体积的SGal/-Ura中，以诱导TDP-43-YFP结构的表达。用半乳糖诱导培养6 h，然后用70%乙醇固定，并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚在Vectashield贴装介质（Vector Laboratories）中染色，以观察细胞核。使用蔡司Axioplan直立显微镜和蔡司ExioCam HRm高分辨率单色电荷耦合设备摄像头获取图像。使用AxioVision 4.5软件中的最近邻算法对图像进行去模糊处理，并选择具有代表性的细胞作为图形。

TDP-43聚合的量化

为了评估野生型和突变型TDP-43之间聚集的差异，在将所有酵母培养物归一化为一个600纳米在半乳糖诱导前=0.2。诱导6小时后，在进行检查之前，观察者对样本的身份一无所知。使用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚过滤器随机选择多个细胞区域，以防止对聚集量增加的细胞群体产生任何偏见，并获得任何给定区域中的细胞总数。对于每个重复，每个样品至少计数200个细胞。只有在YFP通道下具有>3个病灶的细胞才被认为是具有聚集性TDP-43的细胞。

TDP-43净化

TDP-43和各种错义（G294A、M337V或Q331K）或缺失突变体（1–275或188–414）从大肠杆菌作为His-tagged或GST-tagged蛋白质。对于His标记的制剂，TDP-43被克隆到pCOLD I（Takara）中，并在大肠杆菌BL21（RIL）。细胞在40米的冰上通过超声波溶解米Hepes-KOH，pH 7.4500 m米KCl，20米米氯化镁2，10%甘油，20米米咪唑，2米米β-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂（Complete，EDTA free，Roche Applied Science）。蛋白质在镍-硝基三乙酸柱（Qiagen）上纯化。对于GST标记的制剂，TDP-43被克隆到GV13中，以产生可裂解的GST-TDP-43融合蛋白GST-TEV-TDP-43，并在大肠杆菌BL21（DE3）RIL或Rosetta2（Novagen）。根据制造商的说明，通过谷胱甘肽-脑葡萄糖柱（Amersham Biosciences）纯化蛋白质。然后使用TEV蛋白酶（Invitrogen）通过切割去除GST，并使用镍-硝基三乙酸和谷胱甘肽-脑葡萄糖去除蛋白酶和GST。经SDS-PAGE评估，His-tagged和untagged TDP-43蛋白的纯度为～95%。His-tagged和untagged蛋白质以相同的动力学聚集，并形成具有非常相似形态的聚集体。

纯化后，蛋白质被缓冲液交换成组装缓冲液（AB）：40 m米HEPES-KOH pH 7.4，150 m米KCl，20米米氯化镁2，1米米二硫苏糖醇。蛋白质通过0.22-μm过滤器过滤。过滤后，通过Bradford分析（Bio-Rad）测定蛋白质浓度，并立即将蛋白质用于聚集反应。

对于尺寸排除色谱，Superdex-200 10/300 GL分析凝胶过滤柱（Amersham Biosciences）用甲状腺球蛋白（669 kDa）、铁蛋白（440 kDa”）、牛血清白蛋白（67 kDa“）、β-乳球蛋白（35 kDa。TDP-43在25°C的AB中搅拌5分钟，然后在16100×克将蛋白质加载到校准的Superdex-200 10/300 GL柱上5分钟，在AB中平衡并以0.4 ml/min的速度洗脱。聚合低聚部分并进行电子显微镜处理（见下文）。

TDP-43体外聚集

立即使用过滤、纯化的TDP-43进行聚集分析。TDP-43或错义突变TDP-43或者缺失突变（3μ米)在25°C的AB中培养0–120分钟，并在Eppendorf热混合器中以1400 rpm的转速搅拌。浊度用于通过测量395nm处的吸光度来评估聚集。为了进行沉降分析，将反应物以16100×克在25°C下保持30分钟。然后用SDS-PAGE对上清液和颗粒组分进行分离，并用考马斯亮蓝染色，通过密度测定法测定各组分中的含量，并与已知量的TDP-43进行比较。或者，如前所述，处理刚果红结合或硫黄素-T荧光反应(20).

电子显微镜（EM）在体外聚集反应，TDP-43蛋白质样品（10μl of a 3μ米溶液）吸附在发光的300-mesh Formvar/碳涂层铜格栅上（电子显微镜科学），并用2%（w/v）水性乙酸铀酰进行染色。去除多余的液体，并让格栅风干。使用JEOL 1010透射电子显微镜观察样品。使用AMT采集软件用滨松数码相机拍摄图像。

酵母细胞的电子显微镜

如前所述执行常规EM(21). 简单地说，细胞固定在0.1中含有3%戊二醛的溶液中米碳酸钠，pH 7.4，5 m米氯化钙2，5米米氯化镁2和2.5%蔗糖在25°C下搅拌1h；球状成形；包埋在2%超低温琼脂糖中（用水配制）；冷却；然后切成小块（～1 mm三). 然后将细胞固定在1%OsO中4/0.1中含1%亚铁氰化钾米碳酸钙/5 m米氯化钙2pH 7.4，在室温下保持30分钟。用ddH彻底清洗砌块4倍2O、 总共10分钟；室温下转移至1%硫代碳酰肼中3min；用ddH清洗2O（4×，每个1分钟）；并转移到1%OsO4/1%亚铁氰化钾在pH 7.4的二甲氨基甲酸盐缓冲液中，在室温下再保持3分钟。然后用ddH清洗细胞4倍2O（总共15分钟）；整体在Kellenberger的醋酸铀酰中染色2小时至过夜；通过分级系列乙醇脱水；并随后嵌入Spurr树脂中。切片在Reichert Ultracut T超微切片机上切割；用凯伦伯格醋酸铀酰和柠檬酸铅进行后染色；并在80 kV的飞利浦TEM 420上进行观察。图像由软成像系统Megaview III数码相机记录，图形在Adobe Photoshop 10.0中进行组装。

结果

TDP-43具有内在聚集倾向

为了测试TDP-43是否天生具有聚集性，在自然条件下将细菌表达的重组TDP-43纯化为可溶性蛋白。在25°C下搅拌培养后，TDP-43在约5–10分钟的滞后阶段后迅速聚集，这由浊度增加决定(图1B类)以及离心后进入颗粒部分的量(图1C类). 一些控制蛋白，包括BSA、大豆胰蛋白酶抑制剂、肌酸激酶和GFP，在相同条件下没有聚集。30分钟后，TDP-43不再聚合(图1，B类和C类). 如果我们在培养期间忽略搅拌，TDP-43聚集的时间段将延长到几个小时（数据未显示）。因此，TDP-43是一种固有的聚集蛋白。

很可能复杂的细胞蛋白质平衡机制(17，22)，而不是在这里重建，防止TDP-43快速聚集体内然而，与年龄相关的蛋白质组控制下降以及环境因素可能使TDP-43在疾病中聚集。不管疾病中TDP-43聚集的触发因素是什么，在体外在探索帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（Alzheimer disease）聚集事件的基本机制方面，与我们在这里报告的类似的分析是非常有力的工具(23——25).

与酵母朊蛋白Sup35的朊蛋白结构域Sup35-NM形成的聚集体相比，纯TDP-43形成的聚合体不与淀粉样双不可知染料刚果红和硫黄素T反应(26) (图1，D类和E类). 因此，纯TDP-43聚集体可能是非淀粉样蛋白，就像ALS和FTLD-U患者中TDP-43的聚集体一样(27). 在ALS和FTLD-U中，TDP-43是泛素化、磷酸化和蛋白水解的(4). 这些修饰对TDP-43致病性的相对程度和贡献尚待确定。我们的在体外聚集分析将为未来旨在确定TDP-43翻译后修饰和处理对聚集的影响的研究奠定基础。

TDP-43的C末端结构域对聚集很重要

接下来，我们确定TDP-43的哪些区域对聚集至关重要在体外我们纯化了TDP-43片段：1–275，包含N末端结构域、RRM1和RRM2，188–414，包含RRM2和C末端结构域(图1一个). 1–275是可溶的，而188–414是能够产生毒性的最小片段和TDP-43蛋白病酵母模型中的聚集(28). 重要的是，纯1–275没有聚集，而188–414聚集的动力学与全长TDP-43相似(图1B类). 因此，C末端结构域在TDP-43聚集中起着重要作用，这一点非常引人注目，因为最近报道的25个以上的ALS-连锁TDP-43突变，除一个外，其余都在这个结构域内(图2一个) (12). 此外，ALS和FTLD-U中积累了类似的聚集C末端片段(4). 针对这一区域的治疗策略可能有效，我们将其定义为负责推动聚集。

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TDP-43和ALS连锁突变体的聚集体内. 一个，示意图显示疾病相关TDP-43突变。与WT相比，突变的色码表示聚集(红色=骨料比WT多得多，绿色=骨料多于WT，以及黑色=与WT一样多的骨料）。B类，用抗GFP抗体通过免疫印迹测定单独的YFP、WT和突变体TDP-43-YFP的表达水平。磷酸甘油激酶1(第1页)用作加载控件。C类4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色的代表性荧光显微镜图像(蓝色表示细胞核的位置）WT或突变TDP-43-YFP(绿色).D类TDP-43突变对聚集的影响体内通过计数含有>3个病灶的细胞数量进行量化。数值代表平均值±S.E(n个≥3，每个样品至少200个细胞）。仅表达YFP的细胞不含病灶（数据未显示）。E类，未标记的TDP-43也会在酵母细胞中形成聚集体。用抗TDP-43抗体的免疫细胞化学方法观察TDP-43的表达。箭头指向细胞质TDP-43内含物。用空载体转化的细胞作为抗体特异性的对照。如果沉淀分析证明TDP-43在酵母细胞中形成不溶性聚集体。与之前的研究一样，对表达YFP、htt25QCFP、htt103Q-CFP或WT和突变TDP-43-YFP的酵母细胞进行6小时的裂解和处理，以进行沉降分析(19). 通过离心分离可溶和不可溶部分。20%的颗粒组分和10%的可溶性和总组分通过SDS-PAGE进行分离，然后用抗GFP抗体进行免疫印迹。YFP是完全可溶的，WT和TDP-43分为可溶和不可溶部分，类似于亨廷顿蛋白（htt25Q（大部分可溶）或htt103Q（大部分不可溶）的聚集蛋白片段。这个箭头表示凝胶顶部。G公司，沉淀分析按如果除了WT和Q331K TDP-43构建物诱导4小时外，此时，不溶性颗粒部分中Q331K的相对含量大于WT TDP-43。T型，总计；S公司，可溶；P（P），颗粒。显示了三个独立实验的代表性图像。H（H）WT和Q331K TDP-43聚合的时间历程分析表明，Q331K在早期时间点形成的离散聚合比WT更多。

ALS-连接的TDP-43突变体在酵母中形成多重聚集

在确定TDP-43本质上是聚集蛋白后，我们接下来询问ALS相关的TDP-43突变是否影响聚集体内我们开发了一种酵母TDP-43蛋白病模型，以研究TDP-43聚集和毒性的机制(28). 该模型概括了人类疾病的几个重要特征。在酵母中，TDP-43最初定位于细胞核，但最终形成细胞质内含物(28)，模拟人类神经元中TDP-43的病理生物学(4). 重要的是，高水平表达TDP-43对酵母有毒(28)因此，可能在一个简单的细胞中模拟神经退行性变的特征。我们测试了最近报道的七种ALS连锁突变的影响(6——9，11) (图2一个)在该系统中的TDP-43聚合上。在半乳糖诱导型启动子的控制下，从低拷贝（CEN）质粒中表达野生型（WT）和突变体TDP-43-YFP，并通过荧光显微镜观察细胞。我们确认TDP-43蛋白的表达水平相当(图2B类).

我们比较了表达WT TDP-43的细胞与表达7个突变体中每个突变体的细胞的聚集性。仅YFP弥散分布于细胞质和细胞核之间（数据未显示）。引人注目的是，除G294A外，ALS连锁突变体形成了比WT TDP-43更多的聚集体，后者在～4%的细胞中形成了三个以上的细胞质病灶(图2，C类和D类). 在这些突变体中，Q331K在25%以上的细胞中形成了三个以上的细胞质内含物，而其他TDP-43突变体的细胞中只有10%以上(图2，C类和D类). GFP标记的蛋白融合偶尔会产生人工聚集(29). 因此，我们通过使用TDP-43特异性抗体对表达未标记WT的细胞和具有代表性的突变TDP-43构建物进行免疫细胞化学来证实这些结果(图2E类). 与WT或G294A相比，未标记的Q331K和M337V通常在每个细胞中形成更多的离散聚集体(图2E类).

为了证实显微镜下观察到的TDP-43病灶代表不溶性聚集物，我们进行了沉降分析(19). 作为阴性对照，我们使用YFP表达细胞。YFP完全可溶(图2如果). 作为阳性对照，我们使用了亨廷顿蛋白外显子1中含有25Q和103Q的片段。在我们的酵母沉降分析中，这些蛋白质也分为可溶性和不溶性蛋白质，其中25Q主要是可溶性的，103Q主要是不溶性的(图2如果). WT和突变TDP-43在可溶部分和不可溶部分之间划分(图2如果). 因此，TDP-43在酵母中形成不溶性聚集体。与我们的荧光显微镜数据相比(图2，C类和D类)表达6小时后，类似数量的TDP-43在表达WT、G294A、M337V和Q331K TDP-43的细胞中形成不溶性聚集物(图2如果). M337V和Q331K的不溶性蛋白质总量似乎分布在更多离散聚集体中(图2，C类和D类)G294A和WT的病灶较少(图2，C类和D类). 这可能会反映聚合的饱和端点。因此，我们将重点放在Q331K上，它聚集了被测试的最广泛的突变体(图2C类)并在较早的时间点进行沉积分析。4小时时，球团部分中Q331K的相对含量大于WT TDP-43(图2G公司)与此突变加速聚集相一致。然而，沉淀分析可能不够敏感，无法检测WT和酵母中其他ALS连锁突变体之间TDP-43聚集的细微差异，就像我们通过荧光显微镜观察到的那样。因此，为了解决这些问题在体外需要进行分析以定量确定ALS连锁突变对TDP-43生化特性的贡献(即聚集；例如，请参见图5（见下文）。

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Q331K和M337V加速TDP-43自发聚集。 一个和B类、TDP-43或指示的ALS-连锁TDP-43突变型（Q331K、M337V或G294A）（3μ米)在25°C下孵育，搅拌0–60分钟。聚集程度由浊度确定(一个)或沉降分析(B类). 数值表示平均值±S.D(n个= 3).插入(一个)在考马斯染色的凝胶上显示了TDP-43蛋白的相等输入。

接下来，我们使用电子显微镜观察TDP-43形成的聚集体体内在酵母细胞质中，Q331K TDP-43形成直径约0.2μm的离散聚集病灶(图3)在对照细胞中未观察到（数据未显示）。酵母细胞中形成的TDP-43聚集体具有颗粒形态(图3)类似于ALS和FTLD-U中的TDP-43聚集体(30——32)和那些形成的在体外使用纯蛋白质（见下文）。

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酵母中TDP-43聚集体的EM。 A–C低倍透射电镜显示酵母细胞中表达Q331K TDP-43突变体的粒状聚集体(装箱区(一个)，高倍+25°倾斜视图装箱区在里面一个(B类)，以及TDP-43骨料的附加高倍视图(C类)).米=线粒体；V（V）=液泡；箭头描述TDP-43骨料；酒吧=0.25微米。

最后，我们进行了时间进程实验，以比较WT TDP-43和其中一个突变体（Q331K）之间的聚集。即使在很早的时候(例如2 h），我们观察到Q331K TDP-43与WT相比，每个细胞的聚集物更多(图2H（H）). 因此，TDP-43中的ALS连锁突变可以增加酵母细胞质中离散聚集体的数量。

ALS-连接的TDP-43突变体在酵母中毒性更大

接下来，我们研究了ALS-连锁TDP-43突变对毒性的影响。在酵母中，WT TDP-43的高水平表达（2μ质粒）具有极高的毒性(28). 因为我们想比较WT和突变型TDP-43之间的毒性，所以我们使用低拷贝CEN质粒在只有轻微毒性的水平上表达TDP-43-YFP。我们进行了斑点分析，以比较WT和ALS-连锁TDP-43突变体引起的生长缺陷(图4). 六个ALS连锁突变体形成了比WT更多的离散聚集体(图2)毒性也更大(图4，B类和C类). Q331K突变体一直在酵母中形成数量最多的聚集焦点(图2D类)比WT或其他突变体毒性大得多(图4，B类和C类)尽管表达水平与其他蛋白质相同(图2B类). G294A在每个细胞聚集病灶的数量上与WT相似(图2D类)和毒性(图4B类). 我们使用YFP标记的(图4B类)或未标记的构造(图4C类).

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ALS-连锁TDP-43突变对毒性的影响。 一个，示意图显示上述疾病相关TDP-43突变。与WT相比，突变的色码表示毒性(红色=比WT毒性大得多；绿色=毒性略高于WT；黑色=与WT一样有毒）。B类用斑点试验比较WT和突变TDP-43的毒性。用半乳糖诱导的YFP、WT或突变TDP-43-YFP构建物转化的酵母细胞的系列稀释液。在含有葡萄糖（非诱导）或半乳糖（诱导）的琼脂平板上发现转化物，并在48–72小时后评估其生长情况。C类用斑点试验比较WT和突变TDP-43的毒性。用半乳糖诱导的未标记WT或突变TDP-43构建物转化的酵母细胞的系列稀释液。在含有葡萄糖（非还原性）或半乳糖（诱导性）的琼脂平板上发现转化物，并在48–72小时后评估其生长情况。D类，TDP-43诱导期间的存活曲线，使用高拷贝2μ载体。在诱导空载体TDP-43 WT、G294A、Q331K或M337V后，在指定的时间点通过在一个600纳米=1，稀释1:1000，将300μl这些细胞电镀到含有2%葡萄糖的合成培养基上（抑制TDP-43表达）。平板在30°C下培养，2天后测定菌落形成单位。E类，TDP-43表达导致细胞死亡。诱导TDP-43表达6 h，并用碘化丙啶（PI）染色细胞以评估生存能力。表达WT和突变TDP-43的细胞在PI染色中呈阳性（表示细胞死亡），而含有空载体的细胞在P1染色中呈阴性（表示存活）。

在我们的检测分析中，TDP-43引发的生长缺陷可能反映了细胞死亡或只是生长停滞。为了区分这两种可能性，我们进行了存活率分析，其中我们确定了细胞在TDP-43表达停止后形成集落的能力。当我们使用高拷贝2μ质粒表达WT TDP-43和一组突变体时，在表达12小时后，只有不到10%的细胞能够形成集落，到24小时时，仍有不到2%的细胞存活(图4D类). 我们能够通过使用低拷贝CEN质粒检测WT和突变体之间的存活差异。尽管100%含有空载体的细胞能够形成集落，但在半乳糖诱导12小时后，只有～30%表达WT、M337V或G294A TDP-43的细胞能够构成集落，只有～10%表达Q331K的细胞形成集落。这种存活率分析不如斑点分析敏感。因此，通过生存率分析，我们无法检测到WT和M337V之间生长的细微差异，这是我们通过检测发现的(图4，B类和C类).

为了进一步证实细胞死亡而不是简单的生长停滞，我们使用了碘化丙啶（PI），一种结合DNA的荧光染料。PI是膜不渗透的，通常被排除在活细胞之外。TDP-43表达细胞PI染色阳性(图4E类)，表明细胞活力下降。因此，在酵母中TDP-43聚集导致细胞死亡，而不仅仅是生长停滞。此外，一些与ALS相关的TDP-43突变可以增加TDP-43聚集体的数量并增强毒性。

ALS-连接的TDP-43突变可加速TDP-43聚集

然后，我们使用纯蛋白来确定三个ALS-连接的TDP-43突变是否直接影响聚集过程。我们选择了Q331K和M337V，它们比WT形成了更多的聚集灶，以及G294A，它们在酵母中形成了与WT相似数量的聚集灶(图2D类). Q331K和M337V形成多个聚集灶体内可能反映了聚集的更快成核，从而导致更多聚集(33). 与我们的一致体内数据显示，Q331K和M337V突变体的聚集速度比WT快得多(图5，一个和B类)而G294A没有加速TDP-43聚集，与WT相似(图5，一个和B类). 具体而言，与WT和G294A相比，Q331K和M337V的聚集滞后相大大减少(图5，一个和B类). Q331K聚合速度比M337V更快(图5，一个和B类)与Q331K一致，在酵母中形成更多的聚集体。此外，在酵母中表达4小时后，Q331K蛋白比WT蛋白不溶，这与更快的组装动力学一致(图2G公司). 这些数据表明，Q331K和M337V突变可能会改变TDP-43折叠景观，从而使聚集更加有利。然而，尽管Q331K和M337V的聚合速度比WT或G294A更快在体外30–60分钟后，所有TDP-43变体的最终聚集蛋白量相似(图5，一个和B类). 同样，表达6小时后体内这些TDP-43变异体形成了大约等量的不溶性蛋白质(图2如果).

ALS和FTLD-U变性神经元中类似TDP-43聚集物的纯TDP-43聚集体

EM显示，WT TDP-43和G294A在5分钟后迅速形成小寡聚物复合物(图6一个，示例由表示箭头)，有时会采用孔状构造(图6B类)与Aβ42和α-突触核蛋白形成的病理性低聚物惊人相似(34). 为了确认这些构象是TDP-43低聚物，我们进行了尺寸排除色谱分析。与以前的报告一致(35)，WT TDP-43从Superdex 200凝胶过滤柱中洗脱，主要为二聚物和单体物种(图6C类). 然而，一小部分作为高阶低聚物洗脱(图6C类). EM对混合低聚物部分的检查显示低聚物特征与聚集反应早期观察到的特征相似(图6D类).

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纯TDP-43和ALS连接的突变聚集体类似于ALS患者退化神经元中的TDP-43聚集体。 一个、TDP-43或指示的ALS-linked TDP-43突变型（Q331K、M337V或G294A）（3μ米)在25°C下孵育，搅拌0–60分钟。在不同时间，处理EM反应。箭头表示小寡聚物，小箭头表示丝状结构，以及大箭头表示线状结构。酒吧，0.5微米。B类，5分钟后形成TDP-43和ALS-连接的TDP-43突变低聚物的廊道。酒吧，50纳米。C类，TDP-43在25°C下孵育并搅拌5分钟，然后进行Superdex 200尺寸排除色谱处理。TDP-43主要以二聚物和单体物种洗脱，但有一小部分以低聚物物种洗脱。箭头在顶部指示分子量标准的洗脱体积。D类，低聚物池EM从Superdex 200柱洗脱。酒吧，50纳米。E类，TDP-43（3μ米)在25°C下孵育并搅拌30分钟。分离上清液和颗粒组分并进行EM处理。酒吧，100纳米。

将TDP-43培养更长时间（15–60分钟）并搅拌，可诱导形成短丝状结构(图6一个，示例由表示小箭头)与低聚物聚集在一起，在30–60分钟内形成大团(图6一个). 上清液和颗粒组分的EM表明，一些小的低聚物残留在上清液组分中，而低聚物簇和较大物种进入颗粒组分(图6E类).

G294A形成的聚集体往往比WT更无定形，分辨率更低(图6一个). 由纯TDP-43填充的大量寡聚物形式与ALS和FTLD-U患者中观察到的寡聚体形式非常相似，它们可以取代细胞质细胞器(30——32). 例如，WT TDP-43聚合在图6一个（30或60分钟）在形态学上与ALS患者神经元和胶质细胞中的TDP-43内含物相似（参见图3(c–f)参考号。31和图2第页，共页。32).

M337V以类似方式聚集(图6，一个和B类)除了寡聚物和丝状结构聚集在一起的时间比WT或G294A早得多，并且开始形成更大的质量(图6一个). 相比之下，Q331K通过了与WT、G294A和M337V类似的低聚物形式(图6，一个和B类)但最终进入形态上不同的聚集形态，具有线状或绞状外观(图6一个，示例由表示大箭头). 在ALS和FTLD-U患者的退化神经元中定期观察到TDP-43免疫标记的类似线状结构(30——32). 例如，将Q331K TDP-43聚集体与图7一个对于FTLD-U患者的神经元（见图2(b条和d日)参考号。30)或ALS患者的神经元（参见图6(c（c）和d日)参考号。30). 纯Q331K结构与在患者身上观察到的结构略有不同，因为它们的规则性稍差，通常更为丝状，而非颗粒丝状。尽管如此，它们之间的总体相似性是惊人的。

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TDP-43形成的线状聚集体。 一个，TDP-43和Q331K的线状骨料廊道，在25°C下搅拌60分钟后形成。酒吧，100纳米。B类，在25°C下搅拌2小时后，WT TDP-43填充更长且更规则的颗粒纤维形态。酒吧，100纳米。

虽然含量较少，但WT TDP-43也形成了类似的线状结构(图7一个)，以及G294A和M337V（未显示数据）。通常，这些形状比ALS或FTLD-U患者中观察到的形状更短、更粗糙。然而，在延长培养时间后，偶尔可以观察到更长、更光滑的WT TDP-43颗粒纤维聚集物(图7B类). 这些结构让人想起ALS和FTLD-U患者退化神经元中TDP-43聚集的物种(30——32).

讨论

总之，我们仅使用纯TDP-43忠实地重建了病理性TDP-43聚集过程的几个方面。我们的数据表明，纯TDP-43形成聚集物种在体外这与FTLD-U和ALS患者的TDP-43聚集体非常相似。此外，我们发现TDP-43基因的致病性突变可以加速聚集在体外并引发更多聚集物的形成体内因此，TDP-43可能是ALS和FTLD-U中的关键聚集蛋白，正如α-突触核蛋白在PD中，tau和淀粉样蛋白-β在阿尔茨海默病中一样(36).

我们测试的七个ALS-连锁TDP-43突变体中的六个，特别是Q331K，诱导每个细胞形成多个TDP-43聚集体。虽然，在4小时时，我们观察到Q331K的聚集比WT增加(图2G公司)通过沉降分析，我们无法检测到WT和酵母中表达6小时的突变株之间不溶性TDP-43总量的差异(图2如果). 这可能只是反映了聚合的终点体内就像类似数量的TDP-43最终形成聚集物一样在体外，与TDP-43变体无关。此外，沉淀分析可能不够敏感，无法让我们辨别显微镜观察到的聚集模式的显著差异。第25季度与103Q亨廷顿结构体在沉淀分析中明显显示出不溶性的差异。然而，含有～25Q聚谷氨酰胺片段的亨廷顿蛋白片段通常不会聚集在体外或体内(37，38). 因此，预计会有很大差异。此外，我们的TDP-43突变体仅与WT的一个残基不同。

相反，我们认为ALS连锁突变可能会影响聚集体的形态和/或定位体内而不是不溶性TDP-43的总量（通过沉淀分析检测）。例如，对于WT TDP-43，我们经常观察到一个大的近端病灶(图2C类)这让人想起最近描述的JUNQ（“近核质控”）隔间，错误折叠的蛋白质在这里聚集(19). 观察到ALS-连锁TDP-43突变体倾向于形成多个病灶体内(图2C类)可能是由于我们观察到的聚集加速动力学在体外(图5)这使得它们能够摆脱这种质量控制机制，因此比WT毒性更大。然而，在酵母中持续形成多个聚集焦点的两个突变体Q331K和M337V也聚集得更快在体外，在我们的纯蛋白分析中。因此，一个氨基酸的变化就足以加速TDP-43的错误折叠，这支持了一些ALS相关突变可以通过蛋白质水平上的毒性“功能获得机制”导致疾病的观点。加速自发聚集的突变在体外形成多个聚集病灶体内毒性也更大(图4)，表明ALS-连锁TDP-43突变的子集可能通过加速TDP-43聚集和偶然毒性而导致疾病。具有加速聚集和毒性的ALS-连锁TDP-43突变体令人想起PD-连锁α-突变体（A30P、A53T和E46K），其寡聚或纤维化更快，并与早发性PD相关(23，24，39).

到目前为止，TDP-43突变似乎不是ALS的常见原因(40). 可能还有其他致病机制，一些集中在TDP-43上，其他则没有。尽管如此，TDP-43病理学很明显与散发性和非SOD1家族性ALS相关(41). 因此，研究TDP-43聚集和毒性在体外和体内如本文所述，可能有助于阐明TDP-43在发病机制中的作用。此外，鉴于剂量依赖性毒性(28)TDP-43的聚集性，增加TDP-43水平可能会加速ALS，就像增加野生型α-突触核蛋白水平会加速PD一样(42). 因此，还应在ALS、FTLD-U和其他TDP-43蛋白病的背景下分析TDP-43拷贝数、启动子和调控区域。

为什么Q331K的毒性比我们在酵母模型中测试的其他突变体大得多？我们注意到，在经历神经吞咽的运动神经元中，始终可以发现更容易接触到的纯Q331K线状聚集形式和极为相似的内含物，这是散发性ALS运动神经元死亡的最后一步(43). 到目前为止，已有一例报告患者患有这种突变(7)在数千份对照样品中未发现。使用动物模型的未来研究(例如鼠标，果蝇属，秀丽隐杆线虫和斑马鱼）将进一步了解WT的影响与神经变性中的突变TDP-43。

其他TDP-43突变，例如M337V已在多个个体中发现，并与家族性ALS的疾病隔离(7). 另一个突变Q343R也与家族性ALS有关，与大多数非突变TDP-43病例相比，患者存在更广泛的TDP-43病理学(11). 值得注意的是，Q343R在我们的酵母模型中聚集更广泛，毒性更大(图2和​和4）。4). 然而，由于尚未对ALS和FTLD-U中的TDP-43进行详尽的基因研究，因此判断患者中发现的每一个TDP-43突变的潜在致病性可能为时过早。最近的一份报告发现，携带G294A突变的患者的TDP-43病理学与没有这种病变的患者相似(44). 有趣的是，G294A在我们的酵母和纯蛋白检测中表现出类似WT TDP-43的行为，进一步证实了这些方法。

我们的酵母模型将有助于评估新发现的突变对聚集和毒性的影响。鉴于之前使用酵母同核蛋白病模型成功定义PD的疾病机制和哺乳动物遗传抑制物(18，45，46)，使用酵母TDP-43模型的全基因组方法可能有助于深入了解疾病机制，识别潜在的生物标志物，并为治疗策略提供建议。最后，这里描述的纯TDP-43聚集分析将使我们能够识别能够抑制甚至逆转TDP-43聚合的小分子和细胞因子。

致谢

我们感谢Greg Van Duyne提供的pGV13，感谢Mark Lemmon、Jon Epstein和Nancy Bonini对手稿的评论。

*这项工作得到了美国国立卫生研究院1DP2OD004417-01（A.D.G.董事新创新者奖）和1DP2OD002177-01（J.s.董事新创新者奖）的全部或部分支持。这项工作还得到了宾夕法尼亚大学老龄研究所（a.D.G.）的试点拨款的支持。

三使用的缩写如下：

注册风险管理
RNA识别基序
肌萎缩性脊髓侧索硬化症
肌萎缩侧索硬化
FTLD-U型
额颞叶变性伴泛蛋白阳性包涵体
YFP公司
黄色荧光蛋白
美国公共广播电视公司
磷酸盐缓冲盐水
人力资源计划
辣根过氧化物酶
GFP公司
绿色荧光蛋白
英国标准协会
牛血清白蛋白
CFP公司
色荧光蛋白
消费税
谷胱甘肽S公司-转移酶
电磁阀
电子显微镜
PD公司
帕金森病
重量
野生型
圆周率
碘化丙锭
TEV公司
烟草蚀刻病毒。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会