Cannabinoid action induces autophagy-mediated cell death through
               stimulation of ER stress in human glioma cells

María Salazar; Arkaitz Carracedo; Íñigo J. Salanueva; Sonia Hernández-Tiedra; Mar Lorente; Ainara Egia; Patricia Vázquez; Cristina Blázquez; Sofía Torres; Stephane García; Jonathan Nowak; Gian María Fimia; Mauro Piacentini; Francesco Cecconi; Pier Paolo Pandolfi; Luis González-Feria; Juan L. Iovanna; Manuel Guzmán; Patricia Boya; Guillermo Velasco

doi:10.1172/JCI37948

临床投资杂志。2009年5月1日；119(5): 1359–1372.

2009年4月1日在线发布。数字对象标识：10.1172/JCI37948

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PMID：19425170

大麻作用通过以下途径诱导自噬介导的细胞死亡内质网应激对人脑胶质瘤细胞的刺激作用

玛丽亚·萨拉扎

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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Arkaitz Carracedo公司

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）神经退化症（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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尼格尼戈·J·萨拉努埃瓦

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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索尼娅·埃尔南德斯·蒂德拉

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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马·洛伦特

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵美国国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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艾娜拉·埃吉亚

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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帕特里夏·巴斯克斯

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央生物技术研究Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所传染病，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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克里斯蒂娜·巴兹奎斯

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室罗马大学生物学系“Tor Vergata”意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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索菲亚·托雷斯

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）神经退化症（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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斯蒂芬·加西亚

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司U624，法国马赛鲁米尼校区。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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乔纳森·诺瓦克

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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吉安·玛丽亚·菲米亚

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中心欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵美国国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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毛罗·皮亚琴蒂尼

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室罗马大学生物学系“Tor Vergata”意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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弗朗西斯科·塞科尼

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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保罗·潘多尔菲码头

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴昆虫法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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路易斯·冈萨雷斯·费里亚

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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胡安·利奥瓦纳

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，康普卢滕斯大学，西班牙马德里。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室罗马大学生物学系“Tor Vergata”意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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曼努埃尔·古兹曼

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，贝斯以色列女执事癌症哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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帕特里夏·博亚

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司法国马赛Luminy校区U624。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室和罗马大学“Tor Vergata”生物系意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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吉列尔莫·贝拉斯科

¹生物学院生物化学与分子生物学一系，西班牙马德里Complutense大学。²中央欧洲红酒生物研究所（Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades）Neurodegenerativas（CIBERNED），西班牙马德里。^三3D实验室（开发、，分化和退化），细胞和分子系生理病理学，生物研究中心，高级委员会西班牙马德里Científicas调查公司（CSIC）。⁴INSERM公司U624，法国马赛鲁米尼校区。⁵国家研究所《传染病》，IRCCS“L.Spallanzani”，意大利罗马。⁶圣卢西亚IRCCS基金会分子神经胚胎学实验室罗马大学生物学系“Tor Vergata”意大利罗马。⁷癌症遗传学项目，Beth Israel Deaconess Cancer哈佛医学院贝思以色列女执事医疗中心医学中心和医学部学校，美国马萨诸塞州波士顿。⁸神经外科，西班牙特内里费大学医院。

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摘要

自噬可以促进细胞存活或死亡，但其分子基础它在癌症中的双重作用仍不清楚。我们在这里证明了这一点Δ⁹-四氢大麻酚（THC），主要活性成分大麻通过刺激自噬诱导人脑胶质瘤细胞死亡。我们的数据表明THC诱导神经酰胺积累和真核翻译启动因子2α（eIF2α）磷酸化，从而激活ER通过tribbles同源物3依赖促进自噬的应激反应雷帕霉素复合物1 Akt/哺乳动物靶点的（TRB3-依赖性）抑制（mTORC1）轴。我们还发现自噬是细胞凋亡的上游大麻素诱导人和小鼠癌细胞死亡及其激活大麻素的体内抗肿瘤作用需要途径。这些研究结果描述了THC促进人类自噬死亡的机制和小鼠癌细胞，并提供证据表明大麻素给药可能是针对人类癌症的有效治疗策略。

介绍

巨噬，以下简称“自噬”，是一种高度保守的细胞过程，其中细胞质物质-包括细胞器-被隔离在双膜囊泡中，称为自噬体并输送至溶酶体进行降解或再循环(1). 在许多蜂窝环境中，触发自噬依赖于雷帕霉素复合物1（mTORC1）对哺乳动物靶点的抑制，促进几种自噬蛋白激活（去抑制）的事件（Atgs）参与膜隔离的初始阶段(1). 这种复合物的扩大形成自噬体需要2个泛素样结合系统的参与。一个涉及共轭ATG12至ATG5，另一个磷脂酰乙醇胺至LC3/ATG8(1). 激活的最终结果自噬程序高度依赖于细胞环境和强度应力诱发信号的持续时间(2–5). 因此，除了它的在细胞内稳态中的作用，自噬可能是一种程序性细胞死亡，指定为“II型程序性细胞死亡”，或播放细胞保护作用，例如在营养缺乏的情况下(6). 因此，有人建议自噬发挥作用在肿瘤进展和促进癌细胞死亡中的重要作用(2–4)虽然分子机制导致了癌症中的自噬尚未被阐明。

Δ⁹-四氢大麻酚（THC），主要活性成分大麻(7)，发挥多种生物模拟内源性物质内源性大麻素的作用-结合并激活特定的大麻素受体(8). 最令人兴奋的研究领域之一大麻素领域是研究大麻素作为抗肿瘤药物(9). 大麻素给药已经发现可以抑制大鼠和小鼠几种肿瘤异种移植的生长(9,10).基于这一临床前证据，最近进行了一项初步临床试验THC对复发性胶质瘤的抗肿瘤作用研究(11). 最近的研究还表明，促凋亡和大麻素的肿瘤生长抑制活性依赖于上调转录辅激活物p8的(12)和其靶点为假激酶tribbles同源物3（TRB3）(13). 然而，促进这种信号激活的机制途径以及调节其肿瘤的TRB3下游靶点细胞杀伤行动仍然难以捉摸。在这项研究中，我们发现ER应激诱导的p8/TRB3通路上调通过以下途径诱导自噬Akt/mTORC1轴的抑制和自噬的激活促进了肿瘤细胞凋亡死亡。我们认为，这条途径的发现促进肿瘤细胞死亡的新方法可能在治疗中具有治疗意义癌症。

结果

自噬介导THC诱导的癌细胞死亡。

作为深入了解癌症引起的形态学变化的第一种方法通过大麻素给药，我们对细胞进行了电子显微镜分析U87MG人星形细胞瘤细胞。有趣的是，双膜液泡结构在THC处理的细胞中观察到自噬体的形态特征（图（图1，1，A–C）。转换LC3（LC3-I）的可溶性形式转化为脂质和自噬体相关形式（LC3-II）被认为是自噬的标志之一(1)因此，我们观察到LC3阳性点的出现以及LC3-II的外观（图（图1D）1D）英寸大麻素攻击细胞。此外，与溶酶体蛋白酶共同培养抑制剂E64d和pepstatin A，阻断自噬的最后一步退化，退化(14)，增强THC诱导LC3-II的积累（图（图1E），1E），确认大麻素在U87MG细胞中诱导动态自噬。此外，孵化使用大麻素受体1（CB1）拮抗剂SR141716阻止THC诱导的LC3脂化和LC3点的形成（图（图1D），1D）表明大麻素诱导自噬依赖于CB1受体激活。

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图1

抑制自噬可防止THC诱导的癌细胞死亡。

(一个–C类)THC对U87MG细胞的影响形态学。显示了具有代表性的电子显微镜照片（6小时）。比例尺：500 nm。注意早期(一个、打开箭头和B类)而且很晚了(一个、填充箭头和C类)THC处理但非车辆处理（车辆处理）细胞中的自噬体。(D类)顶部：SR141716（SR1；1μM）和THC对LC3的影响U87MG细胞免疫染色（绿色）（18h；n个=3）。这个具有LC3点的细胞相对于总细胞数的百分比如所示每个面板的角（平均值±SD）。比例尺：20μm。底部：SR1和THC对U87MG细胞LC3脂质沉积的影响（18小时；n个=3）。(E类)E64d（10μM）和胃蛋白酶抑制素A（PA；10μg/ml）对U87MG中THC诱导的LC3脂质化的影响细胞（18h；n个=3）。(F类和G公司)效果THC治疗和转染对照siRNA（siC）或ATG1-选择性siRNA（siATG1）对细胞活性的影响(F类; 平均值±SD；n个=3），LC3免疫染色(G公司，左侧面板；18小时；带有LC3点的细胞相对于细胞总数的百分比与红色荧光对照siRNA共转染，平均值±SD；n个= 3; 比例尺：20μm）和LC3脂化(G公司，右侧面板；18小时；n个=3）在U87MG电池中。(H（H）和我)THC对细胞活力的影响(H（H）; 平均值±SD；n个=3），LC3免疫染色(我，左侧面板；18小时；含有LC3的细胞百分比点相对于总细胞数，平均值±SD；n个= 3; 比例尺：20μm）和LC3脂化(我，对面板；18小时；n个=3）英寸附件5^+/+和附件5^–/–Ras公司^V12版本/T大抗原MEF*P（P）<0.05和**P（P）<与经THC处理的U87MG相比，0.01(D类)和附件5^+/+(H（H）和我)并与siC转染、THC处理的U87MG进行比较单元格(F类和G公司). 四氢大麻酚浓度为6μM。

由于自噬与细胞存活的促进和抑制有关，我们接下来研究了其参与癌细胞死亡诱导THC的作用。不同水平的自噬药理学抑制（补充图1，A–C；补充材料可在线获取本文；doi:10.1172/JCI37948DS1）或选择性击倒ATG1蛋白质参与自噬的启动；裁判。1)（图（图1，1、F和G）、ATG5（一种必需蛋白质自噬体的形成；裁判。1)（补充图1，D–F）或AMBRA1（最近确定的beclin-1–调节自噬的相互作用蛋白；裁判。15)（补充图1，D–F）强烈减少大麻素诱导的自噬和细胞死亡。此外附件5-缺乏小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）自噬缺陷(16)，更多比野生型对应物对THC诱导的细胞死亡具有抵抗力（图（图1H）1H）并且没有对大麻素进行自噬处理（图（图1）。1一） ●●●●。总的来说，这些研究结果表明，自噬在THC诱导的癌细胞中起着重要作用死亡。

THC通过内质网应激依赖性上调p8和TRB3。

除了存在自噬体外，电子显微镜分析大麻素处理的细胞显示存在大量扩张内质网的细胞（图（图2A）。2A） ●●●●。根据这一观察，内质网腔标记蛋白二硫醚异构酶（PDI）的免疫染色显示THC处理的U87MG细胞内质网显著扩张（图（图2B），2B），与增加的真核生物翻译起始的α亚基磷酸化因子2（eIF2α），内质网应激反应的标志(17)（图（图2C）。2C） ●●●●。此外，THC诱导的ER扩张和eIF2α通过药物阻断CB1受体阻止磷酸化（图（图2，2、B和C）。

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图2

内质网应激在大麻素作用中先于自噬。

(一个)THC对U87MG细胞形态的影响。注意存在THC-但非载药处理细胞的ER扩张（6小时）。箭头指向ER。比例尺：500 nm。(B类)SR1（1μM）和THC对U87MG细胞PDI免疫染色（红色）（8h；n个=3）。这个带有PDI点的细胞相对于总细胞数的百分比如所示每个面板的角落（平均值±标准差）。比例尺：20μm。(C类)SR1（1μM）对THC诱导的影响U87MG细胞的eIF2α磷酸化（3小时；OD相对于车用处理细胞，平均值±SD；n个= 3).(D类)THC对PDI（红色）和LC3（绿色）免疫染色的影响U87MG电池(n个=3）。含有PDI或LC3点的细胞百分比显示了每个时间点相对于总细胞数的相对值（平均值±SD）。比例尺：20μm。(E类)THC对eIF2α的影响U87MG细胞的磷酸化和LC3脂质化(n个= 3).**P（P）<与THC治疗组相比，0.01(B类)或车辆处理(C类和D类)单元格。

PDI和LC3免疫染色eIF2α的时程分析大麻素处理细胞的磷酸化和LC3脂质化表明，ER应力发生早于自噬（图（图2，2、D和E）。令人感兴趣的是，大麻素管理也产生了类似的结果其他人内质网应激和自噬的激活以及细胞死亡星形细胞瘤细胞系（补充图2，A–F），原代培养人脑胶质瘤细胞（补充图2，G–I）和几种人类癌症不同来源的细胞系，包括胰腺癌（补充图2，J–L）、乳腺癌和肝癌（数据未显示）。然而，ER扩张和eIF2α磷酸化或自噬在正常人中均不明显，非转化的原代星形胶质细胞（补充图3），对大麻素诱导的细胞死亡(13).

接下来我们研究了内质网应激的激活是否参与诱导对大麻素治疗癌细胞的自噬反应。我们以前有过表明THC诱导从头合成神经酰胺的积累ER中发生的事件(18)，导致应激调节蛋白p8及其内质网应激相关蛋白的上调下游靶点ATF4、CHOP和TRB3诱导癌细胞死亡(13). 重要的是，与ISP-1（a）孵育丝氨酸棕榈酰转移酶的选择性抑制剂，该酶催化鞘脂生物合成的第一步；裁判。18)防止神经酰胺积聚（补充图4A）；THC诱导ER膨胀（补充图4B）；eIF2α磷酸化（图（图3A）；三A）；p8、ATF4、CHOP和TRB3上调（补充图4C）；和自噬（图（图3B），三B）支持神经酰胺积累参与大麻素引发内质网应激和自噬。我们还通过RNA进行了验证CaCMKKβ的干扰与激活自噬以响应内质网应激相关钙释放(19)-不是参与THC诱导的自噬和细胞死亡（数据未显示）。作为磷酸化Ser51上的eIF2α减少一般蛋白质合成，同时增强几种内质网应激反应基因的表达(17)，我们使用来自eIF2αS51A敲除小鼠的细胞测试eIF2α磷酸化是否调节p8及其受体的表达下游目标。与这一假设一致的是，四氢大麻酚治疗（神经酰胺在野生型和eIF2αS51A永生化MEF中的积累；补充图5A）触发p8、ATF4、CHOP和TRB3上调（图（图3C）三C）以及自噬（补充图5B）在野生型细胞中，而不是在eIF2αS51A对应物中。

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图3

THC通过内质网应激诱发的p8和TRB3诱导自噬上调监管。

(一个和B类)ISP-1（1μM）对THC诱导的eIF2α磷酸化(一个; 3小时；n个=3）和LC3免疫染色(B类，左侧面板；18小时；具有LC3点的细胞相对于总细胞数的百分比，平均值±SD；n个= 3; 比例尺：20μm），U87MG细胞。sip8，p8-选择性siRNA；siTRB3，TRB3-选择性siRNA(C类)THC对eIF2αWT的p8、ATF4、CHOP和TRB3 mRNA水平的影响实时定量PCR测定的eIF2αS51A MEF（8h；n个=3）。数字表示平均倍数增加±SD相对于车辆处理的eIF2αWT MEF。(D类)顶部：p8和TRB3 mRNA水平分析。代表性RT-PCR结果给出了实验结果。数字表示由以下因素决定的基因表达水平实时定量PCR（相对于siC转染细胞；n个= 5). 底部：THC对LC3的影响转染siC、sip8或siTRB3的U87MG细胞的免疫染色（绿色）（18小时；n个= 4). 带有LC3点的细胞相对于用红色荧光控制siRNA共同转染的细胞显示在每个面板中（平均值±标准偏差）。比例尺：20μm。(E类)的影响THC对转染siC、sip8或siTRB3的U87MG细胞LC3脂质化的影响（18小时；n个=6）。(F类)四氢大麻酚对LC3脂质化的影响（顶部；18小时；n个=5）和LC3免疫染色（底部；18小时；百分比具有LC3点的细胞相对于总细胞数，平均值±SD；n个= 4; 比例尺：40μm）英寸第8页^+/+或第8页^–/–MEF公司*P（P）<0.05和**P（P）<与相比0.01经THC处理的U87MG(B类)，eIF2αWT(C类)，或第8页^+/+(F类)单元格并与之比较siC转染、THC处理的U87MG细胞(D类).

我们随后询问p8及其下游靶点是否调节自噬。p8或TRB3的敲除阻止了THC诱导的自噬（图（图3，三，D和E），但不包括U87MG中的内质网扩张（补充图4D）细胞。此外，THC诱导自噬第8页^+/+但是不第8页-转换后的MEF不足（图（图3F三F和补充图5C）。总之，这些发现揭示了THC通过激活ER诱导癌细胞自噬压力触发的信号通路，涉及神经酰胺的刺激从头合成，eIF2α磷酸化，p8和TRB3上调。

THC通过TRB3抑制Akt和mTORC1。

抑制mTORC1被认为是早期触发自噬的关键步骤(6). 因此，我们测试了大麻素诱导的p8通路上调通过抑制导致自噬这个综合体的。THC处理U87MG细胞降低p70S6的磷酸化激酶（一种成熟的mTORC1底物）和核糖体蛋白S6（a成熟的p70S6激酶底物）（图（图4，4，A和C），表明mTORC1在大麻素激发的小鼠中受到抑制细胞。此外，大麻素诱导p70S6激酶和S6的减少磷酸化、自噬和细胞死亡在Tsc2型^–/–单元格，其中mTORC1具有组成活性(20)（图（图4B4B和补充图6，A和B），进一步支持mTORC1抑制在诱导自噬中的主要作用大麻素引起的细胞死亡。

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图4

THC通过TRB3抑制Akt/mTORC1通路。

(一个)THC对U87MG细胞p70S6K和S6磷酸化的影响(n个=6）。(B类)THC对细胞活力的影响（左侧面板；24小时；平均值±标准差；n个=6）和LC3脂质沉积（右侧面板；18h；n个=4）英寸Tsc2型^+/+和Tsc2型^–/–MEF公司。(C类)THC对Akt、TSC2、PRAS40、p70S6K和S6的影响U87MG细胞的磷酸化（18小时；OD相对于载体处理细胞，平均值±SD；n个= 7). (D类)THC对细胞的影响存活率（左面板；24 h；平均值±SD；n个=4）和LC3脂质沉淀（右侧面板；18 h；n个=4）pBABE和肉豆蔻酰化Akt（myr-Akt）MEF。(E类)THC对Akt的影响在U87MG细胞提取物中与TRB3共同免疫沉淀（8小时；OD相对于车用处理细胞，平均值±SD；n个= 9; 输入：TRB3）。(F类和G公司)THC对Akt、TSC2、PRAS40、，p70S6K、S6磷酸化和LC3脂质化(G公司仅）siC-和siTRB3-转染(F类; 18小时；相对于处理车辆的ODsiC转染的U87MG细胞，平均值±SD；n个= 7; 上面的面板显示了TRB3 mRNA水平和EGFP（Ad-EGFP）或大鼠TRB3的分析（Ad-TRB3）腺病毒载体-感染(G公司; 18小时；外径相对于车用Ad-EGFP感染的U87MG细胞，平均±SD；n个= 4; 上部面板显示rTRB3的分析mRNA水平）U87MG细胞。(H（H）)THC对Akt、p70S6K和S6的影响磷酸化第8页^+/+和第8页^–/–MEF公司(n个=7）*P（P）<0.05和**P（P）<与THC治疗组相比，0.01Tsc2型^+/+(B类)和pBABE(D类)MEF并与车辆处理的MEF进行比较(C类和E类),经载体处理的siC转染(F类)或Ad-EGFP感染(G公司)U87MG电池。

蛋白激酶Akt通过以下途径积极调节mTORC1复合物的活性磷酸化和抑制TSC2和PRAS40（一种成熟的Akt底物mTORC1复合体内）。因此，Akt抑制降低mTORC1活性促进自噬(20). 与此一致想法是，THC降低了Akt、TSC2和PRAS40以及p70S6的磷酸化激酶和S6（图（图4C）。4C） ●●●●。这种抑制通过与CB1受体拮抗剂孵育，Akt/mTORC1通路被阻断（补充图6C）或神经酰胺合成抑制剂（补充图6-D）。同样，细胞过度表达肉豆蔻酰化（组成活性）形式的Akt对THC诱导的mTORC1抑制、自噬和细胞死亡具有抵抗力（图（图4D4D和补充图6，E和F），进一步支持THC通过Akt抑制诱导自噬。

由于TRB3已被证明与Akt直接相互作用并抑制Akt(21,22),我们研究了TRB3的上调是否与THC诱导的Akt/mTORC1抑制。几项意见支持事实确实如此：（a）四氢大麻酚增加了与U87MG提取物中的TRB3共免疫沉淀的Akt的量（图（图4E），4E），（b）TRB3的击倒阻止了THC对Akt、TSC2、PRAS-40、p70S6激酶和S6磷酸化的影响（图（图4F），4F）和（c）TRB3过度表达降低Akt、TSC2、PRAS40、p70S6激酶和S6磷酸化增强了抑制THC对这些蛋白磷酸化的影响，并促进自噬（图（图4G）。4G）。根据这些观察结果，THC未能抑制eIF2α的Akt、p70S6激酶和S6磷酸化S51A敲除蛋白或p8-缺陷的MEF，其中TRB3在大麻素治疗（图（图4H4H和补充图6、G和H）。总之，这些数据表明p8和TRB3通过抑制Akt/mTORC1诱导肿瘤细胞自噬通路。

THC诱导的自噬促进癌细胞的凋亡死亡。

在分析大麻素细胞杀伤作用的机制时，我们观察到与泛酶抑制剂ZVAD-fmk孵育可同样防止细胞死亡遗传程度（图（图5A）5A）或药理学（补充图7）抑制自噬。此外，钡/钡双淘汰（DKO）永生化MEF，受保护抗线粒体凋亡(23)，是对THC诱导的细胞死亡和凋亡具有抵抗力（图（图5B）5B）但经历了eIF2α磷酸化和自噬（图（图5C）5C）经THC处理。因此，我们研究大麻素诱导的自噬是否促进癌细胞。LC3和活性caspase-3免疫染色的时程分析U87MG细胞显示自噬先于细胞凋亡特征的出现THC处理的细胞（图（图5D）。5D） ●●●●。此外，选择性击倒ATG1（图（图5D）5D）还有自AMBRA1或ATG5起（补充图8）阻止THC诱导的caspase-3激活。此外，与野生型的同类不同，附件5-有缺陷的永生化MEF未经历磷脂酰丝氨酸移位到质膜的外小叶（图（图5E），5E）线粒体膜电位丧失（图（图5F），5F）或增加反应性产物氧气种类（补充图9）对大麻素治疗的反应。这些研究结果表明，自噬介导的细胞死亡途径被激活大麻素抗肿瘤作用中的凋亡上游。

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图5

在大麻素诱导的癌细胞死亡中，自噬是凋亡的上游。

(一个)THC和泛酶抑制剂ZVAD（10μM）的可行性附件5^+/+和附件5^–/–MEF（36小时；活细胞相对于相应细胞的百分比附件5^+/+车辆处理细胞，平均值±SD；n个=3）。(B类)THC对细胞凋亡的影响钡/钡WT和钡/钡确定的DKO MEF通过Annexin V/碘化丙啶（PI）的细胞荧光分析（24小时；平均值±SD；n个=3）。平均值±标准偏差百分比膜联蛋白V-阳性/PI阳性和膜联蛋白V-阳性，PI-阴性细胞分别显示在上角和下角。(C类)THC对eIF2α磷酸化的影响（3h；n个=3）和LC3脂质化（18小时；n个=4）个钡/钡WT和DKO MEF。(D类)左图：THC的影响转染siC或siATG1的U87MG细胞的自噬和凋亡。绿色条形图、带有LC3点的单元格；红条，活性caspase-3阳性细胞；白色条，细胞同时具有LC3点和活性caspase-3染色。数据对应于LC3点（绿色条）激活的单元格百分比胱天蛋白酶-3阳性细胞（红条），以及具有LC3点和活性caspse-3染色（白条）与转染总数的关系每个时间点的细胞数（平均值±SD；n个=3）。正确的：代表性显微照片（36小时；比例尺：20微米）。(E类和F类)THC对细胞凋亡的影响(E类; 24h；n个=3）和线粒体膜电位损失由DiOC确定₆（3）染色(F类; 24小时；n个=4）第页，共页附件5^+/+和附件5^–/–MEF公司。在E类，Annexin的平均±SD百分比V-阳性/PI-阳性和Annexin V-阳性，PI-阴性单元格分别显示在上角和下角**P（P）<与THC治疗组相比，0.01附件5^+/+(一个,E类、和F类)和钡/钡重量(B类)MEF和来自THC处理的siC转染细胞(D类).

激活自噬是大麻素体内抗肿瘤作用所必需的。

为了确定我们发现的体内相关性，我们首先研究了THC促进上述自噬介导的细胞死亡途径的激活在U87MG细胞衍生的肿瘤异种移植物中，我们最近发现大麻素治疗可以减少肿瘤生长（特别是对14天肿瘤生长减少50%；裁判。13). 对这些肿瘤的分析表明，大麻素给药增加TRB3表达并降低S6磷酸化（图（图6A）。6A） ●●●●。同样，LC3点的形成以及在THC治疗组中观察到LC3-II和活性caspase-3免疫染色增加，但未经载体治疗的肿瘤（图（图6B）。6B） ●●●●。

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图6

THC激活体内自噬细胞死亡途径。

(一个)瘤周注射THC对TRB3和p-S6的影响U87MG肿瘤的免疫染色。TRB3-或p-S6-染色区域标准化每个截面的核总数；数字表示平均折叠改变±SD；对3个解剖的肿瘤中的每一个进行了18个切片的计数针对每个条件。比例尺：50μm。(B类)左：效果瘤周注射THC对U87MG中LC3和活性caspase-3免疫染色的影响肿瘤。箭头指向带有LC3点的单元格。数字表示百分比活性caspase-3阳性细胞相对于每个节段的细胞核±SD。3个节段中每个节段计数10个针对每种情况解剖肿瘤。比例尺：20μm。右：效果U87MG肿瘤的瘤周THC给药对LC3脂质化的影响。图中显示了来自1个车辆治疗肿瘤和1个THC治疗肿瘤的代表性样本。数字表示与车辆治疗肿瘤相关的LC3-I和LC3-II OD值（平均值±标准偏差）。n个=3。(C类)左：效果THC对LC3免疫染色（绿色）和TUNEL（红色）的给药Ras公司^V12版本/E1A公司第8页^+/+和第8页^–/–肿瘤异种移植物。箭头指向带有LC3点和TUNEL阳性细胞核的细胞。右：条形图显示TUNEL阳性细胞核或具有TUNEL阴性细胞核的细胞的百分比和LC3点相对于每个部分中的核总数（平均值±标准差）。分别从3个解剖肿瘤中计算出18个切片条件。比例尺：50μm。插图显示1的放大倍数所选单元格（箭头指向LC3点；比例尺：10μm）*P（P）<0.05和**P（P）<与相比0.01车辆治疗的肿瘤。

进一步研究p8通路的激活是否介导大麻素抗肿瘤作用，我们还分析了来自第8页^+/+和第8页^–/–Ras公司^V12版本/E1A转化的MEF（在这种情况下，服用THC 8天减少了45%的增长第8页^+/+肿瘤，但没有显著影响第8页^–/–肿瘤；裁判。13). THC处理增加了TRB3表达，S6磷酸化降低，自噬和TUNEL增加p8中活性caspase-3免疫染色^+/+但不是第8页^–/–肿瘤（图（图6C6C和补充图10）。此外，THC处理增强了p8中具有LC3点和TUNEL阳性细胞核的细胞数量^+/+但是不在p8中^–/–肿瘤（图（图6C）。6C） ●●●●。

为了验证自噬在大麻素抗肿瘤作用中的重要性，我们下一个生成的肿瘤附件5^+/+和附件5^–/–Ras公司^V12版本/T大抗原转化MEF。THC用量减少80%以上的肿瘤生长来自野生型细胞，但没有对自噬缺陷细胞产生的肿瘤有显著影响（图（图7A）。7A） ●●●●。此外，大麻素给药自噬增加，TUNEL（图（图7B），7B）、和活性caspase-3免疫染色（补充图11）附件5^+/+但不是附件5^–/–肿瘤。同样，大麻素给药增加了LC3点和TUNEL阳性细胞核附件5^+/+但不是附件5^–/–肿瘤（图（图7B）。7B）。综上所述，这些发现证明自噬介导的细胞死亡途径的激活是大麻素抗肿瘤作用不可或缺。

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图7

自噬对大麻素抗肿瘤作用至关重要。

(一个)瘤周注射THC对肿瘤生长的影响附件5^+/+（上面板）和附件5^–/–（下面板）Ras公司^V12版本/裸鼠体内产生的T大抗原MEF肿瘤异种移植瘤（平均值±SD；n个=每种情况7）。照片显示载药和THC治疗肿瘤的代表性图像。(B类)左图：THC给药对LC3免疫染色（绿色）和细胞凋亡的影响由TUNEL（红色）确定附件5^+/+和附件5^–/–MEF肿瘤异种移植。来自1辆车处理和1辆THC处理的代表性图像附件5^+/+和附件5^–/–肿瘤是展示。右：条形图显示TUNEL阳性细胞核和细胞的百分比TUNEL阳性核和LC3点相对于总核数每个截面（平均值±SD）。从3个截面中计算出18个截面每种情况下的解剖肿瘤（车辆治疗和THC治疗）。比例尺：50微米。(C类)拟议机制示意图THC诱导的细胞死亡（详见正文）**P（P）<0.01与载体治疗的肿瘤相比。

最后，我们分析了2名临床试验患者的肿瘤，该试验旨在研究THC对复发性多形性胶质母细胞瘤的影响。患者接受颅内四氢大麻酚给药，并在治疗后(11). 在这2名患者中，大麻素接种增加了TRB3免疫染色并降低了S6磷酸化（图（图8A）。8A） ●●●●。有趣的是具有自噬表型的细胞数量（图（图8B）8B）以及活性胱天蛋白酶-3免疫染色（图（图8C）8C）在获得的肿瘤样本中增加THC治疗后。尽管这些研究仅在2患者，他们符合上述临床前证据，并表明大麻素也可能触发人类自噬介导的细胞死亡肿瘤。

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图8

2例胶质母细胞瘤患者服用THC促进自噬。

2例多形性胶质母细胞瘤患者术前不同参数分析以及颅内THC治疗后（估计给药部位达到6–10μM）。(一个)TRB3和p-S6免疫染色。代表性显微照片如图所示。数字表示TRB3或p-S6染色区域标准化每个截面的核总数（平均折叠变化±SD）相对于相应的预处理样品。计算了15个部分针对每种肿瘤和每种情况（治疗前后）。比例尺：50微米。(B类)LC3的代表性显微照片二氨基联苯胺免疫染色。带有LC3点的细胞的平均百分比注意相对于每个切片中细胞核总数的±SD在每个面板的角落。从每个活检中计算出10个切片条件。箭头指向带有LC3点的单元格。比例尺：20μm。(C类)活性半胱天冬酶-3的代表性显微照片二氨基联苯胺免疫染色。数字表示具有活性caspase-3染色±SD相对于细胞核总数在每个部分中。对每种情况的每次活检进行十次切片计数。箭头指向caspase-3染色活跃的细胞。比例尺：20微米*P（P）<0.05和**P（P）<与治疗前比较0.01。

讨论

在这项研究中，我们发现大麻素是一种新的潜在抗肿瘤药物家族，诱导癌细胞自噬，并且这个过程介导细胞死亡-这些化合物的促进活性。几个强烈的观察结果支持这一观点：（a）THC在不同类型的癌症中诱导自噬和细胞死亡细胞，但非转化的星形胶质细胞对大麻素杀伤有抵抗力作用，（b）药物或基因抑制自噬阻止THC诱导细胞死亡，（c）自噬缺陷肿瘤对THC生长抑制有抵抗力作用，（d）给药THC激活3不同模型的肿瘤异种移植以及2例人体肿瘤标本。

取决于细胞环境以及触发的强度和持续时间刺激，自噬参与促进或抑制癌细胞生存(4,5,24,25). 然而，自噬在癌症中双重作用的分子基础仍然未知。这里的数据表明，自噬的诱导大麻素导致癌细胞死亡并确定负责这个细胞过程的激活。因此，我们的发现表明THC-通过激活CB1受体和刺激神经酰胺合成从头开始-激活早期内质网应激反应，导致eIF2α在Ser51上的磷酸化。使用执行的实验eIF2αS51A突变细胞显示该残基的磷酸化，它可以减弱一般蛋白质翻译，同时增强表达与内质网应激反应相关的几个基因(17)是上调应激蛋白p8及其ER所必需的压力相关下游目标ATF4、CHOP和TRB3以及大麻素诱导自噬。此外，我们证明p8和TRB3的上调，这以前与大麻素诱发的细胞死亡(13)，是自噬的触发。神经酰胺积累已被认为可诱导内质网应激(26,27)和自噬(28)、和eIF2α磷酸化与细胞自噬的诱导有关对不同情况的反应(29–31). 然而这些作用的分子机制尚未阐明。调查结果这里提出的建议是p8-TRB3通路的上调构成了从头合成神经酰胺和eIF2α的机理磷酸化促进自噬，从而确定我们认为是新的内质网应激和自噬之间的联系。

我们的数据还表明p8的自噬促进活性调节该途径基于其抑制Akt/mTORC1轴的能力。mTORC1的调节主要依赖于前生存激酶Akt的活性，其抑制导致mTORC1失活，进而自噬(20). 我们的发现表明THC上调TRB3，促进其相互作用与Akt结合，导致该激酶及其受体的磷酸化降低直接底物TSC2和PRAS40，触发mTORC1抑制和诱导自噬。TRB3先前已显示抑制Akt(21,22)，尽管精确这种假激酶在调节Akt活性中的作用细胞环境尚不清楚(32). 在这里，我们证明抑制Akt/mTORC1轴的TRB3对大麻素诱导癌细胞自噬。此外，我们还表明该途径是对大麻素抗肿瘤作用至关重要。因此，四氢大麻酚给药导致TRB3上调、mTORC1抑制、诱导自噬和减少肿瘤生长在不同的肿瘤异种移植模型中，但在p8-缺乏的肿瘤中没有p8/TRB3通路上调缺陷。此外，激活该通路在2名接受THC治疗的胶质瘤患者中也很明显。这些结果揭示了TRB3在调控中的重要作用癌细胞死亡。

自噬被认为是防止细胞凋亡的一种替代方法诱导细胞死亡的途径，或与细胞凋亡一起作为细胞死亡(6,33). 然而，人们对这两者之间相互作用的作用知之甚少2控制肿瘤生长以响应抗癌剂的细胞过程。我们的结果现在清楚地表明，自噬的诱导参与了大麻素促进线粒体活化的机制促凋亡途径。因此，p8-调节途径在任何肿瘤中都没有消融（因此，THC治疗不会诱导自噬）或肿瘤固有自噬缺陷的人在THC作用下会发生凋亡，因此他们对THC抗肿瘤作用有抵抗力。这些发现表明自噬是在体内大麻素治疗后激活细胞凋亡所必需的。

值得注意的是，本研究中使用的THC浓度相同范围与我们观察到的患者颅内给药的范围相同自噬介导的细胞死亡途径的激活(11)因此可以认为与临床相关。感兴趣的是，对U87MG肿瘤异种移植物腹腔注射THC也会产生类似的结果肿瘤生长减少（与自噬和凋亡增加同时发生）与瘤周注射大麻素时观察到的情况（我们未发表观察结果）。考虑到在临床试验中未观察到任何毒性迹象病人(11)或接受治疗的荷瘤动物脑内、瘤周或腹腔注射THC（参考文献。34和35和数据未显示），并且在其他临床试验中未报告明显的毒性作用大麻素在癌症患者中的各种应用试验（例如抑制恶心、呕吐和疼痛）和使用不同的给药途径（如口服、，口腔粘膜）(9,36)，我们的研究结果支持安全有效的THC剂量可能会影响癌症患者。

总之，在本研究中，我们确定了我们认为连接ER的新路线自噬激活的应激反应和促进肿瘤细胞凋亡死亡单元格（图（图7C）。7C） ●●●●。此的标识pathway将有助于理解导致激活抗癌药物引起的自噬介导的细胞死亡，可能有助于设计抑制肿瘤生长的新治疗策略。

方法

细胞培养和活力。

如前所述，从24小时大的小鼠中制备皮层星形胶质细胞(13). 脑肿瘤细胞的原代培养按照补充方法中所述进行制备和培养。U87MG、T98G、，U373MG和MiaPaCa2细胞，第8页^+/+和第8页^–/–Ras公司^V12版本/E1A公司MEF、，附件5^+/+和附件5^–/–T大抗原MEF（由东京医科和牙科大学水岛信宝提供，东京，日本），钡/钡野生型和钡/钡DKO T大号抗原MEF（由意大利米兰Dulbecco Telethon研究所的Luca Scorrano提供，和Patrizia Agostinis，天主教鲁汶大学，比利时鲁汶），eIF2αS51S WT和eIF2βS51A T大抗原MEF（提供作者：美国密歇根州安阿伯市密歇根大学理查德·考夫曼和塞萨尔·德Haro和Juan J.Berlanga，Severo Ochoa分子生物学中心，西班牙马德里自治大学），Tsc2型^+/+和Tsc2型^–/– 第53页^–/–MEF，空向量（pBABE）和pBABE-myr-Akt MEF，以及附件5^+/+和附件5^–/–Ras公司^V12版本/在含有10%FBS和转移到含有0.5%FBS的培养基中（Ras除外^V12版本/E1A转换将MEFs转移到含有2%FBS的培养基中）18小时后不同的治疗。第8页^+/+和第8页^–/–Ras公司^V12版本/E1A型MEF以及附件5^+/+和附件5^–/–Ras公司^V12版本/T大抗原MEF对应于至少20的多克隆混合物不同的选定克隆。除非另有说明，否则最终使用THC浓度为5μM。细胞活力由MTT测定[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化]试验（Sigma-Aldrich）。

流式细胞术。

简而言之，细胞（约5×10⁵每个分析的细胞数）胰蛋白酶化，分为2管，清洗，1500离心收集克5分钟。在37°C，Annexin V–FITC（BD Biosciences）。碘化丙啶在细胞荧光分析之前添加（1μg/ml）。另一个等分样品同时用3,3 l-二己基氧基碳菁标记碘化物（DiOC₆[3] 40毫微米；Invitrogen）和氢乙硫磷（5μM；Invitrogen）在37°C下持续10分钟，然后进行细胞荧光测定分析。每次分析中记录细胞数（10000）。荧光强度为在EPICS XL流式细胞仪（Beckman Coulter）中进行分析。

蛋白质印迹。

按照标准程序进行蛋白质印迹分析。列表使用的抗体可以在补充方法中找到。密度分析为使用Quantity One软件（Bio-Read）执行。

转染。

使用DharmaFECT用siRNA双工体转染U87MG细胞（75%融合）1转染试剂（Dharmacon）。细胞胰蛋白酶化，24小时后接种转染，密度为5000个细胞/cm².转染效率为用对照荧光（红色）siRNA（siGLO RISC-Free）监测大于70%小干扰RNA；法尔马孔）。在免疫荧光实验中，对照和选择性siRNA以1:5的比例使用，并对转染后的红点细胞进行评分。

腺病毒载体感染。

将U87MG细胞（75%融合液）用从携带EGFP的腺病毒载体感染HEK293细胞（由Javier G。卡斯特罗，马德里Niño Jesús婴儿大学医院，西班牙），大鼠HA-tagged TRB3（由日内瓦大学Patrick Iynedjian捐赠，瑞士日内瓦）(32)，或人类EGFP-LC3（由剑桥大学Aviva Tolkovsky和Christoph Goemans提供，英国剑桥）。经测定，感染率大于80%EGFP荧光。

RNA干扰。

双标记RNA双链体购自Dharmacon。序列列表可以见补充方法。

RT-PCR分析。

使用Trizol试剂（Invitrogen）分离RNA。cDNA是用转录因子逆转录酶（罗氏应用科学）。引物和扩增条件可以在补充方法中找到。

实时定量PCR。

cDNA是使用转录因子（Roche Applied Science）获得的。实时定量使用FastStart Universal Probe Master与Rox混合进行PCR分析（罗氏应用科学），探针来自Universal ProbeLibrary Set（罗氏应用科学）。引物序列可在补充方法中找到。扩增在7900 HT-Fast实时PCR系统（应用生物系统）中进行。将18S RNA水平作为参考值来调整每个值。

免疫沉淀。

在HEPES裂解缓冲液中裂解U87MG细胞（参见缓冲液的补充方法组成）。通过与5–20μl蛋白质G–Sepharose偶联至免疫前IgG。然后将裂解物提取物与5-20μl蛋白质G–与5–20结合的Sepharoseμg抗TRB3抗体或免疫前IgG。TRB3抗体（氨基末端，ab50516；Abcam）与蛋白质共价偶联G–使用二甲基吡美酰胺的葡聚糖。免疫沉淀是在4°C下在旋转轮上进行1小时。免疫沉淀物用HEPES裂解缓冲液洗涤4次，然后用HEPES激酶洗涤2次缓冲区。将免疫沉淀物重新悬浮在30μl样品缓冲液中（不含2-巯基乙醇）并通过0.22-μm Spin-X过滤过滤器，并添加浓度为1%（vol/vol）的2-巯基乙醇。样品进行电泳和免疫印迹分析。

神经酰胺水平。

神经酰胺水平的测定如前所述(37).

共焦激光扫描显微镜。

使用了免疫荧光显微镜的标准协议（参见所用抗体的补充方法）。量化细胞百分比使用LC3或PDI点，每个条件下至少随机计数200个细胞选定字段。在所有情况下，只有那些具有4个或更多突出圆点的细胞LC3或PDI得分为正。

体内治疗。

来源于U87MG细胞和p8的肿瘤^+/+和第8页^–/–MEF被诱导和处理为前面描述过(13). 肿瘤来源于附件5^+/+或附件5^–/–Ras公司^V12版本/T大抗原MEF（参见程序的补充方法通过皮下注射10⁷补充0.1%葡萄糖的PBS中的细胞。肿瘤被允许增长至200–250 mm的平均体积^三和动物随机分配给不同的组。此时，车辆或THC（15 mg/kg/d）每天在100μl PBS中添加5 mg/ml BSA单次瘤周注射。用外卡尺测量肿瘤体积计算为（4π/3）×（宽度/2）²×（长度/2）。所有涉及动物的程序都是用Complutense大学动物实验委员会根据西班牙官方规定。

人类肿瘤样本。

肿瘤活检取自2例复发性多形性胶质母细胞瘤患者已经用四氢大麻酚处理过。患者特点及临床研究已在别处详细描述(11).简单地说，THC溶解在30ml生理盐水溶液加0.5%（wt/vol）中肿瘤内注射人血清白蛋白。患者1共服用1.46 mg THC 30天，而患者2共服用1.29 mg THC持续26天（估计剂量为6-10给药部位达到μM THC；裁判。11). 样品固定在福尔马林中，嵌入石蜡切片，用于免疫显微镜检查。

肿瘤样本的免疫显微镜检查。

对肿瘤异种移植物的样本进行解剖，将Tissue-Tek（樱花）包埋，冷冻，在进行染色程序之前，在丙酮中固定10分钟室温。人类肿瘤样本进行脱蜡处理，在染色前进行补液和抗原提取。免疫荧光或免疫组织化学显微镜的标准方案是使用（见补充方法）。用TOTO-3碘化物（U87MG）对细胞核进行复染和人体肿瘤样本；Invitrogen）或Hoechst 33342（MEF肿瘤；Invitrogen）。使用Metamorph-Offline 6.2软件（Universal）获取荧光图像成像）和蔡司Axioplan 2显微镜。

隧道。

肿瘤样本被固定、封闭和渗透，TUNEL按前面描述过(13).

电子显微镜。

通过以下方法评估载体和四氢大麻酚处理的细胞的超微结构分析环氧树脂EML-812的常规包埋（Taab实验室）。超薄（20-使用Leica-Reichert-Jung获得样品的截面超微切片，然后用饱和醋酸铀酰铅染色柠檬酸盐标准程序。在JEOL 1200-EX II中分析超薄切片100 kV下运行的透射电子显微镜。

统计。

通过ANOVA进行统计分析，并使用学生-努曼-凯尔斯测试。当P（P）数值小于0.05。

补充材料

补充数据：

单击此处查看。^{（11M，pdf）}

致谢

这项工作得到了西班牙教育和科学部的资助（MEC）（HF2005/0021，致G.Velasco；SAF2006/00918，致M.Guzmán；以及BFU2006-00508，发给P.Boya），Santander-Computense PR34/07-15856，发给G.Velasco），马德里社区（S-SAL/0261/2006，致M.Guzmán）和法律控制癌症和癌极性PACA（对J.L.Iovanna）。M.Salazar是来自MEC的奖学金。A.Carracedo是Gobierno奖学金的获得者Vasco、欧洲生物化学学会联合会和欧洲分子学会生物组织。M.Lorente和P.Boya有一辆Juan de la Cierva和一辆分别与MEC签订Ramón y Cajal合同。美国。Hernández-Tiedra与西班牙教育与欧洲社会基金会。作者感谢Dario Alessi（美国大学邓迪，邓迪，英国）捐献抗PRAS40抗体和技术支持免疫沉淀实验；杰玛·法布里亚斯（Gemma Fabriás）、约瑟菲娜·卡萨斯（Josefina Casas）、，和Eva Dalmau（Químicas y Ambientales研究所，西班牙巴塞罗那），用于分析神经酰胺样品；何塞·利兹卡诺，JoséBayascas、Maria M.Caffarel和Patrizia Agostinis他们的实验建议；以及我们实验室的其他成员支持。

脚注

利益冲突：作者声明存在利益。

使用的非标准缩写：自噬蛋白；eIF2α，真核翻译起始因子2α；MEF、，小鼠胚胎成纤维细胞；THC，Δ⁹-四氢大麻酚；mTORC1，雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶点；蛋白质二硫键异构酶；TRB3，tribbles同源物3。

本文引文： 临床杂志。投资。 119:1359–1372 (2009). doi:10.1172/JCI37948

Arkaitz Carracedo和Ainara Egia目前的地址是：癌症遗传学项目，贝斯以色列女执事癌症中心和医学部，贝斯以色列美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院女执事医疗中心。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会