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生物化学杂志。作者手稿；PMC 2008年6月3日提供。
以最终编辑形式发布为：
生物化学杂志。2007年8月3日；282(31): 22335–22343.
在线发布2007年6月12日。 数字对象标识：10.1074/jbc。M701477200型
预防性维修识别码：PMC2409283型
NIHMSID公司：NIHMS44507标准
PMID：17565989

PIAS3与ATF1相互作用并通过抗氧化反应元件调节人铁蛋白H基因*,秒

肯塔·岩崎,基洛斯·海利马里亚姆,1和Yoshiaki Tsuji先生2
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摘要

基因转录受到激活和抑制机制之间的平衡的协调调节，以响应各种外部刺激。铁蛋白由H和L亚单位组成，是参与铁稳态的主要细胞内铁储存蛋白。我们之前在人铁蛋白H基因及其各自的转录激活物（包括Nrf2和JunD）中发现了一种增强子，称为抗氧化反应元件（ARE）。这里我们发现ATF1(一激活t吨赎金如果演员1)是铁蛋白H ARE的转录阻遏物。后续酵母双杂交筛选确定PIAS3(第页蛋白质我抑制剂一已激活S公司TAT3）作为ATF1结合蛋白。对人铁蛋白H ARE调控的进一步研究表明：1）PIAS3逆转ATF1介导的铁蛋白H AR的抑制；2） ATF1被酰化，但PIAS3，一种SUMO E3连接酶，似乎在SUMO1介导的ATF1酰化或ATF1转录激活功能中没有发挥主要作用；3） PIAS3降低ATF1与ARE的结合；和4）用siRNA敲除ATF1可增加铁蛋白H的表达，而PIAS3敲除可降低铁蛋白H基础表达和氧化应激介导的诱导。这些结果表明，PIAS3可拮抗ATF1的阻遏功能，至少部分是通过阻断其DNA结合，最终激活ARE。总的来说，我们的结果表明PIAS3是ATF1的一个新调节器，它调节ARE介导的铁蛋白H基因的转录。

铁是一种重要元素，参与所有生物体的多种代谢功能；然而，过量的铁是有害的，因为它通过与芬顿化学中的过氧化氢反应催化羟基自由基的形成(1). 羟基自由基和其他活性氧物种可能会损害蛋白质、膜脂和核酸等细胞成分，这些物质与许多人类疾病和疾病的病因有关，包括神经遗传病、癌症和衰老(2-4). 因此，细胞必须在各种生理条件下通过以无毒但生物可用的形式储存多余的铁来严格控制细胞铁水平。

铁蛋白是主要的细胞内铁结合蛋白，由重链（H）和轻链（L）的24个亚基组成(5). 铁蛋白的重要性由其普遍表达、高度保守的蛋白质结构所支持(6,7)和铁蛋白H基因敲除小鼠的胚胎致死率(8). H亚单位具有氧化铁酶活性，参与氧化亚铁并将其并入铁蛋白外壳，而L亚单位在铁核的形成中起作用(6,7). 铁对铁蛋白和转铁蛋白受体的转录后调节通过实验得到了很好的表征，实验表明铁调节的相互作用反式-这些mRNA中的作用铁调节蛋白和铁反应元件(9-11). 在炎症过程中，铁蛋白的表达也以铁离子依赖的方式在转录水平上进行调节(12)，细胞分化(13,14)和氧化应激(15).

我们之前对一种抗氧化反应元件（ARE）进行了表征和鉴定三参与小鼠的转录激活(16)和人类(17)铁蛋白H基因。ARE是包含AP1和/或Mafbinding序列的增强子元素(18-20)，其中Nrf2(N个F-E2型-第页兴高采烈的如果演员-2) (21)结合并激活包括谷胱甘肽在内的多种II期解毒基因的转录S公司-转移酶、NAD（P）H-醌氧化还原酶1和血红素加氧酶1(22-25). 在人类铁蛋白L基因中也发现了类似的ARE元件(26). Nrf2是Cap’n’Collar碱性区亮氨酸拉链（b-Zip）家族成员，对铁蛋白H基因的转录激活也很重要(27)和铁蛋白L基因(28)通过化学预防剂。此外，我们证明了其他b-Zip转录因子，如JunD和JunB，参与铁蛋白H are的激活(17,29,30). 铁蛋白在这些应激条件下的上调使细胞对应激介导的毒性更具抵抗力(31,32)通过减少不稳定的铁池(33)从而最终限制活性氧的产生(34).

ATF1是b-Zip转录因子家族的成员，包括CREB和cAMP响应元件调制器(35). 这些b-Zip转录因子通过在家族内形成同源二聚体或异源二聚体以及与其他b-Zip基因转录因子如Jun和Fos家族成员在AP1结合序列或cAMP反应元件上调节靶基因(35,36). 转化淋巴细胞中ATF1表达增加(37)和转移性黑色素瘤细胞(38)可能有助于这些肿瘤细胞的生长潜能。ATF1似乎起到转录激活剂的作用(39-45)或抑制物(46-48)参与细胞增殖的基因；然而，控制靶基因ATF1功能多样性的分子机制尚不清楚。

针对直接与ARE结合的转录因子特征的广泛研究确定Nrf2为主要ARE激活蛋白(22). 相比之下，对ARE阻遏物或转录协同调节物的参与知之甚少。Yamamoto及其同事首次报道了细胞质抑制蛋白Keap1与Nrf2的相互作用(49)是ARE调节的最具特征的机制(22). 辅活化因子、辅抑制因子的招募和转录因子的翻译后调节是靶基因表达的关键决定因素。其中一种调节蛋白PIAS3(第页蛋白质我抑制剂一已激活S公司周转时间三)最初被鉴定为STAT3信号通路的特异性抑制剂(50). 越来越多的证据表明，PIAS家族（PIAS1、PIAS3、PIASx和PIASy）通过蛋白质相互作用调节多种细胞因子/生长因子信号通路和转录因子，包括NF-κB和SMAD(51). 还证明PIAS家族具有一个保守的RING指状锌结合域，参与SUMO-E3-连接酶活性并调节转录因子（如SMAD4）的活性(52)通过sumoylation。

我们之前确定ATF1是小鼠铁蛋白H ARE的结合蛋白(30); 然而，ATF1和一种ATF1调节蛋白在ARE增强子活性中的作用仍不明确。在这项研究中，我们报道ATF1是人铁蛋白H ARE的阻遏物，PIAS3是一种ATF1结合蛋白，通过减少其DNA结合来抵消ATF1阻遏器的功能体内以独立于苏美人的方式。这些结果表明PIAS3在铁蛋白转录调控和铁代谢中具有新的作用。

实验程序

细胞培养

从ATCC购得的K562人红白血病细胞在添加25 m米肝素，0.3克/升我-谷氨酰胺和10%胎牛血清（FBS，35-010-CV；Mediatech）。293细胞（ATCC）在含有Earle平衡盐溶液的最低必需培养基中培养米非必需氨基酸，1米米丙酮酸钠和2 m米 我-谷氨酰胺和10%FBS。这些细胞在37°C的加湿5%CO中培养2条件。

酵母双杂交筛选

以全长人ATF1为诱饵，利用酵母双杂交技术对购自Clontech的小鼠NIH3T3 pAct2 cDNA文库进行了筛选酿酒酵母应变PJ69-4A(马塔，trp1-901，leu2-3112，ura3-52，his3-200，gal4Δ，加仑80Δ，GAL2-ADE2，LYS2:GAL1-HIS3，金属2:GAL7-LacZ) (53). 用pGBDATF1转化PJ69-4A（培养在缺乏色氨酸的合成滴落培养基上），用抗ATF1抗体的Western blotting证实GAL4DBD-ATF1融合蛋白的表达。用20μg NIH3T3文库cDNA转化表达诱饵蛋白的单个菌落，并用0.1米醋酸锂、44%聚乙二醇3350，在30°C和10%Me条件下保持30分钟2在42°C下静置15分钟。用cDNA文库转化的酵母细胞接种在含有2 m的色氨酸/亮氨酸/组氨酸缺陷的合成滴落琼脂培养基上米3-氨基三唑。通过用玻璃珠（425-600微米；Sigma）对质粒DNA进行机械提取，并将其转化，从选择培养基上生长的20个阳性克隆中回收cDNA质粒大肠杆菌电穿孔法检测HB101（0.1-cm比色皿中1300 V，BTX）。用提取的cDNA转化的HB101在含有50μg/ml氨苄西林的M9/亮氨酸缺乏琼脂培养基上生长，然后分离质粒DNA，用限制性内切酶进行表征，并进行DNA测序（德克萨斯州休斯顿SeqWright公司）。阳性池中的两个克隆结果相同，都编码小鼠PIAS3的C末端区域。

DNA转染、免疫沉淀和蛋白质印迹

使用Bio-Rad开发的预先优化设置，通过电穿孔（Bio-Rad-X-Cell）将pCMVHA-ATF1、pCMVFLAG-PIAS3和/或pCMVT7-SUMO1转染293细胞。为了检测细胞中ATF1-PIAS3的相互作用，用抗FLAG抗体（M2；Sigma）和蛋白a-琼脂糖免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗HA抗体（HA11；Covance）进行Western blotting。对于人铁蛋白H-荧光素酶报告子分析，以前曾报道过人铁蛋白H5'上游增强子/启动子区域的克隆和荧光素酶质粒的构建(17). 将含有ARE（-4.5 kb）或缺乏ARE（-4.4 kb）的0.5-1μgofa铁蛋白H荧光素酶质粒瞬时转染K562细胞（1×107通过电穿孔（Bio-Rad X-Cell）或通过JetPEI（根据制造商的说明；息肉转染）以及ATF1和/或PIAS3表达质粒将细胞/100μl置于0.2-cm间隙试管中。作为转染的内部对照，同时转染20 ng pRL-CMV或pRL-EF（伸长因子启动子）。然后将转染的K562细胞以2-3×10的密度接种6细胞/60-mm板，含4ml培养基。培养36-48小时后，收集细胞，并使用双荧光素酶分析试剂（Promega）测量荧光素素酶活性。由铁蛋白H基因驱动的萤火虫荧光素酶表达被标准化为雷尼利亚萤光素酶的表达，或者在一些实验中，通过细胞提取物的蛋白质浓度。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

如前所述，通过ChIP分析评估转染或内源性ATF1与铁蛋白H ARE的结合(17). 简言之，1×107用1μg HA标记的ATF1表达质粒瞬时转染K562细胞40-48小时，然后用1%甲醛交联染色质，并使用ChIP分析试剂盒（Upstate/Millipore）制备细胞裂解物。用声波去膜器（Fisher）对交联染色质DNA进行12个脉冲周期（10 s）和间隔（20 s）的声波处理。用1μg小鼠IgG或抗HA抗体（HA11；Covance）免疫沉淀1/10等分的声波DNA，并使用如下所示的引物集对铁蛋白H ARE或非ARE区域进行半定量PCR。同时，将每种超声处理的DNA的1/50等分试样用于定量PCR以评估输入DNA的量。为了检测内源性ATF1与铁蛋白H ARE的结合，使用ATF1特异性抗体（SC-243x；Santa Cruz Biotechnology）进行了类似的ChIP分析。为了研究PIAS3对ATF1与铁蛋白H ARE结合的影响，将1μg HA-标记的ATF1表达质粒转染到1×107用抗HA抗体免疫沉淀K562细胞、0、2或9μg pCMVFLAGPIAS3和HA-ATF1染色质复合物。在存在0.1μCi的[α-32P] dCTP和以下特异于铁蛋白H ARE的PCR引物或铁蛋白H基因中不含ARE的另一序列：铁蛋白ARE引物：5'-CCCTCCCATTTATGACTGCTC-3'和5'-GTTCTGGAGTTCAGCACGTC-3'；铁蛋白非ARE引物：5'-ACTAGTACTCATAACATACAAAAT-3’和5'-TCTCTGAGGCTGTCAGAAGC-3’。

小干扰RNA（siRNA）转染

在ATF1 siRNA实验中，在293个细胞中使用了两种不同的转染方法（电穿孔和Lipofectamine 2000）。对于电穿孔，最后20、100或500 n米将siATF1（J-01004508，sense 5'-GAUCGAACUACACCUUCAUU-3'，and antisense 5'-UGAAGGGGUAGUUCGGAUCUCUU-3'；Dharmacon）或非靶向siControl（D-001210-01，sense 5'-UAGCGAAACACUCAUU-3'，antisense-5-UUGAUGUUUAGUCCUAUU-3''；Dharmcon）RNA转染到1×107在不含FBS或抗生素的培养基中使用Gene Pulser X-Cell（293细胞的Bio-Rad预优化设置）的293细胞。在室温下将细胞在试管中培养5-10分钟后，将细胞悬浮在10 ml FBS/无抗生素OptiMEM（Invitrogen）中，并在100 m米盘子。对于脂多糖胺介导的转染，40、200和400 pmol的siATF1或siControl RNA（最终40、200、400 pmol米在500μl FBS/无抗生素OptiMEM中与5μl Lipofectamine 2000（Invitrogen）混合。将产生的RNA-lipid复合物在室温下培养30分钟。2 ml生长培养基（1×105抽吸293个细胞/孔（6孔板），向293细胞中添加500μlof OptiMEM（FBS/无抗生素）和500μl Lipofectamine 2000-siRNA混合物并培养48小时。为了检测ATF1、铁蛋白h和β-肌动蛋白的表达，用抗ATF1（sc-243；Santa Cruz Biotechnology）、抗铁蛋白H（sc-25617；圣克鲁斯生物技术）和抗β-肌动蛋白（A5441；Sigma）抗体。还使用TRIzol（Invitrogen）分离总RNA，并用Northern印迹法对10μg RNA进行32P标记的人铁蛋白H cDNA探针。在PIAS3 siRNA实验中，两种不同siRNA的100 pmol（最终浓度，1μ米)将人PIAS3（M-004164-05，sense 5'-GGAGCAAAUGUGAUUAUAUU-3'，and antisense 5'-UUAUAAUCACAUUGGCUCCUU-3'；J-004164-12，sense 5’-GACAGAGAGUCCACUUAUU-3’，and antisse 5'-AUAGGCUACUCUCUCUUU-3''；Dharmacon）或siControl RNA（D-001210-01；Dharmcon）转染到1×107使用基因脉冲X细胞（Bio-Rad，K562的预先优化设置）电穿孔K562细胞，不使用FBS或抗生素。转染后4小时，将FBS添加到最后20%，培养细胞40小时。然后用50μ米t-BHQ或氯化血红素8小时后收获。对细胞裂解物进行Western blotting，使用抗PIAS3（AP1245a；Abgent）、抗铁蛋白H（sc-25617）和抗β-肌动蛋白（A5441；Sigma）抗体检测PIAS3、铁蛋白H和β-肌动蛋白表达水平。还分离出总RNA，并对10μg RNA进行Northern印迹以与32P标记的人铁蛋白H cDNA探针。

结果

ATF1与铁蛋白H ARE结合并抑制其转录

为了研究ATF1在铁蛋白H ARE调节中的作用，我们首先对细胞中ATF1与铁蛋白H ARE的结合进行了ChIP测定。将HA-ATF1转染到K562细胞，然后进行ChIP检测，结果表明转染的HA-ATF 1与细胞内铁蛋白H基因的ARE结合(图1A类). 我们还使用ATF1抗体检测了K562细胞中内源性ATF1与铁蛋白H ARE的结合(图1B). 这些结果表明ATF1是铁蛋白H ARE的结合蛋白。

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ATF1是铁蛋白H ARE的结合蛋白

A类，将1μg pCMVHAATF1或pCMVHA质粒转染到1×107电穿孔K562细胞。培养48小时后，染色质免疫沉淀(IP（IP）)用小鼠IgG或抗-HA抗体，按照“实验程序”进行。免疫沉淀物在[α-32P] 铁蛋白H ARE和非ARE的dCTP和引物集（“实验程序”中的引物序列），然后是8%聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术。使用0.5pg的-5.2-kb铁蛋白H-荧光素酶质粒DNA作为PCR阳性对照的模板，并将PCR扩增的155-bp DNA作为铁蛋白H ARE和非ARE区域的大小标记。显示了三个独立实验的代表。B, 1 × 106使用抗ATF1家族或ATF1特异性抗体对K562细胞进行ChIP分析，以观察内源性ATF1与铁蛋白H ARE的结合。输入DNA和ChIP DNA样本在[32P] 用8%丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术观察扩增的155-bp DNA。显示了四个独立实验的代表。

然后我们询问ATF1是否通过ARE调节铁蛋白H转录。将不同数量的ATF1表达质粒与含有ARE序列的-4.5-kb人铁蛋白H荧光素酶报告子或缺少ARE的-4.4-kb人体铁蛋白H荧光素酶报告基因一起转染到K562细胞中，并进行荧光素素酶分析。出乎意料的是，ATF1抑制了含有ARE（-4.5-kb ARE（+））的铁蛋白H荧光素酶的表达，而缺乏ARE（-4.4-kb AR（-））的荧光素素酶结构显示基础表达降低，对ATF1无反应(图2A类). 为了证实这一观察结果，并评估内源性ATF1对铁蛋白H表达的作用，我们通过转染siATF1 RNA来敲除ATF1，并通过Northern和Western blots检测铁蛋白H的表达。我们还尝试用以下两种药物进行治疗第三种-丁基对苯二酚（t-BHQ）或氯化血红素，两者都通过ARE诱导人铁蛋白H基因的转录(17,56). 如所示图2(B和C)ATF1敲除增加了内源性铁蛋白H蛋白和mRNA的表达，无论是在稳定状态还是在t-BHQ或氯化血红素介导的诱导水平，表明内源性ATF1是铁蛋白H基因的阻遏物。从这些综合结果中，我们得出结论，ATF1是人类铁蛋白H基因通过ARE的转录抑制因子。

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ATF1是铁蛋白H ARE的转录抑制因子

A类,1 × 107用1μg的-4.5-kb（ARE+）或-4.4-kb的铁蛋白H-荧光素酶，加上20 ng的pRL-CMV作为转染的内部控制，以及0.25、0.5或1μg ATF1表达质粒电穿孔K562细胞。培养36小时后，收集细胞进行双重荧光素酶分析。萤火虫荧光素酶的表达通过雷尼利亚荧光素酶，不含ATF1的-4.5-kb铁蛋白H-荧光素酶的值定义为100%。给出了三个独立实验的结果和标准误差。B使用电穿孔法转染不同数量（显示最终浓度）的siRNA对照或siATF1RNA(顶部)或Lipofectamine 2000(底部)将50μg全细胞裂解物与抗ATF1和抗铁蛋白h特异性抗体进行Western blotting。将重组ATF1和人铁蛋白H蛋白作为Western blotting的阳性对照。β-肌动蛋白蛋白印迹显示为负载控制。C,5 × 106用100 pmol（最终，1μM）非靶向siRNA转染K562细胞(siControl（siControl）)或ATF1siRNA(信号ATF1). 转染48 h后，用10μM t-BHQ或10μM氯化血红素处理细胞24 h，分离总RNA和全细胞裂解物。对5μg总RNA进行Northern印迹，用32P标记的铁蛋白H cDNA。总RNA的溴化乙锭染色如下所示，以验证RNA的均匀负载和完整性。显示了28和18 S核糖体RNA的位置。用50μg全细胞裂解物进行Western blotting，用抗ATF1抗体检测内源性ATF1表达水平。

PIAS3是一种ATF1结合蛋白，通过ARE逆转ATF1介导的铁蛋白H基因转录抑制

为了研究ATF1介导的铁蛋白H ARE的调节，我们采用酵母双杂交筛选来鉴定ATF1结合蛋白，这些蛋白可能通过蛋白质相互作用调节ATF1的活性。我们用全长人ATF1作为诱饵筛选了NIH3T3小鼠cDNA文库，并鉴定了编码PIAS3的C端212个氨基酸（氨基酸418-630）的cDNA(图3A类). 由于PIAS3在小鼠和人类（97%）之间的氨基酸序列中高度保守，包括从我们的双杂交筛选中分离的C末端区域，因此我们在本研究的其余部分中研究了人类PIAS3对人类ATF1转录因子的调节作用。首先，我们通过共免疫沉淀实验证实了哺乳动物细胞中PIAS3和ATF1之间的相互作用。将全长FLAG-PIAS3和HA-ATF1表达质粒共转染293细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体免疫沉淀，用抗HA抗体免疫印迹。在HA-ATF1和FLAG-PIAS3表达水平相等的条件下(图3B,中间的和底部面板)，HA-ATF1只有在FLAG-PIAS3在细胞中表达时才被共沉淀，尽管在所有三个通道中也检测到一个大小略大于HA-ATF 1的未知非特异性带(图3B,顶部面板). 然后，我们用抗PIAS3抗体免疫沉淀，然后用抗ATF1家族抗体免疫印迹（与CREB和cAMP反应元件调节剂交叉反应），检测内源性PIAS3和ATF1相互作用。如所示图3CPIAS3抗体共同免疫沉淀内源性ATF1和CREB，而对照IgG未能沉淀这些蛋白。总之，这些结果表明人类PIAS3是一种ATF1结合蛋白。

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PIAS3是一种ATF1结合蛋白

A类ATF1-PIAS3相互作用的酵母双杂交分析。将PJ69-4A酵母细胞转化为pGBD和pAct2（-/-）、pGBDATF1和pAct1（ATF1/-。pGBDATF1是人类全长ATF1，pAct2-PIAS3是从pAct2 NIH3T3 cDNA文库中分离出的小鼠C末端PIAS3。B将1μg pCMVHA-hATF1和9μg pCMCFLAG-hPIAS3转染到293细胞中，并对细胞裂解物进行免疫沉淀(IP（IP）)免疫印迹法检测抗FLAG抗体(工作分解结构)抗HA抗体(顶部面板)或用抗HA抗体对全细胞裂解物进行Western印迹(中间面板)或抗FLAG抗体(底板). 将pCMVHA-ATF1转染的细胞裂解液同时加载到IP/WB凝胶上，以鉴定HA-ATF1带。显示了四个独立实验的代表。C用1μg兔IgG或抗PIAS3抗体免疫沉淀800μg 293个全细胞裂解物，然后用抗ATF1家族抗体免疫印迹。50μg全细胞裂解物用于ATF1/CREB和PIAS3的Western blot，以确认这些蛋白在SDS-PAGE凝胶中的位置。显示了三个独立实验的代表。

为了研究PIAS3对ATF1功能和铁蛋白H转录的作用，我们将-4.4-kb ARE（-）-或-4.5-kb AR（+）-铁蛋白H荧光素酶报告子与PIAS3共同转染到K562细胞中，以测试PIAS3是否激活或抑制铁蛋白H ARE。如所示图4A类，PIAS3特异性激活-4.5kb ARE（+）报告基因表达。接下来，我们询问PIAS3是否调节ATF1对铁蛋白H ARE的抑制作用。将-4.5-kb ARE（+）-铁蛋白H-荧光素酶报告子与ATF1和不同数量的PIAS3一起转染到K562细胞中，结果表明ATF1可重复抑制铁蛋白H ARE-荧光素酶，并且ATF1介导的ARE抑制可通过增加PIAS3的数量而逆转(图4B). 这种逆转作用不是由于与PIAS3共转染后ATF1表达减少所致(图4B,底部面板). 我们在293细胞中获得了类似的结果，表明PIAS3对ATF1阻遏的逆转作用依赖于铁蛋白H ARE的存在(图4C). 因此，我们得出结论，PIAS3通过ARE覆盖了ATF1介导的人类铁蛋白H基因的转录抑制。

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PIAS3通过ARE逆转ATF1介导的人铁蛋白H转录抑制

A类,1 × 107用0.5μg-4.5-kb（ARE+）或-4.4-kb的铁蛋白H-荧光素酶加0.25μg或0.5μg pCMVFLAG-PIAS3电穿孔K562细胞（通过添加pCMVFLAG空载体，质粒DNA总量达到1μg）。36小时后收集细胞，并测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶的表达通过雷尼利亚荧光素酶，不含PIAS3的-4.5-kb铁蛋白H-荧光素酶的值定义为100%。给出了三个独立实验的结果和标准误差。B,1 × 107用0.5μg-4.5-kb铁蛋白H-荧光素酶和1μg pCMV-HAATF1以及不同量（0.25、0.5和1μg）的pCMVFLAG-hPIAS3电穿孔K562细胞。转染36 h后制备细胞裂解物，并进行荧光素酶分析和HA-ATF1蛋白印迹(底部). 通过将no ATF1、no PIAS3（转染空载体）的荧光素酶读数设置为100%，确定荧光素素酶表达的折叠诱导，并显示三个独立实验和标准误差。C使用Jet PEI转染试剂，用50ng的-4.5（+ARE）或-4.4（-ARE）铁蛋白H-萤光素酶启动子以及指示量的HA-ATF1和/或FLAG-PIAS3表达载体转染293细胞。通过添加pCMV空载体，每次转染的质粒DNA总量等于500 ng。转染48 h后，收集细胞进行荧光素酶分析和HA-ATF1蛋白印迹。-4.5-kb ARE（+）报告子的荧光素酶值以及空载体被定义为100%。给出了四个独立实验的平均值和标准误差。

ATF1以PIAS3-独立方式进行Sumoylated

最近有报道称，CREB在缺氧条件下通过赖氨酸285和赖氨酸304的sumoylation被激活(54). CREB和ATF1属于b-Zip转录因子家族，具有高度保守的氨基酸，包括这两个赖氨酸残基；一个是Lys215另一个是Lys234ATF1的(补充图S1B). 因为PIAS3具有SUMO E3-ligase活性并调节各种靶蛋白的功能(55)，我们首先测试了ATF1在Lys是否被酰化215或Lys234以及PIAS3是否参与了ATF1的合成。我们对PIAS3、ATF1和SUMO1共转染的结果进行了Western blot分析，结果表明ATF1可以被sumoylated，但PIAS3在Lys的SUMO1介导的ATF1 sumoylate中不起主要作用215和Lys234(补充图S1). 此外，ATF1的两个sumoylation位点（K215R、K234R和K215/234R）的突变并不影响PIAS3逆转ATF1介导的ARE抑制的功能(补充图S2). 为了证实这些结果，我们测试了PIAS3的E3-SUMO连接酶结构域对ATF1介导的ARE阻遏的逆转作用是否重要。PIAS3 1-395，由PIAS3的N末端395个氨基酸组成，包含环指状锌结合域和SUMO E3-γ-γ活性的PINIT基序，但缺少C末端ATF1相互作用域（小鼠PIAS3中的氨基酸418-630；图3A类)，未能逆转ATF1介导的铁蛋白H阻遏(图5). 相反，PIAS3 395-619没有SUMO-E3连接酶结构域，但包含ATF1相互作用结构域，显示了与wt-PIAS3一样有效的逆转ATF1介导的铁蛋白H阻遏作用(图5). 因此，我们得出结论，PIAS3对铁蛋白H ARE上ATF1活性的去表达并不是由于PIAS3通过sumoylation介导的ATF1转录功能的激活。

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PIAS3的SUMO-E3连接酶结构域不需要覆盖ATF1介导的铁蛋白H ARE阻遏

将50 ng-4.5-kb铁蛋白H-荧光素酶报告子与HA-ATF1（100 ng）和FLAG-PIAS3表达质粒（wt，250 ng；1-395500 ng；395-619125 ng，其中使用不同数量的wt和突变PIAS3质粒获得可比表达水平）一起转染293细胞。通过添加pCMV空载体，每次转染的质粒DNA总量等于650 ng。转染后48h，取细胞进行荧光素酶检测。-4.5-kb ARE（+）报告子的荧光素酶值以及空载体被定义为100%。给出了四个独立实验的平均值和标准误差。通过Western blots验证转染ATF1和PIAS3（wt和突变体）的可比表达水平(底部).RLD公司，环状指状锌结合域。

PIAS3降低ATF1与铁蛋白HARE的DNA结合

由于PIAS3没有增强ATF1转录活性，我们检测了通过与PIAS3的相互作用抑制ATF1与铁蛋白H ARE结合的可能性。为了解决这一问题，用HA-ATF1质粒以及增加量的FLAG-PIAS3质粒转染K562细胞，并在ChIP测定中检测HA-ATF1与铁蛋白H ARE的结合。与对照IgG相比，未经PIAS3转染，HA-ATF1和铁蛋白H ARE之间的特异性相互作用可通过增加由抗-HA抗体沉淀的ChIP DNA产生的155-bp PCR产物来证实(图6). 这种ATF1-铁蛋白H ARE相互作用因PIAS3表达增加而减弱(图6). PIAS3表达没有改变ATF1表达水平(图6,底部面板)表明PIAS3抑制ATF1与ARE的结合。这些结果还表明，PIAS3最终作为基础铁蛋白H表达的激活剂(图4)至少部分通过ATF1与铁蛋白H ARE的阻断结合。

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PIAS3阻止ATF1绑定到ARE体内

1×107用1μg pCMV-ATF1和0、2或9μg pCMCVLAG-PIAS3转染K562细胞48 h，用抗鼠IgG或抗HA抗体进行ChIP检测。输入DNA和ChIP DNA样本在[32P] dCTP和一组引物，用于扩增含有铁蛋白H ARE的155 bp(左边)或非ARE区域(正确的). 在相同的PCR条件下，同时扩增0.5 pg的pBluescript-5.2-kb铁蛋白H-荧光素酶质粒DNA，作为PCR阳性对照和大小标记。样品经过8%丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。转染的K562细胞裂解物也用于蛋白质印迹(工作分解结构)用抗HA和抗FLAG抗体分别确认HA-ATF1和FLAG-PIAS3的表达。实验重复了三次，并给出了具有代表性的结果。IP（IP），免疫沉淀。

我们之前证明，t-BHQ或氯化血红素治疗诱导氧化应激可通过ARE诱导人铁蛋白H基因的转录(17,56). 为了研究内源性PIAS3在ARE介导的铁蛋白H基因表达中的作用，通过将PIAS3 siRNA转染到K562细胞中，暂时阻断PIAS3的表达，并通过Western和Northern blots检测t-BHQ或氯化血红素介导的铁蛋白H诱导。如所示图7PIAS3敲除降低了铁蛋白H mRNA和蛋白的基础表达和t-BHQ或氯化血红素介导的诱导。这与ARE调节铁蛋白H的基础转录和氧化应激介导的活化这一事实一致(56). 结合结果图6这些结果表明，PIAS3抑制了ATF1与铁蛋白H ARE的结合，这表明PIAS3最终作为铁蛋白H表达的激活剂，至少部分是通过取消ATF1阻遏物在铁蛋白H AR上的功能。

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PIAS3敲低降低铁蛋白H的基础表达和氧化应激介导的诱导

A类,1 × 107用100 pmol（最终，1μmol）转染K562细胞米)非靶向siRNA的(siControl（siControl）)或PIAS3-靶向siRNA(siPIAS3公司，M-004164-05；Dharmacon）。转染40小时后，用50μ米t-BHQ或50μ米用PIAS3、铁蛋白h和β-肌动蛋白抗体对50μg的每个细胞裂解液进行Western blotting。实验重复了三次，并显示了具有代表性的Western blots结果。B,5 × 106用100 pmol（最终，1μmol）转染K562细胞米)无siRNA（无siRNA），非靶向siRNA(siControl（siControl）)或PIAS3 siRNA(siPIAS3公司，J-004164-12；法尔马孔）。转染48小时后，用10μ米t-BHQ或10μ米氯化血红素24小时后，对5μg总RNA进行Northern印迹，用32P标记的铁蛋白H cDNA。总RNA的溴化乙锭染色如下所示，以验证RNA的均匀负载和完整性。显示了28和18 S核糖体RNA的位置。通过蛋白质印迹分析50μg全细胞裂解物的PIAS3和β-肌动蛋白蛋白的表达。

讨论

红系细胞铁稳态的严格调节不仅对血红素合成期间提供充足的铁至关重要，而且对细胞抵抗氧化应激也至关重要(6,57). 铁蛋白在细胞内多余游离铁的储存中起着关键作用，属于一组通过are转录调控的抗氧化基因(16,17,26,56). 对激活ARE的转录因子的研究表明，Nrf2是一种重要的转录因子(22-24). 除Nrf2外，我们和其他人报告称，其他一些AP1/Maf家族成员，如JunD(17)和Nrf1(58,59)，是铁蛋白基因和其他抗氧化基因的转录激活物，通过are进行调节。

在这项研究中，我们确定ATF1是一种与铁蛋白H ARE结合的蛋白，作为转录阻遏物（图。​（图11和​和2）。2). ATF1通过激活皮层神经元细胞中的低氧诱导基因，如p21waf1/cip1、烯醇化酶和促红细胞生成素，参与细胞生长和分化的调节(43)前脂肪细胞中的CCAAT/增强子结合蛋白-β和-δ（C/EBP-β和-Δ）(40,44)，废气再循环-1（e（电子）阿利克罗思第页应答基因-1) (42)，转化生长因子-β2(41)，组蛋白H4(60)和乳腺癌易感基因BRCA1(39). ATF1也是诱导许多癌细胞中与高糖代谢相关的II型己糖激酶基因的转录因子之一(45).

除了ATF1介导的转录激活外，ATF1还通过CREB/ATF1结合位点抑制一些具有肿瘤抑制功能的基因，如视网膜母细胞瘤、gelsolin和血小板反应蛋白-I(46-48). 因此，ATF1可以作为转录激活因子或阻遏因子发挥作用。ATF1调节靶基因表达的功能可能取决于由ATF1结合增强子序列、ATF1结合伙伴和ATF1磷酸化状态调节的特定靶基因；然而，决定ATF1转录激活或抑制的分子机制尚不清楚。

为了更好地理解ATF1通过ARE增强子介导的铁蛋白H转录调控，我们进行了酵母双杂交筛选，并将PIAS3鉴定为ATF1结合蛋白(图3). PIAS介导的转录调控的建议或证明机制如下：1）PIAS通过转录因子的酰化抑制或激活靶基因的转录(55); 2） PIAS通过蛋白质相互作用阻断转录因子的DNA结合能力(50); 和3）PIAS蛋白招募转录协同调节剂，如组蛋白脱乙酰化酶(61)或p300/CREB-结合蛋白(62).

我们在本研究中的结果表明，PIAS3通过ARE介导的人铁蛋白H基因的激活不是由于PIAS3介导的Lys的ATF1酰化215和Lys234（补充图。S1（第一阶段）和第2页)而是由于PIAS3介导的ATF1与细胞中铁蛋白H ARE结合的阻断(图6). 测试PIAS3是否抑制ATF1与铁蛋白H ARE的结合在体外，我们使用纯化的重组ATF1（His-tagged ATF1或GSTATF1）和重组PIAS3（His-tagged PIAS3）进行凝胶移位分析。我们的重复实验表明，重组PIAS3没有抑制ATF1与铁蛋白H ARE的结合在体外（未显示数据）；据推测，ATF1-PIAS3复合体在在体外结合分析条件。

PIAS3介导的ATF1调节可能与PIASx介导的Stat4抑制或PIASy介导的Stat1抑制相似或相关，其中这些PIAS蛋白抑制Stat1和Stat4转录因子，但不抑制在体外凝胶阻滞试验中的DNA结合活性(63,64). 我们的ChIP分析结果显示PIAS3降低了ATF1与铁蛋白H ARE的结合(图6)例如，提示PIAS3可能在铁蛋白H ARE结合之前隔离ATF1，或者PIAS3需要额外的辅因子来抑制ATF1与铁蛋白H AR的结合体内因为ATF1是铁蛋白H ARE的阻遏物(图2)，通过PIAS3将ATF1从ARE隔离可能最终允许其他激活剂，如Nrf2和JunD(17,56)，绑定并激活ARE。PIAS3也可能通过染色质重塑对ARE具有直接激活功能。最近有研究表明，PIAS家族成员减轻了染色质致密化，导致靶基因的转录激活(65,66). 因为PIAS3序列中有锌指状基序(51)，我们还通过凝胶迁移率变化分析测试了PIAS3是否直接与铁蛋白H ARE序列结合。然而，我们没有观察到延迟的PIAS3-铁蛋白H ARE带（数据未显示）。这些结果表明，PIAS3和ATF1之间铁蛋白H ARE结合的竞争似乎不是PIAS3覆盖ATF1介导的铁蛋白H AR转录抑制的机制。

目前，我们没有证据表明ATF1如何抑制铁蛋白H ARE的转录。然而，在以ATF1为诱饵的酵母双杂交筛选中，除了PIAS3外，我们分离出了几个没有特征的cDNA克隆，其中一些似乎在我们的初步荧光素酶报告实验中显示出转录共抑制活性。4有必要进一步研究ATF1抑制ARE增强子活性的分子机制。

ATF1介导的铁蛋白H阻遏的生物学意义是什么？ATF1在许多转化淋巴细胞中过度表达(37)在转移性黑色素瘤细胞中(67). 此外，EWS之间的基因融合(电子战英的秒arcoma蛋白）和t（12；22）染色体易位的ATF1在透明细胞肉瘤中被发现(68). EWS/ATF1嵌合转录因子在维持肿瘤细胞生存能力中发挥作用，因为抗ATF1单链抗体抑制EWS/ATF降低了透明细胞肉瘤的生存能力(69)并抑制黑色素瘤细胞的致瘤性和转移潜能(38). 根据本研究的结果，我们推测，一些ATF1活性增加的癌细胞可能通过ARE介导的转录抑制降低了铁蛋白H基因的表达。这似乎有利于肿瘤细胞的生长，因为一些证据表明，铁蛋白H的下调增加了K562红白血病细胞和其他癌细胞中不稳定的铁库，从而促进细胞生长和致瘤性(70,71). 这也与我们之前的发现一致，即用腺病毒E1A癌基因转化的NIH3T3小鼠成纤维细胞显示了铁蛋白H基因的转录抑制(29,72).

总之，ATF1是人类铁蛋白H基因通过ARE的转录阻遏物。PIAS3与ATF1结合，但在SUMO1介导的ATF1酰化或ATF1转录活性的诱导中不起主要作用。PIAS3介导的ATF1与ARE的隔离似乎是铁蛋白H表达上调的机制。我们的研究表明，ATF1和PIAS3是铁蛋白are的新调节蛋白，可能还有are调节的其他II期解毒基因。

补充材料

2

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致谢

我们非常感谢Satoshi Kishida博士在酵母双杂交分析中提供的卓越技术建议和帮助。我们感谢Elizabeth L.MacKenzie博士彻底阅读了这份手稿。

脚注

三使用的缩写如下：

是
抗氧化反应元件
CREB公司
cAMP反应元件结合蛋白
斯达
信号转导子和转录激活子
相扑
小型泛素样修饰物
FBS公司
胎牛血清
炸薯条
染色质免疫沉淀
哈
血凝素
小核糖核酸
小干扰RNA
t-BHQ公司
第三种-丁基对苯二酚
重量
野生型

秒本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图。S1（第一阶段）和第2页.

*这项工作得到了国立卫生研究院DK-60007（给Y.T.）拨款的部分支持。这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。

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