TSC1-2肿瘤抑制剂通过调节IRS蛋白控制胰岛素–PI3K信号

TSC1-2型调节IRS-1型通过S6K的mRNA

缺乏胰岛素的细胞中胰岛素信号缺陷的基础TSC2系统可能处于胰岛素/IGF-1受体或IRS蛋白的表达水平，也可能处于其激活水平。因此，我们进行了基因表达差异的微阵列分析TSC2系统 ^+/+和TSC2系统 ^−/−MEF，这表明IRS-1型mRNA在TSC2系统 ^−/−MEF公司(图2A） ●●●●。为了证实这一结果，我们分析了IRS-1型mRNA。IRS-1型mRNA丰度在TSC2系统 ^−/−MEF公司(图2B） ●●●●。重要的是，野生型逆转录病毒的稳定引入完全扭转了这种减少TSC2系统(图2B） ●●●●。有趣的是IRS-2号机组mRNA不受功能缺失的影响TSC2系统通过蛋白质印迹比较这些细胞中IRS-1蛋白的水平获得了类似的结果，而IRS-2蛋白或胰岛素或IGF受体的水平不受TSC2系统表达式(图2C） ●●●●。因此，IRS-1型表达是通过功能的存在来维持的TSC2系统.

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图2。

IRS-1 mRNA和蛋白的表达依赖于TSC2。（A） 微阵列分析TSC2系统 ^+/+和TSC2系统 ^−/−MEF公司。IRS-1型mRNA在TSC2系统 ^+/+MEF（绿色）与TSC2系统 ^−/−MEF（红色）。（B） Northern印迹IRS-1型（顶部）或IRS-2号机组等基因中的（中间）mRNATSC2系统 ^+/+,TSC2系统 ^−/−MEF和TSC2系统 ^−/−重新引入野生型TSC2的MEF系（−/−+WT）。将这些样品的等分样品置于单独的凝胶上，并探测β-肌动蛋白，作为RNA含量的对照（底部）。白线表示中间车道已被移除。（C） IRS-1（第一组）、IRS-2（第二组）、InR（第三组）和IGF1-R（第四组）蛋白质水平TSC2系统 ^+/+,TSC2系统 ^−/−、和TSC2系统 ^−/−野生型MEF线TSC2系统已重新引入（−/−+WT）。重新对ERK1/2进行印迹，作为蛋白质负荷的对照（底部面板）。

IRS-1蛋白水平先前被证明对雷帕霉素敏感(Haruta等人，2000年). 因为mTOR/S6K信号在TSC2系统-缺陷细胞(Jaeschke等人，2002年)，我们试图检测雷帕霉素对IRS-1型mRNA丰度。雷帕霉素治疗TSC2系统 ^−/−MEF减轻了对IRS-1型治疗～24小时后的mRNA丰度(图3A） ●●●●。此次恢复IRS-1型放线菌素D逆转雷帕霉素持续治疗的mRNA丰度(图3、B和C)表明mTOR/S6K1信号可能减少IRS-1型mRNA丰度主要在基因转录水平。

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图3。

抑制S6K可恢复IRS-1 mRNA。（A）IRS-1型血清饥饿时的mRNA水平（top）TSC2系统 ^+/+或TSC2系统 ^−/−未经处理的细胞或在不同时间添加20 nM雷帕霉素后的MEF。重复印迹β-肌动蛋白，作为mRNA负载的对照（底部）。白线表示中间车道已被移除。（B） IRS-1 mRNA水平（顶部）TSC2系统 ^−/−单用20 nM雷帕霉素或在10μg/ml放线菌素D存在下处理MEF，持续24小时的最后10小时。重复印迹β-肌动蛋白，作为mRNA负载的对照（底部）。（C） 未经治疗、雷帕霉素治疗和雷帕霉素加放线菌素D治疗的定量RT-PCR分析TSC2系统 ^−/−MEF公司。左，β-actin；右侧，IRS-1。图中显示了三次测定的单一图表，显示了相同的结果。（D） RNAi介导的S6K1和S6K2抑制。提取物的蛋白质印迹TSC2系统 ^+/+或TSC2系统 ^−/−转染有加扰siRNA（C）或S6K1、S6K2或S6K1+S6K2 siRNA组合的MEF。顶部，S6K1；中间，S6K2；底部，抗pS6（Ser240/244）。如有指示，用胰岛素刺激细胞10分钟或用20 nM雷帕霉素处理细胞1小时（E）IRS-1型mRNA水平TSC2系统 ^+/+MEF或TSC2系统 ^−/−用S6K1和S6K2加扰siRNA（C）、S6K1或S6K2 siRNA的组合转染MEF，或用20 nM雷帕霉素处理24小时。顶部，IRS-1型mRNA；此外，还对β-肌动蛋白的印迹进行了重复，作为mRNA载量的对照（底部）。（F） 未经处理的定量RT-PCR分析TSC2系统 ^+/+,TSC2系统 ^−/−，或TSC2系统 ^−/−用20 nM雷帕霉素或RNAi处理S6K1或S6K2。左，β-actin；右侧，IRS-1。图中显示了三次测定的单一图表，显示了相同的结果。

接下来，我们问IRS-1型mRNA由S6K1或S6K2介导，这两种激酶都是雷帕霉素敏感的激酶，使用小干扰RNA（siRNA）方法。观察到S6K1几乎完全击倒，S6K2击倒70-80%(图3D） ●●●●。抑制S6K1或S6K2模拟雷帕霉素治疗和恢复的效果IRS-1型mRNA水平接近TSC2系统 ^+/+MEF公司(图3、E和F). 我们的结论是IRS-1型我们在中观察到的mRNATSC2系统-缺陷细胞由两种形式的S6K-S6K1和S6K2介导。

TSC1-2型通过抑制S6K对IRS-1的作用促进胰岛素信号传导

IRS-1和IRS-2蛋白质提取自TSC2系统 ^−/−MEF在SDS-PAGE凝胶上的迁移减少(图2C） ●●●●。用λ-磷酸酶处理IRS-1免疫沉淀物表明IRS-1的迁移减少TSC2系统 ^−/−MEF是由于磷酸化的差异造成的，与IRS-1相比，该蛋白在迁移率方面表现出更大的变化TSC2系统 ^+/+磷酸酶处理后的MEF(图4A） ●●●●。为了确定IRS-1磷酸化的这种变化是否由mTOR/S6K信号引起，我们对TSC2系统 ^+/+或TSC公司 ^−/−用雷帕霉素进行不同时间的MEF，并检测IRS-1和IRS-2蛋白水平。IRS-1和IRS-2都是迁移速度较慢的物种TSC2系统-缺乏细胞。添加雷帕霉素后TSC2系统 ^−/−MEF持续1小时后，IRS-1和IRS-2都是迁移速度更快的物种，蛋白质水平没有增加。然而，用雷帕霉素处理24小时后，IRS-1蛋白的迁移和水平TSC2系统 ^−/−MEF与未处理的相似TSC2系统 ^+/+MEF公司(图4B） ●●●●。相反，在两种情况下，IRS-2水平在很大程度上不受雷帕霉素治疗的影响TSC2系统 ^+/+或TSC2系统 ^−/−MEF公司。PKB激活TSC2系统 ^−/−雷帕霉素治疗1小时后MEF部分恢复，治疗24小时后完全恢复(图4C） ●●●●。与PKB激活的挽救一致，IGF-1刺激后PIP3升高TSC2系统 ^−/−雷帕霉素预处理24小时的MEFs与刺激条件下产生的MEFs相似TSC2系统 ^+/+MEF公司(图4D） ●●●●。

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图4。

抑制S6K可恢复胰岛素信号。（A） 用λ-磷酸酶处理IRS-1免疫沉淀物表明IRS-1的迁移减少TSC2系统 ^−/−MEF是由于磷酸化增加所致。（B） 缺乏血清的治疗TSC2系统 ^+/+或TSC2系统 ^−/−使用雷帕霉素进行不同时间的MEF，然后对IRS-1（顶部）或IRS-2（底部）进行免疫印迹。存在于TSC2系统 ^−/−MEF用箭头表示；中存在迁移速度更快的IRS-1或IRS-2TSC2系统 ^+/+细胞或雷帕霉素治疗后用箭头表示。（C） 胰岛素或IGF-1治疗后PKB活化TSC2系统 ^+/+或TSC2系统 ^−/−使用雷帕霉素进行指定时间的MEF。顶部，Ser473磷酸化PKB；底部，总PKB的水平。（D） PIP3水平TSC2系统 ^+/+（灰色条）或TSC2系统 ^−/−（白色条）未经处理的细胞或用20 nM雷帕霉素预处理24小时的细胞经IGF-1刺激后的MEF。三次测定的结果（平均值和标准偏差）被归一化，以控制未模拟样品，并代表三次独立实验。（E） RNAi介导抑制IRS-1、IRS-2、IRS-1加IRS-2或干扰IRS-1和IRS-2 siRNA（干扰）组合后PKB激活TSC2系统 ^−/−用20 nM雷帕霉素治疗1小时后，胰岛素刺激MEF 10分钟。第一组，IRS-1；第二个面板，IRS-2；第三组，Ser473-磷酸化PKB；底部面板，总PKB。（F） PKB激活救援TSC2系统 ^−/−IRS-1或IRS-2过度表达后的MEF。模拟转染的提取物TSC2系统 ^−/−转染表达myc-IRS-1或IRS-2的表达构建物的MEF（C）或MEF在转染后饥饿24小时，用20 nM雷帕霉素处理1小时，然后用胰岛素刺激10分钟。如有指示，模拟转染细胞在刺激前也用20 nM雷帕霉素治疗24小时。第一组，用9E10单克隆检测myc-IRS-1；第二个面板，IRS-2；第三组，Ser473-磷酸化PKB；底部面板，总PKB。（G） PKB激活TSC2系统 ^−/−胰岛素刺激10分钟后，通过RNAi介导抑制S6K1、S6K2、S6K1加S6K2或S6K1和S6K2的混合物扰乱siRNAs（扰乱）后的MEF。扰乱siRNA-转染细胞也在胰岛素刺激前用20 nM雷帕霉素处理24小时。

为了研究雷帕霉素对胰岛素信号转导的拯救作用是否是通过对IRS-1或IRS-2的影响介导的，我们再次使用siRNAs。通过抑制IRS-1或在较小程度上抑制IRS-2，我们观察到雷帕霉素治疗1小时后PKB活化的部分挽救作用减弱，当这两种蛋白都被抑制时，效果更显著(图4E） 。为了确定IRS功能的扰动是否是导致胰岛素信号减弱的关键病变TSC2系统 ^−/−MEF，然后我们询问胰岛素信号是否可以在TSC2系统 ^−/−IRS-1或IRS-2过度表达后的MEF。我们发现IRS-1或IRS-2的过度表达导致PKB激活增加，当结合使用雷帕霉素对mTOR/S6K信号的短期抑制时，会导致雷帕霉素持续（24小时）治疗效果的现象学表现(图4F） ●●●●。

然后，我们询问雷帕霉素对信号传导的增强作用是否是由于使用siRNAs抑制S6K所致。结果表明，抑制S6K1或S6K2TSC2系统 ^−/−MEF导致PKB激活增加，而S6K1的抑制导致PKB活化增加更大(图4G） ●●●●。抑制任一激酶都会导致IRS-1蛋白水平的同等增加，而对IRS-2没有影响。总之，这些结果表明，我们在TSC2系统 ^−/−MEF是由对IRS-1和IRS-2的影响引起的。就IRS-1而言，这种影响似乎部分由S6K介导，S6K1和S6K2都有助于降低胰岛素信号。

IRS-1是S6K的新型基板

我们推断IRS-1也可能是S6激酶的新底物，并与S6相比，测试了GST标记的IRS-1片段覆盖整个蛋白质的能力，以在体外被S6K磷酸化。包含108–516残基的片段（IRS-1^108–516)在体外被S6K有效磷酸化(图5B） ●●●●。S6与IRS-1中S6K磷酸化位点的比较^108–516揭示了三个潜在的磷酸化位点，其中RxRxxS之后是S6中发生的远端丝氨酸(图5A） ●●●●。我们对近端（RxRxxS公司)以及每个潜在位点的远端丝氨酸，并询问这些突变体是否可以在体外磷酸化。结果表明，只有在IRS-1中^108–516其中丝氨酸302、307和310发生突变(图5A、 位点2）是体外未被S6K1磷酸化的IRS-1(图5C、 左侧面板）。丝氨酸307和310的个体突变对IRS-1几乎没有影响^108–516磷酸化，表明该位点不像S6那样在多个丝氨酸中被磷酸化，而丝氨酸302突变为丙氨酸会破坏磷酸化(图5C、 右侧面板）。这一结果通过使用磷酸化-Ser302抗体的Western印迹得到证实，该抗体在S6K体外磷酸化后仅识别野生型IRS-1(图5D） ●●●●。为了证实体外检测到的这种磷酸化对TSC2系统在体内，我们用这种抗体探测提取物。虽然IRS-1的水平在TSC2系统-与相比，MEF不足TSC2系统-表达MEF(图2C和图5E） ，Ser302-磷酸化IRS-1的水平大大提高(图5E） 和雷帕霉素敏感(图5F） ●●●●。我们再次使用S6K siRNAs来确定IRS-1 Ser302磷酸化是否通过体内S6K进行。结果表明，在siRNA介导的S6K1抑制后，IRS-1 Ser302磷酸化降低，但不受S6K2抑制的影响(图5G） ●●●●。因此，在TSC2系统 ^−/−MEF细胞，IRS-1 Ser302磷酸化主要由S6K1调节，而不是S6K2，尽管S6K2表达的敲除效果较差，这也为该激酶的某些贡献提供了形式上的可能性。

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图5。

IRS-1是一种新型S6K基板。（A） IRS-1的结构域表明GST融合区域（基于小鼠IRS-1进行aa编号），用于体外激酶分析，并将S6磷酸化位点与IRS-1中存在的候选S6样磷酸化位点进行比较^108–516保存的精氨酸以粗体显示，S6中S6K磷酸化的丝氨酸，IRS-1中可能磷酸化^108–516以红色显示，并且在位点1-3的突变体中突变为丙氨酸的丝氨酸被下划线。还显示了小鼠IRS-2中与位点2的同源位点。（B） 用纯化的S6K2对GST-IRS-1片段进行体外激酶分析。这些制剂中含有全长GST融合蛋白（1–4，如A所示）和40S核糖体蛋白的S6（40S）在考马斯蓝染色凝胶（右）中用星号表示³²激酶分析和放射自显影后的P标记蛋白如左图所示。IRS-1激酶分析中发现两条磷酸化带^108–516其中较低的一个代表蛋白质裂解形式的一个低分辨率双链。箭头表示³²40S核糖体制剂中存在P标记的S6。（C） 利用S6K1对IRS-1定点突变体进行体外激酶分析。顶板、放射自显影；底部面板，考马斯蓝染色凝胶；左面板，IRS-1磷酸化^108–516（WT）和1–3位点复合突变体，如图4A；右面板，IRS-1磷酸化^108–516以及位点2内丝氨酸残基的单个丝氨酸-丙氨酸突变体。（D） IRS-1的Ser302磷酸化^108–516野生型（WT）或IRS-1^108–516其中Ser302突变为丙氨酸（S302A），在体外S6K1磷酸化后用IRS-1 Ser302的磷酸特异性抗体检测。（E） IRS-1 Ser302磷酸化在体内升高。Top，Ser302磷酸化IRS-1，由缺乏血清的同基因提取物中的磷酸特异性Ser302抗体检测TSC2系统 ^+/+和TSC2系统 ^−/−MEF，以及TSC2系统 ^−/−野生型（−/−（+WT））或致病性突变的MEF系TSC2系统重新引入（−/−（+N1643K））；顶部，Ser302-磷酸化IRS-1；底部，总IRS-1。（F） 在缺乏血清的情况下，IRS-1 Ser302磷酸化被雷帕霉素mTOR/S6K抑制所抑制TSC2系统 ^−/−MEF公司。顶部，Ser302磷酸化的IRS-1；底部，总IRS-1。如有指示，MEF也被胰岛素刺激10分钟。（G）IRS-1 Ser302磷酸化在TSC2系统 ^−/−siRNA介导的S6K1抑制后的MEF。顶部，Ser302-磷酸化IRS-1；底部，总IRS-1。如有指示，还用胰岛素刺激MEFs 10分钟。

S6K磷酸化抑制IRS-1功能

接下来，我们询问IRS-1是否可以被酪氨酸磷酸化并与PI3K结合TSC2系统 ^−/−胰岛素刺激后的MEF。结果表明，在TSC2系统 ^−/−MEFs，IRS-1酪氨酸磷酸化程度低，在用胰岛素刺激细胞后与PI3K相关。雷帕霉素治疗1h后，IRS-1酪氨酸磷酸化和PI3K p85亚基的结合部分恢复TSC2系统 ^−/−MEF公司(图6，A和B). 重要的是，这种短期治疗不会显著改变IRS-1蛋白水平(图4、B和E)该研究认为，信号传递能力的降低可归因于功能受损以及可用IRS-1库的减少。雷帕霉素持续抑制S6K信号转导TSC2系统 ^−/−MEF将酪氨酸磷酸化和PI3K结合恢复到接近TSC2系统 ^+/+单元格(图6A） ●●●●。然后，我们问IRS-1的磷酸化是否^108–516通过S6K直接抑制其与激活的胰岛素受体的关联。我们在体外将含有IRS-1磷酸化酪氨酸结合域（PTB）的GST融合蛋白与S6K磷酸化，并在下拉分析中测定与未磷酸化或磷酸化IRS-1相关的活化胰岛素受体的数量。结果表明，S6K对IRS-1 PTB结构域的磷酸化显著降低了其与胰岛素受体的关联(图6、C和D)而Ser302-谷氨酸突变体可能模拟该位点的磷酸化作用，表现出与胰岛素受体的结合受损(图6、E和F). 因此，S6激酶直接磷酸化Ser302处的IRS-1，因此与胰岛素受体结合的减少可能在IRS-1无法向PI3K发出信号方面起主要作用。

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图6。

S6K磷酸化阻断IRS-1功能。（A） IRS-1酪氨酸磷酸化和与PI3K的关联在TSC2系统 ^−/−MEF和通过抑制S6K获救。未刺激或胰岛素刺激的IRS-1免疫沉淀物TSC2系统 ^+/+或TSC2系统 ^−/−雷帕霉素治疗指定时间后的MEF、磷酸酪氨酸免疫印迹（第1组）或PI3K p85亚单位的联合免疫沉淀（第2组）。细胞裂解物中IRS-1和p85的总水平分别显示在面板3和面板4中。（B） 未治疗患者胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸磷酸化的定量TSC2系统 ^−/−雷帕霉素处理指定时间后的MEF或相同细胞。获得了一个任意值，表示扫描放射自显影检测到的IRS-1免疫沉淀中未刺激和相应胰岛素刺激的磷酸酪氨酸水平之间的差异。将三个独立实验的值平均并绘制在条形图上，误差条显示SEM。（C）固定化GST-IRS-1的磷酸化^108–516S6K2的PTB结构域抑制胰岛素受体（InR）相互作用。通过添加含有指示量的S6K2磷酸化或未磷酸化GST-IRS-1的谷胱甘肽珠，在体外测定与酪氨酸磷酸化InR（顶部）的相互作用^108–516或GST到由胰岛素刺激的CHO-IR细胞制备的裂解物。GST-IRS-1融合蛋白或GST水平的免疫印迹显示在底部。DP表示GST-IRS-1蛋白的降解产物。（D） InR与GST-IRS-1结合的定量^108–516（WT）或突变型GST-IRS-1^108–516其中丝氨酸302经S6K2体外磷酸化后突变为丙氨酸（S302A）。误差条显示了三个实验的SEM。（E） 野生型GST-IRS-1的InR结合^108–516或下拉分析中的S302A和S302E突变体。顶部，InR；底部，抗GST。（F） InR与GST-IRS-1结合的定量^108–516（WT）或S302A和S302E突变体。为野生型GST-IRS-1的绑定指定了任意值100^108–516突变IRS-1蛋白的结合表达与该值相关。误差条显示了三个实验的SEM。

细胞培养、生长因子治疗和siRNA转染

饥饿的MEF(Jaeschke等人，2002年)用1μg/ml胰岛素、50 ng/ml IGF-I或20 ng/ml EGF刺激10分钟。将CHO-IR细胞维持在含有10%FCS的Ham’s F12培养基中，并在缺乏血清的培养基中饥饿24小时。为了激活胰岛素受体，然后用1μM胰岛素刺激细胞10分钟。S6K的siRNA（Dharmacon）为：S6K1，5′-GGACATGGCAGGTTT-3′；和S6K2，5′-GAACCAAGAAGTCCAAGAA-3′。

对于IRS-1和IRS-1/IRS-2双转染，使用的序列如前所述(Pirola等人，2003年). 对于IRS-2单次转染，使用以下序列：IRS-2，5′-CAAGCAAGACTACTGAT-3′。

使用LipofectAMINE™2000转染SiRNAs，并在24小时（对于IRS-1和IRS-2）或5天后（S6K1和S6K2）收集细胞。

PI3K测定和PIP3测定

如前所述进行分析(Herbert等人，2000年)并使用荧光成像仪（富士）进行成像；使用AIDA分析软件对条带进行量化。结果在Microsoft Excel中表示为直方图。通过TRFRET置换分析估算PIP3(格雷等人，2003年). 如前所述，PIP3的估计值被归一化为提取的总脂质(Raheja等人，1973年).

RNA分析

小鼠基因寡聚物微阵列载玻片（～7.5k个基因/载玻片）来自人类绘图项目（英国剑桥）。使用Atlas™Glass荧光标记试剂盒（CLONTECH Laboratories，Inc.）和Cy3和Cy5活性染料（Amersham Biosciences）制备荧光标记cDNA探针，并按照制造商的说明进行处理。对于Northern印迹，RNA在琼脂糖甲醛凝胶上运行，在Hybond™-N上印迹，并使用标准程序进行杂交和洗涤。使用Omniscript™RT Kit（QIAGEN）合成的cDNA，使用RNeasy™Mini Kit（QIAGEN）从适当处理的MEF中纯化的总RNA，进行两步定量RT-PCR。对于放线菌素D实验，TSC2系统 ^−/−在不存在或存在20nM雷帕霉素的情况下使细胞饥饿24小时，或在最后10小时内用添加了10μg/ml放线菌素D的雷帕霉素饥饿24小时。使用JOE标记的小鼠β-actin LUX™引物组（Invitrogen）和带有QIAGEN合成的6-FAM标记探针的IRS-1特异性引物对进行定量PCR。使用PCR Master Mix进行探针分析（Eurogentech），使用最终浓度为200 nM的β-actin LUX™引物、最终浓度为300 nM的IRS-1引物和100 nM的探针进行反应。使用序列检测器（ABI Prism™7700；Applied Biosystems）进行三次反应。使用Sequence Detector v1.7软件分析结果。

免疫沉淀

细胞在缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，120 mM NaCl，1%NP-40，1 mM EDTA，50 mM NaF，40 mMβ-甘油磷酸盐，5 mM Na）中溶解_三沃₄1μg/ml亮氨酸肽、1μg/ml抑肽酶和1 mM苯甲脒）。将300μg蛋白质添加到2μg抗IRS-1抗体中，在4°C下进行免疫沉淀12小时，然后在添加10μl蛋白质g–琼脂糖并洗涤后再进行2小时的旋转。对于λ-磷酸酶实验，用λ-磷酸反应缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，2 mM MnCl₂，0.1 mM EDTA和5 mM DTT），并重悬于15μl含有或不含有400 U纯化的λ-磷酸酶的缓冲液中，反应在30°C下孵育1小时，并定期搅拌。

蛋白质方法

将GST-IRS-1（aa 21–400、108–516、516–895和895–1235）从50 mM Tris-HCl、pH 8.0和10 mM谷胱甘肽中的谷胱甘苷-甘露糖珠中洗脱，与50 mM Tris-HCl，pH 8.5、150 mM NaCl、10%甘油、1 mM PMSF、1 mM M苯甲脒和1 mM DTT进行透析，并进行浓缩。使用固定在蛋白A–Sepharose CL-4B（Amersham Biosciences）上的小鼠EE单克隆抗体，从感染产生病毒的昆虫细胞中纯化重组EE-S6K1和EE-S6K2。在激酶分析缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl）中进行体外激酶分析₂，50μM冷ATP，5μCiγ[³²P] -标记的ATP），使用1μg GST-IRS-1片段或0.4μl 40S核糖体制剂作为底物(痛风等，1998年). 反应在30°C下持续20分钟。

对于InR-结合分析，在37°C的15μl激酶反应缓冲液中用200μM冷ATP和0.6μg S6K2磷酸化GST-IRS-1 30分钟。蛋白质与谷胱甘肽-海藻糖结合，用激酶缓冲液洗涤两次，用裂解缓冲液A洗涤一次（50 mM Tris-Cl，pH 7.4，150 mM NaCl，50 mM NaF，1 mM苯甲脒，1 mM-EDTA，1%NP-40，40 mMβ-甘油磷酸，5 mM原钒酸钠，2 mM PMSF，1μg/ml亮氨酸肽，1μg/ml抑肽酶和10%甘油）。在缓冲液A中对过度表达IR的CHO细胞进行裂解，并使用0.5 mg蛋白质在4°C下进行1 h的结合分析，然后用A缓冲液进行三次洗涤，添加SDS-PAGE样品缓冲液和SDS-PAGE。使用QuikChange产生GST-IRS-1（aa 108–516）突变体^®定点突变试剂盒（Stratagene）。为了对InR下拉进行定量和统计分析，使用Adobe Photoshop扫描了放射自显影照片并确定了条带的像素强度^®并针对背景像素强度进行了校正。与GST-IRS-1野生型和GST-IRS1 S302A相关的胰岛素受体在每个对照实验中（即无激酶）被指定为100%的值。经S6K磷酸化后，与GST-IRS-1野生型和GST-IRS1 S302A相关的胰岛素受体在每个实验中相对于100%的对照值进行了标准化。对三个独立实验的值进行了分析，并将平均值绘制在图表上。

细胞趋化性测定

MEF在有或无20 nM雷帕霉素的情况下饥饿24小时，并在胰蛋白酶化前用2μg/ml CellTracker™Green（Molecular Probes，Inc.）进一步标记1小时。在含有0.5%FCS的DME中，将20000个细胞一式两份镀在荧光块Transwell过滤器（Becton Dickinson）上，并放置在含有相同培养基或含有50 ng/ml重组IGF-1或20 ng/ml重构EGF（Sigma-Aldrich）的培养基的微孔中。趋化作用持续6h，然后将微孔固定在PBS/4%PFA中。在配备数码相机（CoolSnap）和暗室图像采集软件（Improvision）的立式显微镜（DM-IRB；Leica）上，使用FITC激发/发射在10×场中显示荧光。对于定量，从每个重复分析中对三个随机区域进行成像，并手动计算穿过滤镜的扩散荧光细胞的数量。细胞数量表示为TSC2系统 ^+/+在IGF-1存在的情况下，在Microsoft Excel中生成直方图。

我们要感谢Alan Ashworth在微阵列实验方面的帮助，Tony Ford在定量RT-PCR方面的建议，以及Paula Muir在数据分析和DNA测序方面的建议。我们感谢斯图亚特·弗兰克（Stuart Frank）构建GST-IRS-1，莫里斯·怀特（Morris White）构建抗体，德里克·勒罗思（Derek LeRoith）构建表达载体，以及克里斯·马歇尔（Chris Marshall）的讨论、批判性阅读和支持。

L.S.Harrington由结节性硬化协会（英国）、C.P.Downes由医学研究委员会（英国）和信号转导治疗司的项目拨款支持，J.Barnett由生物技术和生物科学研究委员会通过葛兰素史克支持的CASE学生奖学金支持。T.Tolkacheva、S.Wigfield和R.F.Lamb获得了英国癌症研究院的资助，G.M.Findlay获得了癌症研究所的奖学金。我们感谢结节性硬化协会（英国）和LAM基金会（美国）的帮助和支持。