自然。作者手稿;PMC 2009年8月12日提供。
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美国国立卫生研究院:美国国立卫生研究院10409
代谢组学特征描述了肌氨酸在前列腺癌进展中的潜在作用
,1,三,4,10 ,5,12 ,1,4,12 ,1,4,12 ,1,4,12 ,1,4 ,1,4 ,1,4 ,1,10 ,1,4 ,9,10 ,9 ,1,4 ,1,4 ,1,4 ,7 ,三,7,8 ,5,10 ,7,10 ,11 ,11 ,11 ,6,10 ,1,4,10 ,1,三,4和1,2,三,4,6,10,#
阿伦·斯里库马尔
1密歇根大学医学院密歇根转化病理学中心,密歇根州安阿伯48109。
三密歇根大学医学院计算医学和生物中心,密歇根州安阿伯48109。
4密歇根大学医学院病理学系,密歇根州安阿伯48109。
10密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院综合癌症中心,邮编:48109。
莱拉·M·泊松
5密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院生物统计学,邮编:48109。
Thekkelnaycke M.拉杰迪兰
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阿姆贾德·P·汗
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齐曹
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于金丹
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巴拉蒂·拉克斯曼
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罗希特·麦赫拉
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罗伯特·隆尼戈
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李勇
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穆克什·尼亚蒂
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阿里夫·阿赫桑
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Shanker Kalyana-Sundaram公司
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韩波(Bo Han)
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曹旭红
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杰蒙·拜恩
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吉尔伯特·S·奥曼
三密歇根大学医学院计算医学和生物中心,密歇根州安阿伯48109。
7密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院内科,邮编:48109。
8密歇根大学医学院人类遗传学,密歇根州安娜堡48109。
德巴希斯·戈什
5密歇根大学医学院生物统计学,密歇根州安娜堡48109。
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Subramaniam Pennathur公司
7密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院内科,邮编:48109。
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丹尼·亚历山大
11Metabolon,Inc.北卡罗来纳州达勒姆市Capitola大道800号1室,邮编27713。
阿尔文·伯杰
11Metabolon,Inc.北卡罗来纳州达勒姆市Capitola大道800号1室,邮编27713。
杰弗里·舒斯特
11Metabolon,Inc.北卡罗来纳州达勒姆市Capitola大道800号1室,邮编27713。
约翰·T·魏
6密歇根大学医学院泌尿科,密歇根州安阿伯48109。
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Sooryanarayana Varambally公司
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克里斯托弗·比彻
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Arul M.钦奈扬
1密歇根大学医学院密歇根转化病理学中心,密歇根州安阿伯48109。
2密歇根大学医学院霍华德·休斯医学院,密歇根州安娜堡48109。
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2密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院霍华德·休斯医学院,邮编:48109。
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#将信件和重印请求发送至:Arul M.Chinnaiyan,医学博士,博士,密歇根大学医学院综合癌症中心,1400 East Medical Center Drive,CCGC室。密歇根州安阿伯5416号,邮编:48109-0940;电话:(734)615-4062;传真:(734)615-4498;电子邮件:ude.hcimu@lura 12这些作者贡献均等
作者贡献A.S.K.、L.M.P.和A.M.C.撰写了手稿。A.S.K.和A.M.C.对数据进行了概念化、设计和解释。L.M.P.、R.J.L.、S.K.S.、D.G.和D.C.A.进行了数据分析。T.M.R.、G.S.O.、J.B.S.P.、J.R.S.、A.B.和C.B.进行了质谱研究。A.P.K.、J.Y.、Q.C.、B.L.、Y.L.、M.K.N.、A.A.、X.C.和S.V.进行了生化实验。R.M.、B.H.、A.M.C.和J.T.W.协调了该研究的临床和病理部分。
这篇文章已被更正。参见第799页第457卷中的更正。
为了描述前列腺癌进展过程中的“代谢组”,我们使用了液相色谱和气相色谱结合质谱法三查询262个前列腺相关生物样本中代谢物的相对水平(概述于补充图1). 特别是对活检阳性癌症患者(59例)和活检阴性对照个体(51例)的42个组织样本和110个匹配的血浆和指后直肠检查(DRE)尿液样本进行了分析(). 共有1126种代谢物被量化,正如预期的那样,这些代谢物中只有一小部分(10.6%)在不同的生物样本类型中共享().
前列腺癌的代谢组学分析一,在42个前列腺相关组织和110个匹配的血浆和尿液样本中检测到的总代谢物的维恩图。b条,组织中626种代谢物的维恩图,在16个良性邻近前列腺、12个临床局限性前列腺癌(PCA)和14个转移前列腺癌(Mets)中测量。c(c),无监督分层聚类的热图表示b条(行)按样本类型(列)分组。黄色和蓝色阴影分别表示代谢物相对于中位代谢物水平的升高和降低(见色标)。d日,的Z分数图b条将其归一化为良性前列腺样本的平均值(为了清晰起见,截断为25 SD,参见补充方法程序细节)。
对血浆或尿液的无偏见代谢组学特征的评估没有发现活检阳性和活检阴性个体之间的显著差异。对于血浆,478(4%)种代谢物中有19种是差异代谢物(WilcoxonP(P)<0.05),错误发现率(FDR)为99%。同样,583(6%)种代谢物中有34种在尿液中存在差异(WilcoxonP(P)<0.05),FDR为64%。因此,我们最初的重点是了解组织代谢组学特征,因为它们表现出更强烈的变化。
组织样本来自良性邻近前列腺(n=16)、临床局限性前列腺癌(n=12,PCA)和转移性前列腺癌患者(n=14,Mets)。选择不同部位的转移组织样本(参见补充表2)最小化非前列腺来源细胞特异性分析物的特征。总的来说,组织高通量分析定量检测了626种代谢物(175种命名代谢物、19种等压线代谢物和432种未经鉴定的代谢物),其中82.3%(515/626)由三个诊断类别共享(). 值得注意的是,在PCA和/或转移性肿瘤中发现了60种代谢物,但在良性前列腺中没有发现。这些配置文件显示为热图()和z-score图(). 在后者中,626种代谢物中的每一种都绘制了基于良性的z评分。与临床局限性前列腺癌样本的变化较少(z评分范围:−7.7至45.8)相比,曲线图显示转移性肿瘤的代谢变化强烈(z评分:−13.6至81.9)。
我们使用双侧Wilcoxon秩和检验和置换检验(n=1000)确定PCA和良性样本之间的差异代谢物。共有87/518种代谢物在这两类中存在差异(P(P)<0.05,相当于23%FDR)。为了可视化87种改变的代谢物之间的关系,使用层次聚类法根据样品中代谢物的相对水平来排列代谢物(). 在受干扰的代谢物中,50种在PCA中升高,37种下调。图2b显示了良性前列腺和PCA之间差异的37种命名代谢物的相对水平。同样,与102种下调化合物的局部肿瘤相比,转移样本中发现124/518种代谢物升高(P(P)<0.05,对应于4%FDR)。显示转移样本中91种命名代谢物的变化水平。疾病从良性进展到PCA再到Mets时,六种代谢产物的子集,包括肌氨酸、尿嘧啶、尿氨酸、甘油-3-磷酸、亮氨酸和脯氨酸显著升高。这些代谢物可能作为进展性疾病的生物标记物,这是促使我们更详细地研究肌氨酸的因素之一。
前列腺癌进展的代谢组学改变a、,热图显示了PCA中与良性样本(Wilcoxon)相关的87种差异代谢物P(P)≤ 0.05). 局部PCA样品分为i.低品位(Gleason<6)和ii。,高品位(格里森>=7)。转移性样本按组织获取的部位分组,即iii.软组织,iv.,肋骨/膈膜或v.,肝脏。b中,来自一。每个点代表一个样本中的一种代谢物,按组织类型着色(翡翠色=良性,黄色=PCA)。c、,如中所示b条除了Mets(红色)和PCA(黄色)之间的比较外,数据表示为相对于PCA样本的平均值。为了清楚起见b条和c(c)分别以高于良性和PCA样本平均值的15个标准偏差进行截断。
将差异代谢组图谱映射到其各自的生物化学途径,如京都基因和基因组百科全书(KEGG,版本41.1,补充图8)揭示了在癌症进展为转移性疾病期间氨基酸代谢和氮分解途径的增加。生物信息学工具Oncomine Concept Map也确定了类似的氨基酸代谢富集网络4,5(OCM、,网址:www.oncomine.org,P(P)= 6 × 10−13,补充图9,10a)支持我们早期基于基因表达的预测,即雄激素诱导的蛋白质合成是前列腺癌发展的早期事件5此外,OCM还发现,“甲基转移酶活性”升高时有较强的富集作用(补充图10b,P(P)= 7.7 × 10−8)在转移样本中代谢产物上调。这证实了我们小组和其他研究小组先前的研究,这些研究显示转移性肿瘤中组蛋白甲基转移酶EZH2升高6–11.
随着前列腺癌进展过程中氨基酸代谢和甲基化的增加,我们将重点放在表征这些过程的差异代谢物上,并进一步显示从良性到PCA再到转移性疾病的进展。氨基酸代谢物肌氨酸(一种甘氨酸的N-甲基衍生物)符合这些标准。值得注意的是,在79%的分析样本中,转移样本显示肌氨酸水平显著升高(卡方检验,P(P)=0.0538),而42%的PCA样品显示该代谢物的水平增加(). 重要的是,良性样本中没有检测到肌氨酸水平。综上所述,这表明肌氨酸可能在监测疾病进展和侵袭性方面发挥作用。
为了证实肿瘤进展中肌氨酸升高的这种模式,我们开发了一种高灵敏度和特异性同位素稀释GC/MS方法,用于准确定量生物样品中的代谢物(检测限=10个股骨,补充图11). 在一组89个组织样本中(补充表6)PCA标本中肌氨酸水平显著升高(n=36),而良性前列腺癌(n=25,WilcoxonP(P)= 4.34 ×10−11,). 此外,与器官相关疾病(Wilcoxon)相比,转移性样本(n=28)中的肌氨酸水平更高P(P)= 6.02 × 10−11,). 相比之下,转移性疾病患者的邻近非肿瘤组织中检测不到肌氨酸(补充图12a–c).
前列腺癌中肌氨酸水平及其与细胞浸润的关系a、,前列腺癌相关组织标本中的肌氨酸水平(n=89)。b中,前列腺癌患者(49例)和前列腺活检阴性对照组(44例)DRE后尿沉渣中的肌氨酸水平。c、,与非侵袭性良性前列腺上皮细胞系相比,侵袭性前列腺癌细胞中的肌氨酸(黑条)水平升高。肌氨酸水平的平均+/-s.e.m.(n=3,PrEC细胞除外,其中n=2)。还测量了细胞侵袭(灰色条)(平均+/-s.e.m.)。e、,外源性给予丙氨酸、甘氨酸或肌氨酸后前列腺上皮细胞侵袭性的评估(平均+/-s.e.m.,n=3)。
上述发现使我们探索了肌氨酸作为生物标记物面板的候选物在早期疾病检测和侵袭性预测方面的潜力。为此,我们监测了活检阳性和阴性个体的尿液样本中的PSA水平,其中大多数患者的PSA浓度升高(>4.0 ng/ml),前列腺穿刺活检用于诊断。这是一个特别具有挑战性的队列,因为这些男性不仅具有前列腺癌的高风险,甚至由于采样问题,针吸活检阴性也不能排除癌症的存在。尿液沉积物中的肌余弦含量明显较高(n=49,WilcoxonP(P)= 0.0004,)和上清液(n=59,WilcoxonP(P)= 0.0025,补充图14a)与活检阴性对照组相比,来自活检阳性前列腺癌患者(分别为44例和51例),补充表7和表8). 肌氨酸的总体受体-操作员特征(ROC)曲线表明其预测值适中,尿沉渣和上清液的AUC分别为0.71和0.67(补充图14b,c). 值得注意的是,AUC为1.0表示预测准确,AUC 0.5表示预测相当于随机选择。有趣的是,当局限于临床灰色区PSA为2–10 ng/ml(n=53)的样本时,肌氨酸在描述两个诊断类别方面的表现优于PSA,AUC为0.69(95%CI:0.55,0.84),而PSA的AUC为0.53(95%CI:3.37,0.69)(补充图15). 因此,肌氨酸可能有助于鉴别前列腺特异性抗原(PSA)轻度升高且前列腺活检可能阳性的患者。
为了确定前列腺癌中肌氨酸升高是否具有生物学相关性,我们测量了前列腺癌细胞系VCaP、DU145、22RV1和LNCaP(各3个)及其良性上皮对应物、原发性良性前列腺上皮细胞(PrEC,n=2个)和永生化良性RWPE前列腺细胞(n=3个)中的肌氨酸水平。与良性细胞相比,前列腺癌细胞中的代谢物水平显著升高(ANOVAP(P)=0.0218,). 此外,肌氨酸水平与细胞侵袭性密切相关(Spearman相关系数:0.943,P(P)=0.0048). 根据我们早期的发现,EZH2在良性细胞中的过度表达可以介导细胞侵袭和肿瘤进展6,10,11,通过调节EZH2表达来评估肌氨酸水平。有趣的是,EZH2在良性前列腺上皮细胞中的过度表达增加了肌氨酸水平(4.5倍,补充图16a)而其在DU145前列腺癌细胞中的敲除降低了代谢物的水平(补充图16 a–c). 为了确定肌氨酸是否在这一过程中发挥更直接的作用,我们将代谢物添加到非侵袭性良性前列腺上皮细胞中。丙氨酸是肌氨酸的一种异构体,被用作这些实验的对照。值得注意的是,仅仅添加外源性肌氨酸就给良性前列腺上皮细胞带来了侵袭性表型(,补充图17). 此外,肌苷治疗后活动前列腺上皮细胞的数量显著增加(t检验P(P)=6.997e-06,n=10)与丙氨酸处理的对照组相比(补充图18). 然而,肌氨酸治疗并不影响这些细胞在细胞周期不同阶段的进展能力(补充图19a–d)或损害细胞增殖(补充图19e). 值得注意的是,甘氨酸(肌氨酸的前体)诱导了这些细胞的侵袭,尽管程度低于肌氨酸(). 这种侵袭可能是由甘氨酸-N-甲基转移酶(GNMT)将甘氨酸转化为肌氨酸引起的().
肌氨酸在雄激素信号转导和前列腺癌细胞侵袭中的作用a、,肌氨酸途径示意图及其与前列腺癌的潜在联系。b中,通过RNA干扰评估GNMT敲除DU145细胞后的肌氨酸水平和细胞侵袭性。c、,如中所示b条RWPE细胞中SARDH的敲除除外(n=6)。日期:,雄激素刺激VCaP细胞中GNMT和SARDH mRNA表达的QRT-PCR分析。e、,由ChIP-seq测定的GNMT启动子上的AR和ERG结合位点。Y轴显示25 bp滑动窗口中的读取次数。f、,如中所示e(电子)SARDH启动子中ERG结合位点除外。克,左面板,RWPE细胞中ERG或ETV1的过度表达以及肌氨酸水平和细胞侵袭性的测量。右侧面板与左侧一样,但VCaP细胞中TMPRSS2-ERG被RNA干扰击倒。除非另有说明,否则所有误差条均表示平均值+/-s.e.m.,n=3。
除GNMT外,肌氨酸水平还受到肌氨酸脱氢酶(SARDH)的调节,该酶将肌氨酸转换回甘氨酸,而二甲基甘氨酸脱氢酶(DMGDH)则从二甲基甘氨酸生成肌氨酸(). 由于这些酶能够控制细胞中的肌氨酸水平,因此可能在调节前列腺癌侵袭方面发挥关键作用。为了验证这一假设,我们进行了一系列RNA干扰介导的敲除实验。GNMT衰减(,补充图20)在DU145前列腺癌细胞中,细胞侵袭性显著降低(t检验P(P)=0.0073,n=3),与对照非靶向siRNA转染细胞相比,细胞内肌氨酸水平下降了3倍。在良性RWPE细胞中进行的类似敲除实验显著阻碍了外源性甘氨酸的能力(t检验P(P)=0.0082,n=3),但不是肌氨酸,以诱导侵袭(补充图21a、b). 在敲除DMGDH后,DU145癌细胞的细胞侵袭性下降和肌氨酸水平降低也很明显(补充图22a、b). 相反,良性前列腺上皮细胞中SARDH的敲低导致内源性肌氨酸水平增加约3倍,同时侵袭性增加>3.5倍(,补充图23).
了解雄激素信号和ETS基因(ERG,ETV1)融合是前列腺癌进展的关键因素12,我们研究了它们在调节GNMT和SARDH中的作用。用雄激素治疗VCaP(ERG阳性)和LNCaP(ETV1阳性)前列腺癌细胞48小时后,通过数字基因表达和QPCR评估,GNMT表达逐步增加,SARDH水平随之降低(,补充图25e). 染色质免疫沉淀测序(ChiP-Seq)支持了这一发现,该测序揭示了AR和ERG与VCaP细胞中GNMT启动子的直接结合()而在SARDH启动子上只发现ERG结合(). 在ETV1阳性LNCaP细胞中,AR(而非ERG)与GNMT和SARDH启动子结合(补充图25a、25b). 结合数据通过ChIP-PCR验证(补充图24a、b、d和25c、d)这进一步揭示了VCaP细胞中AR与SARDH启动子的弱结合(补充图24 c). 这些发现直接将肌氨酸途径的激活与AR和ETS基因融合调节联系起来,这是前列腺癌进展的两个关键介质。值得注意的是,ERG和ETV1诱导的侵袭与良性RWPE细胞中3倍肌氨酸升高有关(). 类似地,VCaP细胞中TMPRSS2-ERG基因融合的敲除(补充图26)导致肌氨酸减少3倍以上,侵袭性表型减少相似().
总之,我们探索了前列腺癌进展的“代谢组”。这导致了代谢组特征的表征,在其他分子改变的背景下,这可能导致对疾病进展的更全面理解。具体来说,我们确定肌氨酸是转移性前列腺癌中最强烈升高的关键代谢产物,并且在患有器官相关疾病的男性的尿液中可以检测到。有趣的是,肌氨酸及其近端调节酶似乎在调节细胞侵袭和迁移的肿瘤进展中起着中介作用。前列腺癌进展的主要转录调控因子AR和ETS基因融合似乎通过其调节酶的转录控制直接调节肌氨酸水平。因此,肌氨酸途径的成分可能有潜力作为前列腺癌进展的生物标记物,也可能作为治疗干预的新途径。
方法
生物样品和细胞系
前列腺组织、尿液和血浆取自密歇根大学SPORE和EDRN组织核心。根据机构审查委员会的批准,在知情同意的情况下收集所有样本。
RWPE、DU145、LnCAP和PC3细胞来自ATCC,PrEC细胞来自Cambrex BioScience,22-RV1由J.Macoska提供,VCaP由K.Pienta提供。VCaP和LnCAP在含有木炭剥离血清的培养基中培养24小时,然后用溶于乙醇的溶媒或1nM甲基三烯酮(R1881,NEN)进一步处理24小时。
代谢组学分析使用劳顿描述的平台执行等. (2008)三并在中概述补充图1平台的LC/MS部分基于Surveyor HPLC和Thermo-Finnigan LTQ-FT质谱仪(Thermo-Fisher Corporation,Waltham,MA),仪器设置用于持续监测正负离子。使用气相色谱-质谱(GC-MS)分析的样品在干燥氮气下使用双三甲基硅油-三氟乙酰胺(BSTFA)衍生,并在Thermo-Finigan Mat-95 XP上使用电子碰撞电离(EI)和高分辨率进行分析。对于LC和GC质谱,使用Metabolon创建的代谢组学库搜索光谱文件,其中包含约800种商用化合物。
使用同位素稀释GC-MS和选择离子监测(SIM)对目标代谢物进行定量。样品修改为t吨-丁基二甲基硅烷衍生物,并使用安捷伦5975 MSD质量检测器使用EI进行分析。对于SIM分析,量化的各种目标代谢物的天然和标记分子峰的m/z分别为:158和161(肌氨酸)、406和407(半胱氨酸)、432和437(谷氨酸)、297和301(胸腺嘧啶)以及218和219(甘氨酸)。在全扫描模式下,在GC-MS上对柠檬酸进行评估。
统计分析
对于样本中平均测量值>100000的代谢物,缺失数据采用零进行插补(即,缺失可能导致缺失),否则插补样本最小值的一半(即,可能由于审查导致缺失)。计算数据为每个样本的中位数中心和四分位范围(IQR)。根据参考集(良性样本,除非另有说明)的平均值和标准偏差计算绘制的z评分。分层聚类14基于皮尔逊相关性,对每种代谢物中位数居中后的对数转换归一化数据进行分析。在每个规范化值中添加一个较小的值(单位),以允许进行日志转换。使用过甲氧基硅烷裂方试验来评估存在和不存在(未检测到)测量值的类别特定代谢物模式。每种代谢产物的双尾Wilcoxon秩和检验用于两个类别之间关联的样本检验。Kruskal-Wallis检验用于所有诊断组之间的三向比较。选择非参数检验来减少插补值的影响。对这些代谢物进行测试,至少20%的样本中检测到这些代谢品的表达。使用1000个样本排列确定显著性使用Storey的q值转换算法计算错误发现率18使用双尾t检验和Satterthwaite方差估计来测试细胞系数据和小规模组织数据中表达的成对差异。涉及多个细胞系的比较使用重复测量方差分析(ANOVA)来调整每个细胞系的多个测量。根据模型对数(Y)=a+B*治疗+E,使用方差分析法在对数标度上估计折叠变化。这样,exp(B)是(Y|治疗=1)/(Y|处理=0)的估计值,exp的标准误差可以使用δ法从SE(B)估计。所有试验的显著性阈值均为P<0.05。
ChIP-PCR公司
如前所述执行ChIP19使用抗AR(Millipore)、ERG(Santa Cruz)和兔IgG(Santa-Cruz)抗体。在配对的乙醇处理和R1881处理样品中进行AR ChIP。通过连接介导PCR扩增富含ChIP的染色质和全细胞提取物。当检测目标基因组区域上的AR结合时,等量的乙醇处理和R1881处理的ChIP扩增物进行QPCR,并根据输入DNA归一化后的周期差异确定折叠富集(R1881/乙醇)。对于ERG-ChIP分析,使用常规培养基中生长的VCaP细胞,使用ERG抗体和兔IgG对照进行ChIP。通过QPCR分析直接分析ChIP产物,并根据ERG检测的富含ChIP的染色质与相应IgG的周期差异评估ERG结合。使用的引物列于补充表9.
ChIP-Seq公司
按照制造商协议,使用基因组DNA样品制备试剂盒制备ChIP样品进行测序。根据标准制造商程序,使用Illumina基因组分析仪进行ChIP-测序。原始序列图像数据由我们的分析管道进行分析,使用ELAND软件与未屏蔽的人类参考基因组(NCBI v36,hg18)对齐,以生成25–32 bps的序列读取。
数字基因表达分析
从经过0h和48h雄激素治疗的样本中提取的三唑RNA,准备好用于使用数字基因表达标签分析进行测序尼尔试剂盒(Illumina),并由基因组分析仪测序。使用ELAND软件将测序读数映射回人类参考基因组。计算感兴趣基因的测序读取次数。每个基因的表达水平是以每百万总测序读数中的转录物数量来衡量的。
定量RT-PCR
如前所述,使用SYBR Green Mastermix在Applied Biosystems 7300 PCR机器上进行Q-PCR19。所有引物均使用引物3设计,并由集成DNA技术合成,列于补充表9.
RNA干扰
用非靶向siRNA(Dharmacon)和基因特异性siRNA序列处理DU145或RWPE细胞,如补充表10.
细胞侵袭试验
如前所述,使用改良的基底膜室试验进行细胞侵袭试验19.
细胞运动测定
对于细胞活力测定,我们按照制造商的说明使用了Cellomics细胞活力试剂盒。