IκB激酶独立的IκB-α降解途径：功能性NF-κB活性及其在癌症治疗中的意义

抗体。

抗IKK1、IKK2、p65、IκBα（C-21和C-15）、I k Bβ、NEMO、p50、p52、Bax和p21的抗体均来自圣克鲁斯生物技术公司。用Calbiochem的抗体（OPO3）检测p53蛋白。使用抗β-肌动蛋白抗体（Sigma）检测肌动蛋白水平，作为所有实验的负荷对照。使用来自Sigma的Flag-M2单克隆抗体检测标记的IKK2。用抗HA抗体（12CA5）检测血凝素标记的IKK1WT和IKK1KM蛋白。所有磷化特异性抗体均来自Zymed实验室。

免疫印迹和免疫沉淀。

通常，细胞在六孔培养皿中培养，汇合细胞用DoxR处理指定时间，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并在放射免疫沉淀分析缓冲液中收获。制备全细胞提取物，并在吗啉丙基磺酸（MOPS）缓冲液中用双三烷基硫酸钠凝胶（4-12%）拆分裂解产物。电泳后，蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜（Immobilon P；Millipore）上，在PBS中被封闭，不含Mg²⁺和钙²⁺但含有0.2%吐温20和5%脱脂牛奶，并在不含镁的PBS中用指示抗体进行检测²⁺和钙²⁺但含有0.2%吐温20和1%牛奶。为了检测磷酸化IκBα，在3%牛血清白蛋白中封闭并探测膜。

对于免疫沉淀，在含有50 mM Tris-HCl（pH 8）、170 mM NaCl、0.5%Nonide P-40和补充有完整蛋白酶抑制剂（Roche）的50 mM NaF的缓冲液中在4°C下制备总细胞裂解物。在用蛋白G-Sepharose（Amersham Biosciences）孵育裂解产物1 h后进行免疫沉淀。将预先清除的上清液与一级抗体以及蛋白G-Sepharose珠在4°C下培养过夜。最后，使用含有10 mM Tris-HCl（pH 8）、250 mM NaCl、5 mM EDTA、0.5%Nonide P-40和完整蛋白酶抑制剂的洗涤缓冲液将这些上清液洗涤四次。

电泳迁移率变化分析。

在Totex裂解缓冲液（20mM HEPES[pH 7.9]、350mM NaCl、20%甘油、1%Nonidet P-40、1mM MgCl）中制备总细胞提取物₂、0.5 mM EDTA、0.1 mM EGTA、1 mM二硫苏糖醇、1 mM-苯甲基磺酰氟、10μg/ml抑肽酶）。15000×离心上清液克收集15min用于迁移率变化分析。NF-κB和Oct-1探针如前所述(36). 末端标记探针（T4激酶）与Totex提取物在37°C下孵育30分钟。配合物在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上用0.5×三硼酸盐-EDTA电泳分离。对干燥的凝胶进行磷光成像仪分析。

细胞存活分析。

细胞通常放置在六孔培养皿中。用DoxR或lactacystin处理融合细胞。用台盼蓝染色法计算贴壁细胞和脱落细胞的存活率。

代谢标记。

IKK1/2的次级流入板10-cm^−/−MEF在温暖的PBS中清洗两次，并在补充有10%透析胎牛血清的无半胱氨酸和无蛋氨酸DMEM中饥饿6小时。使用0.5 mCi的[³⁵S] 每毫升蛋氨酸（NEN Life Science Products，Inc.）。然后用PBS清洗细胞，并在完全培养基中追踪给定时间点，包括或不包括DoxR。在每个时间点之后，用冰镇PBS清洗细胞两次，并将细胞颗粒冷冻在干冰上以备后期操作。将细胞颗粒在冰上解冻，并通过添加500μl含有蛋白酶抑制剂（罗氏公司）的裂解缓冲液（20mM Tris[pH 8.0]、100mM NaCl、0.2%脱氧胆酸钠、0.2%Nonidet P-40、0.2%Triton X-100）进行全细胞裂解。用蛋白G-Sepharose在4°C下预处理裂解液1 h，然后用IκBα（C-21）抗体和蛋白G-Separose在4°C下孵育过夜。将免疫沉淀颗粒洗涤三次并在SDS加载缓冲液中煮沸10 min，将洗脱的蛋白质在吗啉乙磺酸（MES）缓冲液（Invitrogen）中的4~12%双三凝胶上分离。

RNA提取和反转录。

刺激后，收集细胞并使用TriPure试剂（Boehringer Mannheim）分离总RNA。在260 nm处通过分析定量RNA。用RT Superscript II（Invitrogen/Life Technologies）和4μg总RNA和寡核苷酸（dT）（Invit罗gen/Lify Technologies。

实时PCR分析。

用以下引物进行PCR扩增：IκBα阳性（5′-CGC-TTG-GAC-GAT-CG-3′）和反义（5′-TTG-CTC GTA-CTC-GTC-3′）。用以下引物扩增肌动蛋白基因作为对照：正义（5′-TTC-GTT-GCT-CCA CA-3′）和反义（5′-ACC-AGCA-GCG-ATA-TCG-3′）。PCR是通过使用ABI Prism 7700序列检测系统和SYBRGreen PCR主混合（英国沃灵顿应用生物系统公司）进行的。

逆转录病毒的产生和稳定的细胞选择。

用5μg水疱性口炎病毒g蛋白表达载体和1μg绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒将总共20μg的载体质粒转染到细胞系293 gp/bsr中（N.Somia和I.M.Verma，未发表数据）。48和72小时后回收含有病毒的上清液，通过0.45μm孔径的过滤器过滤，并连续3至6天用于感染MEF。

腺病毒的产生和感染。

用携带巨细胞病毒即刻增强因子、鸡β肌动蛋白启动子和兔β珠蛋白多聚体（A）信号的重组腺病毒（rAD）表达盒表达GFP、IKK1WT、IK1KM、IKK2WT和IKK2KM蛋白。病毒由293个细胞中的同源重组产生(20). rAD载体在宿主细胞中不整合和复制。因此，为了保持感染多重性（MOI）恒定，只使用新鲜融合细胞进行感染。

DoxR诱导的IκBα降解不需要丝氨酸32/36磷酸化或PEST结构域。

进一步表征DoxR诱导的IKK1/2中的IκBα降解^−/−MEFs，我们评估了IκBα在32/36/283/288/291/293/296位置的诱导性和组成性磷酸化的作用，它们在其降解中起作用(25). 我们测试了IκBαM(36)DoxR降解IκBα分子，其中上述位置的所有丝氨酸和苏氨酸残基都转化为丙氨酸。IKK1/2型^−/−用逆转录病毒构建物pLXSH或pLXSH-IκBαM转导MEF以产生稳定的细胞系（IKK1/2^−/−Hygro和IKK1/2^−/−IκBαM）。由于内源性IκBα和突变型IκBαμ在大小上没有差异，我们通过rAD-IKKWT过度表达IKK2WT诱导内源性I k Bα降解。rAD-IKK2WT的单独转导导致内源性IκBα的降解（图。​（图3A，3A级，车道3），但不属于IκBαM（图。​（图3A，3A级，车道9）。作为对照，细胞感染rAD-IKK2KM（激酶非活性IKK2）或rAD-GFP（表达GFP的病毒）。DoxR诱导的内源性IκBα降解治疗（比较通道1和2或通道5和6；顶部IκAα面板）。由于通道9和10中的所有IκBα都是IκB-αM，很明显DoxR也诱导了Iκ-BαM的降解（比较通道9和通道10；见低暴露面板）。这些结果表明，丝氨酸32和36的磷酸化对DoxR诱导的IκBα降解不是必需的。此外，DoxR诱导的IκBαC末端PEST结构域残基降解也不需要磷酸化。IKK1/2中表达的标记IK2WT水平^−/−Hygro和IKK1/2^−/−IκBαM细胞具有可比性（数据未显示）。

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图3。

DoxR引起的IκBα降解不需要丝氨酸32和36以及PEST结构域中的磷酸化。（A） IKK1/2型^−/−MEF感染pLXSH或pLXSH-IκBαM逆转录病毒，并使用潮霉素进行稳定筛选。IKK1/2混合种群^−/−Hygro（1-6车道）和IKK1/2^−/−IκBαM细胞（7至12道）感染rAD，表达GFP（rAD-GFP）、IK2WT（rAD-IKK2WT）或IK2KM（rAD-IKK2m）。感染后48小时，细胞未经处理或用0.4μg DoxR/ml处理。分别用Flag M2和IκBα（C21）抗体测定IKK2和Iκ）Bα蛋白的表达。肌动蛋白水平用于蛋白质负荷的正常化。（B） IκBα^−/−MEF感染了表达IκBα，IκBαM的显性负性形式的逆转录病毒。如前所述，生成稳定的细胞池，并将其置于六孔培养皿中。用0.5和0.7μg DoxR/ml处理融合细胞24 h。用C21抗体探测裂解液以检测IκBαM。

我们还重组了IκBα^−/−使用逆转录病毒的IκBαM MEF。DoxR治疗后，IκBαM降解（图。​（图3B，3B公司，车道2和3）。这些结果进一步支持了DoxR诱导的IκBα降解不需要丝氨酸32和36的诱导磷酸化或IκBα的C末端磷酸化位点的观点。

为了进一步评估IκBαC末端PEST结构域的作用，我们转导了IKK1/2^−/−带有逆转录病毒的MEF表达IκBα、IκBαΔ39的C末端截断突变，该突变删除了PEST结构域。令人惊讶的是，PEST结构域的去除增强了IκBα的降解（图。​（图4A，4A级，车道1至3）。然而，IκBαΔ39的降解动力学（图。​（图4B，4B类，泳道1至6）和野生型IκBα（图。​（图2A，2安培，车道1至12）相似。IκBαΔ39突变体在IκB-α中的重组证实了其有效降解的能力^−/−MEF（图。​（图4C；4摄氏度; 车道2至4）。

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图4。

DoxR引起的IκBα降解不需要PEST结构域。（A） IKK1/2型^−/−MEF被表达IκBαΔ39的逆转录病毒感染，该逆转录病毒缺乏IκB-α的最后39个氨基酸。用潮霉素选择细胞，用指定剂量的DoxR处理混合细胞池24小时，并通过用IκBαC15抗体探测来评估IκBα的降解。（B） IKK1/2中IκBαΔ39降解的时间进程^−/−MEF公司。用0.5μg DoxR/ml处理融合细胞，持续时间为小时，并用IκBαC15抗体进行IκAαΔ39的Western blot分析。（C） IκBα^−/−MEF感染了表达GFP（作为对照）或表达IκBαΔ39的逆转录病毒。如前所述，生成稳定的细胞池，并将其置于六孔培养皿中。将融合细胞用0.5和0.7μg DoxR/ml处理24 h。用C15抗体探测裂解液以检测IκBαΔ39。

DoxR对IκBα的降解对活性氧（ROS）不敏感，不受p53介导。

为了更好地理解IKK非依赖性IκBα降解的分子机制，我们评估了ROS的作用，ROS被DNA损伤激活，并与NF-κB通路的调节有关(9). Western blot分析表明，ROS清除剂NAC不抑制DoxR对IκBα的降解（图。​（图5A，5A级，比较车道4和6）或其非硫醇对应物NAA（图。​（图5A，5A级，比较车道4和5）。与IκBα一样，DoxR对IκB-β的降解也未被NAC阻断（图。​（图5A5A级).

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图5：。

DoxR对IκBα的降解不通过ROS、p53或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介导。（A） 合流IKK1/2^−/−如图所示，用0.7μg DoxR/ml和10mM NAA或NAC处理MEFs。24小时后，对细胞进行裂解，并进行蛋白质印迹。（B） IKK1/2型^−/−MEF在六孔培养皿中培养，并在含有5%胎牛血清和抗生素的300μl DMEM中感染增加的rAD-p53或rAD-GFP的MOI。每10分钟摇晃一次平板，让感染继续进行2小时，然后用培养基补充细胞，但不清除病毒。在37°C下与新鲜培养基孵育过夜后，更换该培养基。在感染后48至60小时内，通过Western blot分析对细胞进行裂解和分析。（C） IKK1/2^−/−如图所示，MEF单独使用DoxR或与各种caspase抑制剂联合治疗24小时，然后通过Western blotting进行分析。行：Casp 1、caspase-1抑制剂VI、Z-YVAD-FMK；Casp-2、caspase-2抑制剂I、Z-VDVAD-FMK；casp3，caspase-3抑制剂II，Z-DEVD-FMK；Casp 5，caspase-5抑制剂I，Z-WEHD-FMK；Casp 6，caspase-6抑制剂I，Z-VEID-FMK；Casp 8，caspase-8抑制剂II，Z-IETD-FMK；Casp 9，caspase-9抑制剂I，Z-LEHD-FMK。所有这些都是各种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的细胞可渗透、不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，如其数量所示。Caspase抑制剂III（Casp Ihn III），Boc-d日-FMK是一种广谱胱天蛋白酶抑制剂。有关这些抑制剂的更多信息，请参阅钙生物化学信息表。

为了排除IκBα延迟降解可能是DoxR诱导凋亡的结果的可能性，我们评估了p53和caspases在这种降解中的作用。NF-κB和p53在抗肿瘤药物（如DoxR）的作用下同时被激活，有报道称p53在某些细胞类型中诱导NFκB活化(28). 为了确定p53水平的增加是否有助于IκBα降解，我们使用腺病毒（rAD-p53）过度表达p53。p53的表达导致其靶基因p21、Bax和mdm2在WT和IKK1/2中同时上调^−/−MEF公司。然而，在我们的实验中，即使p53的过表达也不会导致IκBα降解（图。​（图5B，5亿野生型或IKK1/2中的NF-κB DNA结合（数据未显示）^−/−MEF公司。类似地，一系列caspase抑制剂无法阻止IκBα在DoxR作用下的降解（图。​（图5C，5摄氏度，比较车道1和10）。p65的水平显示为负载控制。综上所述，这些结果表明细胞凋亡增加可能与IKK1/2诱导的IκBα降解无关^−/−DoxR的MEF。

LY294002部分阻断了DoxR介导的IκBα降解。

为了更好地理解IKK非依赖性IκBα降解的分子机制，我们评估了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）在这一过程中的作用。已知PI3-激酶活性抑制剂LY294002的治疗部分阻断了IκBα在DoxR作用下的降解（图。​（图6A，6A级，比较车道2和3）。我们认为，活性为LY294002敏感性的PI3-激酶可能以直接或间接的方式参与IKK非依赖性IκBα的降解。

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图6。

其他激酶在DoxR介导的IκBα降解中的作用。（A） IKK1/2型^−/−用0.7μg DoxR/ml单独或与LY294002（80μM）联合治疗MEF。24小时后进行蛋白质印迹分析。肌动蛋白和非特异性（NS）蛋白水平用作负荷对照。（B） IKK1/2型^−/−用0.7μg DoxR/ml和蛋白酶体抑制剂乳酸菌素（20μM）处理MEF 10 h。对处理和未处理的细胞进行裂解，并免疫沉淀IκBα。免疫沉淀物质与指示的磷酸特异性抗体通过Western blot进行分析。用C21抗体分析总IκBα水平。

除IKK1和IKK2外，其他激酶已被证明在体外磷酸化IκBα。为了测试IκBα的IKK非依赖性磷酸化是否先于其降解，我们评估了DoxR对IκBα的磷酸化反应。IKK1/2型^−/−用DoxR和乳酸菌素治疗MEF（见图。​图8），8)，一种蛋白酶体抑制剂，持续10小时，以在降解前积累任何修饰的IκBα物种。对处理和未处理的细胞进行裂解，并免疫沉淀IκBα。免疫沉淀物质用各种磷酸特异性抗体进行Western blot分析（图。​（图6B，6亿，车道1和2）。通过这种方法，我们没有发现IκBα磷酸化状态有任何可检测的变化。需要更灵敏的工具来检测IκBα的修饰，以标记其以独立于IKK的方式降解。

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图8。

DoxR诱导的NF-κB活性的功能相关性。（A） DoxR介导的IκBα降解需要蛋白酶体。IKK1/2型^−/−MEF用二甲基亚砜、乳酸菌素（20μM）或0.7μg DoxR/ml单独或联合治疗，如图所示。处理24小时后制备裂解物，并按照前面所述进行Western blot分析。（B） IKK1/2型^−/−MEF分别用DoxR（0.7μg/ml）、lactacystin（20μM）或这两种药物的联合治疗。24小时后观察细胞。分离的和凋亡的细胞比附着的细胞更难折射。（C） DoxR和lactacystin诱导的细胞死亡定量。用台盼蓝活性测定法测定处理24至30小时后附着和分离细胞的细胞存活率。该图代表了三种独立分析。

DoxR诱导的IκBα降解导致NF-κB依赖性报告基因表达。

接下来我们研究了DoxR对IκBα的降解是否也会导致NF-κB的活化。用一致的NF-κB寡核苷酸探针进行凝胶移位显示IKK1/2治疗^−/−带有DoxR的MEF导致NF-κB DNA结合活性增加（图。​（图7A，第7章，左侧面板，比较通道1和6）。绑定到Oct-1探针（中间面板）用作加载控制。通过超位移分析对响应DoxR诱导的DNA结合复合物的进一步分析表明，它们由p65和p50亚基组成（图。​（图7A，第7章，右侧面板）。为了研究DoxR诱导的IκBα降解是否导致功能性NF-κB转录活性，我们构建了携带荧光素酶报告基因的慢病毒，该慢病毒由五个共有或突变的NFκB结合位点控制（图。​（图7B）。第7页). IKK1/2型^−/−用LV-κBLuc或LV-Mut-κBLuc转导细胞，获得荧光素酶报告基因的完整拷贝。我们一致发现LV-κBLuc-转导的IKK1/2的治疗^−/−DoxR细胞确实导致NF-κB依赖性报告基因活性的增加（图。​（图7C）。7摄氏度). 相反，用TNF-α和LPS处理这些细胞时，未显示出可检测到的NF-κB报告基因活性（图。​（图7C）。7摄氏度). 此外，LV Mut-κBLuc转导的IKK1/2的治疗^−/−带有DoxR的MEF没有导致荧光素酶活性增加（图。​（图7D）。7天). 实时PCR分析显示，DoxR治疗确实诱导了IκBα的表达，IκB-α是一个已知的NF-κB靶基因（图。​（图7E）。第七版). 因此，我们得出结论，IKK1/2的治疗^−/−长时间使用DoxR的MEF确实会产生IKK非依赖性NF-κB转录活性。

DoxR介导的IκBα降解需要蛋白酶体。

为了解释DoxR诱导IκBα降解的机制，我们研究了蛋白酶体的作用，已知蛋白酶体在对典型刺激的响应中对IκBα降解至关重要。DoxR介导的IKK1/2中IκBα的降解^−/−在细胞与乳胱氨酸蛋白酶体抑制剂（一种天然的、不可逆的和高度特异的非肽类蛋白酶体抑制剂）孵育后，细胞显著减少（图。​（图8A，8安，比较车道3和4）。这种IκBα稳定性的增加并不是由于IκB-α稳态水平的增加，因为单用乳酸菌素治疗细胞并没有引起IKK1/2中IκB/α水平的可检测增加^−/−MEF（图。​（图8A，8安，比较车道1和2）。

接下来，我们测试了DoxR在IKK1/2中诱导的NF-κB活性的功能相关性^−/−MEF公司。通过乳酸菌素治疗阻断NF-κB激活显著增加DoxR诱导的IKK1/2细胞死亡^−/−MEF（图。​（图8B）。8B类). 细胞死亡的定量如图所示。​图8C。8摄氏度我们得出结论，IKK1/2中的IKK1-和IKK2-依赖性NF-κB活性^−/−细胞可能有助于防止或减少DoxR引起的细胞凋亡。

NF-κB激活的多种模式。

过多的外部信号利用NF-κB在脊椎动物和非脊椎动物细胞中执行其指导功能(31). 因此，只有快速激活NF-κB的刺激才被认为是生理性的。大多数快速反应刺激，如细胞因子，主要通过IKK2激活NF-κB。最近的证据表明，NF-κB活化的IKK1-依赖性、IKK2依赖性途径也存在(26). 这些依赖于IKK1的NF-κB活化途径对淋巴发育和器官发生至关重要(26). 正如预期的那样，来自IKK1/2的MEF^−/−小鼠对大多数典型的NF-κB诱导物都不敏感(18). 然而，有可能存在独立于IKK1和IKK2激活NF-κB的刺激物，并且在长期治疗后产生的NFκB活性具有生理相关性。

在本研究中，我们报告了IKK1/2的长期治疗^−/−带有DoxR的MEF导致IκBα降解（图。​（图1A）1安培)和IκBβ（图。​（图5A）。5A级). 令人惊讶的是，DoxR对IκBα的降解不需要丝氨酸32和36磷酸化（图。​（图3）三)或IκBα的PEST结构域（图。​（图4）。4). 在我们的试验中观察到的降解不是由ROS介导的（图。​（图5A），5A级)，p53（图。​（图5B），5亿)或半胱天冬酶（图。​（图5C）。5摄氏度). 我们进一步表明，在缺乏IKK1或IKK2活性的情况下，IκB的降解是由蛋白酶体介导的（图。​（图8A）。8安). 以前已经描述过IKK非依赖性IκBα降解途径(2,17). 尽管这些降解途径(2,17)不需要丝氨酸32和36磷酸化，所描述的降解动力学与我们的分析中观察到的不同。与IKK非依赖性IκBα降解不同，在完全缺乏IKK1或IKK2活性的情况下，游离NF-κB的性质和假定作用以前没有文献报道。我们证明，由DoxR介导的IκB降解产生的游离NF-κB能够激活整合在染色体中的NF-kb B依赖性报告基因（图。​（图7C）7摄氏度)并诱导至少一个生理靶基因IκBα的表达（图。​（图7E）。第七版). 此外，我们的初步结果表明，在缺乏IKK的情况下，PI3-激酶可能参与IκBα的降解（图。​（图6A）。6A级). 基于ATM和ATR激酶在NF-κB活化中的既定作用(16)，我们认为PI3-激酶可能作为DoxR介导的DNA损伤的上游传感器，在我们的分析中可能不是直接的IκBα激酶。

p65函数不需要IKK。

IκB对NF-κB的细胞质保留是控制其活性的主要机制(37). IκBα在控制NF-κB活性中的作用通过观察到该分子的不可降解版本（显性-阴性IκB-α突变体）阻断NFκB活化而得到强调(36). 尽管人们普遍认为，仅仅IκB的降解和随后NF-κB释放就足以激活这一重要的信号级联，但有几条证据表明，还涉及其他调节机制。首先，已有文献证明，p65（NF-κB亚单位）的磷酸化增加了其在体外的DNA结合(21,23). 其次，p300/CBP和p/CAF组蛋白乙酰转移酶优先与磷酸化的p65结合(42). 第三，小鼠中NF-κB活化的表型相似性和/或明显缺陷对激酶（如GSK3β）无效(11)，Tbk/t2k/NAK(三,35)和PKCζ(15)让他们参与进来更有吸引力。此外，PKA催化亚单位(41)和CKII已被证明与NF-κB:IκB复合物直接相关(38). 最后，NF-κB被乙酰化以及乙酰化和去乙酰化控制其亚细胞分布的证明，带来了可能调控该途径的其他因素(6).

有趣的是，IKK被指定在p65/RelA从IκB释放后的修饰中发挥作用(13,29,32). 我们观察到，游离p65可以激活NF-κB依赖的报告基因（图。​（图7C），7摄氏度)，激活生理靶基因，如IκBα（图。​（图7E），第七版)，还可以防止TNF-α诱导的细胞凋亡（图。​（图9A）9安)在IKK1/2中^−/−MEF质疑IKK在修改p65中的作用。可能的是，与它们在经典刺激下IκB降解中的作用不同，这些激酶在NF-κB修饰方面的活性存在冗余。目前尚不清楚所有涉及NF-κB磷酸化的激酶是顺序作用还是同时修饰独立位点。至少PKCζ似乎直接或通过调节IKK来调节NF-κB磷酸化(15). 这些额外机制的作用可能只是微调对特定刺激的反应。Nik就是这个案例的最佳例证^−/−老鼠；这些小鼠是活的，从它们身上提取的细胞对除淋巴毒素-β外的所有刺激都会激活NF-κB(40). 或者，这些机制可能需要控制选定细胞类型中NF-κB反应的强度或质量。了解导致IκB降解后产生活性NF-κB分子的事件的时序，将为治疗干预提供更多靶点。

我们感谢Bert Vogelstein和Wafik El-Deiry提供的rAD-p53病毒以及Matt Weitzman提供的有益讨论。

V.T.由白血病和淋巴瘤协会的一个携带者发展研究金资助。V.B.得到了来自拉法格国家癌症控制协会的奖学金支持。Q.L.是白血病和淋巴瘤学会的特别研究员。I.M.V.是美国癌症协会分子生物学教授，由NIH、Larry L.Hillblom基金会、Lebensfeld基金会、Wayne and Gladys Valley基金会以及H.N.and Frances C.Berger基金会资助。