N-Cadherin expression in human prostate carcinoma cell lines. An epithelial-mesenchymal transformation mediating adhesion withStromal cells

doi:10.1016/S0002-9440(10)65177-2

.1999年9月；155(3):787-98.

doi:10.1016/S0002-9440（10）65177-2。

人前列腺癌细胞系中N-Cadherin的表达。上皮-间充质转化介导基质细胞粘附

N L交易¹, R B纳格尔, A E克雷斯, R L Heimark公司

附属公司

PMID： 10487836
预防性维修识别码：项目经理1866912
内政部： 10.1016/S0002-9440（10）65177-2

人前列腺癌细胞系中N-Cadherin的表达。上皮-间充质转化介导基质细胞粘附

N L交易等人。美国病理学杂志. 1999年9月.

.1999年9月；155(3):787-98.

doi:10.1016/S0002-9440（10）65177-2。

作者

N L交易¹, R B纳格尔, A E克雷斯, R L高度标记

附属

¹美国图森，亚利桑那大学健康科学系外科研究科，85724。

PMID： 10487836
预防性维修识别码：项目经理1866912
内政部： 10.1016/S0002-9440（10）65177-2

摘要

在人类前列腺腺癌中，已观察到E-cadherin缺失、Gleason评分增加和囊外播散之间的关系。人类前列腺癌细胞株E-cadherin/catenin表型的进一步表征表明，低分化前列腺癌细胞系（PC-3N来源于PC-3、PC-3和JCA1）中E-cadherin缺失，N-cadherin表达。我们发现N-钙粘蛋白集中在PC-3N细胞延伸的细胞-细胞接触部位。N-钙粘蛋白也在体外和前列腺组织中的前列腺基质成纤维细胞中表达。前列腺基质成纤维细胞和PC-3N细胞的共培养显示N-钙粘蛋白在细胞间接触中的免疫定位。此外，钙粘蛋白结合蛋白p120（ctn）的亚型表达与前列腺癌细胞系E-和N-cadherin的表达不同。p100亚型在E-cadherin阳性的前列腺癌细胞系中表达更高，而p120主要在N-钙粘蛋白阳性前列腺癌细胞株和前列腺基质成纤维细胞中表达。腹腔注射SCID小鼠后，N-钙粘蛋白阳性癌细胞系PC-3N表现出对膈肌表面的侵袭性。侵袭性前列腺癌细胞株获得的N-钙粘蛋白和丢失的E-钙粘蛋白表明从上皮表型向间充质表型发展，这可能使其与周围基质成纤维细胞相互作用并促进转移。

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数字

**图1。**
前列腺癌细胞系PC-3N肿瘤的显微照片(A类)和DU-145(B类)SCID小鼠膈肌表面。SCID小鼠(n个=4）腹腔注射5×10细胞，注射后5周处死，膈肌固定，石蜡处理。DU145肿瘤已经穿透基底膜，PC-3N已经穿透小鼠的斜肌。切割五微米切片并脱蜡，以进行苏木精和伊红染色。刻度，60μm。

**图2。**
E-cadherin和p120的免疫印迹分析^ctn公司前列腺癌细胞系（LNCaP、DU-145、PC-3、PC-3N、JCA-1）中的连环蛋白。在2×SDS样品缓冲液中提取总细胞裂解物，并通过SDS-PAGE分析30μg蛋白质/车道。电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并用能够识别所有经典钙粘蛋白的泛钙粘蛋白多克隆抗体处理过滤器(A类)，一种抗p120的小鼠单克隆抗体^ctn公司识别两种亚型p120^ctn公司和p100^ctn公司(B类)或抗E-钙粘蛋白的小鼠单克隆抗体(C类). 用CSK缓冲液处理培养的PC-3N细胞，测定非离子洗涤剂的溶解度。收集Triton X-100可溶和不可溶部分。通过SDS-PAGE分析等量的总蛋白组分，并使用多克隆pan-cadherin抗体对N-钙粘蛋白进行免疫印迹(D类). 提取PC-3N细胞并用抗p120免疫沉淀^ctn公司或正常小鼠IgG。免疫沉淀用抗泛钙粘蛋白免疫印迹。**车道1**，PC-3N总蛋白裂解物。**2号车道**PC-3N的可溶性蛋白部分。**3号车道**，PC-3N细胞的不溶性部分。**4号车道**，p120免疫沉淀^ctn公司.车道5，用小鼠IgG抗体控制免疫沉淀。(E类)使用抗E-钙粘蛋白（E）的小鼠单克隆抗体、抗N-钙粘蛋白的小鼠单抗或不相关的小鼠IgG抗体（C）在前列腺癌细胞系（DU-145，PC-3N，PC-3）中免疫沉淀E-或N-钙粘素。免疫沉淀部分在SDS-PAGE上分离，转移到硝化纤维素膜上，并用抗p120的单克隆抗体进行免疫印迹^ctn公司（α-p120^ctn公司)或多克隆钙粘蛋白抗体（α-panCAD）。所有免疫印迹均采用化学发光检测试剂。

**图3。**
N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白和p120的免疫定位^ctn公司在PC-3N和DU-145癌细胞系中。细胞生长在盖玻片上直至汇合，然后用4%PFA固定在CMF-PBS中，并用CSK缓冲液渗透。使用PC-3N上N-钙粘蛋白的小鼠单克隆抗体进行免疫荧光(A类)，小鼠抗p120单克隆抗体^ctn公司在PC-3N细胞上(B类)或PC-3N上抗E-钙粘蛋白的小鼠单克隆抗体(C类)和DU-145(D类)单元格。罗丹明偶联二级抗体用于显示免疫反应性，并通过共焦显微镜拍摄照片。箭头表示N-钙粘蛋白和p120的细胞连接和定位^ctn公司到蜂窝扩展。比例尺，40μm。

**图4。**
前列腺癌细胞系和前列腺基质成纤维细胞中E-和N-钙粘蛋白及斑球蛋白的Northern印迹分析。每个细胞株每行总RNA的20微克被印在尼龙膜上。300磅*经济效益*以N钙粘蛋白的I片段作为探针检测N钙粘素。用小鼠E-cadherin的1.7-bp片段作为E-cadherin表达的探针。利用全长板球蛋白和β-catenin cDNA检测板球蛋白和β-catenin的表达。使用1.2-kb GAPDH cDNA片段作为标准化标准。将杂交膜暴露于X射线胶片上1天（E-cadherin、β-catenin、plakoglobin、GAPDH）和2天（N-cadherin）。这是两个独立实验的代表性结果。

**图5。**
N-钙粘蛋白在前列腺基质成纤维细胞中的细胞定位*在体外*(A类，B类、和D类)和就地(C类). PSF细胞在盖玻片上生长，直至汇合。细胞用4%PFA在CMF-PBS中固定，用CSK缓冲液渗透，并与小鼠抗N-钙粘蛋白单克隆抗体反应(A类)或鼠抗α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(B类).箭头表示N-钙粘蛋白介导的细胞连接。**抄送：**正常前列腺组织基质成纤维细胞中的N-钙粘蛋白免疫反应（以S表示）。新鲜冷冻的正常前列腺组织在6μm处切片，并用冷丙酮固定。上皮角蛋白18和N-钙粘蛋白的共表达是通过用N-钙粘素单克隆抗体和角蛋白18多克隆抗体共同免疫组织来实现的。N-钙粘蛋白通过罗丹明偶联二级抗体检测，而角蛋白18通过FITC-偶联二级抗原检测。N表示神经中的N-钙粘蛋白表达，E表示正常上皮腺中的角蛋白18。**医生：**N-cadherin在PC-3N和PSF共培养中的表达。PC-3细胞用40μg/ml的DiO（绿色膜标记细胞）标记，然后接种在PSF培养的盖玻片上24。这个箭头代表N-cadherin在PC-3N和PSF细胞之间的细胞-细胞边界的定位。通过共焦显微镜拍摄图像。比例尺，60μm(A类，B类、和D类)和100微米(C类).

**图6。**
PC-3N和前列腺基质成纤维细胞的细胞聚集分析。为了区分PC-3N和PSF细胞，用40μg/ml的DiO标记PC-3N细胞1小时。在2 mmol/L Ca存在下对所有细胞进行胰蛋白酶化²⁺以防止钙粘蛋白的破坏。在聚集试验中，将标记的PC-3N细胞与未标记的PC-3 N或PSF在钙的存在下混合²⁺此外，在存在抗N-钙粘蛋白阻断抗体的聚集试验中，将标记的PC-3N和PSF细胞混合(n个= 3). 细胞在37°C的回转振动筛上聚集1小时。在荧光下拍摄细胞聚集的照片(顶行)和相位对比度(**最下面一行**)在相同的字段中。比例尺，100μm。

**图7。**
人类前列腺癌中钙粘蛋白细胞-细胞粘附的两种形式。E-钙粘蛋白介导的上皮细胞-细胞粘附(A类)和N-钙粘蛋白介导的基质：间充质细胞粘附(B类)如图所示。钙粘蛋白显示为二聚体。犰狳连环蛋白p100/p120^ctn公司β-catenin（βctn）和γ-catenin/plakoglobin（γctn）将E-cadherin锚定到α-catenin（αctn），后者将复合体连接到外周肌动蛋白细胞骨架。在A类，描述了稳定的钙粘蛋白同型粘附。B类显示了PC-3N癌细胞中N-cadherin/catenin复合物的已知成分，其优先表达p120^ctn公司亚型和基质成纤维细胞。这种细胞与细胞之间的相互作用可能不太稳定，并且与α-连环蛋白损失的亲和力较弱。

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