哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）通路的mTOR复合物1（mTORC1）分支是哺乳动物细胞生长的主要驱动因素，在许多常见肿瘤中被解除调控(1). 它也是药物雷帕霉素的靶点，雷帕霉素作为一种抗癌疗法已经引起了相当大的兴趣。多种信号调节mTORC1通路，包括胰岛素、缺氧、线粒体功能以及葡萄糖和氨基酸的可用性。其中许多是由结节性硬化复合物（TSC1-TSC2）肿瘤抑制物整合在mTORC1的上游，该肿瘤抑制素通过其作为Rheb的GTPase激活蛋白（GAP）的作用，成为mTORC2的重要负调控因子，Rheb是一种小的三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白，能有效激活mTORCl的蛋白激酶活性(2). 即使缺乏维持通路活性所需的许多上游信号，TSC蛋白的缺失也会导致mTORC1信号过度激活。一个显著的例外是氨基酸供应，因为在缺乏TSC1或TSC2的细胞中，mTORC1途径对氨基酸饥饿仍然敏感(三–5).
氨基酸向mTORC1发出信号的机制仍然很神秘。合理的预期是，向mTORC1发出氨基酸可用性信号的蛋白质也可能与之相互作用，但迄今为止还没有确定合适的候选蛋白。由于大多数mTORC1纯化依赖于抗体来分离mTORC2，我们想知道在之前的工作中，在纯化材料的SDS-PAGE分析过程中，抗体重链是否模糊不清，mTORC1-相互作用蛋白为45-55kD。事实上，使用净化策略可以避免这种复杂性(29)，我们鉴定了44 kD RagC蛋白与过度表达的猛禽共同纯化，猛禽是mTORC1的定义成分(6–9).
RagC是一种Ras相关的小GTP结合蛋白，是哺乳动物四种Rag蛋白之一（RagA、RagB、RagC、RagD）。RagA和RagB彼此非常相似，是芽殖酵母Gtr1p的同源物，而RagC和RagD相似，是酵母Gtr2p的同源体(10–12). 在酵母和人类细胞中，Rag和Gtr蛋白作为异二聚体发挥作用，由一个Gtr1p-like（RagA或RagB）和一个Gtro2p-like组件（RagC或RagD）组成(13,14). RagC与猛禽共同纯化的发现引起了我们的兴趣，因为在酵母中Gtr1p和Gtr2p调节Gap1p氨基酸通透酶的细胞内分选(15)和微型自噬(16)、由氨基酸水平和TOR途径调节的过程(17–19). Gtr蛋白被认为在酵母中作用于下游或与TORC1平行，因为它们的过度表达即使在雷帕霉素存在的情况下也会诱导微自噬，而雷帕霉素通常会抑制这种自噬(16).
为了验证我们对RagC作为mTORC1相互作用蛋白的鉴定，我们在人类胚胎肾（HEK）-293T细胞中用不同对的Rag蛋白表达猛禽。与Rags作为异二聚体的功能相一致，猛禽与RagA-C或RagB-C共同纯化，但与RagB-B或Rap2A控制蛋白没有共同纯化(). 由于大多数GTP结合蛋白的核苷酸负载状态调节其功能，我们生成了预测的RagB、RagC和RagD突变体(13,15,16)仅限于GTP-或GDP-结合构象（为简单起见，我们称这些突变体为RagB全球技术伙伴、RagB国内生产总值等）(29). 当用mTORC1组分表达时，含有RagB的Rag异二聚体全球技术伙伴与含有野生型RagB或RagB的复合物相比，用更多猛禽和mTOR进行免疫沉淀国内生产总值(). 结合GDP的RagC增加了共净化mTORC1的量，因此RagB全球技术伙伴-C类国内生产总值在所有测试的异二聚体中，回收了最高数量的内源性mTORC1(). 给出mTORC1-RagB的强度指示全球技术伙伴-C类国内生产总值在同一试验中，我们无法检测到mTORC1与Rheb1的共同免疫沉淀()，mTORC1的既定交互作用物和激活剂(1). 当单独表达时，猛禽，但不是mTOR，与RagB相关全球技术伙伴-D类国内生产总值表明猛禽是Rag-mTORC1相互作用的关键中介(). 与此一致的是，rictor，一种mTOR相互作用蛋白，它只是mTORC2的一部分(1)，未与任何Rag异二聚体共同纯化(和图S1）。最后，高纯度猛禽在体外与RagB-D相互作用，在更大程度上与RagB相互作用全球技术伙伴-D类国内生产总值表明Rag-raptor的相互作用很可能是直接的().
Rag异二聚体与重组和内源性mTORC1的相互作用取决于RagB的核苷酸结合状态。在（A）通过（D）用表达载体中的指示cDNA转染HEK-293T细胞，制备细胞裂解物，并通过免疫印迹法分析裂解物和HA或FLAG免疫沉淀物中指定重组或内源性蛋白质的数量。（E）纯化的FLAG-raptor与野生型RagB-D或RagB的体外结合全球技术伙伴-D类国内生产总值.
我们测试了各种Rag异二聚体是否影响人类细胞内mTORC1通路的调节。在HEK-293T细胞中，RagB的表达全球技术伙伴-D类国内生产总值与mTORC1强烈相互作用的异二聚体不仅激活了该途径，而且根据S6K1的mTORC1-底物T389的磷酸化状态判断，使其对亮氨酸或总氨基酸的剥夺不敏感(). 野生型RagB-D异二聚体的作用比RagB温和全球技术伙伴-D类国内生产总值，使mTORC1通路对亮氨酸剥夺不敏感，但对总氨基酸饥饿引起的较强抑制不敏感(). RagB的表达国内生产总值-D类全球技术伙伴，一种不与mTORC1相互作用的异二聚体()具有主要的负面影响，因为它消除了存在和不存在亮氨酸或氨基酸的S6K1磷酸化(). RagB的表达国内生产总值单独也抑制S6K1磷酸化（图S2）。这些结果表明，正常生长条件下mTORC1途径的活性取决于内源性Rag功能。
过表达RagB的影响全球技术伙伴-mTORC1通路上含有异二聚体及其对亮氨酸、氨基酸或胰岛素的反应。表达指示蛋白对共同表达的S6K1磷酸化状态的影响（A）亮氨酸，（B）总氨基酸，或（C）胰岛素。从剥夺50分钟血清和（A）亮氨酸或（B）氨基酸的HEK-293T细胞制备细胞裂解物，然后，如有指示，用亮氨酸或氨基酸刺激10分钟。HEK-293E细胞（C）被剥夺血清50分钟，如有指示，用150 nM胰岛素刺激10分钟。分析裂解液和FLAG免疫沉淀物中特定蛋白的水平和S6K1的磷酸化状态。（D）氨基酸剥夺对胰岛素介导的mTORC1激活的影响。HEK-293E细胞需要血清和氨基酸或仅需要血清50分钟，如果需要，用10或150 nM胰岛素刺激。分析细胞裂解液中S6K1的水平和磷酸化状态。
为了验证Rags在比瞬时cDNA转染更生理学环境中的作用，我们构建了稳定表达Rheb1、RagB或RagB的HEK-293T细胞系全球技术伙伴（试图生成稳定表达RagB的线国内生产总值失败）。在正常生长条件下，这些细胞比对照细胞大，并且具有较高水平的mTORC1通路活性(). 与瞬时Rheb1过度表达不同()，稳定表达不会使mTORC1通路对亮氨酸或氨基酸饥饿不敏感()与暂时过度表达的Rheb可能对mTORC1的氨基酸信号产生非生理学后果的证据一致(4,5). Rheb1的稳定表达全球技术伙伴突变体也无法使mTORC1通路抵抗氨基酸剥夺（图S3）。相反，RagB的稳定表达全球技术伙伴消除了mTORC1途径对亮氨酸或总氨基酸提取的敏感性，而野生型RagB克服了对亮氨酸的敏感性，但对氨基酸饥饿不敏感(). 因此，适当Rag突变体的瞬时或稳定表达足以使mTORC1途径进入模拟氨基酸存在或缺失的状态。
稳定表达RagB细胞中mTORC1通路对氨基酸剥夺的不敏感性全球技术伙伴.（A）稳定表达RagB、Rheb1、Rag的细胞的细胞大小分布（图）和S6K1磷酸化（免疫印迹）全球技术伙伴或Rap2A。平均细胞直径±S.D.（μm）为：Rap2A，16.05±0.07；Rheb1，16.79±0.06；RagB，16.40±0.08；和RagB全球技术伙伴，16.68±0.06（n=4，与表达Rap2A的细胞的所有比较p<0.0008）。用编码特定蛋白质的慢病毒转导的HEK-293T细胞被剥夺50分钟的血清和（B）亮氨酸或（C）总氨基酸，如有指示，用亮氨酸或氨基酸重新刺激10分钟。分析细胞裂解液中特定蛋白质的水平和S6K1的磷酸化状态。（D）Rag蛋白与mTORC1的氨基酸模拟相互作用。稳定表达FLAG-tagged RagB、RagD或RagB的HEK-293T细胞全球技术伙伴饥饿氨基酸和血清50分钟，如有指示，用氨基酸重新刺激10分钟。然后用化学交联分析对细胞进行处理，并对细胞裂解物和FLAG免疫沉淀物进行分析，以确定指示蛋白的水平。（E）氨基酸刺激对RagB GTP负荷的影响。n=3时，数值为平均值±标准差（氨基酸刺激引起的GTP负荷增加，p<0.02）。（F）表达所示shRNAs的HeLa细胞中RagA、RagB、RagC和RagD的丰度。（G）表达靶向RagC和RagD的shRNAs的HeLa细胞中S6K1磷酸化。细胞被剥夺血清和亮氨酸50分钟，如有指示，用亮氨酸重新刺激10分钟。（H）dsRNA介导的RagB或RagC果蝇同源基因敲除对氨基酸诱导的dS6K磷酸化的影响。
为了确定Rag突变体是否影响来自氨基酸以外输入的mTORC1信号，我们测试了RagB中是否存在全球技术伙伴-表达mTORC1通路的细胞能够抵抗已知的其他干扰来抑制它。但情况并非如此，因为氧化应激、线粒体抑制或能量剥夺仍然会降低这些细胞中S6K1的磷酸化（图S4）。此外，在HEK-293E细胞中，RagB的表达全球技术伙伴-D类国内生产总值在缺乏胰岛素的情况下，不能维持mTORC1通路的活性(). 显性阴性RagB的表达国内生产总值-D类全球技术伙伴然而，异二聚体确实阻断了胰岛素刺激的S6K1磷酸化()氨基酸饥饿也是如此(). 因此，尽管RagB全球技术伙伴这种表达模拟了氨基酸的充足性，不能替代mTORC1正常监测的其他输入。
Rag蛋白在向mTORC1发送氨基酸信号中发挥主要作用的证据提出了一个问题，即在将氨基酸连接到mTORCl的途径中，Rag蛋白可能在哪里发挥作用。Rag-mTORC1相互作用的存在性()Rag突变体对氨基酸信号传导的影响(和)以及RagB诱导的S6K1磷酸化对雷帕霉素的敏感性全球技术伙伴（图S4），强烈表明Rag蛋白在氨基酸下游和mTORC1上游发挥作用。为了验证这一点，我们利用了已确立的发现，即环己酰亚胺通过阻断蛋白质合成，从而提高mTORC1感测的细胞内氨基酸水平，从而在缺乏氨基酸的细胞中重新激活mTORCl信号(20–22). 因此，如果Rag蛋白作用于氨基酸上游，环己酰亚胺应克服RagB的抑制作用国内生产总值-C类全球技术伙伴mTORC1信号传导的异二聚体，但如果它们是下游的，环己酰亚胺不应激活该途径。结果很清楚：环己酰亚胺处理细胞可逆转亮氨酸剥夺引起的mTORC1信号传导抑制，但不能逆转RagB表达引起的抑制国内生产总值-C类全球技术伙伴（图S5）。考虑到Rag蛋白在氨基酸下游和mTORC1上游的位置，我们确定了氨基酸是否调节细胞内Rag-mTORC的相互作用。使用瞬时共表达Rag蛋白和mTORC1组分进行的初始测试没有发现任何相互作用的调节。因为我们推断明显的过度表达可能会克服细胞内正常的调节机制，所以我们开发了一种检测方法(29)，基于可逆化学交联剂，这使我们能够检测稳定表达的FLAG标记的Rag蛋白与内源性mTORC1的相互作用。通过这种方法，我们很容易发现，当使用FLAG-tagged RagB或RagD从细胞中分离mTORC1时，氨基酸（而不是胰岛素）促进了Rag-mTORC2的相互作用(和S6A）。由于Rag蛋白的GTP负载状态也调节Rag-mTORC1相互作用()，我们确定氨基酸是否调节与RagB结合的GTP量。事实上，细胞的氨基酸刺激增加了RagB的GTP负荷(). 与此一致的是，氨基酸没有进一步增强mTORC1和RagB之间已经很高水平的相互作用全球技术伙伴突变体().
为了确定Rag蛋白是否是氨基酸激活mTORC1途径所必需的，我们使用慢病毒传递的shRNAs组合来同时抑制RagA和RagB或RagC和RagD。RagA和RagB的丢失也导致了RagC和RagD的丢失，反之亦然，这表明在细胞内，Rag蛋白不在异二聚体中时是不稳定的(). 在所有Rag蛋白表达减少的细胞中，亮氨酸刺激的S6K1磷酸化强烈减少(). Rag蛋白在果蝇细胞中的作用似乎是保守的，因为dsRNA介导的对RagB或RagC果蝇同源基因的抑制消除了氨基酸诱导的dS6K磷酸化(). 与胰岛素激活mTORC1所需的氨基酸一致，Rag表达的减少也抑制了S6K1的胰岛素刺激磷酸化（图S6B）。因此，Rag蛋白似乎对介导mTORC1的氨基酸信号传导既必要又充分。
与Rheb不同(23,24)，Rag异二聚体在体外没有直接刺激mTORC1的激酶活性（图S7），因此我们考虑了Rag蛋白调节mTOR的细胞内定位的可能性。mTOR存在于细胞的内膜系统，包括内质网、高尔基体和内体(25,26). 内源性mTOR的细胞内定位，正如我们在免疫荧光分析中验证的识别mTOR抗体所揭示的那样（图S8），在缺乏氨基酸的细胞中与饥饿的细胞和用氨基酸短暂再刺激的细胞中显著不同(和S11）或在新鲜完全培养基中生长（图S9）。在饥饿的细胞中，mTOR位于整个细胞质的微小点状，而在用氨基酸刺激仅3分钟的细胞中，mTOR定位于细胞的核周区域、大的囊泡结构或两者(). 雷帕霉素不能阻止氨基酸引起的mTOR定位变化()这表明这不是mTORC1活性的结果，而是mTORC2激活的机制之一。氨基酸诱导的mTOR定位变化需要Rag蛋白和猛禽的表达()，氨基酸也调节猛禽的定位（图S10）。
氨基酸对mTOR细胞内定位的Rag依赖性调节。（A）HEK-293T细胞饥饿血清和氨基酸50分钟或饥饿，然后在有或无雷帕霉素的情况下用氨基酸重新刺激指定时间。然后在免疫荧光分析中处理细胞以检测mTOR（绿色），用DAPI共同染色以检测DNA含量（蓝色），并成像。80-90%的细胞表现出所示的mTOR定位模式。（B）和（C）mTOR在表达所示shRNAs的HEK-293T细胞中的定位，并用（A）中的氨基酸剥夺和重新刺激。猛禽表达水平的免疫印迹。（D）mTOR在稳定表达RagB、Rheb1、RagB的HEK-293T细胞中的定位全球技术伙伴，或Rheb1全球技术伙伴并用（A）中的氨基酸剥夺和再刺激。
在过度表达RagB、Rheb1或Rheb的细胞中全球技术伙伴mTOR的行为与对照细胞相同，其定位在氨基酸刺激下发生变化，从小点到核周区和囊泡结构(). 相反，在细胞中过度表达RagB全球技术伙伴消除mTORC1途径的氨基酸敏感性的突变体，在缺乏氨基酸的情况下，mTOR已经存在于核周结构和囊泡结构上，并且在添加氨基酸后更局限于这些结构(). 因此，在氨基酸饥饿条件下，mTORC1通路的活性与mTOR的亚细胞定位之间存在相关性，这意味着Rag介导的mTOR易位在mTORCl对氨基酸的反应中的激活中起作用。
我们未能找到与mTOR共同定位于氨基酸缺乏细胞中的内膜系统的既定标记。然而，在受氨基酸刺激的细胞中，核周区和大泡状结构上的mTOR与Rab7重叠()这表明，在氨基酸充足的细胞中，有很大一部分mTOR易位到晚期的内胚体和溶酶体隔室。在表达RagB的细胞中全球技术伙伴，即使在缺乏氨基酸的情况下，Rab7阳性结构上也存在mTOR().
氨基酸促进mTOR定位到Rab7-阳性隔间，该隔间也含有Rheb。（A）mTOR和Rab7在被氨基酸剥夺或刺激的细胞中的定位。瞬时转染dsRed-Rab7 cDNA的HEK-293T细胞在50分钟内缺乏血清和氨基酸，如有指示，则用氨基酸刺激10分钟。然后处理细胞检测mTOR（绿色）、Rab7（红色）和DNA含量（蓝色），并成像。显示了在氨基酸存在下mTOR定位的两个实例。（B）稳定表达RagB的HEK-293T细胞全球技术伙伴并瞬时转染dsRed-Rab7的cDNA，按（a）处理和处理。（C）Rheb1和Rab7在被氨基酸剥夺或刺激的细胞中的定位。瞬时转染1–2 ng GFP-Rheb1和dsRed-Rab7 cDNA的HEK-293T细胞按（A）处理，处理后检测Rheb2（绿色）、Rab7（红色）和DNA含量（蓝色），并成像。（D）Rag GTP酶在mTORC1的氨基酸可用性信号传导中的作用模型。
氨基酸刺激后出现mTOR的核周区和囊泡结构类似于Rab7阳性结构，其中GFP标记的Rheb定位于人类细胞中(27,28). 然而，与mTOR不同，氨基酸对Rheb的定位没有明显影响，因为GFP-Rheb1与dsRed-Rab7在氨基酸存在或不存在的情况下共同定位(). 不幸的是，目前无法在同一细胞中比较内源性mTOR和Rheb的定位，因为在固定细胞渗透以获得细胞内抗原后，GFP-Rheb或内源性Rheb信号丢失(27,28). 然而，鉴于在氨基酸刺激后，mTOR和Rheb均存在于Rab7阳性结构中，我们认为氨基酸可能通过Rag蛋白调节mTORC1向含有其激活物Rheb的同一细胞内隔间的运动来控制mTORC 1通路的活性（参见). 这可以解释为什么当细胞被剥夺氨基酸时，Rheb的激活剂，如胰岛素，不刺激mTORC1通路，以及为什么Rheb对氨基酸依赖的mTORC2激活是必要的(4)（图S12）。当Rheb高度过表达时，一些可能会变小，并不适当地遇到和激活mTORC1，这解释了为什么Rheb过度表达，而不是TSC1或TSC2的缺失，使mTORC2通路对氨基酸不敏感(4,5).
总之，Rag GTPases结合猛禽是必要的，足以介导mTORC1的氨基酸信号传导，并介导由氨基酸诱导的细胞内膜系统内mTOR的重新定域。考虑到控制mTORC1的途径中癌相关突变的普遍性(1)Rag功能在人类肿瘤中也可能被解除调控。
