p38α和p38γ介导致癌ras（拉斯维加斯）-诱发的差异衰老机制^*S⃞

摘要

这个ras（拉斯维加斯）原癌基因编码小GTP结合蛋白细胞表面生长信号的转导(1–三).异常激活ras（拉斯维加斯）是肿瘤形成的关键步骤。本构激活ras（拉斯维加斯）基因，或者通过点突变或过表达与多种人类肿瘤相关频率，有助于多个这些癌症的致瘤表型(4–11).然而，在早期传代的初级人类和啮齿动物细胞中ras（拉斯维加斯）导致永久性增殖停滞衰老，因为其与复制性衰老的表型相似在晚传递细胞中观察到(12). 其他致癌基因，如E2F1系列和英国皇家空军，或某些肿瘤抑制因子失活基因也能诱导正常人类细胞衰老(13–15).癌基因激活对早衰反应的存在意味着与细胞凋亡一样，肿瘤诱导的衰老是一种抗肿瘤防御机制。事实上，有充分的证据表明细胞转化ras（拉斯维加斯）需要来自的合作克服衰老反应的永生化癌基因，例如灭活p53(8,16,17). 最近的研究也证明在早期癌前病变中可以检测到衰老细胞两名人类癌症患者的肺、胰腺、皮肤和前列腺病变小鼠肿瘤模型和衰老的破坏加速了恶性肿瘤的发展肿瘤(18–23).这些发现表明肿瘤诱导的衰老发生在里面活泼地并成为肿瘤发生的障碍。

尽管ras（拉斯维加斯）已经进行了广泛的研究，对信号的了解相对较少调节ras（拉斯维加斯）-诱导衰老反应。研究已经表明ras（拉斯维加斯）诱导衰老取决于关于Raf/MEK/ERK-MAPK通路的激活(13,24)并配有几种细胞增殖抑制剂的上调，包括第16页^{INK4A（墨水）}、p53、p14/p19^{农业研究基金}和第21页^{WAF1（加权平均1）}(12,25)和E2F静音靶基因(26). 在一些细胞衰老是由r引起的作为-诱导生产活性氧物种(27). 此外，它已经据报道，致癌基因诱导的衰老是由DNA损伤反应介导的由异常DNA复制产生(28,29). 最近，来自我们的实验室和其他实验室已经证明ras（拉斯维加斯）-诱导衰老依赖于p38的激活MAPK公司^三(30–33).p38及其上游MAPK激酶MKK3和MKK6(34,35)被致癌物质激活ras（拉斯维加斯）由于MEK/ERK（有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号调节激酶）激活衰老细胞。组织的p38激活导致早衰，而药理作用抑制p38阻止ras（拉斯维加斯）-诱导衰老(30).

肿瘤诱导衰老对p38的需求表明p38通路除了以前的作用外，还具有抑瘤作用炎症和应激反应中的已知作用(36–38).事实上，p38α或下游底物激酶PRAK的靶点缺失p38在小鼠模型中加速癌症发展(23,39,40). 此外，删除Wip1是一种p38磷酸酶，在人类乳腺肿瘤中经常扩增，导致p38激活与降低小鼠乳腺肿瘤发生(41,42). 因此，p38通路可能通过介导在肿瘤抑制中发挥重要作用衰老对癌基因激活的反应。

p38的四种哺乳动物亚型（α、β、δ和γ），每个基因都由不同的基因编码，已经被鉴定；他们在以下方面有所不同上游调控MAPK的组织特异性表达和亲和力激酶(43–49).在这些亚型中，只有p38α被证明对小鼠炎症和应激反应的遗传分析(50)，而其他p38亚型在炎症或其他疾病中的生理作用细胞功能尚不清楚(51,52). 我们之前已经展示过SB203580是一种抑制p38α和p38β的化合物，阻止ras（拉斯维加斯）-诱导原代细胞衰老(30)，表明诱导衰老可能需要p38α/β或两者。然而，该化合物还抑制其他p38亚型和其他亚型的活性蛋白激酶虽然亲和力较低。每个人的具体参与p38亚型在衰老中的作用从未被研究过。在当前研究中，我们检测了p38亚型在致癌中的作用ras（拉斯维加斯）-诱发的人类原始细胞的衰老。我们的数据表明p38α和p38γ而非p38β是信号传导的基本成分介导的途径ras（拉斯维加斯）-诱导衰老与p38α和p38γ通过不同的机制参与衰老诱导。而p38γ介导ras（拉斯维加斯）-诱导衰老至少部分是由于直接刺激p53转录活性磷酸化，p38α似乎调节a细胞的衰老p53相关性，p16^{INK4A（墨水）}-依赖方式。

实验程序

细胞培养-维持BJ人包皮成纤维细胞在补充有10%胎牛血清的最低必需培养基中，非必需氨基酸、谷氨酰胺和抗生素。WI38和IMR90人类成纤维细胞和LinX-A逆转录病毒包装细胞在Dulbecco’s中生长添加10%胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素。

质粒-Ha-RasV12表达载体来自Scott Lowe博士。FLAG标记野生型p38亚型的逆转录病毒载体通过将相应的cDNA亚克隆到WZLHygro构建。逆转录病毒血凝素标记野生型和固有活性突变体的载体p38亚型(53)是通过将相应的cDNA亚克隆到pBabePuro中构建。寡核苷酸针对靶向p38α-758（AAATTCCCGAGGTCTAAT）、p38γ-550的shRNA（GCGCTAAGGTGCCATCAA）、p38γ-1023（GCGTGTTACTTACAAAGAG）和GFP(54)被克隆到pSUPER.retro符合已发布的协议(55). 寡核苷酸靶向p38α-577（CGCGGTTACTAAACATATA）、p38α-756的shRNA（CACCAATTCTCCGAGGTCTAA），p38β-319（CCCCTGATGGGCCGACCTGA），和p38β-661（ACCCTCTCCCGGGAGAGCACT）被克隆到pSM2C中公布的协议(56).MKK3E和MKK6E逆转录病毒载体(30)和逆转录病毒p53报告蛋白PG-Luc及其非53结合对照MG-Luc(57)，已报告之前。

基于逆转录病毒的基因转导-这是作为如前所述(58).用120μg/ml潮霉素B和400μg/ml纯化转导细胞G418、5μg/ml速溶菌素和/或1.2μg/ml嘌呤霉素。

衰老分析-这是在细胞培养中进行的通过测量增殖率和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）衰老标志物如前所述(30).使用公式PD计算人口倍增（PD）=日志(N个2/N个1） /log2，其中N个1是单元格数播种和N个2是回收的细胞数(59). 量化SA-β-gal阳性，在随机区域中至少有200个细胞被计数每个重复的井。每个实验分三次进行，或重复。

Western Blot分析-进行Western blot分析转导Ras或MKK3/6E后7-10天制备的裂解物如前所述，来自次分流细胞(30). 主要抗体为来自Covance（HA-11）、Sigma（FLAG-M5、FLAG-F7425和actin）、Santa Cruz生物技术（Ras C-20、MKK3 C-19、p53 FL-393、p21^WAF1型C-19），电池信号转导（磷酸-p38-Thr¹⁸⁰/提尔¹⁸²,磷酸-p53-Ser¹⁵和-Ser³³、和磷酸-ATF2-Thr⁷¹). 抗p38α、-β、-γ和-δ以前在我们的实验室。使用增强化学发光和使用FluorChem™-8900成像系统拍摄（AlphaInnotech）。

p53报告者分析-BJ细胞用含多拷贝启动子驱动的逆转录病毒荧光素酶报告子功能性p53结合位点（PG-Luc）或突变型p53结合部位（MG-Luc）(57). 这些单元格在PD28-32用shRNA转导GFP、p38α或p38γ随后在PD30–34使用Ha-RasV12或载体。细胞被分割在第7天或第8天将其放入12孔板中-ras（拉斯维加斯）转导和裂解第8天或第9天。使用荧光素酶测定系统测定荧光素酶活性（Promega）根据制造商的说明并标准化为Bradford试验测定的蛋白质浓度。每次实验一式三份或两份。

重组蛋白质-重组GST-ATF2、GST-MKK6E和如前所述制备His-p38亚型(60,61). 野生型和突变型hp53(1–61),与双顺反子CREB结合蛋白的ZZTAZ2结构域共表达用于增强蛋白质稳定性的载体，按所述进行纯化(62). 髓磷脂碱性蛋白（MBP）从Sigma购买。

免疫沉淀偶联激酶检测p38-BJ细胞在第6-8天在PD30–40处裂解-ras（拉斯维加斯）/MKK3/6E型50m缓冲液中的转导米HEPES，pH 7.5，2.5米米EGTA，1米米EDTA，1%Triton X-100，150米米氯化钠、10%甘油、1 m米苯基甲基磺酰氟，50米米氟化钠，1米米钒酸钠，1 m米β-甘油磷酸，1 m米二硫苏糖醇和完全蛋白酶抑制剂。100–300μg裂解物与60μl琼脂糖结合的抗FLAG抗体M2（Sigma）在4°C下放置2小时用1ml裂解缓冲液清洗珠子三次，用1×激酶缓冲液（50 m米HEPES，pH 7.5，0.5 m米EGTA，10米米氯化镁₂，0.1米米苯甲基磺酰氟，1 m米氟化钠，0.1米米钠钒酸盐，0.1 m米β-甘油磷酸和1 m米二硫苏糖醇）。反应在20μl的1×激酶中进行10μ缓冲液（以上）米ATP，0.5μl[γ³²P] ATP和10μg hp53(1–61)或2μg GST-ATF2在30°C下放置45分钟7μl 4×Laemmli缓冲液，在95°C下加热，通过SDS-PAGE电泳。使用荧光成像仪检测放射性信号。的一部分免疫沉淀物和总蛋白裂解物Western blot分析确保免疫沉淀和蛋白质输入相等。

重组p38激酶检测-重组病毒检测激酶分两个顺序步骤进行，第一步是MKK6E对His-p38的磷酸化和第二次磷酸化第38页底物。第一步在30°C下进行10分钟14μl 1×激酶缓冲液（20 m米三氯化氢，pH 7.5，20米米氯化钠，10米米氯化镁₂，1米米二硫苏糖醇，20μ米冷ATP和1 m米氟化钠）含0.4μg His-p38，含或不含50 ng GST-MKK6。随后，在1×激酶缓冲液中混合6μl底物（与含有20μg hp53(1–61)（野生型或S33A或S46A突变型）或10μg MBP和2μCi[γ-³²P] 在每个反应中添加ATP。所得20μl反应在30°C下培养30分钟，通过添加7μl 4×Laemmli缓冲液，在95C°下加热10分钟反应在4–20%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。荧光成像仪检测到放射性信号。

Northern Blot分析-从细胞中分离出总RNA根据制造商的要求，使用TRIzol试剂（Invitrogen）说明。10μg RNA在含有3.7%甲醛在1×MOPS缓冲液（20 m）中米MOPS，5个米米NaOAc和1 m米EDTA，pH 7.0），转移至Hybond10×SSC（1.5）中的N+尼龙膜米氯化钠和150米米纳_三柠檬酸盐，pH 7.0），并在65°C下杂交Church-Gilbert缓冲液（1%牛血清白蛋白，400 m米NaPO公司₄，pH 7.0，15%甲酰胺，1 m米EDTA和7%十二烷基硫酸钠）用[α]标记的800碱基对人p16 cDNA探针-³²P] dATP公司和[α-³²P] 通过随机启动的dCTP。大量清洗后用0.2×SSC/0.1%的SDS缓冲液在65°C下对信号进行可视化并通过磷光成像进行量化。

结果

p38等位基因在癌基因诱导过程中的表达和激活人原代成纤维细胞的衰老-我们之前展示过致癌的ras（拉斯维加斯）未能诱导原发性BJ人衰老p38α和p38β特异性抑制剂对成纤维细胞的作用SB203580型(30)，表明这两种亚型中至少有一种可能是诱导衰老所必需的。然而，这种化合物也抑制其他p38亚型甚至其他蛋白质激酶，尽管亲和力较低。调查特定在我们最初研究的本研究中，每个p38亚型的参与这些亚型在衰老细胞中的表达和活性。尽管所有四种p38亚型含有相似数量的氨基酸残基，它们SDS-PAGE显示出明显的迁移率。而其他亚型表观分子量为38–42 kDa，p38γ迁移到49-kDa标记(图。1A类). p38α的迁移率略高于p38β和p38δ。这些差异使我们能够区分彼此异形体。

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图1。

p38α、-β和-γ亚型在原代中表达人成纤维细胞与致癌激活ras（拉斯维加斯）在期间衰老诱导。 A类BJ细胞（PD26）的Western blot分析用检测FLAG-p38和肌动蛋白的FLAG-tagged p38亚型转导。B类转染FLAG-p38的BJ细胞的Western blot分析亚型和Ha-RasV12(Ras公司)，MKK3E或矢量(白色),检测磷酸化p38、FLAG、Ras、MKK3和肌动蛋白。在第8天裂解细胞PD30时Ras后转导。C类，诱导的激酶活性ATF2的FLAG-p38亚型ras（拉斯维加斯）.FLAG-p38亚型从用FLAG-p38和Ha-RasV12转导的BJ细胞免疫沉淀的，或Ras转导后第8天PD30处的载体（与B类)使用琼脂糖结合的抗FLAG M2抗体并孵育在存在[γ]的情况下使用GST-ATF2-³²P] ATP。磷酸化放射自显影检测ATF2。ATF2的输入由以下公式确定考马斯亮蓝R染色。天，蛋白质印迹分析用Ha-RasV12、MKK3E或载体转导的BJ细胞检测磷酸化p38，p38α、p38β和p38γ使用特定抗体。细胞是在PD25时Ras转导后第8天裂解。每组相同的裂解物含有用载体Ha-RasV12转导的BJ细胞裂解物的集合，或MKK3E在相同的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并排溶解转移到硝化纤维膜上。膜被切成了碎片，每个含有一组裂解物。这些膜片当时是与磷酸化p38、-p38α、-p38β抗体杂交-p38γ。化学发光信号在将膜重新对齐到原始位置。的位置p38α、p38β和p38γ标记为箭头.

致癌转导后ras（拉斯维加斯）(哈拉斯V12)或活动MKK3（MKK3E）突变体，胞外表达的磷酸化p38α、p38β、p38γ和p38δ在它们的激活环中是磷酸化特异性抗体检测到BJ细胞中显著增强(图1B类). 这些p38亚型也显示ATF2蛋白激酶活性增加在里面体外当BJ细胞免疫沉淀转导致癌物时ras（拉斯维加斯）与对照组相比(图1C类). 这些结果表明，p38的所有四种亚型在ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。使用异构体特异性抗体，我们能够显示p38α、p38β和p38γ在原代BJ人成纤维细胞(图。1天). 此外，Ras和MKK3E均诱导激活共迁移内源性p38蛋白的磷酸化p38α和p38γ(图。1天). 我们确认磷酸特异性抗体及其与p38α和p38γ的共迁移确实代表磷酸化的p38α和p38γ亚型，因为这些条带在表达p38α(图2A类)或p38γshRNA(图。三A类). 因此，这些发现表明致癌ras（拉斯维加斯）正如我们所证明的那样，不仅激活内源性p38α以前(30)，但也包括内源性p38γ在衰老诱导中的作用。有趣的是，在BJ人类成纤维细胞，致癌ras（拉斯维加斯）通过激活p38γ磷酸化而不改变其表达水平(图1天). 这是在与之前的发现相比，致癌ras（拉斯维加斯）诱导p38γ大鼠肠上皮细胞的表达而非磷酸化（IEC-6）(63). 这就增加了Ras可能通过以下途径刺激p38γ活性不同的机制以物种或细胞类型依赖的方式。

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图2。

p38α对ras（拉斯维加斯）-诱导衰老，但不是为了p53在Ser的磷酸化³³或p21的诱导^{WAF1（加权平均1）}表达式。 A类，用抗GFP shRNA转导的BJ细胞（shGFP）或p38α（shp38α-577、-756或-758）和Ha-RasV12(Ras公司)或向量(白色)进行Western blot分析，检测指示蛋白质。在Ras转导后第10天PD34时对细胞进行裂解(左侧面板)或PD35(右侧面板).B类，的shGFP或shp38α-577转导BJ细胞的群体倍增，-在16天内跟踪756或-758和Ha-RasV12或载体，从Ras转导后第5天开始，PD34(顶部面板)或PD35(底部面板). 重复值为平均值±S.D。C类、BJ细胞系（如中所述B类)为Ras转导后第15天的SA-β-gal衰老标记。值为副本的平均值±S.D。

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图3。

p38γ对ras（拉斯维加斯）-诱导衰老，p53在Ser的磷酸化³³和归纳第21页^{WAF1（加权平均1）}表达式。 A类，用shGFP转导的BJ细胞或shp38γ-550或-1023和Ha-RasV12(Ras公司)或向量(白色)进行Western blot分析，检测蛋白质。在Ras转导后第8天在PD36处裂解细胞。B类,shGFP或shp38γ-550转导的BJ细胞的群体倍增或-1023和Ha-RasV12或载体在12个周期内进行跟踪(左边面板)或23(右侧面板)天，从Ras后的第5天开始PD36时的转导(顶部面板)或PD35(底板).重复值为平均值±S.D。C类，BJ细胞系（如所述B类)对SA-β-gal衰老标记进行染色Ras转导后第17天。数值为平均值±S.D重复。

虽然p38β在原代人成纤维细胞中表达，但我们未能检测到一个明显的p38磷酸带与p38β共迁移(图1天). 然而，基于外源性磷酸化和激酶活性的诱导p38β的原癌表达ras（拉斯维加斯）(图1，B类和C类)，我们推断p38β在ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。因为p38β的流动性SDS-PAGE上的p38α稍慢，可能是磷酸p38β的信号被磷酸p38α的信号所掩盖因为p38β的丰度相对较低p38α。此外，尽管外源性表达的p38δ可能是被两种致癌物质激活ras（拉斯维加斯）和MKK3E(图1，B类和C)，的p38δ在原代人成纤维细胞中几乎检测不到（数据未显示）。因此，我们的研究重点是p38α、-β和-γ亚型。

第38页α和第38页γ，但不是第38页β，对致癌ras诱导至关重要衰老-p38α，-β、 衰老细胞中的γ和γ促使我们检测p38亚型对肿瘤诱导衰老的需求。三个p38αshRNA（shp38α-577、-756和-758），两个p38βshRNA（shp38β-319和-661）和两个p38γ-shRNA（shp28γ-550和-1023）。当通过逆转录病毒稳定地转导到BJ细胞中时，shp38α-577不能抑制p38α的表达水平(图2A类)，而所有其他shRNAs有效地沉默了适当p38的表达不影响其他亚型的亚型（图。​（图2A类2A类和​和3A类三A类).

在BJ细胞中稳定表达时，p38α-shRNAs（shp38α-756和-758），有效地击倒p38α，防止致癌ras（拉斯维加斯）-诱导生长停滞(图。2B类)以及SA-β-gal的积累，这是衰老(图2C类).相反，GFP的shRNA或p38αshRNA（shp38α-577）未能沉默p38α的表达，对衰老诱导没有影响(图2，B类和C类). 此外，两个沉默p38γ的shRNAs表达（shp38γ-550和-1023）也阻断了ras（拉斯维加斯）诱导生长停滞(图。三B类)并且受到了极大的抑制ras（拉斯维加斯）-诱导表达SA-β-加仑(图。三C类)与GFP shRNA相比。另一方面，有效沉默p38β表达的p38βshRNA没有破坏致癌ras（拉斯维加斯）-诱导衰老（数据未显示）。这些结果在来源于正常胚胎肺组织，其中ras（拉斯维加斯）-诱导衰老是shRNA对p38α和p38γ有抑制作用，但对p38β（补充图S1）。p38γ的ShRNA也延迟了发病属于ras（拉斯维加斯）-IMR90原代人肺成纤维细胞诱导的衰老（数据未显示）。这些结果表明p38α和p38γ对于ras（拉斯维加斯）-诱导衰老，而p38β对衰老诱导来说是不必要的。

p38的本构激活α或第38页γ,但不是p38β，导致过早衰老-收件人分析p38激活对衰老诱导的影响，我们采用近年来p38亚型本质活性突变体的优势由Engelberg博士和Livnah博士的团队建造（希伯来大学耶路撒冷(53,53)). 这些突变体获得性自发蛋白激酶活性在体外和在里面活泼地并保持对底物和抑制剂的特异性，类似于野生型p38亚型。当通过逆转录病毒，p38α（p38α-D176A）的活性形式，p38β（p38β-D176A）或p38γ（p38γ-D179A）及其野生型对应项以可比较的水平表示(图4，A类和B类). 然而，活性突变体显示出更高的活性活化环中的自磷酸化水平比相应的用磷酸特异性抗体检测西药中的野生型蛋白印迹分析(图4，A类和B类). 这些结果与以前的报告一致在其他细胞系中，表明p38亚型的这些突变体确实是构成活跃的。

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图4。

组成活性p38α和p38γ，但不包括p38β，诱导人原代成纤维细胞过早衰老。 A类和B类载体转导BJ细胞的Western blot分析对照组（Babe Puro，英国石油公司). Ha-RasV12型(Ras公司),血凝素标记的野生型p38α、p38γ或p38β(重量)，或其活性突变体（p38αD176A，p38γD179A，或p38βD176A）检测指示蛋白。细胞是在转导后第8天PD33时裂解。C类人口翻了一番中描述的BJ细胞系A类和B类被跟踪了6 (左侧面板)或12(中间的和右侧面板)天，转导后第5天开始，PD32。数值为平均值±S.D重复。^*,对< 0.001;^**,对< 0.01; #,对> 0.05,对矢量控制学生的t吨测试。天、BJ细胞系（如中所述A类)在第14天对SA-β-gal衰老标记进行染色后转导。中的值为重复值的平均值±S.D。^*,对< 0.01; #,对> 0.05,对学生的病媒控制t吨测试。

此外，类似于致癌ras（拉斯维加斯），p38α-D176A的表达或p38γ-D179A导致生长停滞(图4C类，顶部和中间面板)和SA-β-gal标记物的积累(图4天)在BJ细胞中，而野生型p38α和p38γ对细胞无明显抑制作用增殖或诱导SA-β-gal表达。相反，主动p38β突变体（p38β-D176A）没有引起原代BJ成纤维细胞的增殖(图4C类，底部面板). 因此p38α或p38γ的组成型激活，但p38β不足以诱导原发性早衰人成纤维细胞。

第38页γ，但不是第38页α，是必需的ras诱导衰老细胞中p53的激活-试图研究以下基本作用的分子机制p38α和p38γ在衰老中的作用，我们检测了它们的能力调节p53活性的亚型，p53是ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。为此，我们使用了一种基于逆转录病毒的，稳定的p53荧光素酶报告系统(57). 在BJ细胞中稳定用这种稳定的p53报告基因（PG-Luc）转导，荧光素酶活性为在Ha-RasV12存在下显著刺激（3-4倍）(图5，A类和B类，顶部面板)，证实了p53的诱导作用衰老过程中的转录活性。然而，ras（拉斯维加斯）-诱导型p53表达有效p38γ的BJ细胞的活性大大降低shRNA（shp38γ-550和-1023）(图。5B类，顶部面板)而p38αshRNA对衰老细胞中p53依赖性荧光素酶活性无明显影响。两者都不是ras（拉斯维加斯）p38α或p38γshRNA也不显著改变MG-Luc的转录，一个含有突变的对照报告p53结合位点(57)(图5A类和B类，底部面板)，表明影响我们观察到p53是特异性的。这些数据表明p38γ，但而不是p38α，在ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。

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图5。

p38γ而非p38α对致癌至关重要ras（拉斯维加斯）-诱导p53的转录活性。 A类，BJ细胞由启动子驱动的逆转录病毒荧光素酶报告子稳定转导包含功能性p53绑定站点（PG-Luc，顶部面板)或突变p53结合位点（MG-Luc，底部面板)是用编码shGFP或shp38γ-756或-758的逆转录病毒转导PD33和Ha-RasV12(Ras公司)或向量(白色)PD35。细胞在Ras转导后第8天进行裂解。B类，BJ细胞稳定由启动子驱动的逆转录病毒荧光素酶报告子转导包含功能性p53绑定站点（PG-Luc，顶部面板)或突变p53结合位点（MG-Luc，底部面板)是用编码shGFP或shp38γ-550或-1023的逆转录病毒转导PD28和在PD30带有Ha-RasV12或载体。Ras后第8天裂解细胞转导。在A类和B类，测定荧光素酶活性并归一化为蛋白质浓度。数值为平均值±S.D一式三份。注意，荧光素酶值在细胞之间不可比较用PG-Luc和MG-Luc作为荧光素酶活性的测定在不同的灵敏度设置下使用不同体积的裂解物光度计。C类和天BJ细胞的Western blot分析用shGFP或shp38γ-550或-1023和Ha-RasV12或载体转导(C类)或带有shGFP或shp38α-756或-758和Ha-RasV12或载体(天)检测指示的蛋白质。在第8天裂解细胞(C类)或第10天(天)PD36时的转导后(C类)或第35页(天).电子，转导的IMR90细胞的蛋白质印迹分析p38α的shRNA(第页α756, -758)或p38γ(第页γ1023)和Ha-RasV12或矢量控制检测指示的蛋白质。细胞裂解物在感染后11天用ras（拉斯维加斯）PD36。F类转导BJ细胞的Western blot分析带病媒控制（Babe Puro，英国石油公司). Ha-RasV12，血凝素标记野生型p38α、p38γ或p38β(重量)，或其活动突变体（p38αD176A、p38γD179A或p38βD176A），检测指示蛋白质。在转导后第8天PD33时对细胞进行裂解。

与p38γ在p53激活和衰老诱导，抑制p38γshRNAras（拉斯维加斯）-调解的p21的诱导^{WAF1（加权平均1）}，p53的内源性转录靶点和衰老的关键效应器(图。5C类). 相反，尽管有效的p38αshRNA（shp38α-756和-758）被阻断ras（拉斯维加斯）-诱导衰老(图2，B类和C类)，它没有减少p21^{WAF1（加权平均1）}归纳法ras（拉斯维加斯）与GFP shRNA相比(图5天). A类似在IMR90细胞中进行观察(图。5电子). 此外，尽管构成活性突变体p38α（p38α-D176A）和p38γ（p38γ-D179A）诱导衰老(图4，C类和天)，只有p38γ-D179A，而没有p38α-D176A，增加p21的表达^{WAF1（加权平均1）}(图5F类). 活动的p38β突变也不能刺激p21水平^{WAF1（加权平均1）}(图5F类)，一致而该突变体不能诱导早衰。拿结合荧光素酶报告分析的结果，这些数据证明尽管p38γ在ras（拉斯维加斯）-诱发的衰老与刺激p53活性和随后诱导p21的表达^{WAF1（加权平均1）}，p38α通过p53/p21介导衰老诱导^{WAF1（加权平均1）}-独立的，独立的机制。

第38页γ，但不是第38页α，中介肿瘤诱导衰老过程中p53在体内的磷酸化ras（拉斯维加斯）-p53的活性是通过其磷酸化来调节的N-末端转录激活域。差异效应p38α和p38γras（拉斯维加斯）-诱导的p53活性表明这些亚型在p53磷酸化过程中可能发挥不同的作用衰老诱导。已经证明³³和序号⁴⁶p53的直接底物是p38α在体外这些位点的磷酸化有助于激活p53DNA损伤后(64). 这个其他p38亚型磷酸化p53的能力尚不清楚。我们发现那个在体外，重组p38γ磷酸化N-末端p53转录激活域，以及阳性对照，MBP，以MKK6E相关方式(图。6A类)，表明p53是活化的p38γ。Ser突变³³对阿拉来说，基本上废除了p38γ磷酸化p53，而Ser突变⁴⁶到丙氨酸对p53磷酸化几乎没有影响(图6B类). 在对比，任一Ser突变³³或Ser⁴⁶至阿拉p38α大大降低了p53的磷酸化(图6B类). 因此，p38γ主要在血清中磷酸化p53³³ 在体外,而p38α在两种血清中磷酸化p53³³和序号⁴⁶如前所述。

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图6。

重组或免疫沉淀p38α对p53的磷酸化作用和p38γ在体外. A类，重组p38γ磷酸化p53。His-p38γ首先与GST-MKK6E（+）或缓冲液（-）和冷ATP，然后使用底物MBP或p53(1–61)在[γ]存在下-³²P] ATP。B类，重组p38α在血清中磷酸化p53³³和Ser⁴⁶,而重组p38γ磷酸化Ser³³只有。His-p38α或-p38γ首先与GST-MKK6E和冷ATP孵育然后是p53(1–61)(重量，野生型）或p53(1–61)携带S33A或S46A突变[γ-³²P] ATP。C类，p38γ免疫沉淀自衰老细胞对p53的激酶活性比p38α确实如此。从BJ免疫沉淀FLAG-p38α或-p38γ用FLAG-p38α或-p38γ和Ha-RasV12转导的细胞(Ras公司)、MKK3E或矢量(白色)Ras后第8天PD30使用琼脂糖缀合的抗FLAG M2抗体转导并孵育带有p53(1–61)在[γ]存在下-³²P] ATP。同一细胞裂解为在图例中描述图。1B类用于免疫沉淀。的一部分对免疫沉淀物进行蛋白质印迹分析以检测FLAG-p38。天衰老细胞磷酸化物中p38γ免疫沉淀Ser处的p53³³.FLAG-p38γ免疫沉淀物来自对照组(白色)或Ras-expressing BJ细胞(Ras公司)，如中所述C类，与野生型或突变型（S15D、S33D或S46D）p53孵育(1–61)在[γ]存在下-³²P] ATP。A–D，的反应用SDS-PAGE分离。磷酸化MBP、p53和p38使用荧光成像仪检测。基板的输入已确定考马斯亮蓝R染色。

通过p38γ研究衰老过程中p53的磷酸化诱导后，我们比较了p38α和p38γ的p53激酶活性免疫沉淀自对照和衰老的BJ细胞。与其关联激活环中磷酸化增加(图1B类)，p38γ表达Ras和MKK3E的衰老BJ细胞的免疫沉淀与对照组相比，p53磷酸化水平更高单元格(图6C类,右侧面板). 另一方面，尽管Ras或MKK3E表达诱导激活环中的p38α细胞水平与p38γ相当(图1B类)，p38α当从这些细胞中免疫沉淀时，几乎没有磷酸化p53(图6C类，比较左边和右侧面板，来源于暴露）。p38α免疫沉淀对p53的磷酸化作用过度暴露后仍可检测到Ras和MKK3E表达细胞，但与从相同暴露条件下的p38γ(图。6C类,³²P-p53过度暴露(超额支出)).这些结果表明，尽管致癌Ras和MKK3E激活了两者衰老过程中p38α和p38γ仅激活p38γ，但p38α不能磷酸化p53。

Ras诱导的p38γ对p53的激酶活性几乎为当Ser³³变异了，但没有改变通过Ser的突变¹⁵或Ser⁴⁶(图6天). 因此，在在衰老细胞中激活，p38γ磷酸化p53主要在序号³³，与重组的结果一致MKK6E激活p38γ在体外(图6B类).

我们进一步研究了p38α和p38γ对血清内源性p53蛋白的磷酸化³³ 在里面活泼地在衰老诱导期间ras（拉斯维加斯）.与激活状态相同ras（拉斯维加斯），本质活性p38γ（p38γ-D179A）诱导p53在Ser的磷酸化³³在BJ细胞中，而活性p38α（p38α-D176A）没有增加p53-Ser³³磷酸化，尽管它诱导衰老(图5F类). 野生型p38α和p38γ对p53-Ser影响不大³³磷酸化。野生型和组成活性p38β也未能导致p53-Ser磷酸化³³(图5F类)，其中与它们不能诱导衰老有关。此外有效的p38γshRNA（shp38γ-550和-1023）大大减少ras（拉斯维加斯）-p53在Ser的诱导磷酸化³³但不是p53-Ser的磷酸化¹⁵，不是p38底物的位点(图5C类). 然而，有效的p38αshRNA（shp38α-756和-758）被阻断ras（拉斯维加斯）-诱导衰老但不诱导p53-Ser³³磷酸化(图5天). 一致BJ细胞中的这些发现ras（拉斯维加斯）-诱发的p53-Ser的磷酸化³³p21的增加^{WAF1（加权平均1）}p38γshRNA也抑制表达，但不受p38αshRNA，在IMR90原代人成纤维细胞中(图5电子). 拿总之，我们的数据表明致癌ras（拉斯维加斯）激活两者p38α和p38γ反过来通过以下途径介导衰老诱导不同的机制。致癌激活后ras（拉斯维加斯），p38γ通过直接磷酸化Ser诱导p53活性³³，残渣这是p53介导的必要条件ras（拉斯维加斯）-诱导衰老(23). 通过以下途径激活p53p38γ导致关键衰老效应物的表达增加，第21页^{WAF1（加权平均1）}相反，p38α有助于衰老通过独立于p53的机制进行诱导。

第38页α，但不是第38页γ，对于ras诱导的p16表达^{INK4A（墨水）}-我们展示了以前是致癌的ras（拉斯维加斯）刺激转录水平第16页^{INK4A（墨水）}是衰老的另一个主要效应器，通过激活p38通路的(30). 收件人为了深入了解p38α在衰老中与p53无关的作用，我们检查p18α和p38γ对p16的需求^{INK4A（墨水）}在衰老细胞中表达。如前所示(30)，致癌ras（拉斯维加斯）诱导p16 mRNA水平增加3倍^{INK4A（墨水）}在BJ细胞中(图7). 然而，这p38αshRNA而非p38γshRNA抑制了诱导作用。因此，p38α和p38γ通过以下途径介导癌基因诱导的衰老诱导两种主要衰老效应物p53和p16^{INK4A（墨水）},分别是。

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图7。

p38α而非p38γ对致癌至关重要ras（拉斯维加斯）-诱导p16增加^{INK4A（墨水）}mRNA水平。总计从shGFP、shp38α-756或shp38γ-550和Ha-RasV12(Ras公司)或向量(白色)第8天用Ras转导后，在琼脂糖凝胶上分离，转移到尼龙上膜，并与人类p16杂交^{INK4A（墨水）}cDNA探针标记随机启动。信号被可视化并用荧光成像仪。这个数字表示的相对强度第16页^{INK4A（墨水）}Ras细胞的信号归一化为来自病媒控制细胞的信号。

讨论

多种p38亚型的存在与组织差异上游调节因子的分布和亲和力表明这些亚型可能具有不同的功能。虽然p38α亚型已被证明炎症和压力反应需要体内(50,65–67),其他p38亚型的生理作用尚不清楚。使用SB203580是一种对p38α和p38β与p38γ和p38δ相比，我们能够证明p38在癌基因诱导的衰老中的关键作用。然而，特异性p38亚型对衰老的相对贡献从未出现过已定义。在本研究中，我们发现p38α和p38γ而非p38β介导致癌诱导衰老ras（拉斯维加斯）这些研究已确定p38γ在肿瘤诱导衰老的调控。综合这些发现我们之前的报告证明p38γ参与γ辐射诱导G₂细胞周期阻滞与DNA损伤检查点控制(68)，我们结论p38γ的主要功能可能是抑制肿瘤发生保持基因组稳定性。

对p38α和p38γ的需求表明在衰老诱导过程中，这些p38亚型的功能并不冗余p38α和p38γ可能靶向不同的下游底物在衰老途径中。事实上，我们的数据表明p38α和p38γ通过不同机制参与衰老诱导，p38γ通过第53页至第21页^{WAF1（加权平均1）}途径和p38α通过p53依赖性，但第16页^{INK4A（墨水）}-依赖，路由。p53-p21^{WAF1（加权平均1）}电路是已知对几乎所有类型的衰老。p38γ-shRNA的破坏能力ras（拉斯维加斯）-诱发的p53-Ser（第53页）³³磷酸化、p53转录磷酸化和活性，表明p38γ至少介导衰老诱导部分通过调节p53-p21^{WAF1（加权平均1）}通路。这个第16页^{INK4A（墨水）}-Rb途径是衰老的另一个主要效应器。我们先前证明，通过活性MKK3或MKK6导致p16表达增加^{INK4A（墨水）}蛋白质和mRNA水平(30). 结果我们目前的研究表明ras（拉斯维加斯）-诱导增加第16页^{INK4A（墨水）}p38α介导表达。

据报道，重组p38α磷酸化物p53-Ser（第53页）³³ 在体外(64). 我们确认了这一点发现并进一步证明激活的重组p38γ磷酸化p53³³ 在体外效率与p38α。然而，当衰老细胞产生免疫沉淀时，只有p38γ能磷酸化p53-Ser，但p38α不能³³.英寸添加，ras（拉斯维加斯）-p53-Ser的诱导磷酸化³³在里面p38γ-shRNA可显著降低衰老细胞，但p38α不能shRNA。组成活性p38γ，但不活性p38α，持续诱导p53-Ser³³细胞磷酸化。这些研究结果表明，在细胞中，p53-Ser的磷酸化³³是衰老诱导主要由p38γ介导，而非p38α。这种差异背后的机制是在体外和体内p38对p53的活性目前尚不清楚。确实如此可能在ras（拉斯维加斯）-诱导衰老体内，的p38α对p53的激酶活性被抑制翻译后修饰或与抑制蛋白结合。或者，p38γ的p53激酶活性可以通过衰老中的翻译后修饰或相关蛋白细胞。

体外，重组p38α和p38γ似乎具有同一蛋白质上底物位点的亲和力不同。鉴于p38α磷酸化两种Ser³³和Ser⁴⁶p53，p38γ仅磷酸化Ser³³。之前已经显示过p38α和p38γ具有不同的底物选择性在里面体外MAPKAPK2、MAPKAPK3和PRAK是p38α高于p38γ，而p38γ具有更高的激酶活性朝向微管相关蛋白Tau和支架蛋白SAP90和SAP97比p38α(60,69). 这些差异p53和其他蛋白质的底物选择性与事实相符这两种亚型属于p38 MAPK的不同亚群家庭(35,69). P38γ份额下降p38α氨基酸序列与其他亚型的同源性，以及ATP结合口袋的结构在α和γ之间不同亚型。

虽然我们的研究表明p38γ/p53-Ser³³/第21页^{WAF1（加权平均1）}级联输入ras（拉斯维加斯）-诱导衰老，几乎可以肯定还有其他途径以平行或部分重叠的方式调节衰老归纳。支持这一观点，我们发现p38γ增加p53-Ser的磷酸化³³到显著高于致癌水平ras（拉斯维加斯）但p21级别更有力地诱导了ras（拉斯维加斯）与主动式相比p38γ(图4A类).除了Ser的磷酸化外³³通过p38γ，致癌ras（拉斯维加斯）诱导额外的翻译后修改p53，导致p53活性进一步增加第21页^{WAF1（加权平均1）}表达。致癌的ras（拉斯维加斯）也可能诱发p53依赖的信号通路有助于增加第21页^{WAF1（加权平均1）}表达。已经证明衰老诱导是伴随着p53上其他位点的磷酸化序号³³，例如Ser¹⁵和Ser³⁷(23,25). 我们发现所有这些站点（Ser¹⁵，序列号³³和Ser³⁷)是p53介导衰老所必需的(23)对于ras（拉斯维加斯）-诱导p53激活（数据未显示）。因此，它是p53可能需要在多个位点磷酸化才能完全表达在衰老过程中激活并作为衰老效应器发挥作用。

p38通路在炎症中的关键作用促使人们努力开发针对这一途径的抗炎药。大多数此类药物目前正在开发的候选基因抑制p38α。然而p38α在肿瘤抑制衰老反应中的重要作用如本研究所示，激活的癌基因表明这些药物可能会增加引发癌症的风险。就是这样必须确定信号成分的功能特异性p38通路，因此抗炎药可以设计成靶向与炎症特异相关的信号分子但在肿瘤抑制方面没有。

补充材料

致谢

笔记

^*这项工作得到了格兰特的全部或部分支持CA106768来自国家研究院健康（对P.S.）。我是斯克里普斯手稿19841。

^S⃞本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1。

脚注

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