Cisd2缺乏导致小鼠过早衰老并导致线粒体介导的缺陷

早衰表型

从8周大开始，Cisd2公司^−/−小鼠开始出现一系列明显类似于早衰综合征的衰老现象(Hasty等人，2003年;Kipling等人，2004年). 这些包括突出的眼睛和突出的耳朵(图1C). 观察到眼部异常Cisd2公司^−/−小鼠在20周大时出现不透明的眼睛和失明，并伴有角膜损伤(图1D). 组织病理学检查显示角膜混浊是由于角膜外瘢痕组织中的碎屑沉积所致(图1E). 此外，角膜新生血管在顺时针方向2^−/−老鼠；这可能会损害视力，通常与眼外伤或退行性疾病引起的发病机制有关（补充图5）。48周龄时，皮毛也出现早期脱色(图1F; 补充图6）；此外，在Cisd2公司^−/−老鼠(图1G、H). 在Cisd2公司^−/−小鼠（补充图7A、B）。此外，48岁老人的皮肤Cisd2公司^−/−小鼠表现出皮肤明显增厚、表面扩张、皮下脂肪组织和肌肉显著减少的表型(图1I–K).

微机断层扫描（micro-CT）显示股骨小梁在Cisd2公司^−/−老鼠(图2A). 双能X射线吸收仪（DEXA）检测到8周龄后股骨密度下降；有趣的是，在杂合子中股骨密度也开始下降Cisd2公司^+/−小鼠，但在24周龄时，在与Cisd2公司^−/−老鼠(图2B). 这表明，除了在寿命评估方面观察到的情况外Cisd2公司股骨密度的单倍不足。从大体解剖角度、X射线照相和显微CT的结果显示，12周龄后出现了显著的后凸畸形表型(图2C、D; 补充图7C、D）；因此，这似乎导致平均胸腔容积减少(图2E)然后是肺功能异常。事实上，我们观察到，在20周大的婴儿中，通过容积描记法测量的各种呼吸参数都有所下降Cisd2公司^−/−小鼠（补充图8）。在3周龄时，在Cisd2公司^−/−老鼠。肌肉纤维进行性退化，退化程度随着年龄的增长而加剧(图2F–J); 通过透射电子显微镜（TEM）进一步证实了肌肉变性（补充图9）。此外，角纤维是神经元变性引起的肌肉萎缩的标志，在Cisd2公司^−/−老鼠(图2H).

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图2。

骨骼和肌肉异常以及胸部容积减少Cisd2公司^−/−老鼠。(A类)12周龄股骨小梁的显微CT成像。小梁厚度在Cisd2公司^−/−鼠标。(B类)采用DEXA分析骨量减少。8周龄时检测到股骨密度下降Cisd2公司^−/−老鼠。在24周龄时，也检测到股骨密度下降Cisd2公司^+/−24周龄时，小鼠的表型变得更加严重Cisd2公司^−/−老鼠。(C类)野生型小鼠和Cisd2公司^−/−16周龄小鼠。这个Cisd2公司^−/−小鼠表现出脊柱后凸（脊柱弯曲）表型。(D类)显微CT扫描可以对胸椎和脊柱进行三维重建。(E类)明显的后凸畸形导致Cisd2公司^−/−小鼠与野生型同窝小鼠进行比较。(F类,G公司)4周龄和28月龄野生型小鼠骨骼肌横切面的H&E染色。(H（H）,我)4周龄和8周龄的肌肉退化Cisd2公司^−/−通过骨骼肌横切面的H&E染色检查小鼠。黑色箭头表示存在于Cisd2公司^−/−在自然衰老的小鼠中也是如此。蓝色箭头表示有角的纤维，这是神经元变性引起的肌肉萎缩的一个标志。(J型)骨骼肌中退化纤维的量化。(*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.005.

加速衰老表型的一个可能机制是Cisd2公司^−/−老鼠。为了测试这种可能性，我们从不同基因型的单个胚胎中创建了几种原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞系。我们的结果显示，加倍时间和MEF细胞生长没有显著差异（补充图10），这表明Cisd2公司^−/−小鼠不是由于细胞增殖的内在缺陷。

衰老相关表型综述Cisd2公司^−/−补充表2中提供了小鼠。使用C57BL/6（B6）或129Sv/B6混合背景，这些突变小鼠表现出早衰表型，两性外显率均为100%。

线粒体变性和自噬

对涉及肌肉退化的早衰表型的观察促使对纯合子敲除小鼠的组织超微结构进行了详细检查。TEM研究表明，坐骨神经、脑细胞的轴突发生线粒体变性(图3A-C)心肌细胞和骨骼肌细胞(图3D-F)在中Cisd2公司^−/−老鼠。值得注意的是，线粒体外膜（OM）似乎在内嵴破坏之前就已经破裂了(图3B、E). 在野生型小鼠中，有髓轴突被髓鞘包裹，髓鞘由雪旺细胞的多层质膜融合而成(图3G). 然而，髓鞘的大量解体和轴突的变性在Cisd2公司^−/−坐骨神经(图3H，I). 重要的是，这些线粒体异常，包括线粒体破坏、髓鞘解体和轴突损伤，在2周龄时已在一定程度上出现Cisd2公司^−/−老鼠(图3J–L; 补充图11），这是这些小鼠肌肉和神经退化的第一个过早老化表型之前的一个阶段。有趣的是，受损的线粒体似乎会诱导自噬以消除功能失调的细胞器(Kim等人，2007年)因为我们发现了形态不同的自噬空泡(Eskelinen 2008年)肌肉、坐骨神经、视神经和脑组织(图3J–L; 补充图12）。自噬空泡是指自噬体、两性体或自溶体。形态学上，自噬液泡可分为两类：（1）早期或初始自噬空泡（AVis），即自噬体，它是含有未消化细胞质物质或细胞器的双层膜结构；（2） 晚期或降解性自噬液泡（AVds），包括两性体和自溶体，其中含有部分降解的细胞质物质(Eskelinen 2008年;Fader和科伦坡2009). 值得注意的是，线粒体变性随着年龄的增长而加剧，自噬的程度与早衰表型的发展平行增加(图3M，N). 测量坐骨神经髓鞘厚度，计算有髓轴突数量；我们的研究结果显示，不同基因型之间没有显著差异（补充图13），表明这两个因素与Cisd2公司^−/−老鼠。我们还检测了自噬体标记LC3-II(Kabeya等人，2000年)骨骼肌和心肌是体内自噬降解最敏感的组织(水岛等人，2004年); 事实上，LC3-II/LC3-I的比率在Cisd2公司^−/−与野生型同窝小鼠相比。这一生化证据证实了TEM的结果，并为自噬诱导提供了定量依据(图3O、P).

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图3。

大鼠肌肉和神经元的线粒体变性和自噬诱导顺时针方向2^−/−老鼠。(A类)大脑（海马体）中的野生型线粒体。(B类)A类Cisd2公司^−/−大脑（海马体）中的线粒体。请注意，线粒体外层膜已经破裂（箭头），而内嵴似乎完好无损。(C类)Cisd2公司^−/−坐骨神经线粒体。一个线粒体（箭头）有一个损坏的OM，但仍可见嵴；另一个线粒体（箭头）破坏了OM和IM。(D类)心肌中的野生型线粒体。(E类)Cisd2公司^−/−心肌线粒体。这张显微照片显示，一个线粒体（箭头）的OM被破坏，两个退化的线粒体由碎片组成（箭头）。(F类)在肌原纤维之间观察到一簇自噬空泡和异常线粒体Cisd2公司^−/−骨骼肌（白色箭头）。(G公司)坐骨神经的野生型有髓轴突。（N） 雪旺细胞核；（MS）髓鞘。(H（H）)坐骨神经的有髓轴突Cisd2公司^−/−鼠标。图中显示了一个卵球形体，其髓鞘解体，轴突成分退化。(我)轴突变性的碎片Cisd2公司^−/−坐骨神经。(J型——L（左）)在2周龄雪旺细胞的轴突成分和细胞质中检测到早期或AVis包裹线粒体（箭头）和晚期或AVdsCisd2公司^−/−坐骨神经。(M（M）,N个)坐骨神经中有髓轴突的百分比显示其髓鞘解体，轴突成分中有自噬空泡，包括AVi和AVd。每组有三只小鼠。(O（运行）)Western blotting检测蛋白LC3-I和LC3-II的存在。(P（P）)LC3-II与LC3-I的比率。每组有三只小鼠。(*)P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.005. 老鼠年龄A类——我4周大。

自噬可通过直接激活自噬（II型程序性）细胞死亡导致细胞死亡，从而产生死亡细胞的自我分级(Shimizu等人，2004年;Mizushima等人2008); 或者，自噬可能通过激活凋亡导致细胞死亡(Scott等人，2007年). 为了确定细胞凋亡是否增加Cisd2公司^−/−我们对小鼠的各种组织进行了TUNEL分析，以原位检测凋亡细胞，并没有发现凋亡增加的证据Cisd2公司^−/−小鼠（补充图14）。此外，有报道称饥饿可以诱导肌肉自噬(水岛等人，2004年). 为了测试这种可能性，我们测量了代谢指数，包括食物和水的摄入量以及尿液和粪便的生成量。我们的结果显示，两组之间的代谢指数没有显著差异Cisd2公司^−/−和6周龄野生型小鼠（补充图15A）；这是在2周大时检测到自噬激活后4周。这不包括饥饿/营养不良作为自噬诱导的原因Cisd2公司^−/−老鼠。12周龄后，代谢指数明显下降（补充图15B），这可能是衰老表型的结果。

Cisd2可能是线粒体OM蛋白

Cisd2蛋白的注释特征与Cisd1非常相似，Cisd1是一种外线粒体膜蛋白（补充图16A；Wiley等人，2007年). 为了解决亚细胞定位问题，我们在NIH3T3细胞中表达了EGFP标记的Cisd2蛋白。我们的结果表明，Cisd2与线粒体标记物共定位（补充图16B）。然而，N端58个氨基酸的缺失完全取消了线粒体定位；此外，当N端58个氨基酸与EGFP融合时，这种结构能够将EGFP从细胞核和细胞质定位重定向到线粒体(图4A)，表明Cisd2是一种细胞核编码的线粒体蛋白，其N末端58个氨基酸对于指导线粒体定位是必要的和充分的。为了确认Cisd2蛋白的亚细胞定位，从野生型小鼠骨骼肌中制备了细胞溶质和线粒体组分。产生了针对Cisd1和Cisd2的抗体。Western blot分析显示Cisd2蛋白与线粒体蛋白Cisd1和Hsp60类似(Samali等人，1999年;Colca等人，2004年;Wiley等人，2007年)，主要定位于线粒体部分(图4B). 为了进一步确定Cisd2的亚线粒体定位，我们将小鼠肝线粒体分为以下部分：OM、有丝分裂体（MP、内膜[IM]和基质）和膜间间隙（IMS，IM和OM之间的可溶性物质）。用抗Cisd2抗体和已知标记物对每个组分进行免疫印迹分析，结果表明Cisd2在OM组分中高度富集，OM标记物VDAC-1也是如此；这一结果强烈表明Cisd2是一种线粒体OM蛋白(图4C).

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图4。

Cisd2主要定位于线粒体外膜，Cisd2缺乏导致线粒体功能障碍。(A类)EGFP标记的Cisd2蛋白通过N-末端信号序列定向到线粒体。EGFP-Cisd2蛋白在NIH3T3细胞中表达。EGFP标记的全长Cisd2蛋白与MitoTracker Red共定位，而N端58个氨基酸的缺失完全取消了线粒体定位。当N端58-氨基酸序列融合到EGFP时，该结构能够将EGFP从核质定位重定向到线粒体(B类)使用从12周龄小鼠骨骼肌制备的线粒体（Mito）和细胞溶质（Cyto）组分的蛋白质提取物，通过Western blotting分析Cisd2和Cisd1蛋白质的亚细胞定位。产生抗Cisd2蛋白（15kDa）的多克隆抗体；该抗体与Cisd1蛋白（12kDa）交叉反应。线粒体蛋白Cisd1和Hsp60的抗体用作对照。(C类)使用抗Cisd2抗体和已知线粒体标记蛋白，通过Western blot分析从4周龄小鼠肝脏制备的每个亚线粒体部分的10微克。OM标记：（VDAC-1）电压依赖性阴离子通道-1；IM标记：（ATP5B）复合物Vβ亚单位；基质标记物：（PDH）丙酮酸脱氢酶。（MP）微体（IM和基质）；（IMS）膜间空间。(D类)4周龄骨骼肌线粒体呼吸受损Cisd2公司^−/−老鼠。在氧气计的密闭室中首先添加谷氨酸-苹果酸盐，然后添加ADP后，线粒体的典型氧合图。(E类)呼吸活动表示为耗氧量（纳米O₂每分钟每毫克线粒体）。在Cisd2公司^−/−线粒体样本(n个=4）与野生型样品相比(n个= 3). (F类)RCR（O）₂添加ADP后的消耗率/O₂添加谷氨酸-苹果酸后的消耗率）显著降低Cisd2公司^−/−线粒体(G公司)4周龄Cisd2骨骼肌线粒体呼吸酶复合物电子传递活性的比较^−/−(n个=4）和野生型小鼠(n个= 4). （NCCR活性）NCCR活性的测量，代表复合物I–III；（SCCR活性）SCCR活性测量，代表复合物II和III；（CCO活动）cCCO活动，代表复杂IV（*）P（P）< 0.05; (**)P（P）< 0.005.

以前，Amr等人（2007）报道在转染的小鼠P19和人类HEK293细胞中，标记的CISD2蛋白与ER标记物calnexin共定位。我们试图使用从野生型小鼠骨骼肌制备的亚细胞组分来确定是否有一小部分Cisd2蛋白被分类到ER/肌浆网（SR）中。我们的数据确实显示了一个微弱的信号，表明线粒体后上清液中存在Cisd2蛋白，这与微粒体部分中的ER标记共定位。线粒体中存在的Cisd2蛋白与内质网的比率估计约为5.8:1（补充图17）。

线粒体是通过氧化磷酸化生成ATP的细胞能量工厂。为了研究本研究中检测到的线粒体变性是否有导致呼吸功能障碍的直接功能后果，我们使用从骨骼肌制备的分离线粒体评估线粒体有氧呼吸。这是通过测量用谷氨酸盐和ADP刺激线粒体以激活呼吸链反应后的耗氧量来完成的。我们的研究结果显示，患者的耗氧量和呼吸控制率（RCR）显著降低Cisd2公司^−/−线粒体(图4D–F). 为了进一步扩大这项研究，我们探索了铁硫蛋白，这是线粒体呼吸链中必不可少的电子载体；有多达12个不同的铁硫团簇将电子穿梭于络合物I–III中(Rouault and Tong 2008年). 我们测量了复合物I–III（NADH细胞色素）的各种铁硫蛋白的活性c（c）还原酶（NCCR）和复合物II–III（琥珀酸细胞色素c（c）还原酶（SCCR）。此外，我们还测定了复合物IV（细胞色素）的活性c（c）氧化酶（CCO），其中包含用于电子传输的血红素和铜中心(Rouault and Tong 2008年). 我们的结果表明，复合物I–III、复合物II–III和复合物IV的电子传递活性在Cisd2公司^−/−线粒体与野生型线粒体的比较(图4G). 结合耗氧实验，这些结果揭示了顺时针方向2^−/−线粒体。

为了测试线粒体氧化磷酸化的副产物活性氧（ROS）水平的增加是否有助于顺时针方向2^−/−小鼠，我们监测细胞内ROS，主要是H₂O（运行）₂在不同基因型小鼠脑和肝的MEF细胞和原代细胞中。不同基因型之间，这些原代细胞中的ROS水平没有显著差异（补充图18A）。此外，清除活性氧的酶在大脑、心脏、肝脏和骨骼肌中的mRNA水平未受影响，这表明活性氧诱导的应激反应在Cisd2公司^−/−小鼠（补充图18B）。

WFS1与ER缺陷相关

以前对患者的研究已经确定WFS1型(钨酸盐)作为WFS1的致病基因(Inoue等人，1998年;Strom等人，1998年). 生化和细胞培养研究表明，钨是一种主要定位于内质网的跨膜蛋白，可能参与内质网应激和钙稳态的调节(武田等人，2001;Fonseca等人，2005年;Zatyka等人，2008年). 在动物研究中，有报道称胰腺表型与葡萄糖不耐受和胰岛素分泌受损有关，但与神经退行性表型无关钨酸盐击倒老鼠。小鼠体内缺乏Wolframin会导致β细胞进行性丢失和葡萄糖稳态受损(Ishihara等人，2004年)这似乎是由内质网应激和胰腺β细胞凋亡增加引起的(Riggs等人，2005年;Yamada等人，2006年). 显然，WFS1患者的发病机制钨酸盐突变与ER而非线粒体缺陷有关。这就解释了为什么在一些线粒体没有任何可检测异常的WFS（特别是WFS1）患者中存在相互矛盾的观察结果。

组织病理学

收集各种小鼠组织，用磷酸盐缓冲的10%福尔马林固定，并包埋在石蜡中。按照标准程序对组织切片（3-4μm）进行苏木精-伊红（H&E）和马森毛染色(Young and Heath 2003年).

骨骼和骨密度分析

骨标本固定在10%福尔马林中，用磷酸盐缓冲，并保存在70%乙醇中。使用DEXA仪器（Northern Radiology）从骨骼的二维图像中量化每平方厘米的骨密度。对于micro-CT扫描，将敲除和野生型标本固定在10%福尔马林中，用磷酸盐缓冲，保存在70%乙醇中，然后通过eXplore Locus SP临床前标本micro-CT（GE Healthcare）进行检查。在轴向平面上进行全身和股骨扫描，样本安装在圆柱形样本架中。从显微CT扫描切片重建骨骼的三维图像，并用于骨骼结构和形态分析。定量数据由eXplore MicroView 2.0版软件指南（GE Healthcare）计算得出。

皮肤和皮肤分析

背部皮肤组织切片用H&E和Masson毛发染色。皮肤、脂肪和肌肉层的厚度通过使用SPOT Imaging Software Advance（Diagnostic Instruments，Inc.）随机测量单个皮肤样本的长度进行量化。

透射电镜

将各种小鼠组织固定在磷酸缓冲液（pH 7.3）中戊二醛（1.5%）和多聚甲醛（1.5%）的混合物中。将其在1%OsO4和1.5%己二酸钾中进行后固定，然后在二甲氨基甲酸盐和0.2M马来酸钠缓冲液（pH 6.0）中进行冲洗，并用1%乙酸铀酰进行块染色。脱水后，将各种组织包埋在Epon中，并如前所述进行TEM切片(Kao等人，1995年).

Western blotting和IHC染色

组织样品在裂解缓冲液中均质（20 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，10 mM EDTA，1%Triton X-100，含完全蛋白酶抑制剂混合物[（Roche]）），并通过煮沸变性5分钟。提取的蛋白质在13%SDS–聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上分离并电转移至Amersham Hybond N+膜（GE Healthcare）。用5%（w/v）脱脂干乳封闭膜，用一级抗体孵育，清洗，然后使用可视化试剂盒（Upstate Biotechnologies，64-201BP）检测。以下抗体用于免疫印迹：LC3B（1:1000；细胞信号，2755）；Gapdh（1:5000；Abcam，ab9482）；Hsp60（1:2000；Chemicon，AB3497）；Hsp70（1:2000；BD转导实验室，610608）；VDAC-1（1:1000；钙生物化学，529532）；ATP5B（1:2000；分子探针，A21351）；PDH（1:1000；圣克鲁斯生物技术，sc65242）。使用石蜡包埋胰腺切片（3μm）对胰岛素蛋白进行IHC染色。将胰腺切片浸泡在含有10 mM柠檬酸钠（pH 6.0）的抗原回收缓冲液中，并在微波炉中加热两次，持续10分钟（Sunpentown，SM-1220，650W）。然后在4°C下用胰岛素一级抗体（1:100；Abcam，ab7842豚鼠多克隆抗体）孵育切片18–24小时，用生物素化二级抗体（1:500；Abcam，ab6907）检测，并用LSAB试剂盒（DakoCytomation，K0690）观察。

兔抗鼠Cisd1和Cisd2多克隆抗体

通过PCR扩增Cisd1（对应氨基酸27–108）和Cisd2（对应氨基酸52–135）的小鼠cDNA片段，并克隆到含有His标签序列的pQE-31（Qiagen）载体中。将His-Cisd1和His-Cidd2的表达质粒转化为M15细菌，用2 mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导，并用Nickel-resin（Novagen）纯化。将这些蛋白注射到兔子体内，分别产生含有抗小鼠Cisd1和Cisd2多克隆抗体的抗血清。

亚细胞定位

使用脂质体2000（Invitrogen，11668-019）将EGFP标记的Cisd2表达质粒转染到NIH/3T3细胞。将瞬时表达EGFP-Cisd2融合蛋白的细胞贴在凝胶涂层玻璃盖玻片上，用各种细胞器探针进行染色，包括线粒体（MitoTracker Red CMXRos；Invitrogen Life Technologies）、ER（抗钙联蛋白；Sigma，C7617）和高尔基体（抗高尔基97；分子探针）。然后固定盖玻片，并通过共聚焦显微镜（Olympus FluoView FV300）进行观察。细胞核用DAPI（4′-6-二氨基-2-苯基吲哚；Sigma）进行复染。

骨骼肌线粒体的分离

新鲜骨骼肌用PBS洗涤两次，并立即在冰冷的SEH缓冲液（0.25M蔗糖、1mM EGTA、3mM HEPES、pH 7.2的蛋白酶抑制剂混合物）中匀浆。通过低速离心（800克)匀浆，然后高速离心（10000克)上清液。最后，将线粒体颗粒重新悬浮在适当体积的SEH缓冲液中。分离的线粒体立即用于评估线粒体呼吸和氧化磷酸化。

线粒体亚分馏

根据下述方法进行线粒体亚分馏Pagliarini等人（2005年）进行了一些修改。简单地说，0.5 mL线粒体悬浮液（10 mg/mL）与10 mg纯化洋地黄素在冰上孵育30 min，每10 min轻轻倒置一次混合物。高速离心（12000克)，将有丝分裂体（包含IM和基质）制成丸，并对上清液进行超速离心（150000克)分离线粒体的OM和IMS。

耗氧量测量

使用782氧气计（Strathkelvin Instruments）测量氧气消耗率。一份300μL的分析缓冲液（125 mM蔗糖、65 mM KCl、2 mM MgCl₂，20 mM钠⁺，K⁺-将含有约0.2～0.5 mg线粒体的pH值为7.2）的磷酸盐缓冲液置于37°C的氧气计密闭室中，以测量线粒体的稳态耗氧量(Chen等人，2008). 为了进一步评估线粒体的呼吸功能，我们测量了谷氨酸-苹果酸支持的线粒体呼吸和RCR。首先，我们使用汉密尔顿注射器（Strathkelvin）添加10 mM谷氨酸和10 mM苹果酸（Sigma-Aldrich）并记录谷氨酸-苹果酸支持的氧消耗率。5分钟后，我们注入3μL 100 mM ADP，以使分析培养基中的最终ADP浓度达到1 mM。记录激活呼吸速率以测量线粒体的RCR。

呼吸酶复合物活性

根据下述方法进行以下活性分析：Wei等人（1998）NCCR（代表复合物I–III活性）和SCCR（代表复杂物II–III活性c（c）.用分析缓冲液（1.5 mM KCN，50 mM K₂高性能操作₄在pH 7.4）下，含β-NADH或琥珀酸盐，在37°C下保持15分钟。添加细胞色素后c（c）在紫外/可见分光光度计上记录550 nm处混合物的吸光度变化。CCO（代表复合物IV）活性通过外源性还原细胞色素氧化测定c（c）.在分析缓冲液（5 mM K）中预培养20～50μg SMP的等分样品₂高性能操作₄pH7.4）在30°C下保持10分钟。添加铁细胞色素后c（c）在紫外/可见分光光度计上记录550 nm处的吸光度变化。

口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验

小鼠禁食10小时后（晚上10点至早上8点），用喂食针口服葡萄糖溶液（1.5 g/kg体重）(Juan等人，2004年). 在葡萄糖负荷之前（0分钟）和之后的指定时间点从尾部尖端采集血液样本。使用葡萄糖试纸（LifeScan；强生）和SureStep品牌测量仪测量血糖水平。用ELISA试剂盒（Mercodia）测定血清胰岛素水平。胰岛素耐受性试验在禁食2小时（上午9点至11点）后进行，涉及腹腔注射胰岛素（0.75 U/kg体重；诺和林人类常规胰岛素；诺和诺德）(Tran等人，2008年). 每组有三只小鼠，每只小鼠有三次独立测量。

感谢邓连福博士（上海第二医科大学附属瑞金医院、上海创伤骨科研究所）；王安国博士（台北市退伍军人总医院）；Ming-Ling Kuo博士（长庚大学）；Chih Cheng Chen博士（中央研究院）；以及Alan M.Lin博士、Hen-Li Chen博士、Chun-Ming Chen博士，Chi-Chang Juan博士、Yi-Shin Lai博士、Ching-Wen Cheng博士和Hui-Wen Zhung博士（国立杨明大学），感谢他们的见解和技术援助。我们感谢国家杨明大学基因组研究中心的微阵列和基因表达分析核心设施。核心设施由国家科学委员会国家基因组医学研究计划（NRPGM）支持。我们感谢国家科学委员会（NRPGM 95HC007、NSC96-2752-B-010-004-PAE和NSC97-2320-B-010-015-MY3）的支持以及教育部的拨款，旨在实现顶尖大学计划。