不同的血管变化随着年龄的增长而发生(4,17,28). 例如，在大脑循环中，衰老会导致结构和功能的改变(10,20,21,29,34). 衰老对脑血管有巨大的负面影响，是脑血管病、中风、阿尔茨海默病和血管认知障碍的主要危险因素(19,36). 尽管衰老是一个重要的心血管危险因素，但它的影响是血管生物学研究最少的领域之一。很少有研究试图确定随着年龄增长，脑循环发生变化的机制。大多数血管疾病和中风模型的研究是在成年动物而非老年动物身上进行的。由于人类的脑血管疾病主要发生在老年人身上，因此这种关注可能会限制我们对血管疾病过程的理解。
人们对活性氧在衰老中的作用产生了极大的兴趣(16,25). 氧化应激的原因和影响是血管生物学研究的主要焦点。氧化应激在各种疾病模型的脑血管功能障碍中起着基础性作用，但对其在衰老中的作用知之甚少(5). 本研究的第一个目标是确定年龄对脑动脉的影响，并检验ROS介导年龄相关功能障碍的假设。作为这项工作的一部分，我们检测了ROS的下游靶点聚ADP核糖聚合酶（PARP）的作用，PARP是血管功能障碍的潜在介质(24,33).
血管受到包括SOD在内的一系列抗氧化酶的保护，免受氧化应激(11). 与衰老有关，SOD的形式定位于线粒体（Mn-SOD）(11)尤其令人感兴趣的是线粒体是衰老研究的焦点(16,25). 随着年龄增长，Mn-SOD在脑血管中的功能重要性尚不清楚。因此，我们的第二个目标是检验Mn-SOD缺乏小鼠中年龄诱导的血管功能障碍增强的假设。
肾素-血管紧张素系统通过促进氧化应激在血管疾病中起主要作用(5,8,32). 血管紧张素II对血管的大多数有害影响由血管紧张素Ⅱ1型（AT）介导1)受体(8,30,32). 为了进一步研究促进脑血管功能障碍的机制，我们的第三个目标是检验AT表达不足的假设1受体在衰老过程中防止脑血管功能障碍。
我们的研究结果表明，衰老会导致大脑动脉明显的内皮功能障碍，这是由ROS和PARP激活介导的，但不会因Mn-SOD缺乏而增强。我们的研究结果还暗示了ANG II和AT的新的基础作用1年龄相关性脑血管功能障碍的受体。
方法
实验动物。
这些实验中使用的小鼠的来源、遗传背景和繁殖方案已经过描述(1,14). Mn-SOD缺乏和AT1a个受体缺失小鼠分别位于CD-1和129P3/J和C57BL/6J的混合遗传背景上(1,14). 对于这两种小鼠，野生型同窝小鼠被用作对照。在下列年龄段对雄性和雌性小鼠进行了研究。老鼠被定期喂食，水可以随意使用。所有的繁殖都是在爱荷华大学的无病毒和无病原屏障设施中进行的。所有协议和程序均符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南并得到爱荷华大学动物保护和使用委员会的批准。
脑动脉体外实验。
在过量麻醉（150毫克/公斤静脉注射戊巴比妥）后，大脑被迅速取出并放置在冰镇克雷布斯缓冲液中。如前所述(14,42)，分离基底动脉，将其插管到器官室中充满Krebs缓冲液的玻璃微量移液管上，并用尼龙单丝固定。动脉加压至60 mmHg。使用显微镜和摄像机，将血管图像投影到视频监视器上。使用电子尺寸分析仪测量管腔直径。
一旦准备好，在开始治疗前，让基底动脉在60 mmHg的扩张压力下平衡至少30分钟。我们检测了KCl（50 mM）对基底动脉直径的影响。在测试血管舒张反应的实验中，U-46619（血栓素a）使基底动脉收缩约30%（对50 mM KCl反应的约60%）2模仿。乙酰胆碱被用作内皮依赖性激动剂(9). 在一些实验中，A23187[产生受体依赖性内皮依赖性舒张(6,9)]也使用了。在形成稳定的基线直径后，获得累积剂量-反应曲线。在方案结束时，使用罂粟碱（一种内皮非依赖性血管舒张剂，100μM）产生最大的血管舒张作用。
统计分析。
对于基底动脉，通过计算血管直径相对于基线控制水平的减少百分比来确定KCl引起的收缩。对于血管扩张反应，结果表示为扩张百分比（诱导张力百分比），100%表示基础条件下的静息值与U-46619收缩值之间的差异。根据情况，使用配对或非配对进行比较吨-测试或ANOVA，重复测量，然后进行Student-Newman-Keuls测试，以检测个体差异。P（P）<0.05为显著。
结果
衰老会导致大脑动脉内皮细胞明显功能障碍。
年轻（6±1 mo）和老年（18±1 mo(). 在非常老的小鼠中，收缩前静息直径的增加（～12%）可能反映了血管壁随年龄增长而发生的结构变化。不同组的体重相似（年轻、老年和高龄小鼠的体重分别为44±2、41±2和37±3 g）。老年小鼠基底动脉向乙酰胆碱的扩张明显减少，而在老年小鼠中几乎消失(). 例如，年轻、老年和高龄小鼠的血管直径对乙酰胆碱最大浓度的反应分别为80±4%、31±6%(P（P）<0.05 vs.幼鼠），以及11±1%(P（P）<0.05 vs.老年小鼠）。野生型小鼠的基线反应和年龄效应通常不受性别的影响。例如，年轻雄性和雌性小鼠的最大乙酰胆碱浓度的血管舒张作用相似[76±5%(n个=7）vs.90±3%(n个= 3),P（P）>0.05]以及非常老的雄性和雌性小鼠[10±3%(n个=3）对11±2%(n个= 6),P（P）> 0.05]. 然而，老年雌性小鼠对乙酰胆碱的血管舒张作用[44±7%(n个=6）]大于老年雄性小鼠[14±4%(n个= 5),P（P）<0.05 vs.老年雌性]，表明雄性小鼠可能更早出现年龄诱导的内皮功能障碍。
基线直径(A类)KCl（50 mM；B类)和罂粟碱（100μM；C类)年轻时(n个=10），旧(n个=11）和非常老（VO；n个=9）野生型（WT；Mn-SOD+/+)和Mn-SOD+/−小鼠[基因敲除（KO）；n个=7只年轻、6只老年和16只VO小鼠]。WT小鼠是Mn-SOD的窝友+/−小鼠，并且具有CD-1遗传背景(1). 数值为平均值±SE*P（P）与年轻WT小鼠相比<0.05#P（P）<0.05与年轻Mn-SOD+/−老鼠。
青年人基底动脉对乙酰胆碱的反应(n个=10），旧(n个=11）和VO(n个=9）锰-SOD+/+和Mn-SOD+/−小鼠(n个=7只年轻、6只老年和16只VO小鼠）。在没有和存在tempol（T）的情况下，对非常老的小鼠的反应进行了检测。数值为平均值±SE*P（P）<0.05 vs.幼鼠；†P（P）与老年小鼠相比<0.05#P（P）与VO小鼠相比<0.05。
老年小鼠对A23187的血管舒张作用明显受损(P（P）与年轻人相比<0.05；). 衰老对基底动脉内皮功能的抑制作用是选择性的，因为在老年或高龄小鼠中，罂粟碱的扩张和KCl的收缩作用没有改变().
A23187对年轻和老年Mn-SOD患者基底动脉扩张的影响+/+和Mn-SOD+/−老鼠。数值为平均值±SE；n个=7个年轻WT和Mn-SOD+/−小鼠和6只大鼠WT和Mn-SOD+/−老鼠*P（P）与幼鼠相比，<0.05。
随着年龄增长，血管功能障碍由活性氧介导。
为了研究随着年龄增长而产生内皮功能障碍的机制，我们首先测试了超氧物在高龄小鼠动脉中的作用。使用天妇罗（1 mM）（一种超氧物清除剂）进行急性治疗，可使非常老的野生型小鼠的动脉对乙酰胆碱的反应恢复到几乎正常的水平(n个= 7;). 基底动脉对乙酰胆碱的反应是由一氧化氮（NO）介导的(13,15). 通过清除超氧物，天妇罗可以阻止超氧物与NO反应，从而恢复NO介导的血管舒张功能。为了确定用天妇罗治疗的动脉对乙酰胆碱的恢复反应是否由NO介导，我们测试了NO合成酶抑制剂的作用N个G公司-硝基-我-精氨酸(我-国家核管理局；100μM）。在tempol和我-极老小鼠的NNA为8±4%(n个=3），证明了天妇罗的保护作用是由NO介导的。在一个单独的时间对照组中，在没有任何阻滞剂的情况下检查了两次血管反应，极老小鼠对乙酰胆碱的血管舒张功能受损是可复制的（在第一和第二剂量反应曲线中，最大血管舒张功能分别为5±1%和7±2%，n个= 4).
Mn-SOD缺乏的影响。
年轻人（5±1 mo）、老年人（17±1 mo+/−小鼠与野生型小鼠相似(). 不同组的体重相似（年轻、老年和高龄小鼠的体重分别为45±2克、40±4克和41±2克）。在年轻的Mn-SOD中+/−小鼠对乙酰胆碱的反应与幼年野生型小鼠相似()表明杂合性Mn-SOD缺乏本身并没有改变脑动脉的内皮功能。Mn-SOD患者的基底动脉扩张为乙酰胆碱和A23187随着年龄增长而受损+/−小鼠的损伤程度与野生型同窝鼠非常相似(P（P）>0.05与野生型；和). 与野生型小鼠一样，Mn-SOD中内皮功能随年龄而受损的机制+/−小鼠使用超氧化物作为tempol的治疗，完全恢复了非常古老的Mn-SOD动脉对乙酰胆碱的反应+/−小鼠(n个= 8;). 与乙酰胆碱相反，罂粟碱对年轻、老年和非常老的Mn-SOD的动脉产生类似的扩张作用+/−小鼠().
为了更详细地研究衰老导致内皮功能障碍的机制，我们测试了PARP在非常古老的野生型和Mn-SOD中的作用+/−老鼠。PARP抑制剂PJ34[3μM治疗(24)]两种菌株的内皮功能均得到改善。例如，在非常老的小鼠中，100μM乙酰胆碱引起的血管直径最大增加从12±3%增加到野生型小鼠的40±6%(n个=3），Mn-SOD缺乏小鼠从10±3%到29±7%(n个= 3,P（P）< 0.05).
AT不足1受体可防止内皮细胞随着年龄增长而出现功能障碍。
为了进一步研究可能促进年龄诱导的血管功能障碍的机制，我们检测了AT缺乏的年轻（5±1个月）和老年（19±1个小时）小鼠的动脉反应1受体（AT1−/−)和他们的野生型室友。不同组的体重相似（年轻野生型和AT组分别为27±2和27±1 g1−/−小鼠和29±1和30±2 g旧野生型和AT1−/−小鼠）。野生型和AT基底动脉的基线直径1受体缺乏小鼠相似，平均为108±5μm(n个=8）和115±4μm(n个=9）幼鼠和120±4μm(n个=8）和118±6μm(n个=9）分别在老年小鼠中。
在年轻的AT中1受体缺乏小鼠，对乙酰胆碱的反应与年轻野生型小鼠相似()，表示AT1受体缺乏并没有改变脑动脉的内皮功能。在年老的野生型小鼠中，基底动脉向乙酰胆碱的扩张受损超过50%(). 然而，年老野生型小鼠的动脉在罂粟碱作用下正常舒张（91±2%）。相反，老年AT对乙酰胆碱的最大血管舒张作用1受体缺陷小鼠与之相似(P（P）>0.05）与在年轻野生型和年轻AT中观察到的相比1受体缺乏小鼠(). 在使用A23187作为第二种内皮依赖性激动剂的实验中(6,9)，我们获得了类似的发现：老年野生型小鼠的血管舒张功能受损，而老年AT对A23187的反应正常1受体缺乏小鼠().
年轻和老年WT[ANG II 1型受体（AT）对乙酰胆碱和A23187的反应导致基底动脉扩张1)+/+]和AT1接收器缺陷（AT1−/−)老鼠。WT小鼠是AT的窝友1受体缺失小鼠，具有129P3/J和C57BL/6J的混合遗传背景(14).数值为平均值±SE；n个=8只年幼和年老的WT小鼠和9只年幼的AT小鼠1−/−老鼠*P（P）与幼鼠相比，<0.05。
讨论
这项研究有几个新发现。首先，衰老导致基底动脉功能障碍，随着年龄的增长，这种功能障碍会逐渐加重。虽然研究最古老时间点的血管功能障碍程度非常大，但这种变化是有选择性的，似乎主要涉及内皮。重要的是，我们在两种不同遗传背景的野生型动物中观察到类似的内皮功能障碍。第二，关于介导这种功能障碍的机制，我们的数据表明氧化应激和ROS起关键作用，PARP的激活起部分作用。尽管在年老的小鼠中内皮功能严重受损，但用超氧物清除剂进行的急性治疗几乎完全恢复了野生型小鼠的反应。第三，我们对Mn-SOD的研究结果+/−小鼠表明，年龄诱导的脑动脉功能损伤是由ROS介导的，但不因Mn-SOD部分缺乏而增强。最后，缺乏AT的老年小鼠没有发生内皮功能障碍1受体，提示ANG II在年龄相关性脑血管功能障碍中具有新的基础作用。
衰老对脑血管系统的影响。
衰老与多种血管变化有关(4,10,17,20,21,28,29,34). 例如，静息脑血流(10)，内皮功能(10,21,29,34)、神经血管耦合(34,38)随着年龄的增长，血管对高碳酸血症的反应都会减少(10,34). 尽管这些变化具有巨大的潜在影响，但很少有研究试图确定随着年龄增长而产生脑血管功能障碍的机制。
我们之前已经证明，小鼠主动脉和颈动脉的内皮功能在22-24个月龄时未受损或仅轻度受损(4,7). 在本研究中，我们对三个年龄段的小鼠进行了检查，发现约18个月龄的小鼠大脑动脉出现明显的内皮功能障碍，而在非常老的小鼠（约23个月龄）中，内皮功能几乎完全丧失。因此，从这项研究中得出的一个关键概念是，与脑外血管相比，年龄诱导的内皮功能障碍在脑循环中发生得更早，甚至更大。
之前的研究(37)研究表明，遗传因素（如遗传背景）对血管功能有很大影响。Mn-SOD缺陷和AT1这些实验中使用的受体缺陷小鼠来自不同的遗传背景(1,14). 事实上，我们在两种遗传背景下的老年野生型小鼠中观察到了类似的内皮功能障碍，这表明年龄对不同菌株的影响是相似的，从而加强了我们的总体发现。
在这些实验中使用了基底动脉，我们假设在该血管中观察到的变化代表了脑血管系统的其他部分。与其他器官相比，大脑相对独特，因为大脑动脉是重要的阻力血管(12). 因为内皮细胞随着年龄的增长而功能障碍已经在基底动脉、其他脑动脉和脑微循环中被描述过(18,21,29,34)，我们的基本假设似乎有效。
活性氧在衰老血管功能障碍中的作用。
ROS被认为是疾病血管结构和功能变化的关键介质(5,23). 尽管在衰老过程中，动物和人类脑血管会出现内皮功能障碍(10,21,29,34)，对于这些变化的机制知之甚少。在目前的实验中，在非常老的小鼠中，基底动脉的内皮功能几乎被破坏，但通过超氧物清除剂可以恢复到几乎正常的状态。因此，我们的研究表明，ROS在随着年龄增长而导致大脑动脉功能障碍的机制中发挥着重要作用。虽然目前的研究还在进行中，但有证据表明，超氧物是由NADPH氧化酶产生的，并有助于随着年龄增长而出现脑血管功能障碍(29,34).
NO与超氧物的相互作用导致过亚硝酸盐的形成，在衰老模型中描述了血管系统中，包括脑血管中，超氧物和过亚硝酸钠的增加(三,4,7,34,39). 过氧亚硝酸盐可能是细胞损伤的一个重要介体，其作用包括激活PARP(24,26,27,33). PARP过度激活会耗尽细胞能量库，从而导致细胞功能障碍(24,33). 我们的发现是，PARP活性抑制剂（PJ34）可以部分恢复非常古老的野生型和Mn-SOD缺乏小鼠的内皮功能，这表明PARP的激活可能会导致随着年龄增长而出现的脑血管功能障碍。PJ34被认为是PARP活性的选择性抑制剂(24)不起抗氧化剂的作用(7). 考虑到PARP活动增加可能产生的各种影响(33)目前尚不清楚PARP激活在衰老过程中如何影响脑血管。
Mn-SOD对脑血管系统随年龄增长的影响。
在衰老和脑循环方面，Mn-SOD似乎具有保护作用。Mn-SOD在内皮细胞中表达相对较高(11,15)脑动脉中的含量可能高于脑外动脉(31).
我们假设，与野生型老年小鼠相比，Mn-SOD缺乏的老年小鼠的脑动脉会表现出更大的功能障碍。相反，在这些小鼠中，年龄诱导的内皮功能障碍的程度没有增加。在一项关于主动脉的类似研究中，老年野生型动物的内皮功能仅适度降低，但Mn-SOD缺乏会增加功能障碍(4). 由于老年小鼠主动脉内皮功能障碍程度较轻，因此可能更容易检测到衰老和Mn-SOD缺乏综合导致的额外损伤。相反，由于我们发现野生型小鼠在～18个月龄时基底动脉内皮功能明显受损，因此在Mn-SOD缺乏的动物中检测额外的功能障碍可能更加困难。我们的数据并不排除Mn-SOD在脑循环老化过程早期起关键作用的可能性。我们还认识到其他形式的SOD（CuZn-SOD或胞外SOD）可能会随着年龄增长而保护脑血管系统。在这方面，我们之前已经证明CuZn-SOD可以保护颈动脉免受年龄诱导的氧化应激和内皮功能的影响。
AT的角色1老年性血管功能障碍中的受体。
肾素-血管紧张素系统在血管生物学中起着重要作用，对包括高血压和动脉粥样硬化在内的疾病中血管结构和功能的改变起着重要的作用(5,30,32). 该系统也可能导致血管疾病的衰老。例如，血管紧张素转换酶的表达、ANG II的组织水平和AT1老年猴子和人类主动脉中的受体增加(40,41). 在主动脉中，肾素-血管紧张素系统的慢性药物抑制会减弱正常生长(2)和AT基因缺陷1受体减弱了衰老过程中过氧亚硝酸盐的增加(三). 在这些先前的研究中没有检查血管功能。在本研究之前，ANG II作为脑循环随年龄增长而变化的介质的作用尚不清楚。
虽然ANG II在血管中产生氧化应激已被证实(5,30,32)随着年龄的增长，ANG II和ANG II诱导的信号在产生血管功能障碍中的相对重要性尚不清楚。ANG II的作用是通过激活两种受体亚型：AT1和ANG II 2型受体(22). 在本研究中，我们使用了AT1受体缺失小鼠，检测该受体在衰老期间脑血管功能障碍中的作用。我们对AT的作用特别感兴趣1作为ANG II的受体是NAPDH氧化酶激活的主要刺激物(5,30)最近被认为与衰老过程中的脑血管异常有关(29,34). 重要的是，一项重要的新发现是，虽然旧野生型小鼠的动脉内皮功能受损，但旧AT中没有这种功能障碍1受体缺乏小鼠。这些发现表明AT的新作用1受体在脑循环中的加速功能障碍即随着年龄的增长而发生。由于通过NADPH氧化酶激活超氧化物形成是血管细胞中ANG II的一个显著作用，我们推测随着年龄增长，循环或局部ANG II水平的增加会通过AT增加超氧化物水平1这种超氧化物来源的受体依赖性激活。然后可能会出现过氧亚硝酸盐的形成增加和PARP随后的活化。随着年龄的增长，内皮功能障碍可能是由于NO-介导的正常信号丢失以及包括PARP在内的其他机制激活所致。
总结和影响。
衰老对脑循环有巨大的负面影响。随着年龄的增长，脑血管疾病、中风、阿尔茨海默病和血管认知障碍的发病率显著增加(19,36). 更好地了解促发血管疾病的机制，可能有助于深入了解延缓脑血管疾病进展的方法。在这项研究中，我们使用生理、药理学和遗传学方法来确定衰老过程中促进氧化应激和血管功能障碍的机制。我们的数据表明，年龄增长导致脑血管内皮功能障碍比脑外血管内皮功能障碍更严重，这种功能障碍由ROS介导，可能涉及PARP的激活。我们的研究结果还表明ANG II和AT具有新的基础作用1年龄相关性血管功能障碍中的受体。内皮功能障碍对大脑的影响尤其深远，因为内皮影响血管肌肉和血液元素以及神经信号和神经发生(5). 这些影响的丧失可能导致认知能力下降(35)并影响受伤后的恢复。
