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.2003年2月4日;100(3):986-91.
doi:10.1073/pnas.0337412100。 Epub 2003年1月27日。

小泛素相关修饰物-1修饰介导CREB依赖性低氧反应的缓解

附属公司

小泛素相关修饰物-1修饰介导CREB依赖性低氧反应的缓解

卡特里娜·M·科默福德等。 美国国家科学院程序. .

摘要

磷酸化依赖性泛素化结合转录调节因子的蛋白酶体降解是近年来公认的控制许多炎症基因的机制。关于在分解过程中抑制这些途径中转录活性的反调节机制,人们知之甚少。在这里,我们研究了低氧诱导的肿瘤坏死因子(TNF)α在T84细胞中的瞬时性质,我们之前已经证明这一过程涉及cAMP响应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化依赖性降解。初步研究表明低氧诱导的TNFalpha是一种暂时性事件,其消退与出现更大分子量的CREB修饰形式有关。通过对缺氧细胞mRNA的基因阵列分析,确定了小泛素相关修饰物(SUMO)-1 mRNA的时间依赖性诱导。在长时间缺氧中,CREB被SUMO-1翻译后修饰。此外,SUMO-1过度表达可稳定低氧条件下的CREB,并增强CREB依赖性报告基因的活性。赖氨酸残基K285和K304的定点突变在体内和体外鉴定为SUMO受体。K304突变也导致CREB核定位丢失,这意味着SUMO-1在该位点的修饰在CREB的亚细胞定位中起作用。因此,在长时间缺氧时,CREB通过与SUMO-1的结合而改变。此外,我们假设这种事件稳定并促进CREB的核定位,从而补充低氧诱导炎症过程的内源性消退阶段。

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图1
图1
低氧诱导的TNFα是短暂的。(A类)ELISA用于测量T84细胞中TNFα的时间分段、基底外侧释放。缺氧引起的TNFα释放是短暂的,在48小时和72小时缺氧之间消失(n个= 3;P(P)< 0.05). (B类)采用床上生物素化研究48小时缺氧对CREB表达和修饰的影响。图中显示了在缺氧条件下进化的更大分子量的CREB修饰形式(黑色箭头)。(C类)如前所述,暴露于缺氧时间增加的T84细胞表现出天然43-kDa CREB表达降低(下部; 参考6)。在同一时期,出现了一个更大的分子量带(60kDa),该带被CREB抗体识别,这意味着CREB的一种修饰形式。
图2
图2
缺氧时SUMO-1 mRNA的表达.(A类)mRNA微阵列分析用于研究暴露于缺氧时间增加的T84细胞中的整体基因表达。尽管96%的研究基因保持稳定,但SUMO-1的表达呈时间依赖性增加。(B类)通过RT-PCR分析证实了芯片数据,表明缺氧时SUMO-1 mRNA随时间增加。(C类)Northern blot分析直接用于评估来自暴露于指定缺氧时期的细胞的RNA中SUMO-1的表达。
图3
图3
缺氧增强蛋白SUMO-1修饰.(A类)Western blot分析用于确认SUMO-1蛋白表达的低氧合法上调。(B类)使用全细胞裂解物的蛋白质印迹分析来研究SUMO-1在0至72小时缺氧中对蛋白质的修饰。箭头表示SUMO-1修饰的蛋白质。(C类)用CREB免疫沉淀法和抗SUMO-1抗体的Western blot检测CREB在缺氧条件下的SUMO-1修饰。≈60 kDa的A带随缺氧时间延长而增加,与SUMO-1修饰的CREB一致。(D类)用CREB免疫沉淀法和抗泛素抗体免疫印迹法研究CREB在缺氧条件下的泛素化。缺氧暴露1小时后,迅速检测到与泛素修饰CREB一致的条带。(E类)通过IκB免疫沉淀和抗SUMO-1抗体的Western blot研究缺氧时IκB的SUMO-1修饰。≈55 kDa的A带随缺氧时间延长而增加,与SUMO-1修饰的IκB一致。
图4
图4
SUMO-1通过修饰特定的结合基序来稳定CREB。(A类)使用CREB依赖性荧光素酶报告分析来确定SUMO-1过度表达对BAE细胞CREB活性的影响。在常氧(N)和48小时缺氧(48)条件下,SUMO-1过度表达显著增强CREB依赖性活性。(B类)Western blot分析用于研究SUMO-1过度表达对正常和缺氧细胞核裂解物中CREB水平的影响。SUMO-1过表达增加了正常氧环境下SUMO-1修饰和非修饰CREB的表达。SUMO-1过度表达导致SUMO-1修饰的CREB在缺氧时稳定,而非非修饰的CREB。(C类)对赖氨酸285和304而非155进行定点突变,导致EGFP-CREB SUMO修饰减少体内. (D类)对赖氨酸285和304而非155进行定点突变,导致EGFP-CREB SUMO修饰减少体外. (E类)野生型CREB定位于核区室,并通过与SUMO共转染而增强。SUMO受体残基(K304R)突变导致EGFP-CREB的核定位丢失,而非受体赖氨酸残基(K155R)突变不会改变CREB的核定位。(F类)采用CREB免疫沉淀物的Western blot分析,研究KKKE肽对低氧条件下CREB SUMO-1修饰的影响。该生物活性肽以浓度依赖的方式减少了CREB的SUMO-1修饰。(G公司)采用CREB依赖性荧光素酶报告试验,研究CREB SUMO-1修饰抑制对CREB活性的影响。CRE-核糖核酸酶和蛋白激酶A的联合转染导致CREB依赖性活性显著增加,而CREB的依赖性活性在用干扰控制肽预处理细胞时没有改变,但在用含有KKKE的肽预处理时显著降低。
图5
图5
低氧条件下转录调节剂翻译后时间修饰模型。在缺氧早期,IκB和CREB以磷酸化依赖的方式迅速泛素化,导致这些分子靶向蛋白酶体降解。抗炎调节因子的这种去除导致促炎表型的诱导。更长时间的缺氧导致SUMO-1表达的诱导以及IκB和CREB的SUMO-lation。这一晚期事件依赖于SUMO的转录和翻译,并导致这些调节因子的稳定,从而介导对低氧合法炎症表型的抑制。

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