Proteomics Analysis Identifies Phosphorylation-dependent α-Synuclein Protein Interactions

Melinda A. McFarland; Christopher E. Ellis; Sanford P. Markey; Robert L. Nussbaum

doi:10.1074/mcp.M800116-MCP200

分子细胞蛋白质组学。2008年11月；7(11): 2123–2137.

数字对象标识：10.1074/mcp。M800116-MCP200

预防性维修识别码：项目经理2577212

PMID：18614564

蛋白质组学分析确定磷酸化依赖的α-突触核蛋白相互作用^*^S⃞

梅琳达·A·麦克法兰,^‡^§ 克里斯托弗·埃利斯,^§^¶ 桑福德·P·马基,^‡和罗伯特·努斯鲍姆^‖^**

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摘要

中的突变和拷贝数变化SNCA公司编码神经元蛋白α-突触核蛋白的基因与家族性帕金森病有关（Thomas，B.和Beal，M.F.（2007）帕金森病。嗯，分子遗传学。16，R183–R194）。α-突触核蛋白的羧基末端可以在酪氨酸125和丝氨酸129处磷酸化，尽管在正常条件下只有一小部分蛋白质被磷酸化（Okochi，M.、Walter，J.、Koyama，a.、Nakajo，S.、Baba，M.，Iwatsubo，T.、Meijer，L.、Kahle，P.J.和Haass，C.（2000）帕金森病相关α-突触核蛋白的组成型磷酸化。生物学杂志。化学。275, 390–397). 在病理条件下，例如在帕金森病中，α-突触核蛋白是路易体的主要成分，是帕金森病的病理特征，并且主要在Ser-129磷酸化（Anderson，J.P.、Walker，D.E.、Goldstein，J.M.、de Laat，R.、Banducci，K.、Caccavello，R.J.、Barbour，R.和Huang，J。P.，Kling，K.，Lee，M.，Diep，L.，Keim，P.S.，Shen，X.F.，Chataway，T.，Schlossmacher，M.G.，Seubert，P.，Schenk，D.，Sinha，S.，Gai，W.P.，and Chilcote，T.J.（2006）Ser-129的磷酸化是家族性和散发性路易体病中α-突触核蛋白的主要病理改变。生物学杂志。化学。281, 29739–29752). 对于路易小体中α-突触核蛋白的磷酸化和/或可见蛋白聚集在多大程度上是疾病发病机制的步骤、是保护性的还是疾病过程的中性标记物，存在争议。在这里，我们结合肽下拉分析和质谱来鉴定和比较磷酸化和非磷酸化α-突触核蛋白的蛋白质相互作用。我们发现，非磷酸化的α-突触核蛋白羧基末端拉下了高度富集线粒体电子传递蛋白的蛋白质复合物，而Ser-129或Tyr-125磷酸化的β-突触核蛋白羧基端没有。相反，被磷酸化的α-突触核蛋白拉下的蛋白质组在某些细胞骨架蛋白、囊泡转运蛋白和少量参与蛋白丝氨酸磷酸化的酶中高度富集。这种有针对性的比较蛋白质组学方法用于无偏见地鉴定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，这表明当α-突触核蛋白磷酸化时会产生功能性后果。

α-突触核蛋白是一种140-氨基酸蛋白，在大脑中高度表达并定位于突触前终末(1). 该蛋白与几种神经退行性疾病有关，α-突触核蛋白编码基因的突变和拷贝数变异与家族性帕金森病（PD）有关¹(2,44). 在被称为路易体的不溶性聚集物中存在大量α-突触核蛋白，这是包括散发性疾病在内的所有PD的病理特征，也表明该蛋白与疾病之间存在联系。

蛋白质主要在溶液中自然展开，但通过在其氨基末端100个氨基酸中采用两亲性螺旋构象，可以与磷脂膜结合(三). 蛋白质的剩余部分是一个酸性、亲水性的40-氨基酸羧基末端末端，被认为不太可能直接参与膜结合。观察到在PC12和嗜铬细胞中，α-突触核蛋白似乎是突触小泡胞吐和神经递质释放的负调节因子，这表明了α-突触核蛋白与小泡结合的生理作用(4). 此外，细胞培养或小鼠中α-突触核蛋白的丢失会导致静息池或储备池中突触前小泡的数量显著减少(5——7). α-突触核蛋白在囊泡运输中的作用的进一步支持来自于秀丽隐杆线虫表明α-synuclein表达引起的毒性可能被参与囊泡运输的蛋白质修饰(8,9)。

α-突触核蛋白的羧基末端部分可以分别在酪氨酸125位（Tyr-125）和丝氨酸129位（Ser-129）被Src家族激酶和各种酪蛋白激酶磷酸化(10——12). Ser-129磷酸化的α-突触核蛋白是路易小体中α-突触核蛋白的主要形式，但仅构成神经元中可溶性α-突突核蛋白的一小部分(13,14). 然而，对于α-突触核蛋白在Ser-129的磷酸化在多大程度上对PD的病因起着重要作用，存在争议。在129位用天冬氨酸取代丝氨酸的α-突触核蛋白的磷酸模拟形式（S129D）被证明可以增强α-突突核蛋白对PD的毒性果蝇属PD模型(15). 相比之下，直接注射到大鼠脑内的腺相关病毒过度表达S129Dα-突触核蛋白似乎相对无毒，而丙氨酸替代丝氨酸129的非磷酸化版本则具有高度的神经毒性(16). 因此，确定依赖于α-突触核蛋白在Ser-129或Tyr-125的磷酸化状态的α-突触核蛋白的蛋白-蛋白质相互作用可能有助于阐明α-突变体磷酸化的正常生理功能，并确定路易体形成和α-突突核蛋白毒性的潜在途径。

我们假设α-突触核蛋白的亲水尾部构成一个结构域，参与磷酸化状态依赖的蛋白质-蛋白质相互作用，这是α-突触核蛋白正常功能所固有的。蛋白质相互作用的质谱分析为阐明蛋白质复合物的成分提供了一种独特的无偏见的工具。因此，我们决定对突触体蛋白复合体进行质谱分析，该复合体可能被拉下在体外含有亲水结构域的肽包含α-突触核蛋白的羧基末端40个氨基酸。我们使用基于靶向质谱的功能蛋白质组学方法来确定磷酸化的蛋白质-蛋白质相互作用的定性和相对定量差异与非磷酸化α-突触核蛋白。我们发现，含有α-突触核蛋白羧基末端40个氨基酸的磷酸化肽优先与细胞骨架蛋白、参与内吞的囊泡转运蛋白和参与蛋白丝氨酸磷酸化的酶相互作用，而非磷酸化肽则优先与线粒体电子传递链复合物相互作用。这表明磷酸化可能对α-突触核蛋白的功能和/或定位有深刻的影响。

实验程序

肽下拉菜单-

所有动物工作都是根据NHGRI动物护理和使用委员会审查和批准的方案进行的。如前所述，分离小鼠脑突触体(17)并在−80°C下冻结。对于人脑提取物，通过手术从一名癫痫患者身上取出新鲜的正常大脑皮层组织，将其嵌入最佳切割温度的化合物中，在干冰/异戊烷中快速冷冻，并在−80°C下储存。然后，在徕卡CM1900低温恒温器中，在−15°C的温度下，通过外科解剖将最佳切割温度化合物从组织中去除，如前所述，分离人类突触体并将其储存在−80°C的环境中(17). 以BSA为标准（Pierce），采用BCA测定法对蛋白质进行定量。手术样本采集方案（02-N-0014，癫痫手术期间获得样本的研究研究）由NINDS校内机构审查委员会批准。对于这两种制剂，突触体在Triton缓冲液中溶解（～1.5%Triton，50 m米三氯化氢（pH 7.4），100 m米氯化钠，2米米EGTA，50米米氟化钠，0.5米米钒酸钠，1×蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich），最终浓度为1%Triton和～5 mg/ml突触体蛋白，并在16000×克在4°C下保持10 min，上清液用于结合实验。

诱饵肽由氨基末端标记的生物素化肽组成（Quality Controlled Biochemicals，Hopkinton，MA）(表一). 所用肽如下：人α-突触核蛋白（NP）的非磷酸化羧基末端40个氨基酸；羧基末端40-氨基酸肽分别在Ser-129（pS129）或Tyr-125（pY125）磷酸化；和一个与NP氨基酸含量相同但残基随机排列的打乱控制肽。使用Beckman DU640分光光度计（260nm）通过吸光度对肽进行定量，并使用每种肽的摩尔消光系数或通过以BSA为标准的BCA测定（Pierce）进行计算。

T型能够的我

用于下拉实验的生物素化肽

pS129和pY125中的磷酸化残留物以粗体显示。

核电厂	`GKNEEGAPQEGILEDMPDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA公司`
第129页	`GKNEEGAPQEGILEDMPVDDNEAYEMP公司S公司^{人事军官₄}EEGYQDYEPEA公司`
125页	`GKNEEGAPQEGILEDMPVDNEA公司Y（Y）^{人事军官₄}EMPSEEGYQDYEPEA公司`
爬	`AGEKPNEEYEGDAQPYQGEEGEILSEPDMPYVAEDPND公司`

在单独的窗口中打开

对于结合培养，400μl链霉亲和素涂层的Dynabeads（Dynal，Carlsbad，CA）在4°C的结合/洗涤缓冲液（50 m）中培养过夜米三氯化氢（pH 7.4），100 m米氯化钠，2米米EGTA，50米米氟化钠，0.5米米钒酸钠、1×蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）、约1.5 mg可溶性小鼠脑突触体蛋白和4 nmol生物素化肽。最终结合条件包含～0.15%Triton和～800 mg/ml突触体蛋白。样品在结合/洗涤缓冲液中洗涤三次，蛋白质在SDS加载缓冲液（50 m）中洗脱米通过在65°C下加热5分钟，将Tris-HCl（pH 6.8）、2%十二烷基硫酸钠、10%甘油、0.1%溴酚蓝）分为两组进行结合培养，并在洗脱前合并。然后将洗脱的蛋白质在95°C下加热5分钟，并用SDS-PAGE（4-20%）（Invitrogen）分离，凝胶用凝胶蓝（Pierce）染色。从三种不同的混合裂解液中重复三次所有下拉和随后的质谱分析。

凝胶内消化-

手动将每条凝胶通道从上到下切割成40～2-mm的条带。凝胶内胰蛋白酶消化和肽提取遵循标准方案的修改版本(18). 简单地说，在100 m内用50%甲醇去除个别凝胶条带米碳酸氢铵，用50%乙腈脱水，然后用100%乙腈脱水并干燥。样品减少并用45 m烷基化米60°C下的DTT，然后是100 m米室温下的碘乙酰胺。再次用50%的乙腈和100%的乙腈对条带进行脱水，然后用200 ng测序级胰蛋白酶（普罗米加，麦迪逊，威斯康星州）在25 m米碳酸氢铵。允许在室温下消化过夜。用30%乙腈、1%甲酸从凝胶片中提取肽并进行超声处理。用70%乙腈、1%甲酸重复提取，在分析之前将上清液混合并干燥。

质谱法-

对于一维LC-MS/MS样品，将其重新悬浮在5%乙腈、0.1%甲酸中，并注入一系列LC-VP HPLC系统（岛津，哥伦比亚，马里兰州），该系统与ESI-LCQ经典离子阱质谱仪（加州圣何塞热电电子公司）耦合。将样品加载到75μm PicoFrit BetaBasic C上₁₈专栏（新目标，马萨诸塞州沃本）。在45分钟内，从10%B到60%B形成线性分离梯度（A，5%ACN，95%水，0.1%甲酸；B，80%ACN，20%水，0.1%甲酸）。以400 nl/min的流速引入色谱流出物(19). LCQ在正离子模式下运行，并以数据相关的方式采集60分钟的光谱，其中质谱调查扫描中的前三个最强烈离子由CID选择用于MS/MS。将三次选择的前体离子排除在外60秒。使用Thermo Electron Excalibur 2.0 extract_msn实用程序提取峰列表，无需平滑或信噪比阈值。

信息学-

使用Mascot搜索引擎（v.2.1.04；Matrix Sciences，London，UK）针对合并的UniProtKB Swiss-Prot和TrEMBL蛋白质序列库（SPTremb_091706.fas）搜索得到的质谱峰列表。搜索参数如下：啮齿动物物种、胰蛋白酶特异性、一个允许缺失的裂解、氨基甲酰化固定修饰、蛋氨酸氧化变量修饰、前体离子质量耐受性2.0 Da和片段离子质量耐受度±0.8 Da。

用三种不同的裂解物重复下拉分析，得到三种凝胶，每个凝胶有四个通道，用于MS/MS分析。通过LC/MS/MS分析40个片段中每个片段的胰蛋白酶消化物，当连接所有凝胶片段的文件时，每个通道产生约75000 MS/MS光谱。在整个研究过程中，仅使用指定的可能肽序列，其吉祥物离子得分超过其识别得分，以产生每个完整凝胶通道连接的最小、简约蛋白质列表。给定下拉实验的所有结果都是内部软件MassSieve提供的来自三份凝胶通道的汇总数据(20)和DBParser 3.0(21——23). DBParser 3.0和MassSieve也用于多个实验中的肽和蛋白质水平简约性比较。此外，如果在所有实验中只观察到一次，则在简约性分析之前对单个肽进行筛选。

采用两种方法测定无标记相对定量。在第一种方法中，区分基于每种蛋白质的总肽“点击数”或观察值（吉祥物分配给给定蛋白质的肽的独立光谱总数，且离子得分大于同一性）。每个实验都相对于给定诱饵的总肽命中率进行了标准化(24,25). 通过MassSieve提取每个肽的点击数，以生成给定蛋白质的肽观察总数的积分(20). 诱饵肽复合物对给定蛋白质的亲和力差异计算为一种α-突触核蛋白形式与另一种形式的归一化肽命中率。

在第二种定量方法中，DBParser 3.0根据初级质谱测量扫描分析计算肽母离子的离子电流强度积分。简言之，提取的离子色谱图是从质谱原始数据中生成的，并确定与马斯科特肽分配相关的肽的积分面积，该肽的离子分数大于同一性(21——23). 将映射到各个蛋白质的所有肽的最大离子强度总和归一化为每个实验的总分配离子电流。对于这两种方法，相应的凝胶迁移也可用于验证肽比较。

使用磷酸化或非磷酸化肽获得的蛋白质肽的归一化肽命中率或归一化离子流比率评估磷酸化或无磷酸化诱饵肽在下拉物中对特定蛋白质的富集。富集被任意定义为磷酸化肽的标准化肽命中数或标准化离子电流的2倍以上与非磷酸化诱饵肽或反之亦然。

西方分析-

作为质谱分析的辅助手段，将含有从清洗过的链霉亲和素涂层珠洗脱出来的突触体蛋白的凝胶转移到Hybond-P膜（Amersham Biosciences），将膜封闭在5%脱脂奶中，PBS与0.1%吐温20中，并进行Western分析。使用的抗体为：核心1；岩芯2杂岩III；和39-kDa、30-kDa（NDUFS3）和17-kDa（NDUFB6）复合物I（来自分子探针的小鼠单克隆抗体）；适应性蛋白β、网格蛋白重链和β-spectrin II（来自BD转导实验室的小鼠单克隆抗体）；和VDAC（Alexis生化公司的兔子多克隆）。然后通过ECL（Amersham Biosciences）检测蛋白质并通过放射自显影术进行可视化。

结果

不同α-突触核蛋白多肽下拉蛋白质的定量分析-

我们试图鉴定以磷酸化依赖的方式与α-突触核蛋白羧基末端结构域相互作用的蛋白质网络。实验设计是使用代表α-突触核蛋白羧基末端部分（残基101-140）的生物素化肽来拉下小鼠大脑突触体蛋白。肽为非磷酸化（NP）、丝氨酸129磷酸化（pS129）或酪氨酸125磷酸化（p Y125）。使用与NP肽具有相同氨基酸但序列混乱的生物素化肽作为非特异性结合的对照。控制车道(图1,2号车道)除了污染链霉亲和素和牛血清白蛋白产品外，几乎没有可见的条带，表明最小的非特异性结合。相反，NP中存在许多蛋白质(图1,3号车道). 该模式与磷酸化肽pS129和pY125的模式明显不同(图1,车道5和6)这表明相互作用蛋白发生了变化，并证明了对这些蛋白进行鉴定的合理性。

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F类免疫球蛋白. 1.

典型的SDS-PAGE凝胶，说明蛋白质以序列和磷酸化依赖的方式与α-突触核蛋白的羧基末端结合。使用生物素化的40-氨基酸肽进行下拉实验，这些肽在Ser-129（pS129）或Tyr-125（pY125）上经过打乱、非磷酸化（NP）或磷酸化，如“实验程序”所述。每条通道都标有肽（打乱、NP、pS129和pY125它被绑定到磁珠上，用于每次下拉。结合到每个肽的蛋白质在Laemmli样品缓冲液中洗脱并在95°C下加热5分钟，用SDS-PAGE（4–20%）分离，并用GelCode Blue染色进行可视化。车道2,三,5、和6标记有用于下拉的肽。蛋白质标记位于车道1,4、和7。

在三个独立的重复实验中制备下拉物。每组实验复制数据被解析为一个单一的合并实验，并得出确定的光谱总数，其中吉祥物离子分数大于其同一性分数，NP为~13000，pS129光谱为15900，pY125光谱为13900，对照为5300（补充图1）。

使用肽命中定量和离子电流强度确定的相对蛋白质定量如所示表二——五我们应用了严格的阈值来决定蛋白质的包含。首先，对三个独立的实验重复进行比较，以确定再现性（补充图2）。分析中只包括在一个以上凝胶中鉴定的蛋白质和一个以上的肽观察结果；在所有实验中只观察到一次的肽在分析之前被丢弃。其次，比较基于10个或更多肽观察结果确定的蛋白质。第三，为了被认为是特异性的，一种蛋白质的肽命中率必须大于加扰对照的三倍。最后，为了使亲和力优先，我们要求根据肽的磷酸化状态有2倍的肽点击数。此外，还计算了离子电流倍数变化，作为肽命中定量的替代方法，以确认优先亲和力。

T型能够的二

对Ser-129磷酸化α-突触核蛋白相互作用网络具有优先亲和力的蛋白质

要被视为特异性蛋白质，其肽命中率必须大于对照的3倍。比较仅显示由10个或更多肽（Pep）点击识别的蛋白质。如果蛋白质在pS129下拉中的肽命中数是NP肽的2倍，则认为其显示优先富集。离子电流倍数的变化也显示为肽命中定量的确认。不适用；可溶性毒蛇N个-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体；CNPase，2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶。

UniProtKB/Swiss-Prot条目名称	主要登录号	基因名称	Pep命中率		pS129亲和力		独特的肽		描述
UniProtKB/Swiss-Prot条目名称	主要登录号	基因名称	第129页	核电厂	正常化Pep命中	归一化离子电流	第129页	核电厂	描述
信号
Q6PJ87_住宅	Q6PJ87型	Csnk1a1号机组	24	0	不适用	不适用	7	0	酪蛋白激酶1，α1
马克_穆斯	Q8VHJ5型	标记1	13	0	不适用	不适用	4	0	丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MARK1
Q5RJI5_住宅	Q5RJI5型	Brsk1号机组	11	0	不适用	不适用	2	0	BR丝氨酸/苏氨酸激酶1
KCC2B鼠标	第28652页	凸轮2b	185	6	25.2	36.7	7	三	CaM激酶IIβ链
Q6PHZ2_小鼠	Q6PHZ2型	凸轮2d	79	三	21.5	29.8	4	1	CaM激酶IIδ链
Q80TN1_老鼠	Q80TN1号机组	凸轮2a	168	13	10.6	25.8	7	4	MKIAA0968蛋白（片段）
标记2_鼠标	Q05512号	标记2	46	4	9.4		10	1	丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MARK2
第1页_使用	第62137页	Ppp1ca公司	16	2	6.5	8.5	三	2	丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1-α催化
细胞骨架
Q8C8R3_住宅	问题8C8R3	Ank2公司	73	0	不适用	不适用	13	0	类似于Ankyrin-2
Q6PCN2_住宅	Q6PCN2	Ank2公司	48	0	不适用	不适用	11	0	锚蛋白2，脑
AINX_模块	第4666页	伊纳	40	0	不适用	不适用	9	0	α-Internexin
MYO5A_母公司	Q99104问题	肌细胞5a	28	0	不适用	不适用	6	0	肌球蛋白-5A
Q3UMG4_住宅	第三季度	伊纳	22	0	不适用	不适用	5	0	Internexin神经元中间丝蛋白
问题32_老鼠	第3季度	Mylc2b公司	22	0	不适用	不适用	5	0	肌球蛋白调节性轻链
BCAS1_小鼠	Q80YN3型	Bcas1公司	14	0	不适用	不适用	1	0	乳腺癌1同源物中新扩增
CTNB1_小鼠	企02248	Ctnb1号机组	13	0	不适用	不适用	6	0	β-连环蛋白
DYL1_模块	第63168页	Dynll1型	12	0	不适用	不适用	1	0	Dynein轻链1
Q3TY37_母公司	Q3TY37问题	Ctna2型	10	0	不适用	不适用	5	0	连环蛋白α2
SPTA2_小鼠	第16546页	斯普纳2	256	4	52.3	298.1	33	三	光谱α链，脑
MYH10_家	Q61879问题	我的10	48	1	39.2	398.8	14	1	肌球蛋白-10（肌球蛋白重链，非肌肉IIb）
Q3V1V5_住宅	第三季度V1V5	斯普纳2	143	三	38.9	98.8	18	2	光谱α链，脑
NFL_小鼠	P08551号	Nefl公司	37	1	30.2	217.8	9	1	神经丝三联体L蛋白
TRIM3_模块	第9季度第2季度	修剪3	33	1	26.9	134.4	7	1	三分基序蛋白3
CAZA2_老鼠	第47754页	卡普札2	34	2	13.9	112.3	6	1	F-肌动蛋白帽蛋白α-2亚单位
DCTN2_小鼠	Q99KJ8型	日期2	16	1	13.1	47.8	5	1	动力蛋白亚基2
MLP3A_住宅	Q91VR7型	地图1lc3a	16	1	13.1	10.8	2	1	微管相关蛋白1A/1B轻链3A
SPTB2_老鼠	Q62261问题	自旋蛋白2	341	22	12.7	64.4	55	15	Spectrinβ链，脑1
Q80UE4_住宅	Q80UE4问题	Epb41l2号机组	26	2	10.6	36.7	7	2	蛋白质4.1G
TMOD2_老鼠	Q9JKK7号机组	Tmod2型	11	1	9	40.8	5	1	Tropomodulin-2
E41L3_住宅	Q9WV92型	Epb41l3号机组	75	8	7.7	17.3	11	5	带4.1类蛋白3
行为_老鼠	第60710页	Actb公司	182	21	7.1	31.1	15	5	肌动蛋白，细胞质1（β-肌动蛋白）
Q9QZ83_住宅	第9季度第83季度	行动1	173	21	6.7	30.5	13	5	γ-肌动蛋白样蛋白
Q7TSJ2_住宅	Q7TSJ2问题	百万吨位6	62	10	5.1	10.7	4	2	微管相关蛋白6
地图1B_房屋	第14873页	百万吨位1b	992	165	4.9	9.2	45	25	微管相关蛋白1B
TBB6使用	问题922F4	管6	51	9	4.6	15.3	5	4	管蛋白β-6链
DYL2_鼠标	Q9D0M5型	动态2	22	4	4.5	32.3	2	1	Dynein轻链2
P25A_住宅	Q7TQD2问题	坦桑尼亚先令	11	2	4.5	8.6	2	1	管蛋白聚合保护蛋白（TPPP）
Q80Y54_住宅	Q80Y54型	管4	100	29	2.8	15.3	12	10	管蛋白β-4
TBB5_住宅	第99024页	管5	123	36	2.8	14.9	12	10	管蛋白β-5链
TBB3_住宅	问题9ERD7	管3	99	29	2.8	11.4	8	7	管蛋白β-3链
TBA4_住宅	第68368页	图巴4	131	43	2.5	11.6	9	7	管蛋白α-4链
动作鼠标	问题8R5C5	演员1b	33	11	2.4	2.5	6	三	β-中心蛋白
ACTZ_MOUSE公司	第61164页	演员1a	30	10	2.4	2.2	6	2	α-中心蛋白
内吞作用
AP1B1_小鼠	O35643型	Ap1b1号机组	26	0	不适用	不适用	6	0	AP-1复合物亚单位β-1
AP2M1_老鼠	第84091页	Ap2米1	26	1	21.2	48.2	5	1	AP-2复合物亚单位μ-1
AP2B1_老鼠	问题9DBG3	Ap2b1号机组	82	8	8.4	20.3	15	4	AP-2复合亚基β-1
AP2A1_老鼠	第17426页	Ap2a1号机组	89	15	4.8	25.5	14	4	AP-2复合亚基α-1
CLH_老鼠	Q68FD5型	氯丁橡胶	105	25	3.4	8.5	26	13	氯菊酯重链
14-3-3监护人
1433E_老鼠	第62259页	Ywhae公司	24	0	不适用	不适用	4	0	14-3-3蛋白ε
1433Z_住宅	第63101页	伊瓦兹	26	1	21.2	103.8	5	1	14-3-3蛋白质ζ/δ
1433G_住宅	第61982页	尤格	23	2	9.4	28.5	4	1	14-3-3蛋白γ
神经粘附分子
NTRI_MOUSE公司	Q99PJ0型	Hnt（小时）	33	2	13.5	185.3	4	1	神经霉素前体
CNTN1_老鼠	第12960页	内容1	78	16	4	13.2	18	7	接触蛋白-1前体
谷氨酸转运膜
EAA1_住宅	第56564页	Slc1a3型	132	38	2.8	4	三	2	兴奋性氨基酸转运体1
Snare复合体
SNIP_MOUSE公司	问题9QWI6	第140页	15	5	2.4	17.4	4	2	SNAP-25相互作用蛋白
线粒体蛋白质类
Q8JZU2_住宅	Q8JZU2型	Slc25a1系列	13	2	5.3	4.6	三	1	溶剂载体系列25
GHC1_模块	Q9D6M3型	Slc25a22号	10	4	2	5.8	5	4	溶质载体系列25个成员22
LACTB_住宅	问题9EP89	乳酸菌	72	0	不适用	不适用	9	0	丝氨酸β-内酰胺酶样蛋白LACTB
TFAM_房屋	第40630页	Tfam公司	15	0	不适用	不适用	三	0	转录因子A，线粒体前体
ATP酶
VA0D_使用	第51863页	附件6v0d1	29	6	3.9	2.6	6	三	液泡ATP合成酶d亚基
Q8CHX2_住宅	Q8CHX2型	Atp6v1a	53	13	3.3	3.7	10	6	液泡ATP合成酶催化亚单位A
G蛋白
GBB1_住宅	第62874页	促性腺激素b1	67	21	2.6	3.8	6	5	转导蛋白β链1
GBB2_住宅	第62880页	促性腺激素2	43	16	2.2	3.4	6	4	转导蛋白β链2
核糖体蛋白质
RS7_住宅	第62082页	7卢比	69	26	2.2	6.6	8	6	40S核糖体蛋白S7
RS10_母	P63325页	10卢比	11	4	2.2	2.2	2	2	40S核糖体蛋白S10
其他
LSAMP_MOUSE公司	问题8BLK3	Lsamp公司	20	0	不适用	不适用	5	0	边缘系统相关膜蛋白前体
校准_鼠标	第62204页	校准m3	16	0	不适用	不适用	三	0	CaM公司
Q6DFY2_老鼠	问题6DFY2	操作控制模块	14	0	不适用	不适用	三	0	阿片结合蛋白/细胞粘附分子样
ROA2_住宅	O88569号	Hnrpa2b1型	10	0	不适用	不适用	1	0	异质核核糖核蛋白A2/B1
H2A2B_小鼠	问题64522	Hist2h2ab公司	11	1	9	40	三	1	组蛋白H2A 2-B型
CN37_母公司	第16330页	Cnp1号机组	74	7	8.6	12.3	7	4	CNPase酶
CSKI1_老鼠	第6季度第9季度第8季度	酪蛋白1	49	5	8	13.6	7	2	CASK相互作用蛋白1
CENG1_穆斯	第3季度第9季度	分1	155	17	7.4	21.6	14	5	半马拉松-γ1
USMG5_住宅	Q78IK2型	乌斯麦5	10	2	4.1	21.4	2	1	骨骼肌生长期间蛋白5上调
THY1_月	P01831号	您的1	58	14	3.4	7.8	5	2	Thy-1膜糖蛋白前体
阿尔多阿_穆斯	P05064号	阿尔多亚	117	37	2.6	4.8	8	7	果糖二磷酸醛缩酶A
SYPH_MOUSE公司	Q62277问题	Syp公司	11	4	2.2	5.6	2	1	突触体素

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T型能够的五

不具有可检测的磷酸化依赖性亲和力的蛋白质

这些蛋白与两种形式的α-突触核蛋白在下拉框中出现的比例相同。筛选条件与中的相同表二.肽，肽；可溶性毒蛇N个-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体。

UniProtKB/Swiss Prot条目名称	主要登录号	基因名称	Pep命中率		pS129亲和力		独特的肽		描述
UniProtKB/Swiss Prot条目名称	主要登录号	基因名称	第129页	核电厂	正常化Pep命中	归一化离子电流	第129页	核电厂	描述
基于微管的囊泡流动性
地图2_老鼠	第2035页	百万吨二氧化碳	152	85	1.5	4.3	22	14	微管相关蛋白2
Q3UHB7_住宅	第3季度第7季度	地图1a	723	497	1.2	1.9	35	33	微管相关蛋白1A
MAP1A_住宅	第9季度第6季度	地图1a	625	437	1.2	2.2	20	19	微管相关蛋白1A
Q7TPD4_住宅	问题7TPD4	百万吨位4	53	50	0.9	1.3	6	7	微管相关蛋白4
Q3UIS2_住宅	Q3UIS2问题	百万吨位4	115	146	0.6	1	9	11	微管相关蛋白4
Q8CIL3_住宅	问题8CIL3	百万吨位7d1	17	23	0.6	0.6	2	三	精氨酸/脯氨酸丰富的线圈线圈1
线粒体载体膜蛋白
MPCP_住宅	Q8VEM8型	Slc25a3系列	28	12	1.9	1.7	7	5	溶质载体家族25成员3
MTCH2_鼠标	Q791版本5	Mtch2公司	15	17	0.7	1.3	三	三	线粒体载体同源物2
CMC1_模块	问题8BH59	Slc25a12公司	176	206	0.7	1.4	16	19	溶质载体系列25个成员12
M2OM_住宅	问题9CR62	Slc25a11系列	77	95	0.7	0.5	7	7	溶质载体家族25人11
CMC2_住宅	问题9QXX4	Slc25a13系列	10	14	0.6	8.3	2	三	溶质载体家族25人13
热休克蛋白
GRP75_住宅	第38647页	Hspa9a型	27	12	1.8	2.5	9	6	GRP 75（砂浆）
GRP78_住宅	第20029页	Hspa5型	20	9	1.8	2.2	5	1	玻璃钢78（BiP）
线粒体膜蛋白
TOM22_老鼠	问题9CPQ3	汤米22	18	12	1.2	0.8	4	4	外膜转位酶22kDa
VDAC1_鼠标	Q60932问题	Vdac1型	393	333	1	0.9	17	17	电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1
VDAC2_鼠标	Q60930问题	Vdac2型	170	269	0.5	0.8	8	8	电压依赖性阴离子选择性通道蛋白2
Q5EBQ0_住宅	问题5EBQ0	Vdac3型	180	288	0.5	0.7	8	8	电压相关阴离子通道3
电压门控钾通道
KCAB2_老鼠	第62482页	Kcnab2公司	185	142	1.1	1.6	12	10	电压门控钾通道亚基β-2
KCAB1_老鼠	第63143页	克纳比1	35	28	1	3.3	三	三	电压门控钾通道亚基β-1
ATP合成酶
ATP5H_小鼠	第9季度第2季度	Atp5小时	32	13	2	3.1	6	4	ATP合成酶D链
ATPG_住宅	第91季度第2季度	附件5c1	137	58	1.9	2.3	4	4	ATP合酶γ链
AT5F1_住宅	问题9CQQ7	第5f1页	27	16	1.4	2.1	4	三	ATP合成酶B链
ATP酶
增值税2_住房	第62814页	Atp6v1b2	43	22	1.6	2.5	10	9	真空质子泵B亚型2
VPP1_住宅	问题9Z1G4	附件6v0a1	27	15	1.5	2.3	9	6	液泡质子转运ATP酶116-kDa亚基a亚型1
G蛋白
GNAO1_老鼠	第18872页	Gnao1号机组	55	32	1.4	2.9	7	4	鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G_o（o）亚单位α1
膜蛋白类
MGST3_住宅	第9季度第4季度	管理3	37	35	0.9	1.1	三	2	微粒体谷胱甘肽S公司-转移酶3
IMMT_小鼠	问题8CAQ8	Immt公司	103	158	0.5		10	12	线粒体内膜蛋白（丝裂原）
Snare复合体
STX1A_住宅	O35526号机组	Stx1a型	30	34	0.7	1.1	6	7	Syntaxin-1A（神经元特异性抗原HPC-1）
谷氨酸转运，膜
EAA2_住宅	第43006页	Slc1a2公司	49	42	1	0.9	7	4	钠依赖性谷氨酸/天冬氨酸转运体2
电子传输链
NDUA2_老鼠	问题9CQ75	恩杜法	8	11	0.6	0.2	1	1	NADH-泛醌氧化还原酶B8亚基
CX6B1_模块	第56391页	Cox6b1公司	11	17	0.5	0.1	三	三	细胞色素c（c）氧化酶亚基VIb亚型1
其他
CD47_母	Q61735问题	抄送47	18	11	1.3	0.8	三	2	整合素相关蛋白
Q91VC6_住宅	Q91VC6问题	Glul公司	18	11	1.3	3.9	4	4	谷氨酰胺合成酶
SYT2_母	第46097页	系统2	45	30	1.2	2.1	5	三	突触结合蛋白-2
Q2KHL7_住宅	Q2KHL7型	图标5	58	47	1	2.2	8	8	细胞间粘附分子5，端脑蛋白
PHB_老鼠	第67778页	菲律宾比索	36	30	1	0.9	8	8	阻抑素
CHCH3_住宅	问题9CRB9	第3章	21	25	0.7	0.4	三	4	螺旋-螺旋-螺旋结构域包含蛋白3
Q6GQU1_鼠标	Q6GQU1型	香港1号	97	131	0.6	1	16	17	Hk1蛋白
PHB2_使用	O35129号机组	菲律宾比索	11	15	0.6	1.4	5	5	禁止-2
PDIP3_住宅	问题8BG81	北极星3	6	10	0.5	0.7	三	三	聚合酶δ相互作用蛋白3

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在用pS129和pY125进行的下拉实验中，有85种蛋白质表现出非常显著的富集（亲和力或倍数变化）与NP公司(表二). 这些蛋白质分为许多离散的功能组。其中39个是细胞骨架蛋白，包括先前报道的与α-突触核蛋白羧基末端相互作用的微管相关蛋白1B（MAP1B）(26). 我们的新发现是当α-突触核蛋白磷酸化时，与MAP1B的相互作用显著增加。我们还观察到一些突触前细胞骨架元素显著富集，特别是非红细胞αII和βII光谱蛋白（fodrins）以及已知的光谱结合蛋白锚蛋白和带4.1B(27,28). 我们还发现β-和γ-肌动蛋白显著富集(29,30)非肌肉肌球蛋白和一种神经丝。这些蛋白质存在于神经元的突触前部分，并形成一个致密的突触前细胞骨架结构，称为突触前颗粒网(31). 第二个功能群包含六种参与突触囊泡内吞的蛋白质(32). 特别是，我们看到了网格蛋白的重链以及富含pS129和pY125的衔接蛋白复合物2（AP-2）的α-1、β-1和μ亚基与NP.第三组富含磷酸化α-突触核蛋白肽的下拉菜单中的九种蛋白质是参与丝氨酸/苏氨酸磷酸化和信号传递的酶的亚单位，例如钙调素（CaM）激酶II的三个亚单位、钙调素激酶家族成员MARK2、酪蛋白激酶1和丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶PP1A。有趣的是，酪蛋白激酶2被认为是主要负责α-突触核蛋白Ser-129磷酸化的激酶，但未见报道(33). 最后，使用磷酸化肽在下拉框中富集14-3-3蛋白伴侣家族的三个成员。以前曾报道过14-3-3蛋白与α-突触核蛋白之间的相互作用，尽管之前还不知道是否偏爱磷酸化的α-突触核蛋白(34)。

当我们比较pS129和pY125下调的蛋白质的富集时与与pY125肽相比，pS129几乎在所有情况下都有更大的富集(表III). 这种趋势的一个例外是酪蛋白激酶1的α亚单位。

T型能够的三

磷酸化位点偏好的蛋白质相互作用

虽然Ser-129磷酸化肽的亲和力通常大于Tyr-125磷酸化肽，但通常可以通过NP上的Ser-129或Tyr-125-磷酸化发现结构蛋白的优先富集。例外情况是，一些激酶没有在下拉框中富集，其中在Tyr-125处磷酸化的肽和表中的第一个蛋白质酪蛋白激酶1，α1的肽显示出更大的富集。CNPase，2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶；肽，肽。

UniProtKB/Swiss-Prot条目名称	主要登录号	基因名称	Pep命中率		pS129亲和力		独特的肽		描述
UniProtKB/Swiss-Prot条目名称	主要登录号	基因名称	第129页	125页	标准化Pep命中率	归一化离子电流	第129页	125页	描述
pY125亲和力>pS129亲和力
Q6PJ87_住宅	Q6PJ87型	Csnk1a1号机组	24	43	0.5	0.5	7	7	酪蛋白激酶1，α1
pS129亲和力>pY125亲和力
信号
Q6PHZ2_小鼠	Q6PHZ2型	凸轮2d	79	24	2.9	1.8	4	4	CaM激酶IIδ链
MARK2_月	Q05512号	标记2	46	16	2.5	不适用	10	7	丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MARK2
Q5RJI5_住宅	第5季度	制动器1	11	4	2.4	3.4	2	2	BR丝氨酸/苏氨酸激酶1
PP1A_住宅	第62137页	Ppp1ca公司	16	三	4.7	4.5	三	2	丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1-α催化
细胞骨架
Q3V1V5_住宅	第三季度V1V5	Spna2型	143	62	2	1.7	18	15	光谱α链，脑
MYH10_家	第61879季度	我的10	48	13	3.2	4	14	8	肌球蛋白-10（肌球蛋白重链，非肌肉IIb）
AINX_模块	第4666页	伊纳	40	13	2.7	4.4	9	7	α-Internexin
ACTZ_MOUSE公司	第61164页	演员1a	30	11	2.4	5.4	6	2	α-中心蛋白
问题32_老鼠	问题3THE2	Mylc2b公司	22	7	2.8	3	5	三	肌球蛋白调节性轻链
Q3UMG4_住宅	第三季度	伊纳	22	7	2.8	4	5	三	Internexin神经元中间丝蛋白
BCAS1_小鼠	第80季度第3季度	Bcas1公司	14	1	12.3	8.8	1	1	乳腺癌1同源物中新扩增
TRIM3_模块	问题9R1R2	修剪3	33	5	5.8	3.3	7	4	三分基序蛋白3
Q3TY37_母公司	Q3TY37问题	Ctna2型	10	4	2.2	4.4	5	三	连环蛋白α2
线粒体相关
Q8JZU2_鼠标	Q8JZU2型	Slc25a1系列	13	5	2.3	2.2	三	2	溶剂载体系列25
LACTB_住宅	问题9EP89	乳酸菌	72	2	31.6	138.4	9	1	丝氨酸β-内酰胺酶样蛋白LACTB
TFAM_房屋	第40630页	Tfam公司	15	5	2.6	3.9	三	2	转录因子A，线粒体前体
其他
CN37_母公司	第16330页	Cnp1号机组	74	28	2.3	5.8	7	6	CNPase酶
RS10_母	P63325页	10卢比	11	三	3.2	2.8	2	2	40S核糖体蛋白S10
H2A2B_小鼠	问题64522	Hist2h2ab公司	11	4	2.4	3.4	三	2	组蛋白H2A 2-B型

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第二类蛋白质包括那些与pS129和pY125相比优先被NP拉下的蛋白质(表四). 引人注目的发现是，这类蛋白质几乎完全由线粒体电子传递链的亚基组成。在复合物I蛋白中，我们观察到7种线粒体编码肽中的3种和39种核编码蛋白中的28种。我们还观察到11个复合物III蛋白中的7个和13个复合物IV蛋白中的8个，但没有观察到复合物II蛋白。复合物I、III和IV，但不是复合物II，一起形成一个超复合物，即呼吸体(35)。

T型能够的四

对非磷酸化α-突触核蛋白相互作用网络具有优先亲和力的蛋白质

标准与表二如果蛋白质在非磷酸化下拉列表中的肽（Pep）命中数是磷酸化下拉菜单中的肽命中数的2倍，则认为该蛋白质具有优先亲和力。不适用。

UniProtKB/Swiss Prot条目名称	主要登录号	基因名称	Pep命中率		NP亲和力		独特的肽		描述
UniProtKB/Swiss Prot条目名称	主要登录号	基因名称	核电厂	第129页	正常化Pep命中	归一化离子电流	核电厂	第129页	描述
综合体I
NDUAB_老鼠	问题9D8B4	恩杜法11	28	0	不适用	不适用	三	0	NADH-泛醌氧化还原酶亚基B14.7
NU1M_住宅	P03888号	ND1号机组	22	0	不适用	不适用	1	0	NADH-泛醌氧化还原酶链1
NIPM_MOUSE公司	Q99LY9年	恩杜夫斯5	14	0	不适用	不适用	2	0	NADH-泛醌氧化还原酶15-kDa亚基
NU5M_房屋	P03921	ND5型	47	2	28.8	22.9	三	2	NADH-泛醌氧化还原酶链5
NUBM_母公司	Q91年初至今	Ndufv1型	164	14	14.3	28.1	11	5	NADH-泛醌氧化还原酶51-kDa亚基
NDUBB_老鼠	O09111号	恩杜夫11	35	三	14.3	12.1	5	2	NADH-泛醌氧化还原酶ESSS亚基
裸体（_MOUSE）	问题9CXZ1	恩杜夫斯4	11	1	13.5	10	三	1	NADH-泛醌氧化还原酶18-kDa亚基
NDUB3使用	Q9CQZ6号	Ndufb3号机组	20	2	12.2	4.9	2	1	NADH-泛醌氧化还原酶B12亚基
NUCM_住宅	Q91WD5型	Ndufs2号机组	167	26	7.9	14.3	14	8	NADH-泛醌氧化还原酶49-kDa亚基
NDUB8_住宅	Q9D6J5型	恩杜夫布8	12	2	7.3	6.9	三	1	NADH-泛醌氧化还原酶ASHI亚基
NUIM_MOUSE公司	Q8K3J1型	恩杜夫斯8	71	12	7.2	23.8	6	三	NADH-泛醌氧化还原酶23-kDa亚基
NDUB6_住宅	Q3UIU2号机组	恩杜夫布6	23	4	7	8.3	2	2	NADH-泛醌氧化还原酶B17亚基
NDUB7_住宅	问题9CR61	恩杜夫布7	97	17	7	11.5	9	4	NADH泛醌氧化还原酶B18亚基
NDUAA_MOUSE公司	Q99LC3号机组	恩杜法10	74	13	7	18.9	12	6	NADH-泛醌氧化还原酶42-kDa亚基
NUAM_MOUSE公司	Q91VD9型	恩杜夫斯1	491	89	6.8	17.1	28	15	NADH-泛醌氧化还原酶75-kDa亚基
NUKM_MOUSE公司	问题9DC70	恩杜夫7	69	13	6.5	33.9	6	三	NADH-泛醌氧化还原酶20-kDa亚基
NU2M_房屋	P03893号	第2个月	15	三	6.1	8	2	1	NADH-泛醌氧化还原酶链2
N4BM_老鼠	Q9CQ54号	Ndufc2号机组	18	4	5.5	15	2	1	NADH-泛醌氧化还原酶亚基B14.5b
NUHM_住宅	Q9D6J6型	Ndufv2型	95	22	5.3	13.3	9	7	NADH-泛醌氧化还原酶24-kDa亚基
NDUB9_住宅	Q9CQJ8号	恩杜夫布9	73	17	5.3	13.5	三	2	NADH-泛醌氧化还原酶B22亚单位
NDUA6_母公司	Q9CQZ5号	恩杜法6	29	7	5.1	15.2	三	1	NADH-泛醌氧化还原酶B14亚基
NDUB5_住宅	问题9CQH3	恩杜夫布5	21	6	4.3	15	三	2	NADH-泛醌氧化还原酶SGDH亚基
Q6GTD3_住宅	Q6GTD3	恩杜法9	87	25	4.3	7.5	9	6	NADH脱氢酶（泛醌）1α亚复合物，9
NU4M_住宅	P03911号	ND4号机组	24	7	4.2	7.8	4	三	NADH-泛醌氧化还原酶链4
NDUBA_住宅	问题9DCS9	恩杜夫10	131	39	4.1	11.7	7	6	NADH-泛醌氧化还原酶PDSW亚基
NDUA5_穆斯	问题9CPP6	恩杜法5	17	6	3.5	5.4	三	2	NADH-泛醌氧化还原酶13-kDa B亚单位
NDUAC_老鼠	问题7TMF3	恩杜法12	16	6	3.3	10	4	2	NADH-泛醌氧化还原酶亚基B17.2
NUGM_MOUSE公司	问题9DCT2	恩杜夫斯3	113	43	3.2	10.7	10	7	NADH-泛醌氧化还原酶30-kDa亚基
NDUAD_老鼠	问题9ERS2	恩杜法13	65	26	3.1	13.8	5	5	NADH-泛醌氧化还原酶B16.6亚单位
NDUA8_穆斯	问题9DCJ5	恩杜法8	40	18	2.7	10.8	5	三	NADH-泛醌氧化还原酶19-kDa亚基
NDUB4_住宅	问题9CQC7	Ndufb4号机组	21	11	2.3	9.1	2	2	NADH-泛醌氧化还原酶B15亚单位
综合体III
UCR6_住宅	问题9D855	Uqcrb公司	18	2	11	30.6	三	1	泛喹诺酮类细胞色素c（c）还原酶复合体14kDa蛋白
UQCR1_住宅	Q9CZ13型	Uqcrc1号机组	289	62	5.7	14.5	14	9	泛喹诺酮类细胞色素c（c）还原酶复合物核心蛋白I
CY1_小鼠	Q9D0M3型	周期1	168	40	5.1	14.5	7	5	细胞色素c（c）₁、血红素蛋白、线粒体前体
UCRI_住宅	第9季度第68季度	Uqcrfs1号机组	118	36	4	9.3	8	5	泛喹诺酮类细胞色素c（c）还原酶铁硫亚基
UQCR2_鼠标	问题9DB77	Uqcrc2号机组	215	66	4	9.4	15	13	泛喹诺酮类细胞色素c（c）还原酶复合物核心蛋白2
UCR10_住宅	问题8R1I1	Uqcr10	19	7	3.3	3.6	2	1	泛喹诺酮类细胞色素c（c）还原酶复合物7.2-kDa蛋白
UCRQ_住宅	问题9CQ69	Uqcrq公司	16	7	2.8	8.4	1	1	泛喹诺酮类细胞色素c（c）还原酶复合物9.5-kDa蛋白
综合体IV
COX6C_老鼠	问题9CPQ1	Cox6c公司	20	2	12.2	44.6	2	1	细胞色素c（c）氧化酶多肽Vic
Q9MD68_住宅	Q9MD68型	mt-Co1型	19	三	7.8	8	1	1	细胞色素氧化酶亚基1
cox7_小鼠	Q61387问题	考克斯7a2l	15	三	6.1	7.3	2	1	细胞色素c（c）氧化酶亚基VIIa相关蛋白
CX7A2_小鼠	第48771页	考克斯7a2	57	12	5.8	13.1	2	2	细胞色素c（c）氧化酶亚基VIIa-L
COX5B_老鼠	第19536页	考克斯5b	15	4	4.6	12.5	1	1	细胞色素c（c）氧化酶多肽Vb
COX2_小鼠	P00405号	COX2型	192	73	3.2	9.3	4	4	细胞色素c（c）氧化酶亚基2
COX5A_模块	第12787页	考克斯5a	28	13	2.6	2.8	三	2	细胞色素c（c）氧化酶多肽Va
CX6A1_小鼠	第43024页	Cox6a1公司	21	11	2.3	1.6	1	1	细胞色素c（c）氧化酶多肽
线粒体膜蛋白
Q3U5Y8_住宅	第3季度U5Y8	Fam82c系列	18	0	不适用	不适用	4	0	蛋白质FAM82C
GLPK_母	Q64516问题	甘油激酶	10	2	6.1	4	2	1	甘油激酶
突触囊泡蛋白
VAPA_MOUSE公司	Q9WV55型	瓦帕	81	17	5.8	21.2	6	三	囊泡相关膜蛋白相关蛋白A
VAPB_住房	Q9QY76期	瓦布	49	11	5.5	13.5	三	三	囊泡相关膜蛋白相关蛋白B
线粒体转运膜蛋白
Q3TWD3_住宅	第三季度三季度	山姆50	25	8	3.8	3	10	6	SAM50样蛋白CGI-51同源物
Q3TBZ2_老鼠	Q3TBZ2号	汤姆40	16	8	2.4	1.2	4	三	线粒体外膜40同系物转位酶
其他
STXB1_住宅	O08599年	标准bp1	111	50	2.7	5.3	17	14	突触结合蛋白1（Unc-18-1）

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第三大类是与打乱的对照肽相比，由α-突触核蛋白的羧基末端部分特异性拖曳下来的蛋白质，但亲和力与诱饵肽的磷酸化状态无关(表五). 该组中的蛋白质包括除MAP1B之外的微管相关蛋白，即MAP1A、MAP2和MAP4，以及溶质载体25家族和电压依赖性阴离子通道孔蛋白家族的线粒体外膜转运蛋白。虽然没有发现富集，但没有定量差异的肽可能需要更具针对性的方法，例如多反应监测分析，以提高准确性。

定量质谱的Western Blot验证-

我们使用磷酸化肽和非磷酸化肽拖曳下来的蛋白质混合物的Western blotting作为评估质谱结果有效性的独立方法。我们选择了五种蛋白质的一个子集，这些蛋白质的强健抗体可用于对被各种肽拉下的大脑蛋白质进行西方分析。如所示图2，我们证实，所有五种已鉴定的蛋白质在pS129和pY125肽或NP肽拉下的复合物中表现出类似的富集模式，正如我们在质谱分析中发现的那样。

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F类免疫球蛋白. 2.

复合西方分析证实选定小鼠蛋白的磷酸化依赖性结合。按中所示进行下拉实验图1。每条通道都标有肽（杂乱肽、NP、pS129和pY125），这些肽与磁珠结合，用于每次下拉。用SDS-PAGE（4–20%）分离与每种肽结合的洗脱蛋白，并按照“实验程序”中的描述，使用各种抗体进行Western分析正确的西方的斑点。碳氢化合物，重型链条。

人脑的生理相关性-

由于这些研究都是使用人类α-突触核蛋白肽来拖拽小鼠突触体蛋白进行的，我们希望确保基于诱饵肽磷酸化状态的突触体蛋白质亲和力的显著差异与人类突触体的蛋白质保持一致。我们使用人脑提取物对诱饵肽拖曳下来的蛋白质进行了Western blot分析，发现与人脑和小鼠脑提取物的结果非常相似(图3)。

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F类免疫球蛋白. 3.

西方分析的合成证实了选定人类蛋白质的磷酸化依赖性结合。人脑蛋白质以序列和磷酸化依赖的方式结合α-突触核蛋白的羧基末端。图中显示了由磁珠拉下的人类突触体总蛋白的蛋白质印迹组成的复合物。每条通道都标有与每次下拉使用的磁珠结合的肽（杂乱、NP和pS129）。下拉实验按照图1用SDS-PAGE（4–20%）分离与每种肽结合的洗脱蛋白，并用各种抗体进行Western分析正确的“实验程序”中所述的蛋白质印迹碳氢化合物，重型链条。

最后，我们询问当α-突触核蛋白羧基末端结构域是全长蛋白质的一部分时，是否会复制与该结构域的蛋白质相互作用。3倍摩尔过量的全长α-突触核蛋白能够部分竞争三种不同电子传递链蛋白和线粒体VDAC的下拉；10倍的摩尔过剩完全阻止了下拉(图4). 由于含有氨基酸1–124（缺少最后15个氨基酸）的重组α-突触核蛋白即使在摩尔过量10倍的情况下也无法竞争，因此与全长蛋白的竞争不是添加过量重组蛋白或肽的非特异性效应。虽然我们不知道相互作用域的最小范围，但残基124和125之间的中断破坏了相互作用，因为包含残基1–124的截短蛋白质和包含末端16个氨基酸（包括Ser-129残基）的肽都无法竞争（补充图3）。最后，全长小鼠α-突触核蛋白和全长人类β-突触核蛋白能够在下拉过程中与生物素化NP肽竞争，而另一个α-突触核蛋白同源物人类γ-突触细胞核蛋白则不能（补充图3）。小鼠α-突触核蛋白和人β-突触核蛋白在羧基末端与人α-突触核蛋白高度同源，并在丝氨酸上进行磷酸化(36,37). 相反，γ-突触核蛋白在其羧基末端与α-突触核蛋白几乎没有同源性，因此，在我们的下拉实验中，它不能与NP肽竞争也就不足为奇了(37)。

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F类免疫球蛋白. 4.

全长重组人α-突触核蛋白与NP肽下拉的竞争。在存在或不存在3×或10×摩尔过量的重组全长人α-突触核蛋白（残基1-140）或由缺乏末端16个氨基酸（残基1-124）的截短α-突触核蛋白组成的对照蛋白的情况下，使用生物素化NP肽进行下拉实验。用SDS-PAGE（4-20%）分离与生物素化肽结合的洗脱蛋白，并使用特定抗体进行Western分析。洗脱后的蛋白混合物用凝胶蓝染色，以识别链霉亲和素，作为凝胶负载控制。

讨论

我们的靶向功能蛋白质组学方法对与α-突触核蛋白磷酸化相关的蛋白质网络的差异进行了广泛而公正的研究。无标签相对定量通过两种方法确定：给定肽的独立赋值或点击数（对次要成分更敏感）和离子电流强度（对主要成分更准确）。这两种定量方法都广泛用于高通量比较蛋白质组学研究中的初始分析(38,39)。表二——四为α-synuclein在磷酸化中作用的改变提供有力证据。

磷酸化α-突触核蛋白亲和力-

一个引人注目的生物学有趣的观察是磷酸化后细胞骨架蛋白的富集与非磷酸化α-突触核蛋白羧基末端肽。结构蛋白是下拉分析和蛋白质组学研究中常见的污染物。然而，我们使用了非常严格的截止值来进行包含，并将其视为相关的优先交互。更多的结构蛋白没有达到我们的包合阈值，可以在补充材料中找到。因此表二——五表现得很自信。

先前已经观察到MAP1B与α-突触核蛋白的羧基末端45个氨基酸的相互作用，尽管之前没有发现与磷酸化的亲和力增加(26). 在使用磷酸化肽的下拉中，一个引人注目的新观察是非红细胞αII和βII光谱蛋白（fodrins）以及光谱相互作用蛋白锚蛋白和4.1B带的突出(27,28). 此外，我们还发现了细胞质肌动蛋白的两种亚型，β-和γ-肌动蛋白(29,30); 非肌肉肌球蛋白；和一种神经丝。这些蛋白质存在于神经元的突触前部分，并形成所谓的突触前颗粒网，参与突触的稳定(31,40). 这一结果表明，磷酸化可以促进α-突触核蛋白与突触细胞骨架的连接，从而也可以将与α-突触核蛋白的氨基末端两亲性螺旋结合的突触小泡固定到位。

在路易小体中，α-突触核蛋白主要在Ser-129处磷酸化(7). 路易小体已被证明含有细胞骨架蛋白，包括MAP1B、蛋白、细胞质肌动蛋白、神经丝L和tau(41). 这里的数据表明，路易小体的产生途径涉及磷酸化α-突触核蛋白和细胞骨架元件之间的相互作用。

另一组与磷酸化α-突触核蛋白相互作用的有趣蛋白质是参与丝氨酸/苏氨酸磷酸化的酶和信号蛋白。先前的工作表明酪蛋白激酶2是负责Ser-129α-突触核蛋白磷酸化的主要激酶，酪蛋白激酶1和CaM激酶的活性要低得多(12,33). 然而，我们发现酪蛋白激酶1、CaM激酶、，和带有磷酸化肽的MARK2表明，这些激酶识别磷酸化产物而不是底物，或者它们不是与α-突触核蛋白的直接相互作用物，而是优先识别磷酸化α-突触核蛋白的复合物的一部分。然而，值得注意的是，当磷酸化位于Tyr-125而不是Ser-129时，酪蛋白激酶1对磷酸化的α-突触核蛋白的亲和力更大，这增加了一种有趣的可能性，即Tyr-125-磷酸化可能与Ser-129的丝氨酸磷酸化协同参与。在细胞培养中，125位的酪氨酸可以被Src家族激酶磷酸化，但我们缺乏确凿证据证明大脑中该部位发生了生理磷酸化(2,三)。

参与网格蛋白介导的内吞作用的氯氰菊酯重链和AP-2和AP-1适配器复合物的亚基也在磷酸化α-突触核蛋白优先于非磷酸化α-突触核蛋白下调的蛋白质中富集。AP-2与网格蛋白相互作用，参与预定进入突触前区再循环池的突触小泡的内吞作用(42). 如果网格蛋白·AP-2复合物和α-突触核蛋白之间的相互作用是直接的，这一发现很有意义，因为最近的数据表明，α-突触前小泡的“储备”或“休息”池的形成和/或维持可能需要α-突厥核蛋白(5——7). 参与囊泡运输的蛋白质也被鉴定为α-突触核蛋白毒性的修饰物秀丽线虫(8,43). 因此，α-突触核蛋白的磷酸化可能对其参与突触小泡的内吞作用很重要。

仍有一长串蛋白质显示出对磷酸化α-突触核蛋白的强烈偏好，如边缘系统相关膜蛋白前体、丝氨酸β-内酰胺酶样蛋白和阿片结合蛋白/细胞粘附分子样蛋白。虽然不可能将所有这些蛋白质组合成一个连贯的相互作用网络，但我们希望这些蛋白质中的许多将成为该领域进一步实验的推动力。

非磷酸化α-突触核蛋白亲和力-

与pS129或pY125肽相比，使用NP肽的下拉物富含一组非常不同的蛋白质(表四). 最引人注目的发现是，NP肽比任何一种磷酸化肽都具有更大的亲和力，能够拉下大量电子传递链蛋白的亚基。表四包括电子传递链复合物I的46个亚基中的31个，以及许多复合物III和复合物IV蛋白质，但不包括复合物II蛋白质。复合物I是一种L型多聚体，其疏水臂位于线粒体内膜内，而亲水臂位于膜外(45,46). 复合物I的31个亚单位列于表四不来自复合物I的任何已知前体亚复合物，并且包括种子复合物I组装的蛋白质，例如线粒体编码的蛋白质，进入复合物稍晚但在B17.2L伴侣结合之前的蛋白质，以及进入复合物较晚且位于亲水臂中的蛋白质，如NDUFS4和NDUFS6(45). 先前对纯化的复合物I进行的蛋白质组学分析表明，许多复合物III和IV蛋白质在这里被鉴定为污染物(47)，反映了由复合物I、III和IV（称为呼吸体）组成的超复合物的存在(35). 因此，我们认为α-突触核蛋白的非磷酸化羧基末端拖拽下来的电子传递链蛋白的富集与α-突触核蛋白与呼吸体复合体的一个或多个组分的优先相互作用是一致的。

本文所报道的研究存在许多局限性。首先，以磷酸化依赖的方式拉下的一些蛋白质可能是假阳性。由于与生物素化肽和链霉亲和素珠的非特异性相互作用，一些可能是技术性假阳性。根据扰乱肽的结果，我们认为这类假阳性相当小。一大类假阳性是由生物假阳性组成的。这些蛋白质可能存在于蛋白质复合体中，其中只有少数蛋白质实际相互作用，而其余蛋白质则通过它们在复合体中的结合而被拉下。确定哪些蛋白质直接相互作用需要大量额外的实验来整理这些列表并测试它们的直接相互作用。我们已经开始使用酵母双杂交系统进行此类实验，以测试直接相互作用，并且已经在一些细胞骨架蛋白中发现了结构域表二它可以直接与α-突触核蛋白的羧基末端部分相互作用。²第二个限制是，实验只使用了一部分α-突触核蛋白。虽然竞争实验表明，当全长蛋白质的一部分能够与具有代表性的相互作用样本特异竞争时，COOH末端，这些实验并没有捕捉到磷酸化所赋予的全长蛋白的构象和随后的相互作用的所有变化，这仍然是事实。最后，这里描述的结果都来自在体外这些相互作用的生物学意义仍然是一个悬而未决的问题。需要在相关活细胞（如神经元）中进行额外的研究，其中α-突触核蛋白要么是组成性磷酸化的，要么是不可磷酸化的。这里报告的结果只是第一步，对于生成新的假设，以在更复杂和真实的生物系统中进行测试，应该是有用的。

有许多已发表的蛋白质组学研究描述了α-突触核蛋白与细胞蛋白质的相互作用。这些研究主要涉及用线粒体毒物（如鱼藤酮或1-甲基-4-苯基-1,2,5,6-四氢吡啶）处理细胞或整个动物，然后在亲和柱上对发现与α-突触核蛋白相互作用的蛋白质的特性和数量的变化进行定量蛋白质组学分析(48——50). 据我们所知，我们是第一个评估磷酸化依赖的α-突触核蛋白相互作用的蛋白质组学研究。在这些已发表的研究和本文提出的研究之间，发现重叠的蛋白质不到十几种。考虑到之前发表的研究旨在解决与这里提出的问题不同的问题，这可能并不那么令人惊讶。已发表的研究旨在寻找毒性应激后与α-突触核蛋白相互作用的蛋白质的变化，而本研究旨在鉴定具有磷酸化差异结合亲和力的蛋白质与非磷酸化α-突触核蛋白。在暴露于毒素后与α-突触核蛋白相互作用的蛋白质的研究中，没有一项涉及到治疗组α-突触核蛋白磷酸化状态的问题与未经处理的细胞或脑组织样本。如果这些治疗后α-突触核蛋白的磷酸化状态几乎没有显著变化，那么我们预计这些研究中的变化不会与我们的数据有实质性重叠。如果用这些毒素治疗后，大部分α-突触核蛋白仍保持非磷酸化状态，那么与线粒体蛋白的相互作用将被忽略，因为其中两项研究明确排除了线粒体，而在第三项研究中，存在大量线粒体损伤和细胞丢失。

复杂I功能障碍一直被假设为PD发病机制的重要组成部分(51——54). 锂等。(55)提出α-synuclein与脑线粒体部分共纯化，并报道了免疫金电子显微镜，显示少量金颗粒使用抗α-synuglein抗体标记线粒体外膜。在已发表的结果中，我们还证明，当α-突触核蛋白在稳定转染的神经母细胞瘤细胞中以低到中等水平表达时，可以在氧化应激或细胞内pH值降低后转移到线粒体膜上(56). 这种膜相互作用可能是通过与心磷脂结合而实现的，心磷脂是一种酸性磷脂，α-突触核蛋白的脂质结合氨基末端部分对其具有高亲和力，没有证据表明α-突触核蛋白确实进入线粒体。电子传递链复合物位于线粒体内膜，然而，在目前的研究中，发现由非磷酸化α-突触核蛋白拉下的电子传递链蛋白占主导地位令人困惑。

与我们的结果相比(56)，德维等。(57)和帕里哈尔等。(58)证明在过度表达α-synuclein的细胞中，该蛋白可以进入线粒体并干扰线粒体功能。德维等。(57)和李等。(55)接着提出，蛋白质氨基末端重复基序中存在的大量赖氨酸可以作为一个隐秘的线粒体靶向序列，允许α-突触核蛋白进入线粒体。人们可以假设，随着非磷酸化α-突触核蛋白的高水平表达，该蛋白与细胞骨架元素脱绑，并可自由进入线粒体，从而干扰电子传递链的复合物I。如果磷酸化α-突触核蛋白的能力受到限制，则蛋白质的过度表达或延长其半衰期的突变将不成比例地增加非磷酸化蛋白质的水平，从而导致更多的线粒体抑制。这些结果与Gorbatyuk的结果一致等。(16)并支持将非磷酸化α-突触核蛋白置于导致线粒体功能障碍和PD发展的途径中的模型。因此，参与磷酸化和去磷酸化α-synuclein的酶可能是PD的潜在治疗靶点。

致谢

我们感谢Douglas Slotta、Sara Yang和Anthony J.Makusky在数据处理方面的帮助；Jeffrey Kowalak和Joanne Connolly对该项目进行初步观察；以及Yien-Ming Kuo博士和Valerie Drews博士，以帮助准备和批判性阅读手稿。我们感谢Nelson Cole提供了一些重组突触核蛋白并帮助我们制造其他突触核。

脚注

出版，MCP论文出版社，2008年7月9日，DOI 10.1074/MCP。M800116-MCP200

¹使用的缩写是：帕金森病；NP，由α-突触核蛋白的羧基末端40个氨基酸组成的肽；pS129，由α-突触核蛋白的羧基末端40个氨基酸组成的肽，在丝氨酸129位磷酸化；pY125，由酪氨酸位置125磷酸化的α-突触核蛋白的羧基末端40个氨基酸组成的肽；电压依赖性阴离子选择性通道；微管相关蛋白；AP-2，衔接蛋白复合物2；钙调蛋白。

²V.Drews和R.L.Nussbaum，未公布数据。

^*这项工作全部或部分得到了国家心理健康研究所内部项目的国立卫生研究院拨款Z01 MH000279和国家健康研究所的支持。这项工作也得到了桑德勒家庭基金会的支持。这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节，仅用于表明这一事实。

^S公司本文的在线版本（可在http://www.mcponline.org)包含补充材料。

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文章来自分子和细胞蛋白质组学：MCP由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会

蛋白质组学分析确定磷酸化依赖的α-突触核蛋白相互作用*S⃞

梅琳达·A·麦克法兰

克里斯托弗·埃利斯

桑福德·P·马基

罗伯特·努斯鲍姆

摘要

实验程序

肽下拉菜单-

T型能够的我

凝胶内消化-

质谱法-

信息学-

西方分析-

结果

不同α-突触核蛋白多肽下拉蛋白质的定量分析-

T型能够的二

T型能够的五

T型能够的三

T型能够的四

定量质谱的Western Blot验证-

人脑的生理相关性-

讨论

磷酸化α-突触核蛋白亲和力-

非磷酸化α-突触核蛋白亲和力-

致谢

脚注

参考文献

蛋白质组学分析确定磷酸化依赖的α-突触核蛋白相互作用^*^S⃞