具有细胞粘附模块开关但无恶性转化的前列腺原代细胞系的上皮细胞向间充质细胞转化

从EP156T变为EPT1期间出现EMT

除了失去接触抑制外，与EP156T细胞相比，EPT1细胞的形态特征发生了显著变化。EP156T细胞有一个非常清晰的圆形边界，单个细胞在一个均匀的阵列中彼此邻接。相邻细胞之间有规则间隔的细胞间连接和粘附(图2A). 非常不同的是，EPT1细胞具有更长且不规则分散的细胞形状，其组成和密度与间充质细胞相似(图2A)与上皮细胞向间充质细胞转化的已知特征相对应[2]EMT的形态特征与EP156T和EPT1细胞在E-cadherin和N-cadherin基因表达方面的关键差异一致，如图2B-D和详细信息如下。hTERT在EP156T和EPT1中的表达水平相似，这些细胞对嘌呤霉素的高度耐药支持了外源性，这与来自嘌呤菌素耐药逆转录病毒载体的hTERT表达一致（数据未显示）[20]将EPT1细胞胰蛋白酶化，在标准EP156T培养基中增殖，FCS增加到5%。

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图2

EPT1细胞经历了EMT。

A.典型的光镜图像显示了从EP156T细胞衍生的EPT1细胞在低密度（A，d）和高密度培养（b，c，e，f）下的形态变化。EPT1细胞呈梭形，比EP156T细胞长得多。也显示了EPT1细胞的重叠生长（d，e，f）。B.实时qPCR显示EPT1与EP156T中的钙粘附素mRNA水平的切换，使用TaqMan分析E-钙粘附素（Hs00170423_m1）和N-cadherin（Hs001 69953_ml）。C.蛋白质印迹显示蛋白质水平的钙粘蛋白转换。抗E-cadherin和N-cadherin的初级抗体（BD转导实验室）均稀释1∶2500。将抗肌动蛋白小鼠单克隆抗体稀释1∶250。HRP-结合抗-Ig稀释1∶8000。根据标记M.D的微孔中的ECL DualVue标记估计分子量（kD）。间接免疫荧光图像（20×）显示EPT1细胞中E-cadherin减少，N-cadherin增加（右图）。抗E-cadherin的一级抗体稀释1∶50，抗N-cadherin（BD转导实验室）稀释1∶25，FITC-结合二级抗体稀释为1∶250。

EPT1细胞迁移和侵袭增加

EMT的特点是运动性增强和侵袭性增强。为了确定EPT1细胞在迁移和侵袭方面是否比EP156T细胞更活跃，我们使用跨阱室分析评估了血清诱导的细胞迁移。如所示图3AEPT1通过孔隙的迁移速度是EP156T细胞的2.5倍以上。通过血清诱导的跨孔细胞外基质层侵袭来检测EPT1和EP156T细胞的侵袭能力。如所示图3B，与EP156T细胞相比，EPT1细胞在孵育24小时后表现出3倍的侵袭增加。24小时的伤口愈合试验也证实了EPT1比EP156T细胞迁移更快(图3C). EP156T细胞作为板材en块正如上皮细胞所描述的那样，而EPT1细胞迁移更为动态，并且单独移动，有时会像间充质细胞那样留下一部分尾部区域[2]所有这些结果表明，与EP156T细胞相比，EPT1细胞在向间充质样细胞过渡期间获得了高得多的迁移和入侵能力。

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图3

EP156T和EPT1细胞的迁移和侵袭。

EP156T和EPT1细胞的迁移（A）和侵袭（B）能力按方法数据表示为四个独立实验中迁移细胞（A）或入侵细胞（B）的平均OD560。C.典型的光镜图像（10×）显示，与EP156T细胞相比，EPT1向伤口线的迁移增加。

EPT1细胞表现出明显的EMT特征的基因表达转换模式

为了鉴定从EP156T到EPT1细胞的EMT相关基因标记，我们使用含有44k探针的安捷伦人类全基因组寡核苷酸微阵列分析了两种细胞系的基因表达。与EP156T细胞相比，EPT1细胞中有965个基因下调，893个基因上调3倍以上。与EMT相关的许多基因表达变化在EPT1和EP156T之间有显著差异(表1). E-钙粘蛋白（CDH1）、粘附连接中的原型上皮粘附分子的丢失和N-钙粘蛋白的增加是EMT的主要特征之一[2]EPT1细胞中CDH1下调27倍，CDH2上调33倍。通过实时qPCR（mRNA水平）和Western-blotting（蛋白质水平）验证钙粘蛋白开关(图2B-C). 免疫荧光染色显示EPT1细胞膜上E-cadherin消失，N-cadherin增加(图2D). 以EP156T为特征的上皮标记物包括细胞角蛋白14（KRT14）、KRT5和p63[20]在EPT1细胞中均下调100倍以上。相反，EPT1细胞中许多间充质标志物上调，包括钙粘蛋白11（CDH11）、波形蛋白（VIM）和纤维连接蛋白（FN）。除了这些EMT标记外，一些已知的调节EMT的转录因子，如TWIST2和ZEB1，也在EPT1细胞中上调(表1).

EPT1中编码细胞连接和附着结构成分的基因的整个模块发生改变

细胞连接，特别是粘附连接、紧密连接和桥粒，是上皮表型和保持相邻上皮细胞彼此牢固附着所必需的[29]细胞-细胞结合复合体的动态形成和溶解是EMT的中心过程[3]除了上述粘连连接外，分离紧密连接[30],[31]或桥粒[10]分别被报道为EMT的重要特征。

使用安捷伦全人类基因组微阵列数据，我们比较了EP156T细胞和EPT1细胞之间粘附连接、紧密连接和桥粒相关基因的表达模式。如所示表2，这三组的大多数检测成分在EPT1细胞中的表达水平远低于亲代EP156T细胞(表2)如粘附连接中的E-钙粘蛋白、P-钙粘素、β1和δ1连环蛋白，紧密连接中的claudin 1、4和7，桥粒中的桥粒2和3以及桥粒蛋白2和3。

非常有趣的是，与EP156T细胞相比，EPT1中编码细胞连接其他结构成分的基因显著下调(表2). 缝隙连接通过单膜结构的端到端对接连接相邻细胞的细胞质。缝隙连接蛋白β家族的大多数成员在EPT1细胞中的表达显著降低(表2). 上皮细胞附着在基底膜上需要半桥粒和局部粘连。与亲代细胞相比，EPT1细胞中半桥粒的大多数成分下调，尤其是抗肌张力素和角蛋白。EPT1细胞中的局灶性粘连成分也发生了变化(表2).

这些观察结果，加上不断变化的EMT标记，表明EMT的调控不仅在细胞表型转变中进行，而且在细胞连接的整个模块中进行。细胞连接的完全改变使EPT1成为研究EMT复杂调控网络的理想模型。

EPT1细胞显示与前列腺癌细胞株相同的基因表达模式

EMT在转化细胞系中经常被观察到。我们询问EPT1细胞是否与以PC3和DU145为代表的前列腺癌细胞具有相似的基因表达谱。比较EP156T和EPT1之间以及EP156T与前列腺癌细胞株之间的差异表达基因。共有1858个基因在EPT1和EP156T细胞之间的差异超过3倍。如所示图S1在比较PC3和DU145与EP156T细胞时，EPT1细胞中EMT后改变的大多数基因也发生了改变。与EP156T细胞相比，EPT1中70%以上的下调基因与PC3细胞中表达不足的基因重叠。有趣的是，在PC3细胞中，许多上皮标记物（包括E-cadherin和细胞角蛋白KRT4和KRT5）也显著下调，而包括N-cadherin在内的间充质标记物也上调。这与之前的报告一致，即PC3细胞是间质样细胞，可通过分泌的Frizzled相关蛋白3（sFRP3）的过度表达诱导间质向上皮转化（MET）[19]EPT1的接触抑制的丧失以及EPT1和前列腺癌细胞相对于EP156T细胞的相似基因表达变化都表明向EPT1细胞转化的发展。

尽管经历了EMT，但EPT1细胞没有转化

观察到EPT1中改变的基因与前列腺癌细胞株具有相同的模式，我们不禁要问EPT1细胞是否发生了转化。在无血清条件下生存和增殖的能力是癌细胞的一个众所周知的特征在体外 [32]我们在含有不同浓度胎牛血清（FCS）的培养基中检测了EPT1细胞的增殖。如所示图4A，EP156T和EPT1细胞在1%FCS中的生长速度比在5%FCS中慢得多，并且在培养48小时后在没有FCS的培养基中完全停止生长并死亡，而前列腺DU145癌细胞在没有FCS的培养基中仍然生长良好，尽管比在完全培养基中慢。长期培养表明，EPT1细胞不仅生长快，而且在含有5%FCS的培养基中比在标准EP156T培养基中生长旺盛，因此EPT1培养基中FCS的浓度从1%调整到5%。

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图4

EPT1细胞的转化分析。

A.分别在含有0%、1%和5%FCS的培养基中培养EP156T、EPT1和DU145细胞。B.EP156T和EPT1细胞在培养基中不存在（GF−）或存在（GF+）生长因子的情况下培养。C.锚定非依赖性生长分析a.如图所示，不同时间软琼脂中菌落形成的代表性图像（10×）。在前3天，一些EPT1细胞继续分裂，而EP156T细胞没有分裂。EP156T和EPT1细胞最终都不能在软琼脂中生长，而前列腺癌DU145细胞中形成了许多集落。b.在软琼脂中培养7天后，将细胞定量为OD570nm处的吸光度，如方法.

癌细胞最重要的能力之一是生长信号的自给自足[33]EP156T和EPT1细胞的完整培养基含有多种生长因子，包括牛垂体提取物、胰岛素和EGF[25]当EP156T和EPT1细胞在没有上述生长因子的基本培养基中培养时，两种细胞系中的大多数细胞在48小时后停止增殖并死亡，而在完全培养基中的平行细胞生长良好(图4B).

锚定非依赖性生长被认为是转化细胞的标志[34],[35]我们在软琼脂中测试了EPT1细胞的非凤尾鱼依赖性生长。在软琼脂中培养7天后，与阳性对照DU145细胞相比，EP156T和EPT1细胞均不能形成集落(图4). 虽然在软琼脂中没有形成菌落，但观察到了差异。近一半的EPT1细胞在前3天分裂，但最后增殖停止，没有形成集落。相反，EP156T细胞在软琼脂中根本不分裂。软琼脂生长的这些差异表明，EMT后EPT1细胞处于癌前阶段(图4). EMT和EPT1的转化分析总结于表3.

EPT1细胞的生成

在EP156T标准培养基中的6孔板中，使EP156T细胞在通道43处完全汇合，基本上如所述[20]该培养基为改良的MCDB153（以色列生物工业有限公司），并补充有1%MEM非必需氨基酸溶液、200 nM氢化可的松、10 nM三碘甲状腺原氨酸、5µg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml亚硒酸钠、100 ng/ml睾酮、5 ng/ml EGF、50µg/ml牛垂体提取物（Invitrogen）、，100 U/ml青霉素、100µg/ml链霉素和1%胎牛血清（FCS）。每3天更换一次培养基。12周后，将细胞胰酶化，转移到新平板上，并在含有FCS的EP156T培养基中生长至5%。

增殖、迁移、侵袭和伤口闭合试验

在增殖试验中，将完整培养基中的3500个细胞添加到96-well板的每个孔中。经过时间培养后，使用CellTiter96®AQ分析细胞增殖_尤斯单溶液细胞增殖试验（MTS）（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。将MTS试剂直接添加到培养孔中，然后在37°C下培养3 h，使用96 well平板读取器（功率波分光光度计）在490 nm处记录吸光度。对于横向迁移分析和侵入分析，1.8×10⁵将隔夜无血清培养基中的无血清细胞添加到24孔跨壁板（8µm大小，Cell Biolabs Inc.，San Diego，CA，USA）的顶部腔室中，并将含有10%胎牛血清（FCS）的培养基添加到底部腔室中。在迁移试验中培养12小时，在侵袭试验中培养24小时。去除顶部（非迁移）细胞，对底部（迁移）细胞进行染色，并在560nm处记录吸光度。所有这些分析都是一式三份的，数据显示为迁移细胞和入侵细胞的平均吸光度。

划痕闭合试验，5×10⁵细胞接种在6孔中。24小时后在高密度区域切开伤口，取出分离的细胞并加入新鲜培养基。在指定的时间点拍摄了受伤区域的照片。

微阵列分析和实时定量PCR

总RNA提取自细胞亚融合单层。根据说明，使用低RNA输入线性扩增试剂盒PLUS，单色试剂盒（安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉）将一微克DNA处理的总RNA转化为cDNA，并与Cy3标记的cRNA相邻。本研究使用安捷伦人类全基因组（4×44k）寡核苷酸芯片和Sure Print技术（安捷伦科技公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托）分析样品。杂交和特征提取在[59]在J-Express中使用EPT1细胞中显著上调或下调的基因进行显著的微阵列分析（SAM）(网址：www.molmine.com)[60]注释的微阵列数据上传到BASE数据库中，并格式化并导出到欧洲生物信息学研究所的ArrayExpress(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress（注册号：E-BASE-8））符合MIAME指南。使用TaqMan分析（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）通过实时定量逆转录PCR（qPCR）确认微阵列数据中的差异表达基因，并根据ACTB表达对平均定量值进行标准化[59].

间接免疫荧光和Western blot分析

间接免疫荧光（IF）和免疫印迹（WB）分析基本上如前所述[61]IF细胞生长在24孔板中的10 mm辅助玻璃盖玻片上，然后用PBS清洗，固定（4%新鲜多聚甲醛在PBS中，室温下20分钟），渗透（0.5%Triton X-100，10分钟），封闭（100 mm甘氨酸，10 min），并在每一步之间用PBS洗涤储存（100%甲醇，4°C）。在用0.5%BSA/PBS封闭15分钟后，在4°C的温度下，以指示的稀释度在0.5%BSA/PBS中过夜。将FITC-标记的次级抗鼠Ig（SouthernBiotech，Birmingham，AL，USA，Cat#4050-02）在室温下加入0.5%BSA/PBS中1小时。使用DAPI（分子探针，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）将盖玻片安装在SlowFade玻璃载玻片上，并使用徕卡共焦显微镜进行分析。

在200 mM Tris.Cl（pH 6.8）、13%超纯甘油、3.2%β-巯基乙醇、40 g/l SDS和蛋白酶抑制剂鸡尾酒组I中溶解WB分析细胞（Calbiochem，Cat#535142）。使用BCA蛋白质检测试剂盒（Pierce，Rockford，IL，USA，Cat#23227）测量蛋白质浓度，并使用10%聚丙烯酰胺凝胶（Biorad Labs.，Hercules，CA，USA）SDS电泳分离20µg蛋白质裂解物，然后将其印迹到PVDF膜上（GE Healthcare Life Sciences，Uppsala，Sweden，Cat#RPN1416F）。在指定浓度下使用初级小鼠单克隆抗体和HRP标记的二级抗体（GE Healthcare，Cat.#NA931），并使用增强化学发光（GE Hearthcare）和Biorax Fluor-s多重成像仪检测条带。使用的分子量标记为ECL DualVue标记（GE Healthcare，RPN810）和MagicMark XP西方蛋白标准（Invitrogen，Cat#LC5602）。

血清非依赖性、生长因子非依赖性分析

对于血清非依赖性分析，细胞分别在含有0%、1%和5%FCS的培养基中培养。对于生长因子非依赖性分析，细胞分别在碱性MCDB培养基和完全培养基中培养[20]。如上所述，在48小时后测量各组的增殖。

锚定非依赖性生长试验

在软琼脂中检测非锚固生长。将50µl碱性琼脂基质（Cell Biolabs；CytoSelect™Cell，比色试剂盒）添加到96 well板的每个孔的底部。当琼脂为固体时，将含有3000个细胞的75µl细胞悬浮液/软琼脂基质分层放置在顶部，然后再放置50µl 2×完整培养基。培养7天后，琼脂基质溶解，细胞染色，并在570 nm处记录吸光度。数据显示在软琼脂试验中EPT1细胞、EP156T细胞和阳性对照DU145细胞的增殖定量。

我们感谢Beth Johannessen的细胞培养工作和RNA纯化，感谢Hua My Hoang的RNA纯化，根据MIAME指南，核酸标记和微阵列分析，向Kjetil Solland提交细胞遗传学分析，向Endy Spriet提供荧光和共焦显微镜分析帮助，向Kzell Petersen提交BASE数据库微阵列数据至ArrayExpress EBI数据库。以下NFR FUGE资助的核心设施得到认可：分子成像中心（Endy Spriet）；卑尔根计算科学中心计算生物学组（Inge Jonassen和Kjell Petersen）；挪威卑尔根大学挪威微阵列联盟（Kjell Petersen）。支持该工作的资金来源的详细信息仅限于提供的资金报表，不包括在确认书中。