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microRNA-101基因缺失导致组蛋白甲基转移酶EZH2在肿瘤中过度表达
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Sooryanarayana Varambally公司
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齐曹
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拉姆·桑卡·马尼
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Sunita Shankar公司
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王晓松
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布什拉·阿提克
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巴拉提·拉克斯曼
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曹旭红
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Jing晓君
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J.查德·布伦纳
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余金丹(Jindan Yu)
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郑海金(Jung H.Kim)
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韩波(Bo Han)
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钱丹·库马尔·西尼亚
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罗伯特·隆尼戈
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纳拉西瓦姆·帕拉尼萨米
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克里斯托弗·马赫
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Arul M.钦奈扬
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8新加坡基因组研究所
#将信件和重印请求发送至:Arul M.Chinnaiyan,医学博士,博士,密歇根转化病理学中心主任,霍华德·休斯医学院研究员,S.P.Hicks捐赠病理学教授,密歇歇根大学医学院综合癌症中心病理学和泌尿学教授,1400 E。医疗中心医生5316 CCGC,Ann Arbor,MI 48109-5940,电话:734-615-4062,传真:734-6.15-4498,电子邮件:ude.hcimu@lura *这些作者贡献均等
包括EZH2在内的多梳组蛋白质在控制重要的细胞过程中发挥主要调节作用,例如维持干细胞多能性(1——三),细胞增殖(4,5),早期胚胎发生(6)和X染色体失活(7). EZH2在一种称为多梳抑制复合物2(PRC2)的多蛋白复合物中发挥作用,该复合物包括SUZ12(Zeste 12抑制剂)和EED(胚胎外胚层发育)(8,9). EZH2蛋白复合物的主要活性是在靶基因启动子处合成三甲基组蛋白H3赖氨酸27(H3K27),导致表观遗传沉默(10,11). 越来越多的证据表明,EZH2具有与癌基因一致的特性,因为过度表达促进细胞增殖、集落形成和增加良性细胞的侵袭在体外(4,5,12)并诱导异种移植瘤生长体内(13). 同样,癌细胞中EZH2的敲低导致生长停滞(4,13)以及肿瘤生长减少(10)和转移体内(14).
最初发现EZH2在一组侵袭性、临床局限性前列腺癌和几乎所有转移性前列腺癌中升高(4). 随后,EZH2也被发现在乳腺癌中异常过表达(12)、黑色素瘤(15),膀胱癌(16),胃癌(17)和其他癌症(5). 因此,虽然EZH2在侵袭性实体瘤中广泛过度表达,并且具有癌基因的特性,但癌症中EZH2-升高的遗传机制尚不清楚。
作为基因表达的调节器,microRNAs(miRNAs)受到了广泛关注(18)在细胞分化和胚胎干细胞发育中发挥重要作用(19),我们推测它们可能在调节EZH2表达中发挥作用。为了测试miRNAs是否在控制EZH2表达中发挥作用,我们通过计算指定了那些可能有助于EZH2型监管。由于已经确定将多个预测算法的结果交叉可以提高特异性,但代价是降低灵敏度(20),我们选择整合预测程序PicTar的结果(21),目标扫描(22),米兰达(23)和MiRInspert(24). 总的来说,任何计划都只发现了29个miRNAsEZH2型,而所有四个程序都发现只有miR-101和miR-217被预测可以调节EZH2型(和表S1) (25). 此外,PicTar、miRanda和TargetScan预测了细胞内的两个miR-101结合位点EZH2型3英尺UTR()而PicTar和TargetScan预测了两个miR-217结合位点EZH2型3英尺UTR。在预测的34个miRNAs中,至少通过一个程序调节EZH2(表S1),只有miR-101与前列腺癌从良性到局限性疾病再到转移的进展呈强烈负相关(如下文所述).
miR-101调节EZH2转录和蛋白表达。(A类)维恩图显示了通过PicTar(蓝色)、miRanda(红色)、TargetScan(绿色)和MicroInspector(橙色)计算预测靶向EZH2的miRNA。(B类)中两个预测的miR-101结合位点示意图EZH2型3英尺UTR。(C类)miR-101调节EZH2型转录表达。的qRT-PCREZH2型在转染前体miR-101的SKBr3细胞中。对照miR和其他前体miRNA(miR-26a、miR-128a和miR-217)也用于转染。(D类),miR-101调节Polycomb Group Complex 2蛋白的表达。miR-101下调SKBr3细胞中的EZH2蛋白以及Polycomb成员SUZ12和EED。对照miRs和EZH2特异性siRNA也用于转染。实验进行了三次独立的实验,并显示了具有代表性的结果。
miR-101位点的基因组缺失可能解释实体肿瘤中EZH2的过度表达。(A类)miR-101转录水平与前列腺癌进展中EZH2的表达呈负相关。使用来自良性邻近前列腺、前列腺癌(PCA)和转移性前列腺癌(MET)组织的总RNA对miR-101和miR-217进行qPCR。EZH2型从相同的RNA样本中分析表达。(B类)前列腺癌进展中miR-101-1和miR-101-2的基因组PCR。纵轴表示对数(基数2)相对量化值;虚线显示在日志的删除阈值处2(0.7)≈−0.51. 为了清楚起见,每个样本类中的点都已水平移动。(C类)匹配正常、肿瘤和转移样本的热图表示(从右到左),其中miR-101转录,EZH2型评估miR-101-1和miR-101-2的相对拷贝数。miR-101和EZH2型表达由一个色阶表示,突出显示转录物的下调(绿色)、无改变(黑色)和上调(红色)。拷贝数的miR-101-1和miR-101-2相对定量(RQ)表示为纯合子丢失(<0.3;亮绿色)、单拷贝丢失(<0.7;浅绿色)、无拷贝数变化(>=0.7和<=1.3;黑色)、单副本增益(>1.3;浅红色)和双副本增益(>1.7;亮红色)。(D类)miR-101-1基因座在肿瘤样本中相对于匹配的正常样本在体细胞上缺失的证据。选择了9例miR-101-1位点拷贝数丢失的转移性前列腺癌,并对匹配的正常组织进行分析比较。横杆高度表示原木的差异2转移组织和匹配正常组织之间的(RQ)值。
检测miR-101是否可以调节EZH2型,我们生成了编码EZH2 3'UTR正常、反义和突变版本的荧光素酶报告子。miR-101而非miR-217或对照miRNA的过度表达降低了编码EZH2 3'UTR的荧光素酶报告子的活性(图S1). 同样,miR-101也不抑制反义和突变的EZH2 3'UTR活性。为了测试miR-101的3'UTR结合是否导致EZH2型转录本,我们用miR-101、miR-217的前体转染SKBr3乳腺癌细胞(表达高水平内源性EZH2),控制miRNA以及其他几个无关的miRNA。qRT-PCR明确显示EZH2型miR-101的转录水平(),但不是miR-217或其他对照miR。
为了确定miR-101是否抑制EZH2蛋白表达,我们使用EZH2-特异性抗体以及其他PRC2成员的抗体(包括EED和SUZ12)进行免疫印迹分析(). 除miR-101外,我们还包括其他预测调控EZH2的miRNAs,包括miR-217和miR-26a。TargetScan预测对照miR-495靶向PRC1组分BMI-1。只有miR-101和EZH2 siRNA减弱了EZ82蛋白的表达。有趣的是,miR-101过度表达还导致PRC2复合体EED中EZH2紧密结合伙伴的抑制,在较小程度上还导致SUZ12的抑制。这些蛋白质被认为形成一种共同调节的功能复合物,改变其中一种蛋白质的表达会影响其他蛋白质的表达(5,26,27). 在这种特殊情况下,进一步检查PRC2组分的3'UTR后,发现miR-101结合位点位于EED公司(图S2)但不在SUZ12型由于已知miRNA可调节多个靶基因,在某些情况下可调节数百个基因(18),我们使用预测算法TargetScan指定miR-101的目标。除EZH2和EED外,我们还测试了4个miR-101预测靶点(表S2)与癌症途径有关,包括n-Myc、c-Fos、ARID1A和FBN2。重要的是,这些假定的miR-101靶点都没有受到miR-101过度表达的影响(). 为了支持miR-101过表达实验的结果,我们采用了antagomiR技术(28)特异性抑制良性永生化乳腺上皮细胞中miR-101的表达(图S3). miR101(i和ii)的两个独立抗gomiR诱导良性乳腺上皮细胞中EZH2蛋白的表达。
虽然我们有强有力的证据表明miR-101调节EZH2的表达,但我们想确定它是否影响EZH2和PRC2的功能。为了实现这一目标,我们评估了细胞增殖,这一特性已知受EZH2调节(4,5). miR-101在SKBr3和DU145细胞中过度表达显著抑制细胞增殖(,图S4). 重要的是,EZH2的过度表达(无内源性3'UTR)挽救了miR-101对细胞生长的抑制,表明其具有靶向特异性。
miR-101在调节细胞增殖、侵袭和肿瘤生长中的作用。(A类)miR-101过度表达降低细胞增殖。用前体miR-101或靶向EZH2的siRNA处理SKBr3细胞的细胞生长测定。测量相对于对照miRNA和对照siRNA双链的细胞生长。通过在miR-101处理的细胞中过度表达EZH2(减去其内源性3'UTR)进行救援实验。(B类)miR-101表达降低DU145前列腺癌细胞的细胞侵袭性。用miR-101、EZH2特异性siRNA、对照miR和非靶向siRNA转染细胞。在安氏病毒感染过度表达EZH2的细胞中,miR-101也过度表达。所有细胞均接受基质凝胶侵袭试验。(C类)AntagomiRs to miR-101诱导良性永生化H16N2乳腺上皮细胞的侵袭性。插图中显示了入侵细胞和染色细胞的代表性区域。计算对照antagomiR和antagomi R-101i和ii之间的P值。(D类)miR-101的过度表达可抑制前列腺肿瘤的生长。miR-101的过度表达降低了小鼠异种移植模型中DU145肿瘤的生长。接种miR-101(红色)和表达DU145细胞的载体(绿色)的小鼠的平均肿瘤体积随时间的轨迹图。误差条表示每个时间点平均值的标准误差。Inset显示miR-101表达细胞系中EZH2蛋白水平降低。
以前,我们在基质涂层基底膜侵袭试验中表明,当EZH2过度表达时,可以诱导细胞侵袭(12). 这里我们显示miR-101过度表达显著抑制在体外DU145前列腺癌细胞的侵袭潜能()和SKBr3乳腺癌细胞(图S5). 类似地,miR-101在DU145细胞中的稳定表达显示EZH2型表达和减少侵袭(图S6A、B). EZH2的过度表达,挽救了miR-101介导的抑制作用。另一个在体外miR-101也抑制了癌症潜能的读出,即细胞迁移增加(图S7). 由于miR-101的过度表达会减弱癌症的侵袭性,因此抑制miR-101应该会增强这种肿瘤表型。当转染到良性永生化乳腺上皮细胞系H16N2或HME中时,两个靶向miR-101(i和ii)的独立抗gomiR诱导了侵袭性表型(,图S8).
为了评估miR-101是否抑制凤尾鱼非依赖性生长,我们采用了软琼脂试验。与亲代细胞或载体对照组相比,稳定过度表达miR-101的DU145前列腺癌细胞的集落形成显著减少(图S9). 此外,体内表达miR-101的DU145细胞的生长速度明显慢于载体对照异种移植物(p=0.0001,)证明miR-101在这些特定的分析中具有与肿瘤抑制剂一致的特性。
由于已知EZH2和PRC2通过三甲基化H3K27来调节基因表达,我们假设miR-101过表达会导致癌细胞中H3K27三甲基化的总体减少。用miR-101或EZH2 siRNA转染SKBr3乳腺癌和DU145前列腺癌细胞7天后,三甲基H3K27水平总体下降(图S10A). miR-101对H3K27甲基化的影响可以通过EZH2的过度表达来抵消(图S10B).
为了测试H3K27组蛋白标记的启动子占用水平,我们对过度表达miR-101的癌细胞进行了染色质免疫沉淀(ChIP)分析。我们发现已知PRC2靶基因(如ADRB2、DAB2IP、CIITA和WNT1型miR-101过度表达SKBr3细胞和EZH2 siRNA处理细胞(,图S11). 为了测试H3K27降低启动子占用率是否会导致基因表达同时降低,我们对ChIP检测的PRC2靶点进行了qRT-PCR。正如预期的那样,miR-101和EZH2 siRNA处理的细胞中目标基因表达显著增加(). 为了进一步探索miR-101对EZH2的调控,并测试与EZH2-特异性RNA干扰的相似性,我们测试了miR-101的过度表达和EZH2型敲除产生了类似的基因表达谱。为了评估这一点,我们对转染miR-101或EZH2 siRNA双链体的SKBr3细胞进行了基因表达阵列分析。在miR-101和EZH2 siRNA转染细胞中,在2倍阈值下过度表达的基因显著重叠(p=6.08e-17)(图S12). 同样,那些被抑制的基因也有显著重叠(p=3.24e-27)。
miR-101通过EZH2和H3K27三甲基化调节癌表观基因组。(A类)miR-101过度表达时三甲基H3K27组蛋白标记的染色质免疫沉淀(ChIP)检测。在SKBr3细胞中检测已知的PRC2阻遏靶点。进行ChIP以测试H3K27在ADRB2、DAB2IP、CIITA、RUNX3、CDH1和WNT1型.GAPDH,KIAA0066和第214号机组基因启动子作为对照。(B类)使用转染miR-101的SKBr3细胞对EZH2靶基因进行qRT-PCR。EZH2转录本及其已知靶点包括ADRB2、DAB2IP、CIITA、RUNX3和E-钙粘蛋白(CDH1型)进行了测量。
接下来,我们想确定miR-101的表达是否与人类肿瘤中的EZH2水平呈负相关。对大多数公开的miRNA表达数据集进行的荟萃分析表明,miR-101在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌中显著表达不足(表S3). EZH2最初被发现在一组侵袭性临床局限性前列腺癌中过度表达,在转移性疾病中几乎普遍升高(4),我们通过qPCR分析在前列腺癌进展的类似背景下检测miR-101(,图S13). 正如预期的那样,与临床局限性疾病或良性邻近前列腺组织相比,转移性前列腺癌表达的EZH2水平显著升高(p<0.0001)。与miR-101和EZH2之间的功能联系一致,相对于临床局限性疾病或良性邻近前列腺组织,转移性前列腺癌中miR-101的表达显著降低(p<0.0001)。重要的是,miR-217与miR-101一样被预测调节EZH2,在转移性疾病和临床定位的前列腺癌或良性前列腺之间没有表现出显著差异(分别为0.35和0.13)。
为了研究前列腺癌进展中miR-101转录缺失的机制,我们对miR-101进行了定量基因组PCR。值得注意的是,miR-101有两个基因组位点,分别位于第1号染色体(miR-101-1)和第9号染色体(miR-101-2)上(图S14A、B). 基于基因组PCR,16例临床定位前列腺癌中有2例和33例转移性前列腺癌中17例显示miR-101-1基因座缺失(). 同样,16例临床局限性前列腺癌中的4例和33例转移性前列腺癌的8例显示miR-101-2缺失().显示匹配样本的热图表示,其中miR-101转录本,EZH2型对转录本、miR-101-1基因组位点和miR-101-2基因组位点进行监测。EZH2型在前列腺癌进展至转移期间,转录水平与miR-101转录水平呈负相关(p<0.0001)。EZH2型在miR-101-1或miR-101-2基因座出现拷贝数丢失的样本中,倾向于均匀升高(p=0.004,排列测试)。
为了正式证明miR-101基因座的基因组丢失在本质上是体细胞性的,我们鉴定了9例转移性前列腺癌,其表现为miR-101-1的丢失,并从匹配的正常组织中获得了DNA。正如预期的那样,与匹配的正常组织相比,9例患者中有8例癌症中miR-101-1拷贝数的相对水平显著降低(). 为了将我们的发现扩展到其他癌症,我们探索了多种肿瘤类型中miR-101的基因组丢失。我们使用一些实验平台证明了miR-101-1在乳腺癌、胃癌和前列腺癌亚群中的局灶性丢失(约20kB)(图S15–S17). 此外,我们探索了公共领域高密度阵列CGH和SNP阵列数据集,并观察到多形性胶质瘤、肺腺癌和急性淋巴细胞白血病亚群中一个或两个miR-101基因座的基因组丢失(补充文本,图S18).
miR-101通过其对EZH2的调节,可能对不仅在癌细胞中,而且在正常多能干细胞中活跃的表观遗传途径具有深刻的控制作用。miR-101的过度表达可能会将癌细胞的组蛋白代码配置为更良性的表型。由于miR-101的缺失和伴随的EZH2的升高在转移癌中最为明显,我们假设miR-101缺失可能代表更具侵袭性疾病发展过程中的一种进行性分子损伤。将miR-101再导入肿瘤的方法可能通过将肿瘤细胞的表观遗传程序恢复到更正常的状态而具有治疗益处。