结果和讨论
DIM-5的总体结构
我们使用了重组DIM-5蛋白（蛋白质数据库登录号的残基17至318｛“type”：“entrez核苷酸”，“attrs”：｛“text”：“AF419248”，“term_id”：“17063800”｝AF419248型)用于晶体学研究（参见实验程序）。利用三种锌离子的多波长反常衍射数据计算电子密度图(). 建立了DIM-5模型，并将其细化至1.98º分辨率，晶体学R因子为0.205和R自由的值为0.258。最终模型包括1913个蛋白质原子（平均B值为26.92)，3个锌离子和103个水分子，键长和角度的均方根偏差分别为0.008Å和1.5°。
表1
| 导数 | 天然（锌） | | |
|---|
| 波长（Ω） | 1.0332 | 1.2834 | 1.2830 |
| 分辨率范围（Ω） | 24.83-1.98 | 24.83-2.3 | 24.83-2.3 |
| 完整性（%）一 | 97/95.8 | 98.8/95.3 | 98.8/94.0 |
| R线性（%）一 | 0.055/0.276 | 0.063/0.184 | 0.067/0.227 |
| <I/σ（I）> | 15.4 | 18.6 | 18.6 |
| 观察到的反射 | 112,569 | 77,000 | 78,335 |
| 独特的反射 | 20,963 | 13,923 | 14,065 |
| 异常锌位置 | 三 | 三 | 三 |
| 整体绩效数字 | 分辨率为2.9º时为0.48 | | |
| 整体Z得分值 | 20.13分辨率为2.9Å | | |
我们对DIM-5的结构测定使我们能够对SET蛋白进行结构导向序列比对()其中包括人类SUV39家族蛋白，迄今为止报道的所有经验证的活性HKMT，以及三种细菌SET蛋白。318残基DIM-5蛋白是SUV39家族中最小的成员。它包含四个片段：（1）一个弱保守的氨基末端区域（浅蓝色），（2）一个包含九个不变半胱氨酸的前SET结构域（黄色），（3）包含NHXCXPN和DY（洋红色）的特征基序的SET区域（绿色），以及（4）包含三个不变半胱氨酸的SET后区域（灰色）。9 Cys预SET区域是SUV39系列独有的，而SET后区域也存在于SET1和SET2系列的许多成员中(Kouzarides，2002年)，甚至在一种细菌SET蛋白中苛求木霉(). 两个活跃的人类HKMT既不包含SET前区域，也不包含SET7后区域(Wang等人，2001a)（也称为SET9[Nishioka等人，2002a])组蛋白H3和SET8的甲基化赖氨酸4(Fang等人，2002年)（也称为PR-SET7[Nishioka等人，2002b])甲基化H4的赖氨酸20。
预SET残基（黄色）形成一个9 Cys笼，包围一个三角形锌簇(). SET残基（绿色）折叠成围绕催化甲基转移位点（品红色）的六个β片，β片上方有螺旋帽（αF）。氨基末端残基（浅蓝色）似乎对分子的结构完整性至关重要：38个残基片段以所示方向几乎贯穿分子的整个背面()，为三个单独的β板提供边缘链（β1、β2或β3），并将1圈螺旋αa连接到预先设置的三角锌笼。分子的总尺寸为60×50×30Ω。三角形锌簇和辅因子结合位点相距约38º，位于分子最长维度的两端(). 可以看到从辅因子结合位点到锌簇的缝隙().
DIM-5结构（A） 色带图正视图(卡森，1997年)（顶部，立体声；底部，单声道）。蛋白质的颜色根据，三个锌离子是红色、绿色和蓝色的球（如C中所示）。差异电子密度图（黑色）的等高线为平均值以上5.5σ，表明假定的辅因子结合位点（由突变型测试支持）。
（B） 侧视图。虚线表示链β17（洋红色）和SET后片段（灰色）之间的无序氨基酸。
（C） 三角形锌簇立体图。三个锌离子被染成红色、绿色和蓝色，桥联半胱氨酸残基被染成橙色，而非桥联半月氨酸残基则被染成与其相关的锌离子相匹配的颜色。原子是灰色（碳）和黄色（硫）。DIM-5的预SET序列如上图所示。两个富含Cys的片段共同协调红色和蓝色锌离子，而绿色锌离子仅由五个Cys片段协调。
Pre-SET结构域形成三角形锌簇
前SET结构域包含九个不变的半胱氨酸残基，这些残基分为五个和四个半胱氨酸的两个片段，由不同数量的氨基酸分开（DIM-5中的46个）。这九个半胱氨酸协调三个锌离子形成等边三角形簇(). 每个锌离子由两个独特的半胱氨酸（共六个）配位，其余三个半胱氨酸残基（C66、C74和C128）分别由两个锌原子共享，从而充当完成金属原子四面体配位的桥梁。锌原子之间的距离为~3.9º，Zn-S距离为~2.3º。在参与锌代谢、锌转移和细胞凋亡的金属硫蛋白中可以发现类似的金属硫代物簇（综述于瓦萨克和哈斯勒，2000年). 甲硫堇素通常有两个金属簇：a（Me）三赛斯9和a（我）4赛斯11，我可以成为Zn2+，镉2+，铜2+或其他重金属。DIM-5的三锌簇可以完美地叠加在（Zn）上2镉）Cys9大鼠金属硫蛋白簇(Robbins等人，1991年)（未显示）。这种明显相似性的意义尚不清楚。
SET域构成活动站点
SET域类似于由螺旋帽（αF、αG、αH和αI）覆盖的方形β桶。四张β板-（1↑5↑6↓）、（7↑16↓），（4↓14↑15↓8↑）和（3↑9↑11↓10↑）-形成桶的侧面，一张板-（2↓12↓）-构成一端(). 桶开口端的中间是一个交叉结构（品红色），通过将β17-环穿过链β13和β14之间的短环形成的开口而形成。这将SET结构域的两个最保守区域结合在一起：αJ-β13-环（N241HXCXPN公司247)和β17-环（DY283) (). 这两个高度保守的链段的侧链参与（1）疏水性结构堆积（αJ的I240和β17的L279和F281），（2）分子内侧链-主链相互作用（在P246处急转弯后，N247的侧链与E278的主链羰基氧和T280的主链酰胺氮相互作用），（3）AdoMet结合位点和活性位点形成（αJ的R238和F239，N241:E278对，H242:D282对，Y283）。这些不变残基通过成对相互作用聚集在一起，例如N241和E278之间以及H242和D282之间的相互作用，在紧邻AdoMet结合囊和肽结合间隙的位置形成活性位点（见下文）。
DIM-5的酶学性质
DIM-5蛋白在体外是一种非常活跃的HKMT。我们注意到DIM-5的几个相当不寻常的特性。（1） 在我们的实验室条件下，酶在~10°C时最活跃，在37°C时几乎不活跃(). （2） DIM-5对盐极为敏感，例如100 mM NaCl将其活性抑制约95%(). （3） 这种酶具有较高的最适pH值。DIM-5在~pH 9.8时表现出最大活性()，尽管在pH值8左右，它与AdoMet的交联最强(). 在pH 6.0以下未观察到HKMT活性和AdoMet结合。
重组DIM-5的酶学性质HKMT活性随（A）温度、（B）盐浓度、（C）pH值和（D）AdoMet交联随pH值变化。所用缓冲液为50 mM柠檬酸钠，pH值为5.0-6.0，MES为6.0-6.5，HEPES为7.0-7.5，Tris为8.0-8.5，Bicine为9.0，甘氨酸为9.35-10.7。为了排除柠檬酸钠的潜在抑制作用，柠檬酸钠和Mes均用于pH 6.0。
（E） 具有保守点突变的DIM-5突变体的活性。所有突变蛋白的表达水平与野生型相似，尽管有些蛋白不易溶解，而且都是单体蛋白，这表明没有任何突变导致蛋白的总聚集。使用不同量的突变酶，将其活性与以相同方式纯化的野生型酶的系列稀释液的活性进行比较，并估计突变蛋白相对于野生型的比活性。所示活动是至少两次测量的平均值。
（F） 显示了pH 8.0下AdoMet交联实验的荧光结果以及考马斯染色结果，以控制测试的突变蛋白量。
辅酶装订袋
所有已知的HKMT均使用AdoMet作为甲基供体。AdoMet或其反应产物AdoHcy最常见的构象是在所谓的共识MTases中发现的。这些MTase是围绕一个混合的七品牌β片构建的，它们包括20多个具有结构特征的MTase，作用于DNA、RNA、蛋白质或小分子底物中的碳、氧或氮原子(Cheng和Roberts，2001年). DIM-5与这些AdoMet依赖性蛋白没有结构相似性，似乎使用了与其辅因子完全不同的相互作用方式。
在DIM-5分子一端与三角形锌团簇相反的开口口袋中观察到不同的电子密度(和). 我们将此密度解释为晶体生长过程中出现的辅因子产物AdoHcy（见实验程序）。虽然AdoHcy的一部分可以适应密度（未显示），但很难适应整个分子，特别是因为AdoHcy的腺嘌呤环没有可识别的密度。这可能反映了绑定到DIM-5的辅因子的灵活性。与AdoMet/AdoHcy结合在腺嘌呤环两侧疏水堆积的相对封闭口袋中的“共识”MTase不同(Fauman等人，1999年)，我们观察到的密度位于一个开放的口袋中，位于反向平行链β5和β6的上方，紧靠短螺旋αJ(). 这种环境可能有助于提高其灵活性，或允许在没有基底的情况下进行多种构象。灵活性也可能是由于结晶过程中pH值较低（pH值5.4–5.6）造成的，在这种情况下，未观察到AdoMet与蛋白质的紫外线交联(). 在低pH值下，腺嘌呤环与DIM-5的相互作用可能不够稳定，无法与蛋白质交联或在结构中观察到。
协同因子结合和活性位点拟议辅因子结合位点和相邻活性位点的特写视图（顶部，立体；底部，单声道）。差分电子密度图（蓝色）的等高线为5.5σ；水分子编号为1-4。虚线表示氢键。残留物的颜色如所示第2位的水与R238的主链羰基氧原子和第1位和第3位的水分子氢键结合，然后分别与N241的侧链羰基氧气和Y204的侧链羟基氧相互作用。
这种密度的重要性因其周围高度保守的残基而进一步增强。两个保守的精氨酸（β5的R155和αJ的R238）和三个芳香残基（W161、Y204和F239）直接接触密度(). 这两种精氨酸的侧链被其他保守残基锁定：R155的胍基平行于W161吲哚环和D35离子对的平面；R238的胍基被三个芳香环F43、F239和Y204包围，其两个末端氮原子（N∊和Nη2）分别与G230和E231的主链羰基氧原子形成氢键().
我们对围绕该密度的几个残基进行了保守取代：R155H、W161F、Y204F和R238H（见实验程序）。所有突变体的酶活性降低了75%（W161F）到几乎不活跃（R238H）(). 通过交联测定，这些突变体结合AdoMet的能力也降低了，但并未消除(). 似乎只有AdoMet结合减少才能解释R155H、W161F和Y204F突变的HKMT活性减少。然而，R238H突变导致HKMT活性的降低比AdoMet结合的降低大得多，这表明R238也可能在催化的其他方面发挥作用（见下文）。在SUV39H1和SUV39H2中，组氨酸位于DIM-5中R238的位置；将组氨酸改为精氨酸导致SUV39H1的活性至少增加20倍(Rea等人，2000年)与DIM-5的反向R238H突变体的活性大大降低一致。
推测肽结合裂痕
推测的辅因子结合位点沿表面产生的缝隙可能是底物多肽的结合位点(). 该裂缝的一侧由链β10（绿色)-β片的最外层链（3↑9↑11↓10↑）-另一侧由链β17之后的环形成，这是无序羧基末端残基（286–299）的开始。
推测肽结合裂痕（A） GRASP表面前视图(Nicholls等人，1991年). 差电子密度图（黑色）的等高线为5.5σ。股β10为绿色，N241、H242和Y283为洋红色，C244为黄色。
（B） 叠加果蝇属HP1β链（浅灰色）(Jacobs和Khorasanizadeh，2002年; PDB代码1KNA）和DIM-5链β10（绿色）。虚线表示HP1和H3肽（黄色）之间的氢键。HP1肽另一侧的DIM-5残基为洋红色。二甲基化（黑色中的甲基）目标氮原子占据水位置2（参见). 组蛋白H3肽的序列显示在底部；K4和K14都与K9相距五个残基。
（C） 对接的H3肽位于假定的肽结合间隙中。如图所示，裂缝在转弯后向两个方向延伸。表面电荷分布显示为蓝色表示正极，红色表示负极，白色表示中性。
（D） 活性位点NPPY残留物的叠加塔克I DNA-腺嘌呤氨基转移酶（灰色）(Goedecke等人，2001年; PDB代码1G38）和提议的DIM-5活性位点残留物N241、H242和Y283（品红色）。在这两种情况下，Tyr都是氢键连接到主链酰胺氮原子（虚线键）。
结构研究表明，异染色质蛋白HP1通过在两条HP1链之间插入一条反平行的β链，与甲基化组蛋白H3肽结合，形成一个杂交的三链β片(Jacobs和Khorasanizadeh，2002年;尼尔森等人，2002年). 受到DIM-5裂的一侧是一条链（β10）这一事实的鼓舞，我们叠加了HP1β链(果蝇属HP1残基60–62）到DIM-5链β10上（残基205–207）(). 重叠将H3肽（如HP1中观察到的Q5-S10）放置在DIM-5裂中()和肽另一侧β17链后面的残基Y283-V284-N285(). HP1中使用了诱导fit机制，其中游离HP1的氨基末端在与H3肽相互作用时采用β链状构象(尼尔森等人，2002年). 以类似的方式，H3肽的结合可以诱导DIM-5的残基Y283-V284-N285和随后的无序残基采用更稳定的β链构象，该构象与肽相互作用以形成杂交片。
目标赖氨酸结合位点
对接实验最有趣的结果是靶K9紧邻假定的辅因子结合位点()目标氮原子占据水分子的位置（位置2 in). 我们认为水位点2可能是DIM-5的活性位点，其中末端氨基（NH三)底物赖氨酸与R238的主链羰基氧原子形成氢键。许多高度保守的残基，主要来自两个特征基序（洋红），围绕着这个位置。N241、H242、Y283和Y204的侧链立即围绕站点2形成一个内圈(). 残基E278、D282和Y178通过与内环残基的相互作用形成外环：E278与N241相互作用，D282与H242相互作用，Y178通过水分子与Y283相互作用（位点4）(). 与蛋白质精氨酸MTases或小分子甘氨酸N-MTase不同，后者使用酸性残基中和底物氨基上的正电荷(Fu等人，1996年;Zhang等人，2000年)，DIM-5的拟定活性位点中不立即存在酸性残留物。然而，螺旋αJ羧基端的负偶极矩（R238和F239）、负极化主链羰基氧原子（I240和W161）、Y178、Y204和Y283的侧链羟基氧原子的组合，N241的天冬酰胺氧原子可能会增加氮电子密度，使其足以对AdoMet甲基砜基团进行亲核攻击。质子消除步骤和甲基转移很可能是通过涉及H242和D282的电荷中继系统完成的，与蛋白质精氨酸MTases中的情况类似(Zhang等人，2000年).
与该机制一致的一个观察结果是DIM-5的异常高的最佳pH值（~10）()尽管事实上AdoMet结合在低pH值溶液中更有利(). 在pH值为10时，目标赖氨酸的氨基（典型pKa值为10）可部分中和，活性位点附近的保守酪氨酸Y283、Y204和Y178（也具有典型pKa10）可脱质子化；这两种脱质子都会促进甲基转移。
活性位点残基的重要性得到了定点突变实验的支持。紧邻水位点2的三个残基（N241Q、H242K和Y283F）的保守变化基本上消除了HKMT的活性(). Y283F的残余活性最低，表明Y283的羟基是关键的；它与I240的主链酰胺氮氢键结合，紧邻水位点2。Y283也是SET结构域最保守的残基之一，在Pfam数据库中的大多数含SET的蛋白质中是不变的。两个可能参与质子消除的残基H242K和D282N的突变分别抑制和降低了HKMT的活性。正如预期的那样，这两个突变体都保留了AdoMet交联，尽管水平有所降低(). N241Q和Y283F突变蛋白中AdoMet交联的完全丧失有些出乎意料。对于N241Q，可能较长的谷氨酰胺侧链阻止了N241侧链氨基与W161的主链羰基和E278侧链之间形成两个氢键(). 中断W161-N241-E278相互作用可能会破坏局部结构，与W161F突变体中的侧链替换相比具有更有害的影响。N241和Y283也可能与AdoMet的腺嘌呤环相互作用，这可能与紫外线交联有关，但在晶体中未观察到。
DIM-5的假定活性位点让人想起DNA中腺嘌呤或胞嘧啶的氨基甲基化所涉及的一致NPPY基序(Blumenthal和Cheng，2001年;Goedecke等人，2001年;Gong等人，1997年)和肽释放因子中的谷氨酰胺(Heurgue-Hamard等人，2002年;Nakahigashi等人，2002年). 值得注意的是，DIM-5的不变量N241和Y283可以叠加到NPPY的第一个和最后一个氨基酸上塔克I DNA腺嘌呤MTase(). 这表明组蛋白赖氨酸MTases和DNA氨基酶之间的催化机制具有潜在的相似性。在后一种情况下，氨基（NH2)甲基化后，通过氢键与连接两个不灵活脯氨酸的主链羰基结合，对AdoMet进行顺时针攻击(Goedecke等人，2001年). DIM-5中的等效主链羰基可能是R238。由于这种特殊的羰基需要相对固定以阻碍结合在位点2的氨基的自由旋转，因此R238H突变体中HKMT活性的大幅降低可能是由于主链羰基氧原子位置的微小变化或灵活性导致的，主链羰基氧原子未能与目标氨基正确相互作用。
组蛋白中观察到了单甲基、二甲基和三甲基赖氨酸(杜尔和查克拉巴蒂，1975年)但是关于单个残基的甲基化状态的信息很少。然而，我们发现DIM-5能有效地甲基化组蛋白H3肽的二甲基化赖氨酸9，并且DIM-5能够向组蛋白H4肽的K9添加1-3个甲基（H.T.、X.Z.、D.McMillen、J.Nakayama、P.Singh、D.Allis、S.Grewal、X.C.和E.U.S.的未公开数据）。我们建议将供水点1和3()氢键连接到位点2，可以在单甲基和二甲基赖氨酸底物上容纳甲基。这些额外的相互作用可能有助于定位氮原子并增强其反应性。
Post-SET域
C末端，包括SET后区域，除了残基299和308之间的片段（灰色). 这10个残基片段通过M303在硒代蛋氨酸取代的DIM-5蛋白中鉴定（见实验程序），稳定在两个晶体相关分子之间的界面上。我们假设该片段（以及相邻的无序残基）在与底物结合时将采用不同的结构。SET后区域包含三个保守的半胱氨酸残基，似乎对SUV39家族中的HKMT活性至关重要。将所有三种半胱氨酸改为丝氨酸（3C-S）可消除DIM-5活性()，正如SETDB1中C1279的Cys到Tyr取代(Schultz等人，2002年)，对应DIM-5的C306。虽然三个SET后半胱氨酸的确切作用不能从当前结构中确定，但一个有趣的可能性是，当与来自由特征基序N形成的环的第四个半胱氨酸结合时241HXCXPN公司247（PerDIM-5中的C244），这些形成了额外的金属结合位点。一些观察结果与这个假设一致。（1） 在我们迄今为止检查的50多个SET蛋白序列中，SET后的存在与DIM-5的C244对应的半胱氨酸之间似乎存在绝对相关性（参见例如）。此外，将SUV39H1或SETDB1中对应于C244的Cys替换为丙氨酸，从而取消了HKMT的活动(Rea等人，2000年;Schultz等人，2002年). （2） DIM-5蛋白质的总锌含量为3.51()，表明存在三个以上的锌离子。（3） 金属螯合剂菲咯啉或EDTA与DIM-5蛋白孵育抑制其活性并显著降低AdoMet结合(). 有趣的是，即使EDTA完全消除DIM-5活性，该蛋白仍保留约三（2.9）个锌离子(). 由于三角形锌簇是相当稳定的，可以想象螯合的锌是由三个SET后半胱氨酸和C244配位的（黄色)，位于活动场地附近。（4） 与金属螯合剂一样，三种半胱氨酸（3C-S）的同时突变也会导致DIM-5活性和AdoMet交联的完全丧失()与SET后半胱氨酸参与AdoMet结合的想法一致。也许所观察到的SET后障碍部分或全部是当前结构中青春期密度低的原因。
金属螯合剂抑制DIM-5活性（A） 使用和不使用EDTA处理DIM-5的锌含量分析。DIM-5蛋白与20 mM EDTA孵育2天，此时不再检测到HKMT活性。为了去除与EDTA结合的锌，对蛋白质进行透析（Exp1）或针对20 mM甘氨酸（pH 9.8）、5%甘油、0.5 mM DTT和1 mM EDTA进行凝胶过滤色谱（Exp2）。
（B） 将纯化的DIM-5蛋白（1 mg/ml溶于20 mM甘氨酸[pH9.8]，5%甘油中）与不同浓度的1,10-菲咯啉或EDTA在4°C下孵育18小时。将酶稀释80倍，在标准条件下测定HKMT活性，但不存在DTT。
（C） EDTA存在下AdoMet交联的荧光结果。
结论
我们测定了组蛋白H3赖氨酸9 MTase DIM-5的晶体结构N.克拉萨，并进行了突变和生化研究，以阐明该酶的机制。我们发现，前SET区域高度保守的残基形成一个三角形的锌簇，Zn三赛斯9SET结构域中的残基对辅因子结合和甲基转移至关重要。SET结构域也有一个裂缝，该裂缝可能是组蛋白H3可甲基化氨基末端尾部的结合位点。SET后区域还可以通过与活性位点附近的保守半胱氨酸结合形成另一个锌结合位点来促进辅因子结合和催化。这些结果提供了对SUV39家族组蛋白H3赖氨酸9 MTases的常见折叠和催化机制的见解。最后，这项工作提供了一个完全无关、结构不同的蛋白质的例子，它们执行一种共同的功能，在本例中是依赖于AdoMet的甲基转移。
实验程序
蛋白质表达与纯化
N.克拉萨DIM-5蛋白以GST融合表达。野生型的一部分尺寸-5ORF，包括氨基酸残基17–318，从pGEX-5X-3/DIM-5中扩增(Tamaru和Selker，2001年)并在巴姆HI和生态在pGEX2T（Amersham Pharmacia）中的RI位点，得到pXC379。大肠杆菌携带pXC379的菌株BL21（DE3）Codon plus RIL（Stratagene）在添加10µM ZnSO的LB培养基中生长4在37°C至外径600=0.5，移到22°C，在22°C下用0.4mMIPTG诱导过夜。使用谷胱甘肽-Sepharose 4B（Amersham-Pharmacia）、UnoQ6（Bio-Rad）和Superdex 75柱（Amersham-Pharmacia）纯化蛋白质。通过将凝血酶应用于与谷胱甘肽-Sepharose柱结合的融合蛋白，将GST标记裂解，在DIM-5的氨基酸17前面留下五个额外的残基（GSHMG）。所有纯化缓冲液均含有1 mM DTT，无EDTA。将蛋白质储存在含有20mM甘氨酸（pH 9.8）、150mM NaCl、1mM DTT和5%甘油的Superdex 75柱缓冲液中。含Se的DIM-5（含五种蛋氨酸）在含有Se-蛋氨酸的蛋氨酸营养缺陷型菌株（B834）中表达，该蛋白的纯化与天然蛋白类似。
甲基转移活性测定
在含有50 mM甘氨酸（pH 9.8）、2 mM DTT、40–80µM未标记的AdoMet（Sigma）、0.5µCi[甲基]的20µl反应中测定活性-三H] AdoMet（78 Ci/mmol，NEN NET155H）、0.25-0.5µg DIM-5蛋白和2-5µg组蛋白（小牛胸腺组蛋白Sigma H4524、罗氏223565或重组鸡红细胞组蛋白，V.Ramakrishnan博士赠送）。将反应在室温下孵育10–15分钟，通过SDS-PAGE和荧光成像或20%TCA沉淀、过滤（Milipore GF/F过滤器）、洗涤和液体闪烁计数分析甲基化。在此条件下，DIM-5活性与反应时间和酶量呈线性关系，AdoMet和组蛋白饱和。由于某些原因，相对粗糙的Sigma H4524组蛋白制剂的掺入量通常比Roche制剂或重组组蛋白高2-4倍。
紫外交联法测定AdoMet结合
用0.5µCi的[甲基]培养20微升纯化DIM-5蛋白（2-5µg）-三H] AdoMet（78 Ci/mmol，NEN NET155H）在4°C下过夜。将样品添加到96 well板上的冰上，并将其放置在距离反向紫外线透射仪（VWR，302 nm）8 cm处1小时。然后用SDS-PAGE分离蛋白质，用考马斯染色，并进行荧光照相。
突变
使用Quik-Change定点突变协议（Stratagene），使用pXC379和引物对生成CAC、TTC、TTC、CAC、CAG、CAG，CAG、AAA、AAC和TTC密码子代替AGG、TGG、TAC、AGG、AAC、GAC和TAT密码子，对DIM-5进行氨基酸替换，以生成R155H、W161F、Y204F、manuR238H、N241Q、H242K、D282K和Y283F，分别是。使用诱变3′引物通过PCR产生DIM-5突变体3C至3S，其中SET后区域的所有三个不变半胱氨酸均被丝氨酸取代。对所有突变体进行测序，以验证是否存在预期突变以及是否存在其他突变。唯一的例外是Y204F突变体，该突变体在N末端区域携带一个额外的天冬氨酸替代物（A24D），这在结构中没有观察到。从100–200 ml诱导培养物中纯化突变蛋白和野生型蛋白。每个突变株使用含有0.5 ml谷胱甘肽-Sepharose 4B（Amersham-Pharmacia）的一次性柱。通过柱上凝血酶裂解从GST中分离出突变蛋白，然后用于酶分析（以小牛胸腺组蛋白Sigma H4524为底物）、通过交联分析进行AdoMet结合，以及用于测定天然蛋白大小的分析凝胶过滤色谱。
锌含量分析
在雅典乔治亚大学化学分析实验室的Thermo Jarrell Ash Enviro 36 ICAP分析仪上分析一个未处理的DIM-5蛋白样品和两个EDTA处理的DIM-5蛋白样品（各约2ml 2mg/ml）是否存在20种元素。为了计算锌与蛋白质的摩尔比，通过在耶鲁大学凯克设施进行的氨基酸分析（两次独立测量的平均值）确定未处理DIM-5蛋白质的精确浓度。消光系数（29559 M−1厘米−1)通过氨基酸分析得出的结果用于估计EDTA处理样品的蛋白质浓度。
晶体学
在20 mM甘氨酸（pH 9.8）、150 mM NaCl、1 mM DTT、5%甘油和600µM AdoHcy中将纯化的DIM-5蛋白浓缩至约10-15 mg/ml。采用挂滴法获得晶体，母液中含有1.1–1.2 M硫酸铵和100 mm柠檬酸钠（pH 5.4–5.6），温度为16°C。晶体属于P2空间组12121电池尺寸为36.73×81.56×101.27º。每个不对称单元包含一个分子。完整的数据集是从锌吸收边缘附近的天然晶体中收集的()以及硒和锌吸收边处的SeMet掺杂晶体（未显示）。使用HKL软件包处理数据(Otwinowski和Minor，1997年). 解决方案(Terwilliger和Berendzen，1999年)首先揭示了三个锌原子的位置，然后RESOLVE(特威利格，2000年)然后用于修改电子密度图。修改后的图谱在2.9Å的分辨率下具有良好的质量，可以使用O将DIM-5的氨基酸置于可识别的密度中(Jones和Kjeldgard，1997年). 同时，SOLVE确定了五个硒原子的位置：其中两个硒原子（SeMet 233和248）通过锌相图确认，其中三个硒原子在追踪过程中作为初级序列的标记（SeMet75、85和303）。使用X-PLOR程序套件，根据在波长1.0332 Au、分辨率24.8–1.98 Au范围内收集的数据，对所得模型进行了改进(布伦格尔，1992年). 在最终模型中未观察到DIM-5的三个片段：N端8个残基（17-24）（这些残基可能不存在于天然DIM-5蛋白中，因为在这些残基之后有一个框内剪接位点）；前SET结构域的残基89–99（在许多SUV39蛋白质中被删除）（参见); 以及大多数C末端34个氨基酸（除了SET后的三个Cys区域外，C末端在SET蛋白的长度和序列上也有很大差异）。在非甘氨酸和非脯氨酸残基中，86%最受欢迎，14%在拉马钱德兰地块的其他允许区域(拉斯科夫斯基，1993年).
