分子细胞生物学。2002年7月；22(14): 5222–5234.
PIAS蛋白作为SUMO-1连接酶调节转录因子
，1 ，1 ，1,2和1,三，*
努拉·科塔亚
赫尔辛基生物医学研究所，1临床化学系，2芬兰赫尔辛基大学生物技术研究所和赫尔辛基中心医院，FIN-00014三
乌拉·卡尔沃宁
赫尔辛基生物医学研究所，1临床化学系，2赫尔辛基大学生物技术研究所和赫尔辛基大学中央医院，芬兰赫尔辛基FIN-00014三
奥利·A·Jänne
赫尔辛基生物医学研究所，1临床化学系，2芬兰赫尔辛基大学生物技术研究所和赫尔辛基中心医院，FIN-00014三
乔尔马·J·帕尔维莫
赫尔辛基生物医学研究所，1临床化学系，2芬兰赫尔辛基大学生物技术研究所和赫尔辛基中心医院，FIN-00014三
赫尔辛基生物医学研究所，1临床化学系，2芬兰赫尔辛基大学生物技术研究所和赫尔辛基中心医院，FIN-00014三
*通讯作者。通讯地址：芬兰赫尔辛基FIN-00014赫尔辛基大学生物医学研究所赫尔辛基生物医学研究所，邮政信箱63。电话：358-9-191 25291。传真：358-9-191 25302。电子邮件：if.iknisleh@omivlap.amroj. 收稿日期：2001年11月6日；2001年12月26日修订；2002年4月8日接受。
摘要
PIAS（活化STAT蛋白抑制剂）蛋白与各种转录因子的活性相互作用并调节其活性。在这项工作中，我们证明PIAS蛋白xα、xβ、1和3与小泛素相关修饰物SUMO-1及其E2结合酶Ubc9相互作用，并且PIAS蛋白本身被SUMO-1（sumoylated）共价修饰。PIAS蛋白也以非共价的方式系住其他sumoylated蛋白。此外，重组PIASxα在体外增强Ubc9介导的雄激素受体和c-Jun的sumoylation。重要的是，PIAS蛋白在促进完整细胞中琥珀酰化的能力上存在差异。刺激蛋白sumoylation的能力以及与sumoylated蛋白的相互作用依赖于保守的PIAS环指状结构域。这些功能与PIASxα对雄激素受体依赖性转录的活性有关。总之，我们的结果表明PIAS蛋白作为SUMO-1-系留蛋白和锌指依赖的E3 SUMO蛋白连接酶发挥作用，这些特性可能解释了它们调节各种转录因子活性的能力。
最近发现的PIAS（活化STAT蛋白抑制剂）蛋白家族成员与几种不同的核蛋白相互作用。PIAS1和PIAS3分别与STAT1和STAT3结合，并抑制其作用(4，28). PIASxα/ARIP3（雄激素受体[AR]相互作用蛋白3）最初被鉴定为AR相互作用蛋白，它调节受体的转录活性(34). 其他PIAS蛋白最近被证明是AR和其他类固醇受体的协同调节剂(25，57). PIASxβ/Miz1（Msx相互作用锌指）与含有同源结构域的Msx2蛋白结合(61)与PIAS1几乎相同的GBP（Gu/RNA解旋酶II结合蛋白）与Gu/RNA II解旋酶相互作用(59). 最近，在许多酵母双杂交筛选中发现了PIAS蛋白，包括PIASxα/ARIP3，其与小鼠失能2（mDab2）的相互作用(三)和DJ-1蛋白(54)PIAS1与p53的相互作用(9)，和PIAS3与高迁移率组蛋白HMGI-C的相互作用(63)和锌指蛋白Gfi-1(43). 除PIASx（PIASxα/ARIP3和PIASxβ/Miz1）外，Minty等人还将SUMO-1（小泛素相关修饰物1）鉴定为p73α相互作用蛋白(32)，他建议通过与与p73α共价连接的Smt3p（酵母SUMO）的相互作用来分离PIASx。我们还检测到SUMO-1是酵母中主要的PIASxα/ARIP3相互作用蛋白（未发表结果）。
SUMO蛋白家族成员，也称为Sentrin、GMP1、PIC1和Ubl1(31，37，62)存在于原生动物、后生动物、植物和真菌中。后生动物中的SUMO蛋白可分为两个家族：SUMO-1家族和SUMO-2和-3家族(31，37，62). SUMO-2和SUMO-3在氨基酸水平上非常相似（人类蛋白质的同源性为97%），但它们与SUMO-1的同源性仅为～50%。SUMO-1与泛素只有18%的同源性，但它有一个泛素样蛋白共同的泛素折叠(2). SUMO修饰（sumoylation）途径在机理上与泛素化途径相似，但这两个过程的酶是不同的。编码SUMO修饰过程酶的基因在酵母中是必不可少的，并且接合机制相对保守(18，27，49). SUMO由E1的特异活性激活，E1是一种包含SAE1/Aos1和SAE2/Uba2蛋白的异二聚体(6，21). 随后，SUMO被转移到E2-结合酶Ubc9(7，10，18，48). 有几种E2泛素连接酶，但迄今为止只鉴定出一种SUMO E2。在泛素化过程中，E3泛素蛋白连接酶促进泛素从E2酶转移到底物中目标赖氨酸残基的ɛ氨基。E3泛素蛋白连接酶在很大程度上负责泛素化的底物特异性(60). 已经建立了两类不同的泛素连接酶：HECT（与E6-AP羧基末端同源）结构域E3s和环指E3s(16). HECT域E3s与泛素形成硫醇酯中间体，作为该过程的一部分，而环指E3s被认为有助于泛素从E2直接转移到底物，可能不会形成硫醇酯类中间体（参考文献29以及其中的参考）。
PIAS蛋白最保守的部分是其中心区域，它可能形成一个称为Miz锌指的锌结合域(61). 在无脊椎动物的许多蛋白质中也发现了类似的结构域，例如黑腹果蝇PIAS同源Zimp（含锌指，Miz1，PIAS3-样），预测秀丽隐杆线虫蛋白质，以及酿酒酵母七肽相互作用蛋白Nfi1p，以及来自葡萄裂殖酵母，蚕豆、和拟南芥.
PIAS或PIAS样蛋白的许多相互作用伙伴，如AR、p53、septins和DJ-1蛋白(12，19，42，45，54)，由SUMO-1修改。因为PIASxα/ARIP3能够与sumoylated蛋白和SUMO-1相互作用(32)，我们检测了PIAS蛋白在蛋白质sumoylation中的作用。我们在这里证明，除了与SUMO-1和Ubc9相关外，PIASxα/ARIP3本身也被sumoylated，即使它不包含SUMO附件的可识别共识位点。更重要的是，PIASxα/ARIP3连接其他sumoylated蛋白并增强AR和c-Jun的sumoylation。我们还表明，PIAS蛋白在促进完整细胞中sumoyleting的能力方面存在差异。PIASxα/ARIP3的环形指状结构对于所有这些功能都是必需的。同样，PIASxα/ARIP3和PIAS1对AR依赖性转录的影响依赖于它们的类环结构域。总之，PIASxα/ARIP3和其他PIAS蛋白不仅与SUMO-1和其他sumoylated蛋白相互作用，而且还以类似于RING型E3泛素蛋白连接酶的方式作为E3型SUMO蛋白连接蛋白发挥作用。
材料和方法
材料。
小鼠单克隆抗FLAG抗体M2购自Sigma，小鼠单克隆抗GMP-1购自Zymed。描述了兔抗AR多克隆抗体K333和抗ARIP3抗体(24，34). 抗绿色荧光蛋白（GFP）的兔多克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。抗GRIP1单克隆抗体是M.Brown赠送的礼物。辣根过氧化物酶结合的抗兔免疫球蛋白G（IgG）和抗小鼠IgG来自Zymed。罗丹明红X-缀合山羊抗小鼠IgG来自Jackson ImmunoResearch。针对五种His序列的小鼠单克隆抗体购自齐亚根。睾酮来自Makor Chemicals。
质粒及其结构。
如前所述，通过PCR构建了pFLAG-ARIP3、pFLAG-ARIP3Δ102-207、pFLAG-ARIP3Δ的347-418、pFLAH-ARIP3的Δ346-475和pFLAG-ARIP3的△467-547(26). PCR还构建了pFLAG-ARIP3Δ467-487；ARIP3（1-466）编码序列通过使用含有欣dIII位点和含有千磅我的网站。使用5′和3′引物扩增ARIP3（488-572）编码序列，这两个引物均含有千磅I站点。首先将PCR片段连接到pCMV-Tag2A（Stratagene）中，然后将ARIP3Δ467-487编码序列转移到pFLAG-CMV2中生态意大利。在pFLAG-ARIP3（W383A）中，根据制造商的说明，使用定点突变系统将Trp 383密码子突变为Ala密码子（Stratagene）。pFLAG-PIAS3和pFLAG-PAAS1是K.Shuai送的礼物，Miz1 cDNA是R.Maxon送的礼物。全长pFLAG-Miz1的构造如前所述(25). pFLAG-PIAS1Δ310-407是通过使用含有Xba公司我和欣dIII站点。PCR片段在Xba公司我的站点在mPIAS1编码序列中。pFLAG-PIAS1（W372A）是通过使用定点突变系统（Stratagene）生成的。pSG5-rAR、pcDNA-Flag-hAR和pcDNA-Flag-hAR-K386R/K520R[AR（K→R） ]已描述(39，42). 将ARIP3、ARIP3Δ347-418、ARIP1Δ467-487、Miz1、PIAS1和PIAS3编码序列克隆到pCMV-Tag2中进行体外翻译。GFP-ARIP3（341-418）和GFP-ARIP（341-490）是通过使用含有生态RI和巴姆HI站点。将PCR产物转移到用相同酶消化的pEGFP-C1（Clontech）中。谷胱甘肽S公司-已描述了转移酶（GST）-ARIP3（pGEX4T3-ARIP3）和Miz1（pGEX5X1-Miz1）(25). pGEX6P1-ARIP3Δ347-418和pGEX6 P1-ARIP3Δ467-487是通过消化ARIP3的编码序列生成的，分别删除了pVP16-ARIP3-Δ347-418和pVP16-RIP3Δ46 7-487生态RI并将其结扎成生态RI消化的pGEX-6P1载体。通过将ARIP3（W383A）编码序列从pFLAG-ARIP3转移到pGEX-4T3载体，克隆了pGEX4T3-ARIP3（W383A）生态意大利。描述了pGEX5X1-SUMO-1和pGEX5 X1-Ubc9(42). GST-SUMO公司GG公司-1，对应于缺失前体最后四个C末端氨基酸的成熟SUMO-1(6)，通过PCR构建。pGEX-SAE1和pGEX-SAE2是来自R Hay的礼物。pSG5-His-SUMO-1由A.Dejean提供，pSG5-GRIP1由M.Stallcup提供。
细胞培养和转染。
COS-1细胞（美国型培养物收集）保存在含有青霉素（25 U/ml）、链霉素（25 U/ml）和10%（vol/vol）胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。HeLa（American Type Culture Collection）细胞保存在含有青霉素、链霉素、10%FBS和非必需氨基酸的DMEM中。免疫沉淀3×105转染前24小时，将COS-1细胞接种在6厘米直径的培养皿上。通过FuGene转染方法（Roche Molecular Biochemicals）转染细胞；DNA总浓度为2.5μg。转染48小时后收集细胞进行免疫沉淀。当研究睾酮激活的AR时，细胞在转染前4小时接受含有10%炭样裂解FBS的新鲜培养基，转染后24小时加入睾酮（100 nM）。对于报告基因分析，将COS-1或HeLa细胞接种到12孔板上，24小时后通过FuGene试剂转染。简而言之，每个人都收到200 ng荧光素酶报告蛋白ARE2TATA-LUC公司(35)、20 ng pCMVβ（Clontech）、5 ng AR表达质粒和图图例中规定的各种数量的PIAS表达载体。适当时，通过添加空pFLAG-CMV2来平衡DNA总量。转染前4小时，将培养基改为含有10%炭质裂解FBS的培养基。转染后20小时，细胞接受含有2%炭质裂解的FBS（含或不含睾酮）的新鲜培养基（100 nM）。转染48小时后，收集细胞并在报告裂解缓冲液（Promega）中进行裂解，清除的上清液用于使用Promega和Luminoskan Ascent读取器（ThermoLabsystems）的试剂进行荧光素酶测量，以及进行前面所述的β-半乳糖苷酶分析(42).
免疫沉淀和免疫印迹。
COS-1细胞收集于含有20 mM磷酸盐缓冲液中N个-乙基马来酰亚胺（NEM）和细胞提取物在改良放射免疫沉淀分析1（RIPA-1）或RIPA-2缓冲液（RIPA-1:50 mM Tris-HCl[pH7.8]，150 mM NaCl，5 mM EDTA，15 mM MgCl）中制备2、1%Nonide P-40、0.75%脱氧胆酸钠、1 mM二硫苏糖醇、1:200稀释蛋白酶抑制剂混合物∑和10 mM NEM；RIPA-2:50 mM三氯化氢[pH7.8]、150 mM氯化钠、5 mM乙二胺四乙酸、15 mM氯化镁2、0.5%Nonide P-40、0.3%Triton X-100、1 mM二硫苏糖醇、1:200稀释蛋白酶抑制剂混合物和10 mM NEM）。如前所述，使用小鼠单克隆抗FLAG抗体进行免疫沉淀(35). 结合蛋白在2×十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中释放，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行解析，转移到Hybond增强化学发光硝化纤维素膜上，并使用增强化学发光检测试剂（Amersham Pharmacia Biotech）进行可视化根据制造商的说明。
GST蛋白的纯化和GST下拉分析。
GST融合蛋白产生于大肠杆菌BL21-CodonPlus细菌（Stratagene）并用谷胱甘肽-Sepharose 4B（Amersham Pharmacia Biotech）纯化，如前所述(23). 含有50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、150 mM KCl、0.1%Nonide P-40、0.1%Triton X-100、0.5 mM EDTA、10%甘油、5 mM MgCl的溶解缓冲液2，并使用1:200稀释的蛋白酶抑制剂鸡尾酒。ARIP3、ARIP3Δ347-418、ARIP1Δ467-487、PIAS3、PIAS1和Miz1使用TNT-coupled转录-翻译系统（Promega）在体外进行翻译[35S] 蛋氨酸。纯化GST融合蛋白结合谷胱甘肽-脑葡萄糖和10μl[35S] 在4°C下，在含有50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、150 mM NaCl、10%甘油、0.5 mM EDTA、5 mM MgCl的结合缓冲液中对标记在体外翻译蛋白中的蛋氨酸进行2 h2，50μM氯化锌2、0.4%Nonide P-40、0.1%Triton X-100和总体积为500μl的1:200稀释蛋白酶抑制剂混合物。用1 ml结合缓冲液将树脂清洗四次。通过在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸树脂来释放结合的蛋白质。电泳后，将凝胶固定在甲醇（45%）-乙酸（10%）中，用Amplify（Amersham Pharmacia Biotech）处理，并干燥，通过荧光成像显示放射性蛋白质(40).
SUMO-1体外结合。
GST-SUMO公司GG公司-1、GST-Ubc9、GST-SAE1、GST-SA E2、GST-ARIP3、GST-ARIP3Δ347-418、GST-AR IP3（W383A）和GST-ARIPΔ467-487按上述方式生成。纯化的蛋白质在含有50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、150 mM NaCl、10%甘油和20 mM谷胱甘肽的缓冲液中洗脱。c-Jun-His6如前所述纯化蛋白质(23). 体外翻译是通过使用TNT-coupled转录翻译系统在[35S] 蛋氨酸。对于结合分析，1μl体外翻译产物或1μg His标记蛋白与2μl GST-SUMO孵育GG公司-在1 mM二硫苏糖醇、4 mM MgCl存在下，1（2μg）、2μl GST-Ubc9（2μg）和2.5μl GST-SAE1和GST-SAE2的混合物（0.2μg）在30°C下保持1小时2和2 mM ATP。反应中使用的GST-PIAS蛋白量为0.2μg。通过添加15μl 2×SDS样品缓冲液终止反应。样品在95°C下加热5分钟，通过SDS-PAGE进行解析，并通过荧光或免疫印迹进行可视化。
免疫荧光。
用FuGene试剂转染接种在六孔板玻璃盖玻片上的COS-1细胞，其中0.75μg表达质粒编码FLAG标记的PIAS蛋白，0.75μg/质粒编码GFP-SUMO-1。细胞固定在磷酸盐缓冲盐水中4%（wt/vol）的多聚甲醛中，并用Triton X-100渗透，用抗FLAG M2单克隆抗体（1:50稀释；Sigma）和罗丹明红X结合山羊抗鼠抗体（1:200稀释；Jackson ImmunoResearch Laboratories）检测PIAS蛋白。共焦成像是通过使用Bio-Read MRC-1024共焦激光系统进行的，该系统连接至蔡司Axiover 135 M显微镜，该显微镜带有63×1.4数字孔径油浸物镜（33）。
结果
PIAS蛋白在体外与SUMO-1和Ubc9相互作用。
通过GST下拉试验研究了PIASxα/ARIP3与SUMO-1和SUMO-1结合酶Ubc9相互作用的能力。在体外翻译ARIP3和两个ARIP3缺失突变体[35S] 蛋氨酸，蛋白与GST、GST-SUMO-1或与谷胱甘肽-脑葡萄糖结合的GST-Ubc9孵育。如图所示。，ARIP3与SUMO-1和Ubc9有效相互作用，而控制蛋白荧光素酶不与GST-SUMO-1或GST-Ubc9结合。ARIP3未能单独绑定GST。ARIP3Δ347-418缺乏含有保守半胱氨酸和组氨酸的锌结合结构，与野生型ARIP3一样与SUMO-1结合，而与GST-Ubc9的相互作用显著减弱。氨基酸467至487的缺失完全消除了ARIP3与SUMO-1的相互作用。该区域包含一个与PM-Scl75蛋白中的基序类似的基序，该基序被证明足以与酵母中的SUMO-1相互作用，并被提议为SUMO-1交互基序(32). 后一种删除并不影响Ubc9绑定。总之，ARIP3在体外能够通过单独的保守结构域与SUMO-1和E2 SUMO-1结合酶Ubc9相互作用；氨基酸467到487之间的短酸性区域对SUMO-1结合至关重要，而推测的锌结合区域参与了与Ubc9的相互作用。与哺乳动物PIAS蛋白中两个结构域的高度保守性一致，Miz1、PIAS1和PIAS3显示出与SUMO-1和Ubc9相互作用的类似能力（图。).
PIAS蛋白在体外与SUMO-1和Ubc9相互作用。ARIP3、ARIP3Δ347-418、ARIP3Δ467-487、Miz1、PIAS1和PIAS3用[35S] 通过体外翻译蛋氨酸，并与谷胱甘肽-脑结合GST、GST-SUMO-1或GST-Ubc9孵育。在大量洗涤后，用SDS样品缓冲液洗脱结合蛋白，用SDS-10%PAGE进行解析，并通过荧光成像进行可视化。泳道i，代表与基质一起孵育的标记蛋白量的10%的输入样品。
PIAS蛋白和SUMO-1在核颗粒中共定位。
为了确定ARIP3是否与SUMO-1在哺乳动物细胞中共定位，用编码FLAG标记的ARIP3（FLAG-ARIP3）和与增强型GFP（EGFP）融合的SUMO-1的表达质粒转染COS-1细胞。使用针对FLAG表位的单克隆抗体和罗丹明结合的二级抗体通过间接免疫荧光显示ARIP3。在缺乏外源性表达的SUMO-1的情况下，ARIP3、Miz1、PIAS1和PIAS3显示出核分布的斑点模式（图。、D、E和F）。然而，核斑点的数量因PIAS蛋白而异。单独转染的SUMO-1通常扩散分布在核质中（图。). 有趣的是，ARIP3中氨基酸347至418的缺失使得该蛋白均匀分布在整个核质中，而缺乏氨基酸467至487的ARIP3显示出的核颗粒比全长ARIP3更少（图。).
PIAS蛋白和SUMO-1在COS-1细胞中的定位。按照材料和方法中的描述，用编码FLAG-ARIP3、FLAG-ARIP 3Δ347-418、FLAG-AR IP3Δ467-487、FLAG-PIAS1、FLAG-PAAS3、FLAH-Miz1或EGFP-SUMO-1的表达质粒转染细胞。用针对FLAG表位的M2抗体和罗丹明红X偶联二级抗体（a至F）进行免疫荧光标记。使用连接至蔡司Axiover 135 M显微镜的Bio-Read MRC-1024共焦激光扫描系统对细胞进行分析。EGFP在488nm激发，罗丹明红X在568nm激发。
SUMO-1和ARIP3的共表达导致SUMO-1与ARIP3完全共定位为核颗粒（图。). 由于EGFP的亚细胞定位不受ARIP3的影响，SUMO-1的靶向是选择性的（数据未显示）。ARIP3、Miz1和PIAS1在某种程度上更好地集中于核颗粒，即当与SUMO-1一起表达时，它们在整个核质中的染色较少。ARIP3（467-487）SUMO-1-结合基序的缺失部分破坏了共定位，导致颗粒较少但较大，并导致大量弥漫性核SUMO-1（图。). 假定的锌结合区域对ARIP3颗粒的形成至关重要，也需要将SUMO-1靶向核颗粒，因为ARIP3Δ347-418只能看到弥漫的核SUMO-1分布（图。). 因此，体外与SUMO-1和Ubc9结合的重要区域也影响ARIP3的核内靶向性及其与细胞核中SUMO-1的关联。除PIASxα/ARIP3外，其剪接亚型PIASxβ/Miz1、PIAS1和PIAS3与COS-1细胞核中的SUMO-1共定位，并显示类似的颗粒形成模式（图。).
PIAS蛋白和SUMO-1在核颗粒中共定位。COS-1细胞与编码EGFP-SUMO-1和FLAG-ARIP3、FLAG-ARIP3Δ347-418、FLAG-ARIP3Δ467-487、FLAG-PIAS1、FLAG-PAAS3或FLAG-Miz1的表达质粒共转染。使用针对FLAG表位的M2抗体和罗丹明结合的二级抗体进行免疫荧光标记，并按照图所示对细胞进行分析。分别收集图像（EGFP在488 nm处激发，而利萨明-罗丹明结合的M2抗鼠IgG在568 nm处兴奋），并按图所示进行合并。
PIAS蛋白被SUMO-1修饰。
由于PIASxα/ARIP3与SUMO-1和Ubc9相互作用并与SUMO1共定位，因此测试ARIP3本身是否是sumoylation的靶点是相关的。为此，在有无SUMO-1表达载体的情况下，将FLAG标记的ARIP3转染到COS-1细胞，并用抗FLAG抗体免疫印迹法从细胞裂解液中检测到ARIP3。由于COS-1细胞含有极少量未结合的内源性SUMO-1，因此需要异位表达SUMO-1(31). NEM，一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，阻断SUMO-1脱偶联酶的作用(11，27，53)添加到收获和裂解缓冲液中，以稳定sumoylated蛋白。在没有共表达SUMO-1的情况下，只检测到一个在～80 kDa迁移的双ARIP3带，而在存在外源性表达的SUMO-1时，其迁移率较高-M（M）对也检测到了最有可能代表ARIP3的酰化形式的条带（图。). 用抗SUMO-1抗体确认了这些ARIP3条带的身份（见图。). Miz1和PIAS1在COS-1细胞中也被sumoylated。Miz1的sumoylation模式与ARIP3相似，而sumoylated PIAS1的形式稍高M（M）对.高迁移-M（M）对SDS-PAGE凝胶上的PIAS形式表明，在这些蛋白质上可以附着多达三个SUMO-1部分，并且含有两个SUMO-1部分的PIAS是在这些条件下的主要sumoylated产物。PIAS3的表达水平比其他PIAS蛋白的表达水平低得多，因此不能准确地将其sumoylation与其他PIAS蛋白质进行比较（图。).
SUMO-1在哺乳动物细胞和体外修饰ARIP3和其他PIAS蛋白。（A） 用1μg的pFLAG-ARIP3、pFLAG-Miz1、pFLAG-PIAS1或pFLAG-PIAS3和1.5μg的空pSG5载体或pSG5-His-SUMO-1转染生长在6-cm直径培养皿上的COS-1细胞。转染48小时后，在含有10 mM NEM的RIPA-1缓冲液中对细胞进行裂解，并用M2 FLAG抗体对细胞裂解产物进行免疫印迹。（B） 体外PIAS蛋白的氨酰化。在vitro-translated中，35S标记的PIAS蛋白与纯化的GST-SUMO孵育GG公司-如图所示，GST-SAE1、GST-SAE2和GST-Ubc9存在（+）或不存在（-）时为1。通过添加SDS-PAGE样品缓冲液停止反应，并通过SDS-PAGE对样品进行解析并进行荧光照相。（C） 在B组所述的条件下，纯化GST-ARIP3、GST-ARIP3Δ347-418和GST-ARIPΔ467-487（各1μg）的氨酰化。用抗ARIP3抗体对反应混合物进行免疫印迹。
ARIP3与其他sumoylated蛋白相互作用。用1μg空pFLAG-CMV2或pFLAG-ARIP3和1.5μg空的pSG5或pSG5-His-SUMO-1转染COS-1细胞。转染48小时后，收集细胞并在含有10 mM NEM的RIPA-1缓冲液中或在含有2%SDS的变性缓冲液中溶解10 mM Tris-HCl（pH 8.0）-150 mM NaCl。在后一种缓冲液中溶解的样品在95°C下加热10分钟。在免疫沉淀（IP）之前，用10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和150 mM NaCl（含1%Triton X-100）的混合物将这些样品稀释（1:10）。5%的细胞提取物用抗FLAG抗体（A）免疫印迹，其余样品用抗FLAG抗体免疫沉淀，然后用抗SUMO-1抗体（B）或抗FLAG免疫印迹（C）。WB，Western blotting。
为了研究PIAS蛋白在无细胞条件下的sumoylation，35体外翻译产生的S标记PIAS蛋白在ATP存在下培养，并纯化GST与SAE1、SAE2、Ubc9和SUMO-1的融合。体外磺酰化反应产生了至少三个额外的高分子量ARIP3带（图。)这是因为GST与SUMO-1融合，迁移速度远慢于面板A中的sumoylated形式。这些带的形成取决于反应中SUMO-1 E1（SAE1+SAE2）和E2（Ubc9）结合酶活性的存在。在该系统中培养纯化的GST-ARIP3产生了类似的sumoylated形式（图。). ARIP3中氨基酸467至487的缺失并没有降低sumoylation的程度，而GST-ARIP3Δ347-418的sumoylated非常弱。在这些体外条件下，ARIP3作为SUMO-1受体，至少与早幼粒细胞白血病蛋白（PML）一样好（数据未显示）。Miz1和PIAS1的酰化作用与体外ARIP3的酰化作用相似，而PIAS3的酰化作用在这些条件下是检测不到的（图。)，这与COS-1单元数据一致。这些结果共同表明，ARIP3、Miz1和PIAS1可以在多个站点上有效汇总。
PIASxα/ARIP3与其他SUMO-1修饰的蛋白质相互作用。
为了验证高分子量ARIP3带（图。)将COS-1细胞裂解物用抗FLAG抗体免疫沉淀并用抗SUMO-1抗体或抗FLAG抗体免疫印迹。抗SUMO-1抗体检测到与细胞提取物和抗FLAG抗体免疫沉淀物中检测到的相同的缓慢迁移带（介于～100和140 kDa之间）（图。)表明它们确实代表SUMO-1修改的ARIP3。此外，抗SUMO-1抗体显示存在其他含SUMO-1的蛋白质，尤其是在>230kDa时迁移的大量免疫反应涂片（图。，车道2）。缓慢迁移的条带被认为代表与ARIP3共免疫沉淀的其他sumoylated蛋白。为了检验这种可能性，将共转染ARIP3和SUMO-1的细胞放在含有2%SDS的缓冲液中进行裂解，而不是放在标准免疫沉淀缓冲液中，并通过在95°C下加热10分钟使蛋白质变性，这将打破非共价蛋白与蛋白质的相互作用。这种治疗消除了分子量>140kDa的抗SUMO-1免疫反应带，并且在抗SUMO1抗体中只发现了与抗FLAG抗体检测到的相同的～100~140kDa带（参见图中的通道4）。). 因此，除了被SUMO-1共价修饰外，PIASxα/ARIP3还以非共价方式结合其他sumoylated蛋白质。与PIASxβ/Miz1相互作用的sumoylated蛋白质的模式与ARIP3相似，而PIAS1招募的蛋白质转移到低分子量范围（数据未显示）。
接下来，我们试图确定参与sumoylation的ARIP3区域以及与其他sumoylated蛋白相互作用所需的区域。鉴于ARIP3的高效sumoylation，令人惊讶的是，ARIP3序列不包含一致的SUMO-1连接位点，其序列形式为ΨKXE，其中Ψ是一个大的疏水残基，X代表任何氨基酸(5，8，19，44，51). 为了解决这个问题，在COS-1细胞中表达具有不同缺失的ARIP3版本，并检测其sumoylation（图。). 单独去除SUMO-1-结合基序（氨基酸467至487）或包含该区域的较长片段（氨基酸467-547）改变了sumoylated带的模式，而没有显著降低修饰程度（图。和数据未显示）。相比之下，当氨基酸347至418被删除时，ARIP3的sumoylation显著减弱，由氨基酸346至475组成的ARIP3区域的删除完全取消了sumoylion（图。). 尽管后一区域不包含一致的sumoylation位点，但赖氨酸对324和326、379和380、390和391以及430和431被突变为精氨酸，并研究了COS-1细胞中双突变体的sumo酰化。由于这些赖氨酸没有嵌入到一个一致的sumoylation序列中，所以突变未能改变ARIP3 sumoylationation的模式也就不足为奇了（数据未显示）。为了确认ARIP3的中心区域确实存在SUMO-1连接位点，并且缺失突变体缺乏sumoylation不是由于其他ARIP3区域折叠不当所致，我们进行了一个相反的实验，将包含341-418和341-490氨基酸的ARIP3区域融合到EGFP，并检测COS-1细胞中融合蛋白的sumoylation。来自转染GFP-ARIP3（341-490）和抗GFP抗体的细胞的免疫印迹提取物在共表达SUMO-1的情况下确实显示了一个额外的缓慢迁移带，但GFP-ARIP（341-418）未检测到任何sumoylation（图。). 因此，ARIP3中部地区至少有一个SUMO-1连接点。
ARIP3的锌指区是其他sumoylated蛋白招募所必需的。（A） 如图所示，在COS-1细胞中不含或含有pSG5-His-SUMO-1的情况下，FLAG标记的野生型ARIP3、ARIP3Δ347-418、ARIP1Δ467-487和ARIP3△346-475共表达。在RIPA-1缓冲液中裂解细胞，并用抗FLAG抗体对裂解液中的样品进行免疫印迹。（B） 将编码EGFP、EGFP-ARIP3（341-418）或EGFP-ARIP3（34.1-490）的表达载体共转染到COS-1细胞中，不含或含pSG5-His-SUMO-1。细胞在RIPA-1缓冲液中裂解，裂解产物用抗GFP抗体进行免疫印迹。（C） A组的其余裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP），免疫沉淀用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹。（D） B组剩余的裂解物用抗GFP抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹。WB，Western blotting。
对含有ARIP3的COS-1细胞裂解物进行免疫沉淀，用FLAG抗体删除，然后用SUMO-1抗体进行免疫印迹，结果表明ARIP3（氨基酸347到418）的潜在锌结合结构是招募其他SUMO-1结合蛋白所必需的，因为没有sumoylated蛋白与该突变体连接（图。). 影响游离SUMO-1-结合基序（氨基酸467至487）的ARIP3缺失并没有消除招募，而是将招募蛋白的模式转移到了较低水平M（M）对范围。尽管ARIP3的假定锌指区域对于苏氨酰化蛋白的束缚是强制性的，但分离的区域不足以进行募集，因为没有苏氨酰化蛋白与EGFP-ARIP3（341-418）免疫沉淀（图。). 然而，EGFP-ARIP3（341-490）能够系住其他sumoylated蛋白。因此，除了在非经典连接位点被SUMO-1共价修饰外，PIASxα/ARIP3（以及PIASxβ/Miz1和PIAS1；数据未显示）还与其他sumoyated蛋白相互作用；预测的锌结合区和SUMO-1-结合基序都与其他sumoylated蛋白的连接有关。
PIASxα/ARIP3刺激完整细胞中的蛋白质sumoylation。
ARIP3最初被描述为一种AR相互作用蛋白，在AR依赖性转录中起协同调节作用(34). 我们最近发现AR在两个位点上被sumoylated，并且这种修饰调节AR的转录活性(42). 由于ARIP3与sumoylated蛋白相互作用（图。)为了测试蛋白sumoylation是否影响ARIP3和AR之间的相互作用，我们感兴趣。为此，用抗FLAG抗体免疫沉淀COS-1细胞裂解物，并用抗AR抗体免疫印迹COS-1。只有在免疫沉淀缓冲液中存在NEM时，才能从细胞裂解液中用ARIP3共免疫沉淀AR（图。). 然而，未修饰和sumoylated AR蛋白均与ARIP3共免疫沉淀，后者的AR形式显示出比未修饰受体更好的恢复。此外，sumoylation-deficient AR突变体（K386R/K520R）[42])也以NEM敏感方式与ARIP3共免疫沉淀（数据未显示）。这些结果表明，在AR-ARIP3相互作用中，SUMO-1与AR的共价连接不是必需的。然而，NEM的稳定作用表明硫醇酯键参与了相互作用。再次，共免疫沉淀实验表明，ARIP3的锌结合区对与AR的相互作用至关重要，因为AR不能与ARIP3Δ347-418或ARIP3△346-475结合（图。).
ARIP3结构域在与AR相互作用中的作用以及ARIP3对蛋白质sumoylation的影响。（A） 将0.7μg空pFLAG-CMV2载体或pFLAG-ARIP3、0.9μg pSG5或pSG5-rAR和0.9μg/pSG5或者pSG5-His-SUMO-1转染生长在6-cm直径平板上的COS-1细胞。转染24小时后向细胞提供100 nM睾酮，转染48小时后收集细胞，并在NEM存在（+）或不存在（-）的情况下在RIPA-2缓冲液中溶解。5%的裂解物用抗AR的K333抗体进行免疫印迹，其余样品用抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP）。免疫沉淀用抗AR抗体印迹。WB，Western blotting。（B） ARIP3的锌指区是NEM依赖性与AR相互作用所必需的。在COS-1细胞中，具有不同缺失的FLAG标记ARIP3与AR共表达。细胞在含有10 mM NEM的RIPA-2缓冲液中进行裂解，并按照面板A所述进行细胞提取物的免疫印迹和免疫沉淀。箭头表明ARIP3的sumoylated形式。（C）ARIP3过度表达增强内源性COS-1细胞蛋白的sumoglated。ARIP3、ARIP3Δ347-418或ARIP3△467-487在COS-1细胞中无SUMO-1或与SUMO-1共表达。细胞在RIPA-1缓冲液中裂解，裂解产物用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹。wt，野生型。
ARIP3与AR和SUMO-1的表达增强了最慢迁移AR带的强度（图。)，对应于具有两个SUMO-1部分的受体形式(42). 这表明ARIP3能够促进完整细胞中的蛋白质酰化。为了确定ARIP3是否也影响内源性COS-1细胞蛋白的sumoylation，用抗SUMO-1抗体对来自转染或不转染ARIP3和SUMO-1细胞的裂解物进行免疫印迹。如图所示。全长ARIP3，而非ARIP3Δ347-418，显著增加了与内源性COS-1蛋白连接的SUMO-1的数量，表明PIASxα/ARIP3确实具有促进蛋白质sumoylation的一般能力。
ARIP3对体外表达SUMO-1的COS-1细胞AR sumoylation的影响相当温和。由于COS-1细胞含有非常少量的非偶联SUMO-1，我们研究了ARIP3和PIAS1对另一种细胞系中AR修饰的影响。在HeLa细胞中，即使仅在内源性SUMO-1存在的情况下，ARIP3和PIAS1都促进AR的sumoylation，但在PIAS蛋白的异位表达情况下，未检测到任何sumoylated AR形式（图。).
ARIP3和PIAS1增强HeLa细胞AR的sumoylation。接种在六孔板上的HeLa细胞与100 ng pcDNA-Flag-hAR共转染；100 ng pFLAG-CMV2、pFLAG-ARIP3或pFLAG-PIAS1；和0、10或50 ng pSG5-His-SUMO-1。细胞在RIPA-1缓冲液中裂解，裂解产物用抗AR抗体进行免疫印迹。与内源性SUMO-1酰化的AR型与外源性表达的SUMO-1的AR型迁移之间的差异是由于SUMO-1表达载体中存在His标签。通过免疫印迹抗AR抗体-免疫沉淀AR和抗SUMO-1抗体（未显示）来验证sumoylated AR形式的身份。
PIASxα/ARIP3增强AR和c-Jun的体外酰化。
为了检测ARIP3是否也促进AR在体外的琥珀酰化，GST-ARIP3在大肠杆菌并进行纯化。随后将其用于含有重组SUMO-1 E1和E2酶、GST-SUMO-1和35S-标记AR，通过体外翻译产生，作为底物。与sumoylated AR相对应的两条谱带的形成取决于Ubc9的存在（图。). 反应混合物中的GST-ARIP3显著增加了AR酰化的程度，而GST-ARIPΔ347-418在这方面没有活性。当使用较低浓度的Ubc9时，ARIP3的影响更为显著（数据未显示）。重组GST-Miz1也能够促进SUMO-1体外修饰AR（数据未显示）。
ARIP3在体外增强AR和c-Jun的酰化。（A） ARIP3对体外翻译AR的sumoylation的影响。35S标记的体外翻译AR与纯化的GST-SUMO孵育GG公司-1（在所有反应中）、GST-SAE1加上GST-SAE2（在所有的反应中）和GST-Ubc9（在有或无GST、GST-ARIP3或GST-ARIPΔ347-418的情况下），如图所示。样品通过SDS-PAGE进行解析，并进行荧光照相。（B） ARIP3增强纯化重组c-Jun的sumoylation。His-tagged c-Jun与GST-SUMO孵育GG公司-1、GST-SAE1加上GST-SAE2和GST-Ubc9（仅存在GST）、GST-ARIP3、GST-ARIP3Δ347-418、GST-AR IP3（W383A）或GST-ARIPΔ467-487，如图所示。样品通过SDS-PAGE进行分离，并用抗-His抗体进行免疫印迹。箭头表示蛋白质的酰化形式。
为了研究ARIP3是否促进其他特异蛋白的琥珀酰化，以纯化的重组c-Jun为底物进行体外琥珀酰化反应。c-Jun在体内以单个赖氨酸残基进行酰化(36). ARIP3明显增加了纯化重组c-Jun的sumoylation程度，并且ARIP3在这个完全含有重组蛋白的系统中的作用至少与网织红细胞裂解产物产生的AR作为底物时的作用一样强（图。). 同样，ARIP3的锌结合结构的缺失（ARIP3Δ347-418）消除了ARIP3促进sumoyalization的能力，而氨基酸467至487的缺失并没有削弱ARIP3对c-Jun的活性（图。).
许多活性RING型泛素连接酶，如c-Cbl，在其RING结构域中含有保守的Trp408残基(17，50)，其突变消除了c-Cbl的E3连接酶活性(17). 有趣的是，PIASxα/ARIP3和其他PIAS蛋白在其潜在的锌指中间也含有保守的Trp。将该Trp突变为Ala（W383A）抑制c-Jun的ARIP3的sumoylation（图。)和AR（数据未显示），表明这种庞大的氨基酸残基在结构域结构中起着重要作用，这可能与RING E3泛素连接酶中保守的Trp类似。Sumoylation选择性地受到W383A突变的影响，因为该突变在GST下拉分析中保持与SUMO-1和Ubc9相互作用的能力（数据未显示）。总之，我们的数据表明，PIASxα/ARIP3和其他具有Miz锌结构域的PIAS蛋白参与蛋白质的sumoylation，并以类似于RING型E3泛素蛋白连接酶的作用方式发挥E3型SUMO-1蛋白连接蛋白的功能。
PIAS蛋白促进GRIP1的sumoylation的能力不同。
我们已经证明，PIASx和PIAS1除了与类固醇受体相互作用外，还与p160核受体辅活化子糖皮质激素受体相互作用蛋白1（GRIP1）相互作用(26; 另请参阅参考14). 为了研究这些相互作用是否与GRIP1的SUMO-1修饰有关，在存在或不存在SUMO-1编码载体的情况下，各种FLAG标记的PIAS蛋白与GRIP1.共表达。用单克隆抗GRIP1抗体免疫印迹COS-1细胞裂解物检测GRIP1，或用PIAS蛋白免疫沉淀的蛋白（抗FLAG抗体）免疫印迹抗GRIP1。GRIP1确实是共价SUMO-1修饰的靶点，但与AR的发现类似，未修饰的GRIP1和sumoylated GRIP1都与PIASxα/ARIP3和PIAS1相互作用（图。). GRIP1中有四个潜在的SUMO受体位点（赖氨酸239、731、788和1452），这至少部分解释了sumoylated GRIP1形式的异质性。目前尚不清楚为什么在缺乏共表达SUMO-1的情况下，未经氨酰化的GRIP1与PIASxβ/Miz1相互作用不良（图。). 有趣的是，PIASxα/ARIP3影响SUMO-1与GRIP1结合的能力明显弱于其他两种PIAS蛋白，即PIASxβ/Miz1和PIAS1。用抗FLAG抗体对样品进行免疫印迹，排除了PIAS蛋白促进GRIP1 sumoylation的不同能力来自其表达水平差异的可能性（图。). PIAS1（W372A）（锌结合域中保守的Trp残基转化为Ala）和PIAS1Δ310-407（整个锌结合域被删除）突变体无法促进GRIP1的sumoylation（图。)验证了PIAS类环区域在反应中的重要性。同样，这些结果不是由PIAS1突变体的低表达引起的。这些结果表明，即使PIAS蛋白被酰化并能够结合其他SUMO-1结合蛋白，其促进蛋白质酰化的能力也表现出底物选择性。
PIAS蛋白增强GRIP1的sumoylation。将0.7μg空pFLAG-CMV2载体或编码FLAG-标记PIAS蛋白的载体、0.9μg pSG5或pSG5-GRIP1以及0.9μgpSG5和pSG5-His-SUMO-1转染生长在6-cm直径平板上的COS-1细胞。转染48小时后收集细胞，并在含有10 mM NEM的RIPA-2缓冲液中溶解。5%的裂解物用抗GRIP1抗体（A）免疫印迹，其余的用抗FLAG抗体免疫沉淀（IP），然后用抗GRIP抗体（B）免疫印记。WB，Western blotting。（C） 通过用抗FLAG抗体免疫印迹细胞裂解物来验证PIAS蛋白的数量。（D） 预测的PIAS1锌结合区是刺激GRIP1的sumoylation所必需的。COS-1细胞与0.9μg pSG5-GRIP1共转染；0.7μg pFLAG-CMV2、pFLAG-PIAS1、pFLAG-PIAS1（W372A）或pFLAG-PIAS1Δ310-407；和0.9μg pSG5或pSG5-His-SUMO-1。细胞在RIPA-2缓冲液中裂解，裂解产物用抗GRIP1抗体或抗FLAG抗体进行免疫印迹。
PIAS蛋白的SUMO-1系链和连接酶结构域在AR依赖性转录调控中的作用。
上述结果表明，PIAS蛋白对类固醇受体（如AR）的调节作用可以通过其SUMO-1-结合和SUMO-1连接酶活性来实现。为了将这些发现与转录调控联系起来，我们使用由C3的两个雄激素反应元件（ARE）驱动的荧光素酶报告子检测了ARIP3（W383A）和ARIP3Δ467-487突变体对AR依赖性转录的影响(1)TATA盒前的基因（pARE2TATA-LUC）。野生型ARIP3的异位表达激活了COS-1和HeLa细胞中的AR功能，而连接酶缺失的ARIP3（W383A）是抑制性的或惰性的，并且ARIP3Δ467-487（其中SUMO结合基序被删除）未能影响AR依赖性转录（图。和B）。值得注意的是，即使这些ARIP3突变体显示出改变的核定位模式（图。)，它们仍然能够与AR交互（图。)（我们未公布的结果）。因此，这些突变体在AR依赖性转录中的活性改变不能简单地归因于它们的定位错误。与ARIP3相似，PIAS1的RING样区域对AR-依赖性转录的激活至关重要，因为Trp372-Ala突变和310-407氨基酸的缺失都将PIAS1从COS-1细胞AR功能的辅激活子转化为AR功能的共抑制子（图。). 与我们最近的结果一致(42)，具有两个主要sumoylation位点（K386和K520）的AR突变体转化为精氨酸[AR（K→R） ]在简单ARE驱动的报告中比野生型受体更为活跃（图。). 与野生型AR相比，AR（K→R） 在HeLa或COS-1细胞中ARIP3未显著激活。ARIP3抑制突变AR的原因目前尚不清楚，但可能是ARIP3增强AR（K→R） -通常不与野生型AR相互作用的相互作用蛋白。总之，PIAS蛋白的SUMO-1-结合和连接酶活性对这些蛋白调节转录功能至关重要。我们不能正式排除ARIP3和PIAS1的作用也涉及AR的亚核靶向的可能性，这是由PIAS SUMO-1结合域与其他核蛋白的相互作用引起的。然而，我们还无法检测到PIAS诱导的AR亚核定位的改变。
SUMO-1-系留区和连接酶结构域对PIAS蛋白协同调节AR依赖性转录的能力至关重要。将培养在12孔板上的HeLa（A）和COS-1细胞（B）与200 ng pARE共转染2TATA-LUC、20 ng pCMVβ、5 ng pcDNA-Flag-hAR和10、50或100 ng pFLAG-ARIP3、pFLAG-ERIP3（W383A）或pFLAG-ARIP3Δ467-487，并用或不用100 nM睾酮（T）治疗。通过使用β-半乳糖苷酶活性对转染效率进行归一化后，报告基因活性相对于不含协调剂的AR+T表达（设为100）。wt，野生型。（C） 与B组相同的实验，但不是ARIP3表达质粒，COS-1细胞与pFLAG-PIAS1、pFLAG-PAAS1（W372A）或pFLAG-P1AS1Δ310-407共同转染。（D和E）共转染ARIP3对SUMO-1连接赖氨酸突变为精氨酸的AR突变体的影响[AR（K→R） ]与野生型AR相比。实验条件与面板A和B中的条件相同。数值表示三到六个独立实验的平均值±标准偏差。
讨论
PIAS蛋白可以与不同类别的核蛋白结合，增强或抑制结构无关因子的转录活性，如类固醇受体和STATs(4，28，34，57)它们的生物学功能显然不限于抑制STAT信号。尽管PIAS1和Miz1具有适度的内在转录激活功能，而ARIP3和PIAS3缺乏这种活性，但PIAS蛋白对转录调控的多效性作用很难从这些功能中获得(25). PIAS蛋白作用的机制仍然难以捉摸，一项研究表明，它涉及与其他协同调节蛋白形成复合物(25).
使用PIASxα/ARIP3作为PIAS蛋白的主要代表，我们在本研究中证明，ARIP3通过单独的保守结构域与SUMO-1及其E2结合酶Ubc9相互作用。此外，尽管ARIP3、Miz1和PIAS1的序列中没有可识别的一致SUMO-1连接基序，但它们仍被严重酰化。最近，许多不同的蛋白质被SUMO-1修饰(31)而特定蛋白质与Ubc9和SUMO-1相互作用的能力通常反映了其进行酰化的能力。ARIP3、Miz1和PIAS1与其他SUM酰化蛋白相互作用，并具有独特的SUM酰化特征，即它们缺乏一致的SUMO-1受体位点，这表明这些蛋白参与了SUM酰化过程本身。
有人认为，含有Ser-rich和Glu-以及Asp-rich延伸的蛋白质基序在疏水残基之前介导与游离SUMO-1的相互作用(32). 与这一观点一致，缺失包含氨基酸467至487的区域，实现了潜在SUMO-1结合基序的特征，从而在体外消除了ARIP3与未结合SUMO-1的相互作用。然而，这种缺失并没有减少体内或体外ARIP3的sumoylation，但它影响了其他sumoylated蛋白的招募。相比之下，ARIP3Δ347-418不含锌指状区域，其sumoylated非常弱，无法连接其他Sumoyled蛋白。SUMO-1和PIAS蛋白在同一个亚核部位的克隆化可能反映了SUMO-1与PIAS蛋白的共价连接以及它们在这些亚核结构域结合其他sumoylated蛋白的能力。这些结果与以下发现相一致：SUMO-1结合基序的缺失减弱了ARIP3和SUMO-1对核共粒的形成，锌指状结构的去除消除了核颗粒。
除了以锌指状结构域依赖方式结合蛋白质外，ARIP3、Miz1和PIAS1还以同样依赖于该结构域的方式明显促进了其他蛋白质的sumoylation。ARIP3和PIAS1均能刺激完整细胞中SUMO-1与AR的连接，而PIAS1（而非ARIP3）增强GRIP1的sumoylation。此外，在利用纯化重组蛋白的无细胞系统中，ARIP3以类环结构域依赖的方式增强AR和c-Jun的sumoylation。许多E3型泛素蛋白连接酶的活性依赖于其环指结构。因此，令人感兴趣的是，哺乳动物PIAS蛋白的中心区域，除了PIAS3外，含有七个半胱氨酸残基和一个组氨酸，这对C是必需的三HC公司4-类型指环图案。事实上，PIAS区域的线程分析表明其三维结构类似于C三HC公司4环形手指折叠。然而，哺乳动物PIAS环样结构的潜在锌配位残基和氨基酸组成之间的间距与E3泛素连接酶的环基序有很大不同。有趣的是，PIAS3在无细胞条件下和完整细胞中的氨酰化较差，在假定的C的第四位没有半胱氨酸残基三HC公司4动机。
与同源E2和底物肽结合的c-Cbl E3泛素连接酶的晶体结构表明，环指结构域不仅可以招募底物和E2酶，还可以作为支架，对其进行最佳定位和定向，以进行泛素转移(64). 许多作为泛素E3连接酶或参与蛋白质降解的环指蛋白在其环的第五和第六位半胱氨酸之间具有保守的Trp残基(17). c-Cbl中的Trp构成了与E2连接酶相互作用的RING界面的一部分，Trp突变消除了E3活性。所有PIAS蛋白在其富含Cys的中心区域都含有Trp残基。它在具有类似富含半胱氨酸结构的较远相关蛋白质中保守。PIASxα/ARIP3（W383A）和PIAS1（W372A）中的Trp转化为Ala，消除了它们促进蛋白质sumoylation的能力，表明这种氨基酸残基在sumoylationprocess中起着重要作用。因此，具有Miz锌指结构的PIAS蛋白似乎作为E3 SUMO-1连接酶发挥作用，以类似于RING型E3连接酶在泛素化中的作用的方式促进Ubc9依赖性的sumoylation。
Ubc9与几乎所有已知的SUMO受体发生物理相互作用，这可能表明它足以在体内识别底物。有人认为，sumoylation位点本身是Ubc9结合和SUMO-1修饰的主要决定因素，这与sumoylate中E3连接酶活性的必要性相矛盾(47). 然而，尽管纯化或重组的E1和E2酶足以在体外合成靶蛋白，但与完整细胞中的反应相比，这些反应速度慢且效率低(1，5，31，58). Ubc9本身不太可能区分不同的SUMO蛋白，因此不能赋予特异性，这一观点也有力地表明了sumoylation中存在额外的调节因子(58). Ubc9和泛素E2连接酶之间的高度同源性表明，SUMO-1向靶蛋白的转移与泛素化过程中的转移非常相似，并且sumoylation中的底物特异性需要额外的E3型连接酶。我们的结果表明，PIAS蛋白促进SUMO-1附着到GRIP1的能力不同，这确实支持了不同PIAS蛋白作为E3 SUMO连接酶对靶蛋白底物偏好不同的观点。
sumoylation酶主要是核酶，参与各种核功能（DNA复制和修复、有丝分裂和转录调控）的蛋白质是SUMO附着的底物(31，37). 有令人信服的证据表明，SUMO修饰在蛋白质相互作用和亚细胞和亚核定位的调节中起着关键作用(31，37，62). SUMO-1与RanGAP1的结合将其靶向核孔复合物(30)，SUMO-1对PML的修饰将其导向称为PML核体的亚核结构域(38). PML介导的其他蛋白质招募也需要后一种修饰(15)，PIAS蛋白也可能是这种情况。氨甲酰化还可以阻止目标蛋白的降解，如IκBα(5). 鉴于SUMO-1在蛋白质复合物形成中的作用，可以设想SUMOylization调节转录因子协同调节因子的相互作用(12，36, 41,42，45). 我们目前关于PIAS1促进辅激活子GRIP1的sumoylation的数据支持这种可能性。除了与各种序列特异性转录因子相互作用并影响其sumoylation状态外，PIAS蛋白还可以作为平台来招募其他sumoylated蛋白或待sumoyled的蛋白，例如转录辅激活剂和辅抑制剂。值得注意的是，ARIP3和PIAS1对AR依赖性转录的影响依赖于SUMO结合基序和连接酶结构域。然而，PIAS蛋白对AR依赖性转录的所有影响不能通过仅基于AR的sumoylation的事件来解释。重要的是要注意，PIAS蛋白质在转录调控中有多种相互作用伙伴，包括类固醇受体辅激活子GRIP1及其影响（正或负）在一个给定的启动子上最有可能是组合的，反映了相互作用伙伴的整体效果。与这一观点一致，我们最近发现PIAS蛋白和GRIP1在类固醇受体依赖的信号传导中表现出协同作用，PIAS蛋白的类环结构域在这一过程中也起着关键作用(26).
PIAS或PIAS-like蛋白在染色体结构和功能调节中的功能也可能与蛋白质的sumoylation有关。这个果蝇属PIAS蛋白同源物Su（var）2-10（Zimp）是正确的染色体结构和遗传所必需的，一项研究表明，它通过维持间期细胞核中的染色体组织来控制染色体功能的多个方面(13). 染色体凝集缺陷的发现酿酒酵母由于SMT4型当SIZ1型基因过度表达(52)将PIAS样蛋白连接到sumoylation过程。明确地，表面活性剂编码一种进化上保守的蛋白酶，显示SUMO-cleaving异肽酶活性，Siz1与动物PIAS蛋白具有广泛的相似性。事实上，虽然这项工作正在最后定稿，但据报道Siz1和相关蛋白Siz2（Nfi1）可以促进酵母中的sumoylation(20，56)Siz1在体外可增强败血病毒蛋白的sumoylation(20，55). 此外，同期研究表明，PIAS1和PIASy分别作为p53和LEF1的SUMO连接酶发挥作用(22，46).
总之，我们的结果以及其他实验室的最新数据令人信服地证明，具有保守Miz锌指的蛋白质作为E3 SUMO-1连接酶发挥作用。哺乳动物PIAS蛋白自身以类似于环指E3泛素连接酶的自修饰方式进行sumoylation(29)，可能起到自我调节的作用。此外，负责SUMO-1结合和SUMO-1接合的结构域被分离，这两种结构对PIAS蛋白的核靶向和转录调控至关重要。重要的是，哺乳动物PIAS蛋白在完整细胞中表现出靶蛋白选择性。鉴于这些考虑，我们认为PIAS蛋白对各种转录因子的许多影响是通过其SUMO醚化和SUMO连接酶活性发挥的，并且这些性质与它们与不同转录因子相互作用和调节其活性的能力有关。
致谢
我们感谢Kati Saastamoinen和Saija Kotola提供的技术援助；Hetti Poukka、Anne Dejean、Ronald T.Hay、Rob Maxon、Ke Shuai和Michael R.Stallcup的质粒；和Christophe Roos进行结构线程分析。
这项工作得到了芬兰科学院、芬兰癌症研究基金会、Sigrid Jusélius基金会、赫尔辛基生物中心和赫尔辛基大学中心医院的资助。
参考文献
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