自噬。作者手稿；PMC 2009年11月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院57365
线粒体定位ERK2调节有丝分裂和自噬细胞应激
帕金森氏病的影响
,1 ,1 ,1,三和1,2,*
鲁本·达格达
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系
朱建辉
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系
斯科特·库利奇
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系
三美国宾夕法尼亚州匹兹堡退伍军人事务匹兹堡医疗系统
查琳·T·楚
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡匹兹堡大学医学院病理学系
2美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院神经科学中心
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院病理学系
2美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院神经科学中心
三美国宾夕法尼亚州匹兹堡退伍军人事务匹兹堡医疗系统
*致：Charleen T.Chu；病理科；匹兹堡大学；洛思罗普街200号。；美国宾夕法尼亚州匹兹堡市，邮编15261；电子邮件：ude.ttip@4ctc - 补充资料
GUID:A73C3CA6-0856-432E-8376-96F0EEE5FD0B
摘要
帕金森氏病（PD）患者大脑退化神经元呈现磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）颗粒，定位于自噬细胞的线粒体。这里我们表明6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导SH-SY5Y细胞线粒体ERK1/2的活性相关定位，并且这些事件与自噬的诱导一致，并且先于线粒体降解。瞬时转染野生型（WT）ERK2或组成活性MAPK/ERK激酶2（MEK2-CA）足以诱导与6-OHDA诱导的有丝分裂，而组成活性ERK2（ERK2-CA。我们开发了WT、CA和激酶缺乏（KD）ERK2的绿色荧光蛋白（GFP）融合构建物，以研究ERK2定位在调节有丝分裂和细胞死亡中的作用。在基础条件下，转染GFP-ERK2-WT或GFP-ERK1-CA而非GFP-ERK-KD的细胞显示出离散的细胞质ERK2颗粒，其中很大一部分与线粒体和自噬溶酶体成熟标记物共定位。6-OHDA进一步增加共定位GFP-ERK2/线粒体颗粒，并进行自噬降解，因为作为自溶体降解抑制剂的巴非霉素-A强烈增加了其检测。有趣的是，通过分析自噬标记物微管相关蛋白1轻链3（LC3）评估，增加ERK2-WT或ERK2-CA表达足以促进大自噬的可比水平。相反，有丝分裂水平与ERK活性水平的相关性更为密切，这可能是因为ERK2-CA相对于ERK2-WT在线粒体中的定位更高。这些数据表明，ERK2活性的线粒体定位足以重现6-OHDA对有丝分裂和自噬细胞死亡的影响。
关键词：自噬、氧化应激、线粒体、丝裂原活化蛋白激酶、6-羟基多巴胺、帕金森氏病
介绍
长寿命蛋白质和细胞器的细胞降解由两个主要过程介导：泛素蛋白酶体介导的降解和自噬。长寿命蛋白质和细胞器的细胞降解的适当平衡对于神经元的存活至关重要，降解的改变导致泛素化蛋白质的异常积累，如帕金森病（PD）所示。1,2
自噬在细胞分化和生存中起着重要作用。三,4在哺乳动物细胞中，大细胞自噬和伴侣介导的自噬（CMA）的研究最为深入。大自噬，通常简称为自噬。它是一个受调控的过程，涉及细胞质成分吞噬到自噬体或早期自噬空泡（AVs）中，然后成熟为自溶体或晚期AVs进行降解。人类自噬机制在酵母中保存完好，包括结合酶，其介导Atg12与Atg5的共价连接，以及Atg8/微管相关蛋白1轻链3（LC3）与新生自噬膜的共价结合。5Atg12-Atg5复合物在自噬体完成后丢失，但一些LC3仍与AVs相关，直到在溶酶体中降解。6虽然在营养缺乏期间调节体降解的上游信号已经得到了很好的确定，但调节不需要或受损细胞器降解的信号还不太清楚。7,8
分解代谢和合成代谢活动的适当平衡对神经元的存活至关重要。在某些情况下，自噬发挥有益的稳态作用，包括清除蛋白质聚集体，9-12线粒体的维持，13,14轴突突触形态。15另一方面，过度或不平衡的自噬会造成“自噬应激”，导致神经退化和细胞死亡。16特别是，过度的线粒体降解可能对神经元有害，因为它们高度依赖氧化磷酸化。17,18自噬和ERK信号的双重作用也在秀丽线虫在饥饿诱导的自噬过程中存活。19
细胞外信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）调节多种神经元功能，包括突触/神经炎重塑、分化和存活。20-23ERK1/2活性的动力学和亚细胞定位变化会在缺血性、创伤性、毒性和神经变性损伤期间促进细胞死亡。24在人类PD脑组织中，我们观察到细胞质ERK1/2活性增加。25退化的黑质神经元显示磷酸化的ERK1/2颗粒，其中许多颗粒与线粒体和AV共定位。26在PD神经元中也观察到涉及核转录调节因子的细胞质颗粒，这表明信号蛋白亚细胞功能的改变导致神经退行性变。27,28ERK1/2活性是MPP诱导自噬和线粒体降解所必需的+,29帕金森神经毒素的活性代谢产物。30,31然而，ERK活性升高本身是否足以诱导自噬和线粒体周转尚不清楚。
6-羟基多巴胺（6-OHDA）是一种氧化还原循环多巴胺类似物，是一种在动物模型中重现PD许多特征的氧化神经毒素。32,33用6-OHDA处理多巴胺能细胞可诱导ERK1/2的强烈激活，而药物抑制ERK激活可提高神经元存活率。34,35有趣的是，6-OHDA引起线粒体ROS生成的延迟期35这与线粒体ERK激活增加有关。26,35神经元损伤期间线粒体定位ERK激活的潜在功能尚不明确。
在本报告中，我们发现ERK2表达增加会增加神经细胞系SH-SY5Y细胞中毒素诱导的线粒体自噬。神经毒素损伤或组成型活性ERK2（ERK2-CA）的表达刺激了线粒体、自噬体和溶酶体的活性依赖性ERK2。此外，ERK2-CA的表达概括了毒素处理引起的有丝分裂水平。虽然ERK2-WT转染诱导的ERK2活性的微小增加足以诱导自噬并引起溶酶体扩张，但线粒体ERK2定位和有丝分裂的水平取决于ERK活性增加的程度，ERK2-CA的影响远大于ERK2-XT。总的来说，我们的结果表明，ERK2是宏观自噬和有丝分裂的调节剂，但需要较高水平的激酶活性和/或线粒体ERK2定位来诱导有丝分裂和自噬细胞应激。
结果
6-OHDA诱导自噬和ERK磷酸化
以前的报告显示MPP+PD基因富含亮氨酸重复激酶2的突变，或多巴胺的神经毒性剂量引发与神经变性相关的自噬。23,29,42在这里，我们发现6-羟基多巴胺（另一种PD神经毒素）可诱导自噬，通过透射电镜和LC3（自噬标记物）的分布和电泳迁移率的改变证明了这一点。43从超微结构水平分析6-OHDA对细胞的影响。用载体处理的细胞表现出正常的线粒体形态和几乎没有AVs(). 然而，暴露于6-OHDA 4小时的细胞显示线粒体基质密度降低，降解性AVs和溶酶体数量增加(). 还观察到早期AV（插图，).
6-OHDA诱导自噬和ERK磷酸化。用载体对照物（A）或6-OHDA（B）处理4小时的细胞的典型电子显微照片。请注意，6-OHDA增加AV和溶酶体（ly）的数量，减少线粒体（m）的含量，而细胞核（n）的完整性不受影响。插图显示早期AV包含不同的细胞质物质（标尺：1μm）。（C） 在存在或不存在6-OHDA的情况下稳定表达GFP-LC3的代表性细胞。绿色通道被提取为灰度并反转。（D） 6-OHDA治疗对GFP-LC3点状数目（左条形图）和大小（右条形图）的影响通过方法中描述的NIH Image J宏确定。为便于比较，虚线表示由于巴非霉素A治疗而累积的GFP-LC3点的平均数量和大小。柱状图显示了至少3个独立实验的汇编平均值±标准误差（o:p<0.05 vs.untached，:p<0.001 vs.6-OHDA）。（E） SH-SY5Y细胞用6-OHDA或载体处理指定时间点。用毒素处理后，对细胞进行总ERK1/2和LC3的免疫印迹。（F） 在有或没有MEK抑制剂U0126的情况下，用6-OHDA共同处理4小时的瞬时转染细胞的GFP-LC3点的平均数量的定量。条形图显示平均值±标准偏差（每个条件分析30–40个细胞），并代表至少3个独立实验（o:p<0.0001 vs.基本，⊗：p<0.001 vs.6-OHDA）。注意，用U0126抑制MEK可抑制GFP-LC3点的6-OHDA诱导，但对基线自噬几乎没有影响。
在单细胞水平上，与未经处理的细胞相比，6-OHDA在4小时后增加了SH-SY5Y细胞中GFP-LC3点的数量和大小(). 此外，6-OHDA处理细胞中GFP-LC3点的大小大于bafilomycin-A处理细胞中的GFP-LC3-点(，右图），它不会诱导自噬，但通过抑制降解增加AV数。39,40AV大小的增加与AV诱导相一致，39,446-OHDA治疗24小时后，AV值恢复到基线水平，表明降解没有受到影响。观察到巴非霉素A阻止了24小时点刺数的下降，进一步支持了自噬流量的增加(，左图）。LC3（LC3-I）的非结合形式存在于胞浆中，而磷脂酰乙醇胺结合形式（LC3-II）定位于自噬体，通过SDS-PAGE表现出更大的流动性。66-OHDA还通过western blot促进LC3-II增加，表明自噬体增加(，LC3）。
正如之前在不同的中枢神经系统细胞系中观察到的那样，34我们发现用6-OHDA处理SH-SY5Y细胞可导致ERK持续激活，这与自噬增加相一致(，P-ERK）。与U0126共处理的细胞抑制了6-OHDA对GFP-LC3 puncta的诱导，表明参与了MEK依赖性ERK磷酸化().
6-OHDA促进线粒体降解
自噬是细胞器靶向溶酶体降解的主要机制。45鉴于人类PD脑组织在自噬细胞线粒体中表现出P-ERK1/2，26我们希望研究6-OHDA对SH-SY5Y细胞线粒体ERK磷酸化和有丝分裂的影响。与未经治疗和溶媒治疗的对照组相比，暴露于6-OHDA 4小时后，线粒体部分的磷酸化ERK1/2增加(). 为了确定6-OHDA是否诱导线粒体自噬，我们在暴露于6-OHDA之前用GFP-LC3转染细胞，并用线粒体定量GFP-LC2的共定位百分比作为自噬隔离的指标。通过共焦显微镜分析，我们发现，与载体处理的细胞相比，6-OHDA处理的细胞显著增加了GFP-LC3点与线粒体的共定位(). 此外，6-OHDA介导的有丝分裂需要激活ERK1/2，因为与MEK抑制剂U0126共同处理的细胞完全消除了线粒体-LC3共定位的增加(). 接下来，我们研究了6-OHDA对细胞中线粒体含量的影响。我们发现6-OHDA处理导致线粒体断裂(). 定量图像分析证实线粒体细胞含量降低()人线粒体110kDa抗原（MITO-P110）的免疫印迹显示线粒体蛋白相对于β-肌动蛋白的时间依赖性丢失(). 用自体溶酶体降解抑制剂bafilomycin-A或RNAi介导的Atg7和LC3的敲除共同处理细胞，均能显著逆转6-OHDA作用5h时观察到的线粒体丢失()证明了自噬在6-OHDA诱导的线粒体丢失中的作用。
6-OHDA促进线粒体ERK1/2磷酸化和有丝分裂。（A） 代表性的Western blot显示，与载体处理的细胞（V）相比，6-OHDA处理4小时的SH-SY5Y细胞胞浆（C）和线粒体部分（M）中的p-ERK1/2。（B） 稳定表达GFP-LC3的MitoTracker红染色（MTR）SH-SY5Y细胞的典型共聚焦图像，用载体对照或6-OHDA处理4小时。插图放大了50%，显示了第二个6-OHDA治疗细胞的GFP-LC1和MTR 2的合并和分离通道。（C） GFP-LC3点状细胞与线粒体共定位百分比的量化。柱状图显示平均值±s.e.m.（每种情况分析25–30个细胞），并代表至少3个独立实验：p<0.005 vs.载体：p<0.05 vs.6-OHDA）。（D） 用载体对照或6-OHDA处理4小时的细胞的代表性表观荧光图像，然后用60kDa人线粒体抗原特异性抗体（MITO-P60）进行免疫标记。注意6-OHDA诱导线粒体断裂。比例尺：20μm。（E） SH-SY5Y细胞经6-OHDA或载体对照处理不同时间点。通过线粒体人类抗原110 kDa（MITO-P110）免疫印迹分析细胞线粒体总蛋白水平，并复制β-肌动蛋白作为负荷对照。（F） 用载体或6-OHDA处理SH-SY5Y细胞，在没有和存在巴非霉素A的情况下，通过Western blot分析60kDa线粒体膜蛋白（p60）和基质蛋白丙酮酸脱氢酶（PDH）的水平。短暂转染GFP的（G，左）SH-SY5Y细胞在有或无巴柳霉素A的情况下用6-OHDA处理5h。固定细胞，并免疫染色线粒体人类抗原60kDa。通过使用定制的NIH Image J算法测量GFP转染细胞中线粒体占据的细胞面积百分比，分析6-OHDA对线粒体含量的影响。数据被归一化为非处理细胞显示的基础线粒体含量。代表性条形图显示平均值±标准偏差（每种情况下分析的22–50个细胞）（o:p<0.0001与未经治疗的比较，：p<0.005与6-OHDA比较）。（G，右）3天后，用6-OHDA处理联合转染GFP和靶向人类Atg7或LC3的siRNA的细胞5小时，并使用上述图像J进行分析。数据被归一化为用每个siRNA处理的细胞显示的基础线粒体含量，而这些细胞没有接受毒素。代表性条形图显示了平均值±标准偏差（每种情况下分析的22–50个细胞）（o:p<0.0005与未经处理的相比，⊗：p<0.0005;与6-OHDA加扰siRNA，\8855；p<0.05;与6-OHDA加乱siRNA）。
这些观察结果表明，6-OHDA介导的细胞损伤涉及细胞溶质和线粒体ERK1/2的强烈激活，伴随着毒素诱导的自噬和线粒体降解。
ERK2的激活足以促进自噬
鉴于6-OHDA诱导的自噬和有丝分裂需要MEK-ERK信号，我们想评估ERK2是否在没有毒素诱导损伤的情况下调节自噬或有丝分裂。由于ERK2是在人PD脑组织中磷酸化的同种型，并且在培养中6-OHDA损伤期间ERK2的磷酸化程度大于ERK1，25,34我们分析了ERK2瞬时转染结构对自噬的影响。
我们发现ERK2-WT的瞬时表达可诱导基础细胞内ERK活性增加3-4倍()，与空载体相比，增加了每个细胞GFP-LC3点的数量(). 与GFP相比，ERK2-WT（GFP-ERK2-XT）N端GFP融合的瞬时表达增加了LC3-II/β-actin比率，表明N端GFP-tag并不抑制ERK2的这一功能(). 同样，与GFP转染细胞或未转染细胞相比，GFP-ERK2的瞬时表达增加了内源性LC3点的平均数量，这由LC3免疫荧光测定（数据未显示）。我们还用ERK2-CA转染细胞，促进细胞ERK活性增加82倍(). 有趣的是，与瞬时表达相应ERK2-WT质粒的细胞相比，ERK2-CA或GFP-ERK2-CA的瞬时表达并未诱导GFP-LC3 puncta和LC3-II/β-actin比率进一步增加，这表明细胞ERK2活性增加四倍足以促进自噬().
ERK2的激活足以促进大细胞自噬和有丝分裂。（A） 在用GFP-LC3和载体、野生型ERK2、组成型活性ERK2（ERK2-CA）或激酶缺陷型ERK2（ERK2-KD）瞬时共转染的SH-SY5Y细胞中，每个细胞的GFP-LC3点的平均数量的定量。⊘：p<0.005 vs.矢量+：p<0.0001 vs.ERK2-WT）。条形图显示平均值±标准误差（每个条件分析25–30个细胞），代表3个以上的独立实验。补充图S5C和D表明MEK的药理抑制抑制ERK2-WT诱导的GFP-LC3点。（B） 转染GFP对照或所示ERK2 N端GFP融合构建物的SH-SY5Y细胞的代表性LC3-Western blot，并重新表达β-actin。柱状图显示了在同一Western blot上分析的每个转染条件的三个重复的LC3-II/β-actin比率（o:p<0.014 vs GFP，හ：p<0.05 vs.GFP-ERK2-WT）。（C） 瞬时共表达GFP-LC3和ERK2野生型或指示突变质粒载体的细胞的典型共焦显微镜图像。为了对线粒体进行成像，在共焦显微镜成像之前（比例尺：20μm），用MitoTracker Red（MTR）染料对细胞进行30分钟的染色。（D，左）使用Elk1转报告系统在表达不同形式ERK2的SH-SY5Y细胞中测量细胞内ERK活性。Elk-1荧光素酶报告质粒与所示ERK2质粒共转染，转染48小时后测定其活性。条形图显示了相对于载体控制（每种转染条件下4-8孔）的倍数增加平均值±s.e.m，是3个独立实验的代表。（⊗：p<0.0001 vs Vector，Ş：p<0.0001 vs ERK2-WT，ø：p<0.009 vs ERK2-WT）。（D，右）代表性条形图，显示在存在或不存在6-OHDA的情况下，表达所示质粒的细胞中GFP-LC3点与线粒体共定位的百分比。条形图显示平均值±s.e.m.（每个条件分析25–30个细胞），并代表至少3个独立实验（⊗：p<0.003 vs.矢量，：p<0.0005 vs.ERK2-WT，⊔：p<0.01 vs.ERK2-WT）。补充图S3结果表明，活性ERK或MEK的瞬时表达可将线粒体吞噬提升至与GFP-LC3/共定位和细胞线粒体含量损失测定的6-OHDA类似的水平。
为了确定ERK2激酶活性的重要性，我们使用了ERK2的K52R突变体（ERK2-KD），与野生型ERK2相比，其活性降低。未标记ERK2-KD或GFP-ERK2-WD的瞬时表达未能诱导自噬，这表明ERK2激酶活性的基础水平是其对自噬的影响所必需的(). 同样，MEK抑制剂U0126完全消除了ERK2-WT介导的自噬和有丝分裂，证实了ERK2诱导的自吞噬/有丝分裂需要激酶活性(图S5C和D).
在没有毒素损伤的情况下，ERK2的激活足以促进有丝分裂
与表达空载体的细胞相比，ERK2-WT的瞬时表达增加了GFP-LC3对线粒体的共定位(，右图），表明ERK2活性增加足以促进有丝分裂。向ERK2-WT表达细胞中添加6-OHDA仅显示出进一步增加的趋势，表明6-OHDA诱导的有丝分裂主要由ERK2激活介导(图S3A).
ERK2对有丝分裂的影响与使用LC3测量一般自噬相比，更紧密地依赖于细胞ERK2活性升高的程度，因为ERK2-CA的瞬时表达显著增加了GFP-LC3点与线粒体的共定位，甚至比ERK2-WT的表达更进一步(). 组成活性MEK2 S222D/S226D（MEK-CA）的瞬时表达将ERK-介导的Elk1活化报告活性提高了23倍，在基础条件下也增加了有丝分裂(图S3A). 另一方面，我们发现ERK2-KD突变消除了ERK2对有丝分裂的影响()MEK抑制剂U0126的给药也是如此(图S5D).
由于线粒体的自噬隔离似乎取决于ERK活性的程度，因此我们研究了不同ERK2结构对存在或不存在6-OHDA的线粒体含量的影响。基础条件下GFP-ERK2-CA瞬时表达诱导线粒体含量显著降低(图S3C). 与转染GFP的细胞相比，6-OHDA处理细胞导致GFP-ERK2-WT和GFP-ERK1-CA表达细胞的线粒体含量进一步降低，而GFP-ERK-KD阻断了6-OHDA诱导的线粒体丢失(图S3C). 总之，这些结果表明，ERK2的激活对于诱导线粒体的自噬隔离和降解是必要的和充分的。
6-OHDA诱导ERK2颗粒的形成，ERK2被溶酶体机制降解
为了探讨线粒体ERK2定位在调节有丝分裂中的潜在作用，我们构建了不同ERK2 plas-mids的GFP标记衍生物，以研究其亚细胞分布。
单个活细胞的共焦显微镜分析表明，GFP-ERK2-WT显示出混合的细胞质和细胞核分布，只有12%的细胞显示出完全的细胞质分布。然而，6-OHDA处理细胞4h后，含有GFP-ERK2-WT特异性细胞质定位的细胞比例增加，显示核定位的细胞数量减少(). GFP-ERK2-WT的瞬时表达导致细胞中不存在离散的GFP颗粒，仅瞬时表达GFP载体（数据未显示），其中一些与线粒体共定位，如共焦显微镜所示(). Western印迹分析证实了WT和突变体融合构建体的表达大致相等，并且使用泛ERK抗体的分析表明，与内源性ERK2相比，即使在校正了24%至29%的转染效率之后，标记的构建体也以低水平表达(;图S1A). 没有证据表明在存在或不存在6-OHDA的情况下存在显著的蛋白质聚集，因为GFP标记的蛋白质可以在Triton X-100可溶组分中进行解释，这可以通过两种独立的方法进行评估(图S1B和C).
GFP-ERK2表现出与线粒体的活性依赖性共定位。（A）量化表达GFP-ERK-WT的细胞百分比，证明在6-OHDA治疗的指定时间点ERK2的特定亚细胞分布。请注意，6-OHDA诱导GFP-ERK2-WT从细胞核到胞浆的时间依赖性再分配。分布条形图代表了至少3个独立实验。（B） 在有（右）或无（中）巴非霉素A的情况下，用载体对照（左）或6-OHDA处理4小时，瞬时表达ERK2所示N末端GFP融合结构的细胞的典型共聚焦图像。在共焦显微镜（标尺：20μm）成像前30分钟，用MitoTracker红染料装载细胞，对线粒体进行成像。在一些实验中，通过将细胞与mito-RFP和GFP-ERK2结构体共转染，可以观察到线粒体，产生类似的共定位结果（未显示）。白色箭头表示ERK2-GFP点状突起与线粒体共定位。请注意，6-OHDA（中上），而非载体控制（左上），会导致线粒体断裂和丢失。ERK2-KD的表达减少了线粒体的丢失，但没有减少碎片（中下部）。补充图S1B和C显示6-OHDA不会诱导triton不溶性GFP或GFP-ERK2的任何增加，并且与SDS样品缓冲液相比，triton X-100可溶解相当水平的GFP-ERK-WT和-CA，这表明没有发生聚集。（C）转染GFP或ERK2的N末端GFP融合构建物的细胞的代表性Western blot，以及GFP和总ERK1/2的免疫印迹。箭头指向与GFP-ERK2结构相对应的免疫反应带，其中预测分子量为73kDa。在所有实验中，所有四种含GFP质粒的转染效率约为25%(补充图S1A). （D） 量化用GFP瞬时转染的未经处理或6-OHDA处理的SH-SY5Y细胞中每个细胞GFP-ERK2颗粒的平均数量，作为对照或ERK2的指示GFP融合构建物。汇总条形图平均数为3–7个实验的±s.e.m.，每个实验有25–30个细胞（与未经处理的GFP相比，p<0.05；与未经治疗的GFP-ERK2-WT相比，p<0.01；与经6-OHDA处理的GFP-ERK2-XT相比，p<0.05）。（E） GFP-ERK2颗粒在6-OHDA存在或不存在的情况下显示线粒体共定位的百分比的汇总定量（平均值±标准误差，n=3-7个实验，每个实验25-30个细胞；o:p<0.05 vs.GFP，：p<0.005 vs.未经处理的GFP-ERK1-WT，Φ：p<0.05vs.未处理的GFP-ERK2-WT）。补充图S4表明不同质粒对MPP的反应相同+、和补充图S5A和B表明ERK2-WT的MEK激活是GFP-ERK2-XT颗粒数量增加和线粒体共定位所必需的。（F） 在有或无巴非霉素A的情况下，GFP-ERK2颗粒与线粒体共定位的百分比的简要量化（n的平均值±s.e.m.=3–7个实验，每个实验25–30个细胞；o:p<0.02与未经治疗的GFP，⊗：p<0.01与未经处理的GFP-ERK-WT，\8855；p<0.05与GFP-ERK1-WT与巴非霉素A）。补充图S2表明，在6-OHDA存在下，巴非霉素A也显著增加GFP-ERK2颗粒的数量和线粒体共定位。
用6-OHDA处理GFP-ERK2-WT转染细胞4h后，每个细胞中GFP-ERK1-WT颗粒的数量和线粒体定位都显著增加(). MPP治疗+另一种产生线粒体氧化应激的PD毒素也给出了类似的结果(图S4). 此外，GFP-ERK2颗粒的线粒体定位依赖于ERK活性水平，因为与GFP-ERK 2-WT转染细胞相比，GFP-ERK2-CA的瞬时表达促进了颗粒的平均数量和线粒体定位的显著增加，而GFP-ERK2-KD或U0126对MEK的药理抑制阻断了这些作用(;图S5A和B)无论是否有6-OHDA。
这些结果表明，ERK2形成活性依赖的细胞质颗粒，并通过自噬降解。事实上，在存在或不存在6-OHDA的情况下，抑制自噬体融合/降解导致GFP-ERK2-WT颗粒水平显著增加(图S2A)表明6-OHDA处理或CA突变诱导的ERK2颗粒通过自噬溶酶体机制降解。
与ERK2颗粒共定位的线粒体发生自噬降解
我们以前曾报道过内源性ERK1/2颗粒与PD脑组织变性神经元中的线粒体、AV、胞内丝和少量早期内体共定位。26此外，位于异常线粒体的ERK1/2颗粒被AVs吞噬，增加了与ERK2颗粒相关的线粒体进行自噬隔离和降解的可能性。26为了解决这个问题，我们用巴非霉素A处理瞬时表达ERK2 GFP融合结构的细胞，并分析其对GFP-ERK2点状数和线粒体共定位的影响，作为通量的测量。43与未经处理的细胞相比，用bafilmycin-A抑制融合/降解显著增加瞬时表达GFP-ERK2-WT细胞中的线粒体/GFP-ERK2共定位颗粒，而bafilmicin-A处理对瞬时表达GFP的细胞没有影响(). 使用溶酶体降解的第二个独立抑制剂E64-D也观察到线粒体/GFP-ERK2共定位增加（数据未显示）。我们还发现，与单独使用6-OHDA处理的细胞相比，6-OHDA和巴非霉素A共同处理细胞4小时足以进一步提高表达GFP-ERK2-WT或GFP-ERK1-CA的细胞中GFP-ERK颗粒的数量和线粒体共定位时间(图S2A和B). 因此，在6-OHDA处理的细胞中，线粒体/GFP-ERK2共定位颗粒通过类似机制被清除。
有趣的是，虽然6-OHDA处理GFP-ERK2-WT表达细胞进一步增加了ERK2-mitochondria共定位颗粒的数量，但GFP-ERK-CA单独诱导的颗粒数量与ERK2-XT和毒素联合诱导的颗粒数相等()表明6-OHDA介导的ERK激活是6-OHDA诱导有丝分裂的主要机制。自相矛盾的是，在GFP-ERK2-CA表达细胞中添加6-OHDA导致GFP-ERK-CA颗粒百分比下降，这一趋势并不显著，表明线粒体共定位()但对每个细胞中GFP-ERK2-CA颗粒的平均数量没有影响(). 一种可能性是组成型活性ERK2和6-OHDA的组合导致ERK2线粒体共定位颗粒的更有效降解。事实上，ERK2-CA表达子与6-OHDA和bafilomycin-A联合治疗可恢复线粒体共定位水平（数据未显示）。类似地，与无毒素的MEK-CA相比，在6-OHDA存在下用MEK-CA转染也显示GFP-LC3与线粒体的共定位减少，并且添加巴非霉素A可以逆转这种下降(图S3B)这表明组成活性激酶和6-OHDA的结合增强了丝裂原吞噬清除。
GFP-ERK2颗粒与线粒体、溶酶体和自噬体共定位
随着与线粒体相关的ERK2颗粒发生自噬降解，我们想确定GFP-ERK2是否也与AV和溶酶体（自噬体轴的两个组成部分）共定位。通过共焦显微镜分析转染不同GFP-ERK结构两天的细胞ERK2与线粒体和溶酶体的共定位。在基础条件下，GFP-ERK2点刺与樱桃-LC3点刺共定位观察到，一部分ERK2颗粒与AVs相关(). 这并不是由于非特异性GFP聚集，因为表达GFP的细胞主要表现为樱桃-LC3的弥散分布。相反，野生型ERK2（RFP-ERK2）的N末端RFP融合的瞬时转染证明RFP-ERK1颗粒与GFP-LC3的部分共定位()或内源性LC3点().
GFP-ERK2颗粒与自噬体和溶酶体共定位。（A） 6-OHDA处理的细胞瞬时共表达GFP载体或GFP-ERK2和LC3（Cherry-LC3）的N端RFP融合的代表性共聚焦切片，或（B）共表达ERK2（RFP-ERK3）和GFP-LC3的N端REP融合，或（C）表达RFP-ERK2，并通过免疫荧光用蓝色细胞核复染物（比例尺：20μm）对内源性LC3进行染色。箭头指向LC3点状物与ERK2颗粒共定位。（D） LysoTracker Red（LTR）染色细胞的代表性共聚焦切片，表达GFP载体控制或ERK2的N末端GFP融合结构（比例尺：20μm）。箭头指向GFP-ERK2颗粒与溶酶体共定位（E）GFP-ERK1颗粒与每个细胞溶酶体同定位百分比的汇总量化（每个细胞25-30个细胞的n=3-5次实验的平均值±标准偏差；豗：与GFP相比p<0.05，与GFP-ERK-WT相比p<0.05。（F）每个细胞溶酶体平均数量的汇总量化（平均值±标准偏差，n=3-5个实验，每个实验25-30个细胞；o:与GFP相比p<0.05，与GFP-ERK2-WT相比p<0.05）。
共聚焦显微镜分析还显示，在瞬时表达GFP-ERK2-WT的细胞中，ERK2颗粒与溶酶体共定位的一部分。ERK2活性的低水平增加足以诱导ERK2粒与溶酶体共定位，因为GFP-ERK1-CA没有引起共定位的进一步增加(). 然而，ERK2活性的一些基础水平对于GFP-ERK2颗粒与溶酶体的共定位是必要的，因为GFP-ERK-KD的瞬时表达与GFP单独转染的共定位水平相似(). 溶酶体扩张是真核生物大自噬上调的另一个指标。44与瞬时表达GFP或GFP-ERK2-KD的细胞相比，瞬时表达GFP-ERK 2-WT或GFP-ERK 2-CA的细胞增加了每个细胞的平均溶酶体数量().
持续激活ERK2促进自噬应激
鉴于ERK2活性形式的瞬时表达不仅促进了有丝分裂，而且还促进了大细胞自噬，这两者都是6-OHDA毒性的主要特征()，我们假设持续ERK2激活介导的持续自噬细胞应激对细胞有害。隔夜暴露于载体或6-OHDA（85μM）后，测定用碘化丙啶（PI）标记作为细胞死亡标记物的GFP转染细胞的百分比。与转染GFP控制质粒的细胞相比，GFP-ERK2-WT的瞬时表达显著增加了基础和6-OHDA诱导的细胞死亡(). 有趣的是，GFP-ERK2-CA的瞬时表达增强了基底细胞的死亡，其水平与GFP-ERK1-WT和6-OHDA联合暴露的水平相当，这表明毒素处理或突变诱导的ERK2持续激活对细胞有毒(). 毫不奇怪，GFP-ERK2-KD对内源性ERK活性具有显著抑制作用，38与单独表达GFP的细胞相比，细胞死亡也增加，这表明ERK2活性的基础水平是生存所必需的。另一方面，ERK2活性有助于6-OHDA诱导的细胞死亡，因为与GFP-ERK-WT转染细胞相比，GFP-ERK2-KD的表达对6-OHDA具有部分但显著的保护作用()与之前使用MEK抑制剂的研究一致。34MPP也报道了基础ERK激活与损伤诱导ERK激活的双重作用+毒性。47
ERK2表达诱导的自噬细胞应激促进基础性和6-OHDA诱导的细胞死亡。通过量化GFP阳性细胞在每个外荧光显微照片场中对碘化丙啶（PI）的渗透性，对暂时表达GFP的细胞作为对照或ERK2的N末端GFP融合构建物进行细胞死亡分析。代表性条形图显示平均值±s.e.m.（根据从7-10个随机显微镜场采集的条件分析150–200个细胞），并代表至少3个独立实验（o:p<0.005 vs.GFP，⊗：p<0.001 vs.未处理的GFP-ERK2-WT，≥：p<0.05 vs.带有6-OHDA的GFP，Φ：p<0.05 vs.带有6-OHDA的GRP-ERK2-WT）。
讨论
ERK1/2与包括分化、可塑性和存活在内的关键神经元功能有关。另一方面，ERK1/2持续激活在一些中枢神经系统疾病中起着有害作用。24在PD和路易体痴呆患者中观察到ERK磷酸化25，癫痫48、阿尔茨海默病49,50以及患者和大鼠模型中缺血性中风的半影区。51-53在6-OHDA和MPP中也观察到ERK激活+帕金森病损伤模型和药物MEK抑制剂对几种神经细胞系和初级中脑多巴胺能神经元具有神经保护作用29,34,47(图S6).
ERK1/2信号传导对神经元存活的不同影响可能是由ERK1/2活性的亚细胞区隔化以及下游靶点的改变所解释的。24早期短暂ERK1/2激活伴核移位与神经元存活增强有关，21,22,54,55而没有核定位证据的细胞质ERK1/2是阿尔茨海默病退化神经元的典型特征，50以及在PD和相关模型中。25,35虽然无法从人类尸检研究中判断ERK1/2是调节线粒体周转还是被动定位于线粒体和AV，但目前的研究表明，ERK2对线粒体的活性依赖性定位足以诱导线粒体吞噬。此外，显性干扰ERK2-KD表达和MEK抑制剂U0126阻止ERK2颗粒与线粒体的生成和共定位，抑制6-OHDA诱导的有丝分裂(;图S5). ERK2颗粒的亚群也与自噬体和溶酶体标记进行了colo-calize()和巴非霉素实验表明，ERK2颗粒在这些隔室中随着线粒体的共定位而降解(和图S2). 这些数据支持线粒体ERK2活性升高诱导有丝分裂的模型，并表明ERK2信号持续失调导致自噬/有丝分裂应激().
示意图描述了ERK2在介导自噬细胞应激中的拟议作用。PD毒素6-OHDA诱导胞质和线粒体ROS，诱导ERK2的强大磷酸化，并形成与线粒体、AVs和溶酶体共定位的ERK2颗粒（红色椭圆形）。氧化应激或激活突变诱导的ERK2持续激活促进自噬和有丝分裂，导致自噬细胞应激和神经退化。尽管通过毒素或实验性突变持续激活ERK2会导致ERK2颗粒的溶酶体共定位和溶酶体扩张，但需要更多证据来确定ERK2是否也可能直接靶向溶酶体，以及该信号可能发挥的作用（阴影箭头）。
激活的ERK2在线粒体中富集的机制尚不清楚。虽然线粒体活性氧物种参与ERK1/2的氧化还原激活，表明原位磷酸化的作用，35,56GFP-ERK2数据支持线粒体易位的机制。鉴于磷酸化ERK仅占细胞总ERK的百分之几，57用标准的生化分离方法可能无法检测到这种成分向线粒体亚群的转运。因此，这两种机制可能都有助于改变活化ERK1/2的分布，类似于单个蛋白质穿梭进出的核移位，增强活化亚群的核保留。58
除了与自噬细胞线粒体货物一起携带到溶酶体外，ERK1/2还被报道与非神经元细胞中的溶酶体支架蛋白结合。59MEK1中的C末端截断被提议用于揭开一个隐匿的溶酶体靶向信号，导致溶酶体MEK/ERK信号传导，并降低Hela细胞的活性。60因此，ERK2可能通过诱导或延迟溶酶体成熟的多种机制促进自噬应激，这与致癌物林丹有关。61然而，在其他系统中，一些证据表明ERK促进而不是抑制溶酶体降解。在结肠癌细胞中，ERK活性对于饥饿诱导的细胞固存和降解的增加是必要的[14C] 缬氨酸标记的长寿蛋白质。62在MPP中+通过EM、免疫荧光和western blot分析评估MEK/ERK信号通路的抑制阻断毒素诱导的线粒体降解。29在6-OHDA处理的细胞中，抑制自噬诱导或溶酶体融合/降解可显著恢复细胞线粒体含量，如对几种线粒体蛋白的抗体所检测到的那样(). 虽然我们不能完全排除6-OHDA也可能通过氧化损伤等其他机制降低线粒体蛋白免疫反应性的可能性，但GFP-ERK2 bafilomycin研究表明ERK2共定位颗粒的溶酶体有效降解(和图S2B). 在帕金森病神经退行性变期间，ERK是否直接靶向溶酶体，以及ERK活性对溶酶体功能的潜在影响，尚待发现。
ERK2调节有丝分裂和大自噬的机制是什么？值得注意的是，ERK2定位于线粒体及其刺激线粒体-LC3共定位的能力高度依赖于ERK2活性增加的程度，ERK-CA结构表现出比ERK-WT更大的作用(,). 相反，转染ERK2-WT后ERK总活性的适度增加足以促进大细胞自噬，LC3-II移位、LC3点状细胞数和溶酶体扩张证明了这一点，CA突变不会进一步增加(;). ERK活性对于一般的大细胞吞噬和有丝分裂都是必需的，因为GFP-ERK2-KD的瞬时转染不能增加基础自噬，同时抑制6-OHDA诱导的自噬；MEK抑制剂U0126可以减少毒素和ERK2过度表达诱导的大细胞自噬和有丝吞噬(,,;图S5C和D). ERK激活促进自噬或有丝分裂的确切机制尚待发现，可能包括蛋白质靶点的磷酸化或构象或结合伙伴的激活相关改变。无论哪种情况，ERK1/2的激活都是必要的，足以诱导大自噬、线粒体定位和有丝分裂。
未来的研究需要确定线粒体定位ERK信号是否在线粒体损伤和功能障碍的上游或下游发挥作用。MEK的药物抑制和GFP-ERK2-KD的瞬时表达都不能保护6-OHDA诱导的线粒体断裂和肿胀(; GFP-ERK2-KD/6-OHDA vs。MEK抑制剂也不能减少6-OHDA诱导的线粒体超氧化物生成35或急性MPP的线粒体肿胀+模型。29因此，我们假设线粒体ERK活性的增加可能作为线粒体损伤的传感器来启动线粒体自噬。鉴于线粒体驱动的ERK信号可以促进肾细胞线粒体功能障碍和呼吸减少，63然而，在其他情况下，ERK信号也可能促进线粒体损伤。
有趣的是，我们的数据表明，ERK2颗粒定位于线粒体在增加线粒体-LC3共定位方面比诱导LC3脂质氧化的一般性措施方面发挥更重要的作用。由于线粒体ROS的产生与线粒体ERK的激活在时间上相关，35抗氧化剂可以阻止6-OHDA介导的ERK激活，25,35,56触发损伤诱导的有丝分裂的候选信号包括线粒体蛋白质或脂质的氧化，64线粒体膜电位降低65,66和/或改变线粒体上的磷酸化靶点。18
神经元特别容易受到自噬应激的影响，4,16以及促进自噬应激的因素导致AV和溶酶体异常积聚。18,67由于线粒体功能障碍在PD发病机制中起着重要作用，68,69ROS介导的线粒体吞噬最初可能代表对“隔离”受损线粒体的适应性反应。然而，过度的线粒体自噬可能导致神经元死亡。70自噬诱导的神经炎重塑也有望发挥生理作用71和病理作用，如在PD的突变富含亮氨酸重复激酶2模型中观察到的。23在PD的毒素和遗传模型中，ERK1/2在调节自噬应激中起着关键作用(). 了解激活的ERK1/2调节自噬和线粒体稳态的机制将为PD和其他神经疾病提供重要的见解。特别是，识别触发ERK1/2依赖性有丝分裂的线粒体信号可能有助于开发未来的治疗方法，以对抗PD中有害水平的有丝分裂应激。16
材料和方法
DNA构建物
野生型ERK2，具有双激活突变L73P和S151D的匹配组成活性（CA）质粒36pCMV5.0中的激酶缺陷（KD）ERK2（K52R）突变来自Natalie Ahn（科罗拉多大学博尔德分校）。pEGFP-C1中ERK2-WT的构造，37由Rony Seger（魏茨曼科学研究所）提供。为了产生具有组成活性的GFP标记ERK2（GFP-ERK2-CA），将pCMV5-ERK2的BamHI-ApaI片段（L73P，S151D）和一个新的SspI位点亚克隆到GFP-ERK1-WT的相应位点。筛选新的SspI位点的集落，并对SspI阳性集落进行测序，以确认突变的引入。为了产生激酶缺陷型GFP标记的ERK2（GFP-ERK2-KD）、pCEP4-ERK2（K52R），这是梅兰妮·科布（德克萨斯大学西南分校，达拉斯，德克萨斯州）的礼物，38用BamHI-ApaI消化并亚克隆到GFP-ERK2-CA中的相应位点。对克隆进行SspI位点缺失的筛选并测序，以确认引入了激酶死亡（KD）突变。为了生成pCMV5.0空载体，通过EcoRI和XbaI消化去除pCMV4.0中ERK2-CA的DNA插入编码。用DNA聚合酶I的Klenow片段（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）处理后，对空载体进行凝胶纯化和重新鉴定。
这些研究中使用的其他DNA质粒包括Scott T.Eblen（南卡罗来纳州查尔斯顿的南卡罗来纳医科大学）的pCDNA3.1中的FLAG标记的野生型ERK2、由Yongjian Liu博士（宾夕法尼亚州匹兹堡大学）提供的未标记的RFP，人类细胞色素氧化酶亚单位VIII的线粒体靶向序列融合到来自Ian Reynolds（宾夕法尼亚州西点军校默克研究实验室）的RFP（Mito-RFP）的N末端，来自Robert Lefkowitz（北卡罗来纳州达勒姆杜克大学）的RFP-ERK2，来自Jayanta Debnath博士（加利福尼亚大学旧金山分校）的樱桃-LC3和LC3融合到来自Tamotsu Yoshimori（日本国家遗传学研究所）的红色（RFP-LC3）或绿色（GFP-LCD）荧光蛋白。成分活性MEK2（S222D/S226D）购自纽约普莱西德湖上游生物技术公司。
组织培养
SH-SY5Y细胞系（马里兰州罗克维尔美国型培养物收集中心）是一种表达酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺转运体的人神经母细胞瘤细胞系，保存在无抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基中（马里兰州沃克维尔BioWhittaker）在37°C下补充10%胎牛血清（Gibco/Invitrogen，Carlsbad，California）、15 mmol/L HEPES和2 mmol/L-谷氨酰胺（BioWhittaker）。SH-SY5Y细胞是含有5%CO的增湿培养箱2用dH处理2LD（密苏里州圣路易斯市西格玛）的O（载体）或新溶解的6-羟基多巴胺浓度（85μM）50我们使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四氮唑内盐（MTS）分析（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）在18小时或更高剂量（120μM）下测定该细胞系。一些培养物也接受培养基对照，1-甲基-4-苯基吡啶鎓（MPP+)在2.5 mM（密苏里州圣路易斯Sigma）下，MAPK/ERK激酶（MEK）抑制剂U0126（10μM；马萨诸塞州贝弗利Cell Signaling）或bafi-lomycin-A（10 nM，加利福尼亚州圣地亚哥Calbiochem）通过影响融合和/或溶酶体酸化抑制自溶体降解。39,40
GFP-LC3稳定细胞系的建立
将浓度为20%至30%的SH-SY5Y细胞与moloney小鼠白血病病毒（MoMLV）颗粒转导，该颗粒带有水泡状气孔病毒G（VSV-G）蛋白的假型，并用含有编码LC3（GFP-LC3）N端GFP融合的cDNA的puro-BABE载体包装。在转导时，使用含有8 ug/ml聚brene（溴化六甲菊酯，Sigma）的条件培养基将MoMLV颗粒稀释至所需的MOI。转导后24小时，在含有2μg/ml嘌呤霉素的培养基中选择表达GFP-LC3的细胞3天，然后在常规培养基中恢复。扩增GFP-LC3株系并接种在较大的组织培养板中，测试GFP-LC2的正确表达和自噬反应性。
透射电子显微镜
用PBS冲洗在6孔组织培养皿中生长的细胞，并在4°C的2.5%戊二醛中固定过夜，然后按照前面所述进行处理29用于在JEOL JEM 1210透射电子显微镜上成像。
脂质体介导的转染
使用LipofectAMINE 2000（Invitrogen）将上述DNA质粒转染SH-SY5Y细胞。对于在2孔室盖玻片或12孔板中生长的细胞，将在OPTIMEM中稀释的1μg DNA与最终浓度为0.10%的脂质体混合。这些转染条件不会诱导LC3凝胶移位或GFP-LC3点。
共焦显微镜
转染后两天，用100 nM的MitoTracker Red染料580或LysoTracker Red DND-99（俄勒冈州尤金市分子探针）对细胞进行染色，以分别分析GFP-ERK2与线粒体和溶酶体的共定位，或GFP-LC3与线粒体的共定位以衡量有丝分裂。在一些实验中，用载体控制或6-羟基多巴胺处理细胞以诱导损伤，并使用FluoView 1000激光扫描共聚焦显微镜对活细胞成像。
免疫荧光显微镜
为了计数细胞内的内源性AV，用GFP载体和未标记ERK2构建物共转染的SH-SY5Y细胞在四个有良好腔室的盖玻片（Nunc）中清洗一次，用3.7%多聚甲醛和0.1%Triton X-100/PBS固定，然后在5%正常驴血清中封闭至少35分钟，然后用兔抗LC3（1:2000）染色41在4°C下过夜。为了分析6-OHDA对线粒体驱动的影响，将细胞与小鼠抗线粒体抗原60KD（克隆113-1；1:100；BioGenex，San Ramon，California）在4°C下孵育过夜。然后在PBS中清洗细胞3-5次，每次清洗5分钟，然后用Alexa 568结合驴抗兔抗体（俄勒冈州尤金的分子探针）或Cy3-结合驴抗鼠抗体（1:400；宾夕法尼亚州西格罗夫的Jackson Immuno-Research Laboratories）孵育。用1.25μg/ml DAPI对细胞进行复染，以显示细胞核，并使用配备FITC和罗丹明特异性滤光片、激发波长/发射滤光片（分别为490 nm/520 nm；541 nm/572 nm）的IDX71奥林巴斯荧光显微镜（奥林巴斯美国公司，纽约梅尔维尔）对LC3点和线粒体形态进行成像。
线粒体分离试验
如前所述，使用培养细胞分离试剂盒（Pierce）从SH-SY5Y细胞中分离线粒体。35
Western Blot分析和密度测定
处理后，用PBS清洗细胞，在0.1%Triton X-100和蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物中溶解，并按照考马斯加蛋白质测定法（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）测定30μg蛋白质负载量，通过5%至15%的梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳。为了连续提取洗涤剂，通过在SDS负载缓冲液（4.0%SDS、40%甘油、0.33M丙二醇缓冲液、0.1%溴酚蓝）中孵育，然后使用60声波消除器（Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts）超声处理10分钟，进一步提取Triton X-100颗粒。在其他实验中，细胞直接在SDS加载缓冲液中溶解。如前所述，将蛋白质带转移到Immobilon-PDVF膜（Millipore，Bedford，Massachusetts）。29在PBST（20 mmol/L磷酸钾和150 mmol/L.氯化钾，pH 7.4，含0.3%（w/v）吐温20）中混合的5%非脂肪干乳中封闭膜1小时，并通过在兔抗MAP-LC3（1:4000）中4℃培养膜过夜来探测内源性LC3、转染GFP或ERK1/2，41兔抗GFP多克隆抗体（1:1000）（Invitrogen，Carlsbad，California）、小鼠抗磷酸-ERK1/2（在磷酸盐缓冲盐水/Tween 20中1:1000；细胞信号传导）或兔抗总ERK1/2（1:30000，Upstate Biotechnology，Lake Placid，New York）然后用辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠或兔IgG（Amersham，Piscataway，NJ）以（1:5000）稀释培养。对于线粒体制剂，还使用乳酸脱氢酶抗体（加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）、110 kDa的人线粒体抗原（MITO-P110）（1:500，马萨诸塞州波士顿癌基因公司）和超氧化物歧化酶2（1:100，SOD2）（纽约州普莱西德湖Upstate Biotechnology公司）进行免疫印迹检测确认上述制剂的纯度。35使用ECL检测试剂盒（新泽西州皮斯卡塔韦市阿默沙姆）检测免疫反应性。在PBST清洗之前，使用10%SDS、甘氨酸、pH 2.0剥离膜30分钟，然后用小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体（Sigma；1:10000）孵育。使用NIH Image J软件（美国NIH）进行密度测定。
ERK信号报告分析
使用PathDetect Elk1转报告系统（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）测量ERK2不同结构对细胞内ERK活性水平的影响。简言之，将培养在24孔板上的细胞转染0.25μg/孔pCMV5.0载体中的空载体、野生型和突变ERK2 cDNA，并将组分活性MEK1（MEK-CA）作为对照，并与0.25μg/m孔Elk-1特异性融合反激活质粒的鸡尾酒混合物（比例20:1）共转染，其由与酵母转录激活剂GAL4的DNA结合结构域融合的Elk-1转录因子的激活结构域和表达萤火虫（萤火虫）荧光素酶基因由含有酵母GAL4结合位点的启动子调节。这些结构物测量活细胞中Elk-1依赖ERK的磷酸化和反式激活，从而驱动荧光素酶的表达。转染后两天，制备细胞并测量荧光素酶活性，如所述，并进行一些修改。27简言之，用高糖磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，然后在哺乳动物被动裂解缓冲液中轻轻搅拌20分钟。在20000 x g的条件下对细胞裂解液进行微离心15分钟，并在Lumat LB9507光度计中监测20μl细胞裂解液发出的光20 s。
细胞死亡分析
将瞬时转染的SH-SY5Y细胞接种在24孔板上48小时，然后用LD50剂量的6-羟基多巴胺（85μM）暴露以诱导细胞损伤。用最终浓度为（1μg/ml）的碘化丙啶（PI）（俄勒冈州尤金的分子探针）对细胞进行染色，并在37°C下培养5-10分钟，从而量化细胞死亡。细胞在PBS中清洗两次，并使用装有FITC和罗丹明滤光片的倒置奥林巴斯IDX71显微镜立即成像GFP和PI特异荧光。使用MicroSuite软件的内置宏功能，将绿色和红色通道组装并合并为RGB图像。将合并图像随机分组，并根据实验条件对与PI染色共定位的GFP转染细胞的百分比进行盲目评分。
RNA干扰（RNAi）
使用已发布序列（5-GCCAGGGGUUUUGGAUCAA-3用于Atg7，5-GAAGGCUUACAGCUACAA-3用于LC3）对人类Atg蛋白的小干扰RNA（siRNA）23,29由Invitrogen（德克萨斯州奥斯汀）合成。转染的功效、Atg蛋白的敲除以及对诱导自噬的抑制作用已经在我们的实验室得到了验证。23,29简而言之，在用6-OHDA处理细胞5小时之前，细胞在30%的浓度下与40 nmol/L LC3、20 nmol/L-Atg7 siRNA或siControl非靶向（加扰）siRNA池（科罗拉多州拉斐特市达马孔）进行转基因。
量化GFP-LC3点和线粒体面积的数量和大小
使用包含插件的自定义ImageJ宏，处理以至少40倍放大率拍摄的RGB图像，以对每个细胞的GFP-LC3点进行算法量化。（Chu等人，《神经突和神经退化中的自噬：体外和体内模型》。酶学方法：自噬，按）。简而言之，提取RGB图像的绿色通道，并通过自动阈值化将其转换为二值（灰度）图像，并使用软件的“分析粒子”功能分析GFP-LC3颗粒的数量和大小（半径=sqrt（面积/π））。宏观辅助算法被设置为测量大于背景像素但小于平均核尺寸的所有粒子尺寸。含有凋亡细胞核或坏死细胞体的细胞被排除在分析之外。
为了测量细胞线粒体面积，使用另一个自定义Image J宏处理RGB图像，该宏使用“Analyze particles”功能的轮廓算法计算感兴趣细胞中线粒体颗粒所占的总面积。宏然后使用以下公式计算线粒体占据的细胞面积百分比：（线粒体总面积/细胞面积）x 100）。
统计
除非另有说明，否则结果表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。使用Student t检验进行两组比较(网址：www.graphpad.com). 采用单向方差分析和Fisher LSD进行多组比较。p<0.05的值被定义为具有统计学意义。
致谢
我们感谢西蒙·沃特金斯（Simon Watkins）和匹兹堡大学生物成像中心（CBI）在实时共焦成像和EM成像方面的技术专长，感谢克里斯托弗·冯（Christopher Fung）构建稳定的GFP-LC3细胞系，感谢夏洛特·迪格斯（Charlotte Diges）提供技术援助，以及方法部分列出的提供分子试剂的所有研究人员。这项研究得到了国家卫生研究院（AG026389和DC009120，CTC）和退伍军人管理局高级职业发展奖（SMK）的资助。RKD部分由T32 NS07495和F32 AG030821支持。
参考文献
1道森TM，道森VL。帕金森病神经变性的分子途径。科学。2003;302:819–22.[公共医学][谷歌学者] 2Ventruti A，Cuervo AM。自噬和神经变性。当前神经科学代表。2007;7:443–51.[公共医学][谷歌学者] 三。Tanida I、Ueno T、Kominami E.LC3接合系统在哺乳动物自噬中的作用。国际生物化学与细胞生物学杂志。2004;36:2503–18. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Mizushima N、Ohsumi Y、Yoshimori T.哺乳动物细胞中的自噬体形成。细胞结构功能。2002;27：421–9。[公共医学][谷歌学者] 6Kabeya Y、Mizushima N、Ueno T、Yamamoto A、Kirisako T、Noda T、Kominami E、Ohsumi Y、Yoshimori T。LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜。Embo J。2000;19:5720–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Nair U，Klonsky DJ。酵母中特异性和非特异性自噬途径的分子机制和调节。生物化学杂志。2005;280:41785–8.[公共医学][谷歌学者] 8Kissova I、Deffieu M、Manon S、Camougrand N.Uth1p参与线粒体的自噬降解。生物化学杂志。2004;279:39068–74.[公共医学][谷歌学者] 9Hara T、Nakamura K、Matsui M、Yamamoto A、Nakahara Y、Suzuki-Migishima R、Yokoyama M、Mishima K、Saito I、Okano H、Mizushima N。抑制神经细胞中的基础自噬会导致小鼠的神经退行性疾病。自然。2006;441:885–9.[公共医学][谷歌学者] 10Rideout HJ，Lang-Rollin I，Stefanis L.大自噬参与神经元内含物溶解。国际生物化学与细胞生物学杂志。2004;36:2551–62.[公共医学][谷歌学者] 11Qin ZH，Wang Y，Kegel KB，Kazantsev A，Apostol BL，Thompson LM，Yoder J，Aronin N，DiFiglia M.自噬调节氨基末端亨廷顿蛋白片段的加工。人类分子遗传学。2003;12:3231–44.[公共医学][谷歌学者] 12Ravikumar B、Vacher C、Berger Z、Davies JE、Luo S、Oroz LG、Scaravilli F、Easton DF、Duden R、O'Kane CJ、Rubinsztein DC。在亨廷顿病的苍蝇和小鼠模型中，抑制mTOR可诱导自噬并降低聚谷氨酰胺扩增的毒性。自然遗传学。2004;36:585–95.[公共医学][谷歌学者] 13Zhang Y，Qi H，Taylor R，Xu W，Liu LF，Jin S.自噬在线粒体维持中的作用：自噬缺陷酿酒酵母菌株线粒体功能的表征。自噬。2007;三:337–46.[公共医学][谷歌学者] 14Jennings JJ，Jr，Zhu JH，Rbaibi Y，Luo X，Chu CT，Kiselyov K。IV型粘脂蛋白病的线粒体畸变。生物化学杂志。2006[公共医学][谷歌学者] 15Komatsu M，Wang QJ，Holstein GR，Friedrich VL，Jr，Iwata J，Kominami E，Chait BT，Tanaka K，Yue Z。自噬蛋白Atg7在维持轴突稳态和预防轴突变性中的重要作用。美国国家科学院程序。2007;104:14489–94. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Cherra S，III，Chu CT。神经保护和神经变性中的自噬：平衡问题。未来神经学。2008;三:309–23. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Tolkovsky AM，Xue L，Fletcher GC，Borutate V.细胞线粒体消失：自噬在程序性细胞死亡和疾病中的作用线索？生物化学。2002;84:233–40.[公共医学][谷歌学者] 18Chu-CT，Zhu J，Dagda R.Beclin 1损伤诱导的线粒体自噬和自噬应激的独立途径：对神经退行性变和细胞死亡的影响。自噬。2007;三:663–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Kang C，You YJ，Avery L.自噬在肿瘤生存中的双重作用秀丽隐杆线虫在饥饿期间。基因发育。2007;21:2161–71. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Trifilieff P、Calandreau L、Herry C、Mons N、Micheau J.海马和杏仁核中的双相ERK1/2激活可能揭示了背景恐惧记忆的系统巩固。神经生物学学习记忆。2007;88:424–34.[公共医学][谷歌学者] 21Lu Z，Xu S.ERK1/2 MAP激酶与细胞存活和凋亡。IUBMB寿命。2006;58:621–31.[公共医学][谷歌学者] 22Hetman M，Gozdz A.细胞外信号调节激酶1和2在神经元存活中的作用。欧洲生物化学杂志。2004;271:2050–5.[公共医学][谷歌学者] 23Plowey ED，Cherra SJ，3rd，Liu YJ，Chu CT.自噬在分化SH-SY5Y细胞G2019S-LRRK2-相关轴突缩短中的作用。神经化学杂志。2008 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Chu CT、Levinthal DJ、Kulich SM、Chalovich EM、DeFranco DB。氧化性神经元损伤。ERK1/2的黑暗面。欧洲生物化学杂志。2004;271:2060–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25朱建华，库利希·SM，欧里·TD，楚·CT。路易体疾病中磷酸化细胞外信号调节激酶的细胞质聚集体。《美国病理学杂志》。2002;161:2087–98. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26朱建华，郭凤，谢尔本J，沃特金斯S，楚CT.磷酸化ERK/MAP激酶在路易体病线粒体和自噬体中的定位。脑病理学。2003;13:473–81. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Chalovich EM，Zhu JH，Caltagarone J，Bowser R，Chu CT。6-羟多巴胺处理神经元细胞中cAMP反应元件的功能性抑制。生物化学杂志。2006;281:17870–81. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Chu CT、Plowey ED、Wang Y、Patel V、Jordan-Sciutto KL。位置、位置、位置：神经变性中转录因子贩运的改变。神经病理学实验神经学杂志。2007;66:873–83. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Zhu JH，Horbinski C，Guo F，Watkins S，Uchiyama Y，Chu CT.1-甲基-4-苯基吡啶诱导细胞死亡过程中细胞外信号调节蛋白激酶对自噬的调节。《美国病理学杂志》。2007;170：75–86。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Przedborski S，Jackson-Lewis V.MPTP毒性机制。运动障碍。1998;13:35–8.[公共医学][谷歌学者] 31Beal MF。帕金森病的实验模型。自然评论神经科学。2001;2:325–34.[公共医学][谷歌学者] 32Segura Aguilar J，Kostrzewa RM。与神经退化有关的神经毒素和神经毒素物种。神经毒素研究。2004;6:615–30.[公共医学][谷歌学者] 33Callio J，Oury TD，Chu CT。锰超氧化物歧化酶保护小鼠大脑免受6-羟基多巴胺损伤。生物化学杂志。2005;280:18536–42. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Kulich SM，Chu CT。6-羟基多巴胺持续激活细胞外信号调节激酶：对帕金森病的影响。神经化学杂志。2001;77:1058–66. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Kulich SM、Horbinski C、Patel M、Chu CT.6-羟多巴胺诱导线粒体ERK活化。自由基生物医学。2007;43:372–83. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Emrick MA，Hoofnagle AN，Miller AS，Ten Eyck LF，Ahn NG。协同点突变对细胞外信号调节激酶2的组成性激活。生物化学杂志。2001;276:46469–79.[公共医学][谷歌学者] 37Wolf I，Rubinfeld H，Yoon S，Marmor G，Hanoch T，Seger R.ERK激活环参与细胞溶质锚定分离。生物化学杂志。2001;276:24490–7.[公共医学][谷歌学者] 38Frost JA、Geppert TD、Cobb MH、Feramisco JR。Ha-Ras、佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐和血清激活AP-1时对细胞外信号调节激酶（ERK）功能的要求。美国国家科学院程序。1994;91:3844–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Yamamoto A、Tagawa Y、Yoshimori T、Moriyama Y、Masaki R、Tashiro Y。Bafilomycin A1通过抑制大鼠肝癌细胞系H-4-II-E细胞中自噬体和溶酶体之间的融合来防止自噬空泡的成熟。细胞结构功能。1998;23:33–42.[公共医学][谷歌学者] 40Fass E、Shvets E、Degani I、Hirschberg K、Elazar Z。微管支持饥饿诱导的自噬体的产生，但不支持其靶向性和与溶酶体的融合。生物化学杂志。2006;281:36303–16.[公共医学][谷歌学者] 41Koike M、Shibata M、Waguri S、Yoshimura K、Tanida I、Kominami E、Gotow T、Peters C、Figura KV、Mizushima N、Saftig P、Uchiyama Y。自噬参与神经元类蜡褐脂肪酶（巴顿病）小鼠模型神经元溶酶体的储存《美国病理学杂志》。2005;167:1713–28. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Gomez-Santos C、Ferrer I、Santidrian AF、Barrachina M、Gil J、Ambrosio S.多巴胺诱导人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的自噬细胞死亡和α-同核蛋白增加。神经科学研究杂志。2003;73:341–50.[公共医学][谷歌学者] 43Klonsky DJ、Abeliovich H、Agostinis P、Agrawal DK、Aliev G、Askew DS、Baba M、Baehrecke EH、Bahr BA、Ballabio A、Bamber BA、Basham DC、Bergamini E、Bi X、Biard-Piechaczyk M、Blum JS、Bredesen DE、Brodsky JL、Brumell JH、Brunk UT、Bursch W、Camougrand N、Cebollero E、Cecconi F、Chen Y、Chin LS、Choi A、Chu CT、Chung J、Clarke PG、Clark RS、，Clarke SG、Clave C、Cleveland JL、Codogno P、Colombo MI、Coto Montes A、Cregg JM、Cuervo AM、Debnath J、Demarchi F、Dennis PB、Dennis PA、Deretic V、Devenish RJ、Di Sano F、Dice JF、Difiglia M、Dinesh Kumar S、Distelhorst CW、Djavaheri-Mergny M、Dorsey FC、Droge W、Dron M、Dunn WA、Jr、Duszenko M、Eissa NT、Elazar Z、Esclatine A、Eskelinen EL、，Fesus L、Finley KD、Fuentes JM、Fueyo J、Fujisaki K、Galliot B、Gao FB、Gewirtz DA、Gibson SB、Gohla A、Goldberg AL、Gonzalez R、Gonsalez-Estevez C、Gorski S、Gottlieb RA、Haussinger D、He YW、Heidenreich K、Hill JA、Hoyer-Hansen M、Hu X、Huang WP、Iwasaki A、Jaattela M、Jackson WT、Jiang X、Jin S、Johansen T、Jung JU、Kadowasaki M、Kang C、，Kelekar A、Kessel DH、Kiel JA、Kim HP、Kimchi A、Kinsella TJ、Kiselyov K、Kitamoto K、Knecht E、Komatsu M、Kominami E、Kondo S、Kovacs AL、Kroemer G、Kuan CY、Kumar R、Kundu M、Landry J、Laporte M、Le W、Lei HY、Lenardo MJ、Levine B、Lieberman A、Lim KL、Lin FC、Liou W、Liu LF、Lopez Berestein G、Lopez-Otin C、Lu B、Macleod KF马洛尼W，Martinet W、Matsuoka K、Mautner J、Meijer AJ、Melendez A、Michels P、Miotto G、Mistiaen WP、Mizushima N、Mograbi B、Monastyrska I、Moore MN、Moreira PI、Moriyasu Y、Motyl T、Munz C、Murphy LO、Naqvi NI、Neufeld TP、Nishino I、Nixon RA、Noda T、Nurnberg B、Ogawa M、Oleinick NL、Olsen LJ、Ozpolat B、Paglin S、Palmer GE、Papassideri I、Parkes M、，Perlmutter DH、Perry G、Piacentini M、Pinkas-Kramaski R、Prescott M、Proikas-Cesanne T、Raben N、Rami A、Reggiori F、Rohrer B、Rubinsztein DC、Ryan KM、Sadoshima J、Sakagami H、Sakai Y、Sandri M、Sasakawa C、Sass M、Schneider C、Seglen PO、Seleverstof O、Settleman J、Shacka JJ、Shapiro IM、Sibirny A、Silva-Zacarin EC、Simon HU、Simone C、，Simonsen A、Smith MA、Spanel-Borowski K、Srinivas V、Steeves M、Stenmark H、Stromhaug PE、Subaust CS、Sugimoto S、Sulzer D、Suzuki T、Swanson MS、Tabas I、Takeshita F、Talbot NJ、Talloczy Z、Tanaka K、Tanida I、Taylor GS、Taylar JP、Terman A、Tettamanti G、Thompson CB、Thumm M、Tolkovsky AM、Tooze SA、Truant R、Tumanovska LV、，Uchiyama Y、Ueno T、Uzcategui NL、van der Klei I、Vaquero EC、Vellai T、Vogel MW、Wang HG、Webster P、Wiley JW、Xi Z、Xi G、Yahalom J、Yang JM、Yap G、Yin XM、Yoshimori T、Yu L、Yue Z、Yuzaki M、Zabirnyk O、Zheng X、Zhu X、Deter RL。高等真核生物中监测自噬测定的使用和解释指南。自噬。2008;4:151–75. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Munafo DB，密歇根州科伦坡。研究自噬的新方法：通过氨基酸剥夺调节自噬体空泡大小。细胞科学杂志。2001;114:3619–29.[公共医学][谷歌学者] 45Klonsky DJ，Emr SD。自噬作为细胞降解的调节途径。科学。2000;290:1717–21. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Larsen KE、Fon EA、Hastings TG、Edwards RH、Sulzer D.甲基苯丙胺诱导的多巴胺能神经元变性涉及自噬和多巴胺合成上调。神经科学杂志。2002;22:8951–60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47Gomez-Santos C、Ferrer I、Reiriz J、Vinals F、Barrachina M、Ambrosio S.MPP+增加人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白表达和ERK/MAP激酶磷酸化。大脑研究。2002;935：32–9。[公共医学][谷歌学者] 48奚ZQ、王XF、何RQ、李兆伟、刘XZ、王莉莉、朱X、肖福、孙JJ、李JM、龚Y、关LF。人类顽固性癫痫的细胞外信号调节蛋白激酶。欧洲神经学杂志。2007;14:865–72.[公共医学][谷歌学者] 49Zhu X，Lee HG，Raina AK，Perry G，Smith MA。丝裂原活化蛋白激酶途径在阿尔茨海默病中的作用。神经信号。2002;11:270–81.[公共医学][谷歌学者] 50Pei JJ，Braak H，An WL，Winblad B，Cowburn RF，Iqbal K，Grundke-Iqbal I.丝裂原活化蛋白激酶ERK1/2和MEK1/2的上调与阿尔茨海默病神经纤维变性的进展相关。大脑研究摩尔大脑研究。2002;109:45–55.[公共医学][谷歌学者] 51Alessandrini A、Namura S、Moskowitz MA、Bonvente合资公司。MEK1蛋白激酶抑制可防止局灶性脑缺血造成的损伤。美国国家科学院程序。1999;96:12866–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 52Li PA，He QP，Yi Bing O，Hu BR，Siesjo BK。高血糖大鼠短暂性脑缺血后细胞外信号调节激酶的磷酸化。神经生物学疾病。2001;8:127–35.[公共医学][谷歌学者] 53Wang X，Zhu C，Qiu L，Hagberg H，Sandberg M，Blomgren K。新生大鼠脑缺氧缺血后ERK1/2的激活。神经化学杂志。2003;86:351–62.[公共医学][谷歌学者] 54Lin E、Cavanaugh JE、Leak RK、Perez RG、Zigmond MJ。6-羟基多巴胺快速激活ERK可促进多巴胺能细胞的存活。神经科学研究杂志。2008;86:108–17.[公共医学][谷歌学者] 55Luo Y，DeFranco数据库。ERK1/2在神经元氧化毒性中的相反作用：ERK1/2作用于氧化应激早期和晚期的不同机制。生物化学杂志。2006;281:16436–42.[公共医学][谷歌学者] 56Kulich SM，Chu CT。活性氧物种在ERK磷酸化和6-羟基多巴胺细胞毒性中的作用。生物科学杂志。2003;28:83–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 57Philipova R，Whitaker M.活性ERK1在体内二聚：双磷酸二聚体产生峰值激酶活性，单磷酸二聚物维持基本ERK1活性。细胞科学杂志。2005;118：5767–76。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 58Xu L，Kang Y，Col S，Massague J.Smad2核质通过核孔蛋白CAN/Nup214和Nup153穿梭给细胞质和细胞核中的TGF-β信号复合物喂食。分子细胞。2002;10:271–82.[公共医学][谷歌学者] 59Wunderlich W，Fialka I，Teis D，Alpi A，Pfeifer A，Parton RG，Lottspeich F，Huber LA。一种新的14-千道尔顿蛋白与晚期内体/溶酶体室上的有丝分裂原活化蛋白激酶支架mp1相互作用。细胞生物学杂志。2001;152:765–76. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 60Cha H，Lee EK，Shapiro P.调节有丝分裂原活化蛋白激酶激酶-1细胞质定位和ERK活化的C末端区域的鉴定。生物化学杂志。2001;276:48494–501.[公共医学][谷歌学者] 61Corcelle E、Nebout M、Bekri S、Gauthier N、Hofman P、Poujeol P、Fenichel P、Mograbi B。致癌物林丹在成熟阶段破坏自噬与持续的丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶活性有关。癌症研究。2006;66:6861–70.[公共医学][谷歌学者] 62Ogier-Denis E，Pattinge S，El Benna J，Codogno P.Erk1/2依赖性磷酸化半乳糖相互作用蛋白刺激其GTPase加速活性和人类结肠癌细胞自噬。生物化学杂志。2000;275：39090–5。[公共医学][谷歌学者] 63Nowak G，Clifton GL，Godwin ML，Bakajsova D.ERK1/2通路的激活介导氧化诱导的肾细胞线粒体功能下降。美国生理学杂志肾生理学。2006;291:840–55. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 64Kissova I、Deffieu M、Samokhvalov V、Velours G、Bessoule JJ、Manon S、Camougrand N。酵母中的脂质氧化和自噬。自由基生物医学。2006;41:1655–61.[公共医学][谷歌学者] 65Kim EH、Sohn S、Kwon HJ、Kim SU、Kim MJ、Lee SJ、Choi KS。亚硒酸钠诱导恶性胶质瘤细胞中超氧化物介导的线粒体损伤和随后的自噬细胞死亡。癌症研究。2007;67:6314–24.[公共医学][谷歌学者] 66罗德里格斯·恩里奎兹S、赫·L、勒马斯特斯JJ。线粒体通透性转换孔在线粒体自噬中的作用。国际生物化学与细胞生物学杂志。2004;36:2463–72.[公共医学][谷歌学者] 67Nixon RA、Wegiel J、Kumar A、Yu WH、Peterhoff C、Cataldo A、Cuervo AM。阿尔茨海默病自噬的广泛参与：一项免疫电镜研究。神经病理学实验神经学杂志。2005;64：113–22。[公共医学][谷歌学者] 68Mandemakers W，Morais VA，De Strooper B.帕金森病和其他神经退行性疾病中线粒体功能障碍的细胞生物学观点。细胞科学杂志。2007;120:1707–16.[公共医学][谷歌学者] 69Betarbet R、Sherer TB、Di Monte DA、Greenamire JT。帕金森病发病机制的机械方法。脑病理学。2002;12:499–510. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 70Xue L，Fletcher GC，Tolkovsky AM。凋亡期间阻断半胱天冬酶后，真核细胞中的线粒体被选择性清除。当前生物量。2001;11:361–5.[公共医学][谷歌学者] 71Koike T，Yang Y，Suzuki K，Zheng X.轴突和树突退化：其机制和保护性实验范式。神经化学国际。2008;52:751–60.[公共医学][谷歌学者] 72Chu CT，Plowey ED，Dagda RK，Hickey RWSJC，III，Clark RS。神经突损伤和神经变性中的自噬：体外和体内模型。方法酶制剂。2008新闻界。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
