低氧诱导因子1和失调c-Myc协同诱导血管内皮生长因子和代谢开关己糖激酶2和丙酮酸脱氢酶激酶1^{▿ †}

摘要

动物的发育依赖于协调正常细胞增殖、生长、新陈代谢和对局部组织微环境（例如器官发生的缺氧）的反应的机制(21,50). 另一方面，肿瘤发生通过激活癌基因的基因改变篡夺了类似的机制，例如MYC公司癌基因，或使抑癌基因失活以促进细胞增殖(28). 然而，肿瘤细胞在三维多细胞簇中的增殖受到氧和营养物质扩散的限制，因此必须通过激活低氧诱导因子（HIF），尤其是HIF-1来维持代谢适应阶段(6,25,72). HIF-1在低氧张力下诱导，并作为转录因子激活允许代谢适应的基因，如己糖激酶2（HK2）和丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）(16,37,54,61,81). HIF-1还诱导血管内皮生长因子（VEGF），促进新生血管形成(67). 有趣的是，c-Myc致癌转录因子也诱导参与糖酵解和VEGF的基因，但与HIF-1相反，c-Myc在非缺氧条件下促进线粒体生物发生(三,38,46,49,85). 我们推测c-Myc将糖酵解和氧化代谢与正常细胞的细胞生长和增殖结合。随着正常发育，HIF-1活性发出的缺氧和营养缺乏信号理所当然与细胞增殖的停止有关(18,22,48). 事实上，已经报道了HIF-1对抗c-Myc活性的多种机制。例如，HIF-1结合c-Myc并抑制c-Myc的转录活性以及激活c-Myc拮抗剂Mxi-1，从而导致细胞周期停滞和基因组不稳定(9,24,42-44,80). 或者，其共识结合位点（5′-G/ACGTG-3′）与c-Myc共识位点（5’-CACGTG-3′）重叠的HIF-1可能取代HIF-1/c-Myc反应元件中的c-Myc(55). 此外，缺氧诱导的c-Myc蛋白酶体降解可能独立于HIF-1，并保护缺氧细胞免受c-Myc介导的凋亡(9).

这些HIF-1介导的机制可能对c-Myc正常表达并受到HIF-1的稳态调节的正常发育至关重要。然而，在癌症中MYC公司通常是失调的，尚不清楚这些正常的稳态机制是否被绕过，从而允许失调的c-Myc和HIF-1之间的合作。因此，我们在这里试图确定失调的c-Myc如何与HIF-1合作调节改变新陈代谢和新生血管的基因。特别是，我们关注的是HK2、PDK1和VEGF，所有这些之前都被证明是HIF-1靶点，并且受c-Myc的约束或调节(三,16,37,38,47,54,61,77).

在三种亚型（HIF-1至-3）中，HIF-1主要与肿瘤进展有关(20,25,69,72,74). HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成的异二聚体转录因子。HIF-1水平的氧调节依赖于HIF-1α氧依赖性结构域，该结构域包含两个脯氨酰残基（402和564），在氧存在下被脯氨酰羟化酶羟基化(4,33,34,52,70,73). von Hippel-Lindau（VHL）蛋白识别羟基化HIF-1α的泛素化和随后的蛋白酶体降解(30,56). 因此，在肿瘤微环境中，HIF-1的激活对肿瘤细胞的生存和增殖至关重要。

与HIF-1对缺氧或特定信号转导途径作出反应不同，c-Myc转录因子在非缺氧增殖的正常细胞中表达，在人类癌症中经常失调。c-Myc是一种与Max异二聚体化的基本螺旋环螺旋转录因子，其转录网络与许多生物过程有关，包括发育、细胞增殖和生长、细胞周期、凋亡和能量代谢(1,8,12,27,58). 通过c-Myc表达失调而激活的癌基因有助于转基因小鼠和包括淋巴瘤在内的多种人类癌症中各种组织的肿瘤发生(14,32,57,65,66). 然而，与生理表达相比，c-Myc表达失调在HIF-1介导的缺氧反应中的作用尚不清楚。

在这里，我们报告了人类P493-6 B细胞的使用，该细胞在条件下过度表达人类MYC公司退出四环素后(71). P493-6模型重述了人类Burkitt淋巴瘤，以及通过HIF-1的缺氧激活在体内外对缺氧的反应。此外，HIF-2α在P493系统中不表达，因此，该系统不会被另一个低氧反应因子混淆(17). 因此，我们利用P493-6系统研究HIF-1和失调c-Myc的转录调控。在这项研究中，我们提供证据表明HIF-1与失调的c-Myc协同促进淋巴肿瘤。我们的研究进一步证明，c-Myc和HIF-1可增强葡萄糖代谢关键开关的转录，如香港2号和PDK1系列刺激糖酵解。HK2通过磷酸化葡萄糖来催化糖酵解的第一步，形成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸酯通过糖酵化进一步分解代谢。PDK1由缺氧诱导，磷酸化并灭活丙酮酸脱氢酶，丙酮酸氢脱氢酶是丙酮酸转化为乙酰辅酶A（乙酰-CoA）所必需的(29). 因此，PDK1通过限制乙酰辅酶A对线粒体氧化磷酸化的可用性来抑制线粒体呼吸(37,61). 我们还证明，c-Myc和HIF-1协同刺激VEGF的诱导，VEGF是一种促血管生成因子。我们的研究揭示了失调的c-Myc和低氧诱导的HIF-1在促进糖代谢和血管生成方面的协同作用，这为低氧肿瘤微环境下的肿瘤进展提供了适应性优势。

材料和方法

结果

HIF-1促进c-Myc介导的肿瘤发生。

我们发现shRNA降低HIF-1α表达显著抑制c-Myc介导的P493-6细胞的肿瘤发生(17). 这些研究表明，HIF-1α对P493-6细胞体内肿瘤发生是必要的。为了确定HIF-1α在P493-6肿瘤发生中是否能与c-Myc协同作用，我们引入了一种组成活性形式的HIF-1β（CA5-HIF-1），如前所述，其氧依赖域被删除，一些脯氨酸发生突变(35)发现与对照组相比，肿瘤生长显著增强（图。​（图1A）。1安培). 然而，在体外CA5-HIF-1αP493-6细胞中没有观察到增殖或活力的增加（数据未显示）。这些结果表明HIF-1α参与体内c-Myc介导的肿瘤发生。

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图1。

组成稳定的HIF-1α（CA5-HIF-1）对肿瘤发生及HK2和PDK1表达的影响。（A） 表达CA5-HIF-1α的P493-6细胞的肿瘤生长，或通过饮用水进行四环素类似物多西环素（0.01%，wt/vol）处理或不处理控制EV。肿瘤体积通过卡尺测量确定。误差条表示平均值的标准误差(n个=20，对于非四环素治疗的肿瘤，n个=10（对于四环素治疗的肿瘤）。（B） 表达CA5-HIF-1α或对照EV的P493-6细胞异种移植物裂解物的免疫印迹分析（顶部）及其定量（底部）。表示每个CA5-HIF1α和EV对照P493-6异种移生物的两个谱带的平均光密度。误差条表示两个频带的范围。（C） 免疫印迹分析（top）及其诱导定量(n个-在非缺氧条件下退出四环素后48小时（底部），在CA5-HIF-1α或对照EV P493-6细胞中加入HK2、PDK1、LDHA、HK1、CA5-HIF1α和c-Myc。Actin显示为加载控件。*，P（P）<0.02（学生）t吨测试。

通过四环素停药诱导c-Myc后，我们检测了对照组与CA5-HIF-1α过度表达的P493-6细胞中参与低氧代谢适应的选定蛋白的表达（图。1B和C). 我们注意到，表达CA5-HIF-1α的P493-6细胞中Myc略有增加，HK2和PDK1蛋白水平均高于表达对照EV的细胞，这表明HK2和PDK1均由c-Myc和缺氧协同诱导。尽管肿瘤异种移植物缺氧微环境诱导了高水平内源性HIF-1α，但额外的异位CA5-HIF-1β表达进一步诱导了HK2和PDK1（分别比EV对照高1.6倍和1.7倍）（图。​（图1B，1B年，底部）。特别是，虽然HK2在这两种条件下都是由c-Myc诱导的，但PDK1的表达似乎仅在稳定的HIF-1α（CA5-HIF-1β）活性存在的情况下对c-Myc有反应（图。​（图1C）。1摄氏度). 有趣的是，CA5-HIF-1α似乎是由c-Myc诱导的。我们推测c-Myc对异位CA5-HIF-1表达的影响可能是转录或转录后的，这还没有进一步研究。尽管如此，PDK1和HK2的诱导增强与异位CA5-HIF-1α水平相关，支持异位CA5-HIF-1α确实有助于HK2和PDK1表达的观点。在大鼠成纤维细胞中也观察到通过c-Myc和HIF-1增强这些蛋白质的表达Myc公司无效（HO15.19）或用人类重建MYC公司（HO15.19-c-Myc）(46,53). 值得注意的是，与表达较高水平HK2的HO15.19-c-Myc或TGR细胞相比，在缺氧条件下，HO15.19细胞对HK2的诱导作用最小，这表明c-Myc对于HK2的显著诱导是必要的（参见补充材料中的图S1）。然而，PDK1的诱导似乎主要受HIF-1或大鼠成纤维细胞缺氧的调节。这些研究进一步支持了c-Myc和HIF-1在另一个系统中的协同作用（参见补充材料中的图S1）。

c-Myc和HIF-1通过诱导HK2协同增强葡萄糖代谢。

由于获得功能和丧失功能的研究都表明HIF-1α在c-Myc介导的P493-6细胞肿瘤发生中的重要性，并且HK2蛋白的表达在c-Myc和HIF-1的协同作用下增加，我们试图确定HIF-1和失调的c-Myc能否协同改变葡萄糖分解代谢和转录调节HK2。用四环素和/或缺氧处理P493-6细胞以调节c-Myc和HIF-1α的水平。如图所示。​图2A，2安培，在四环素（0.1μg/ml）存在下，MYC公司表情几乎被完全压抑了。MYC公司通过去除P493细胞中的四环素（之前用四环素处理48小时）快速诱导。为了诱导HIF-1α的表达，将P493-6细胞暴露于低氧（0.1%O₂)或100μM CoCl₂HIF-1α表达在缺氧29小时或氯化钴作用下达到峰值₂治疗。在这些条件下，P493-6细胞在72小时内仍能存活，且无凋亡迹象。细胞通过缺氧或c-Myc抑制（四环素治疗）或两者都停止增殖。只有c-Myc高表达的非缺氧P493-6细胞增殖（参见补充材料中的图S2）。

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图2。

c-Myc和HIF-1增强P493-6细胞的糖酵解。（A） 免疫印迹法检测P493-6细胞中c-Myc和HIF-1α的表达。用四环素（0.1μg/ml）预处理P493-6细胞48 h。清洗后，在缺氧（0.1%O）条件下培养细胞，加入或不加入四环素₂)或底部所示的正常氧。为了在非缺氧条件下诱导HIF-1α，将P493-6细胞培养在含有100μM CoCl的培养基中₂对等量的核蛋白进行免疫印迹分析，以确定c-Myc和HIF-1α的表达。拓扑异构酶1显示为核提取物的负载控制。（B） 通过测量细胞内2-[^三H] 脱氧葡萄糖。误差条表示两个独立实验的平均值的标准误差。（C） 使用乳酸检测试剂盒测量培养基中的乳酸积累。将乳酸浓度标准化为活细胞数。误差条表示两个独立实验的平均值的标准误差。

我们通过测量葡萄糖摄取和乳酸生成来测定糖酵解活性。我们发现，表达c-Myc和HIF-1的P493-6细胞在葡萄糖摄取和乳酸生成方面均表现出增加，表明糖酵解代谢升高（图。2B和C). 由于HK2是HK的四种亚型之一，在人类癌症中高度表达，并且已知它是c-Myc和HIF-1的直接靶点，因此我们试图确定葡萄糖摄取和糖酵解增加是否与HK2表达增加相关。我们发现HK2在mRNA处显著增强（图。​（图3A；3A级; 另请参见补充材料中的图S3A）和蛋白质（图。​（图3B）3B公司)与单独表达c-Myc或HIF-1α的P493-6细胞相比，同时表达c-Myc和HIF-1α的P493-6细胞中的水平。与mRNA和蛋白质水平一致，c-Myc和HIF-1也增强了己糖激酶的酶活性（图。​（图3C）。3C公司). 我们还检测了其他糖酵解酶的水平，包括HK1、ENO1、GAPD和LDHA，已知其受c-Myc、HIF-1或两者调节(38,75). 在P493细胞中未观察到c-Myc和HIF-1导致其他糖酵解酶基因（包括ENO1、GAPD、HK1和LDHA基因）增加，支持HK2在c-Myc与HIF-1促进糖酵化代谢中的主要作用（参见补充材料中的图S3B）。与其他酶相比，在非缺氧条件下，P493-6异种移植物以及具有组成活性HIF-1α（CA5-HIF-1）的P493-6细胞中，HK2的表达也增加（图。1B和C).

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图3。

c-Myc和HIF-1增强HK2表达。（A） P493-6细胞中HK2表达的Northern blot分析。四环素预处理48小时以抑制MYC公司如图所示，表达后在不同条件下培养细胞。18S溴化乙锭染色显示为负荷控制。（B） P493-6细胞中HK2表达的免疫印迹分析。Actin显示为加载控件。（C） HK酶活性。在缺氧（左）或氯化钴中培养或不培养四环素的P493-6细胞的总细胞裂解物₂治疗（右）29小时后进行HK活性测定。HK活性由340 nm处NADH的产生量决定，并由总蛋白浓度标准化。误差线表示三个独立实验的标准偏差。

除CoCl外₂在非缺氧条件下稳定HIF-1α的治疗，我们使用表达靶向HIF-1 a的shRNA的P493-6细胞进一步证实缺氧条件下HK2的协同诱导是由HIF-1β而非非HIF-1途径介导的（图。​（图4A）。4A级). 如图所示。​图4B，4B类在高c-Myc和低氧条件下，HIF-1α敲低的P493-6细胞中HK2的诱导显著减弱。值得注意的是，c-Myc水平并未因HIF-1α表达减少而升高（图。​（图4A4A级).

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图4。

HIF-1α表达降低对HK2和PDK1诱导的影响。（A） 靶向HIF-1α或对照载体稳定表达shRNA的P493-6细胞中HIF-1 A和c-Myc表达的免疫印迹。用四环素（0.1μg/ml）预处理HIF-1αshRNA或对照P493-6细胞48 h。洗涤后，细胞在缺氧（0.1%O）中培养₂). Actin显示为加载控件。（B） HK2、PDK1和p21表达的免疫印迹。用四环素（0.1μg/ml）预处理HIF-1αshRNA或对照P493-6细胞48 h。洗涤后，在低氧（0.1%O）条件下培养细胞，加入或不加入四环素₂)或底部所示的正常氧。Actin显示为加载控件。

接下来，我们试图确定HK2在缺氧时增加葡萄糖摄取和乳酸生成中的作用。用靶向HK2的siRNA转染P493-6细胞（图。​（图5A）。5A级). 缺氧P493-6细胞中葡萄糖摄取的增加通过抑制HK2的表达而消除（图。​（图5B）。5亿). 低氧条件下经HK2 siRNA处理后，乳酸生成也减少，但程度较小（图。​（图5C）。5摄氏度). 综上所述，这些结果表明HIF-1协同诱导HK2表达和c-Myc活性失调，共同促进葡萄糖摄取和乳酸生成增加。

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图5：。

HK2表达减少对P493-6细胞糖酵解的影响。（A） 用四种不同的靶向HK2的siRNAs（siGENOME SMART POOL）池或低氧条件下对照干扰的siRNA池电穿孔P493-6细胞中HK2表达的免疫印迹分析₂). HK1被显示为加载控件。（B和C）P493-6细胞的葡萄糖摄取（B）和乳酸积累（C）。在指定条件下48小时对细胞进行细胞内2-[^三H] 培养基中的脱氧葡萄糖或乳酸积累。活细胞的蛋白质浓度或活细胞总数分别用于葡萄糖摄取或乳酸积累的标准化。误差条表示两个或三个独立实验的平均值的标准误差。

HK2基因调控区c-Myc和HIF-1的DNA结合。

自早期研究报告以来香港2号是缺氧条件下HIF-1或非缺氧条件下c-Myc的直接靶点，我们试图确定缺氧条件下，HIF-1和Myc与HK2启动子区的结合。通过DNA序列分析，我们鉴定了5个潜在的c-Myc结合位点（E-boxes，5′-CAGTG-3′）和大约50个潜在的HIF-1结合位点（缺氧反应元件，5′-G/ACGTG-3′），它们位于香港2号第一个内含子。我们用22对引物对进行了ChIP扫描，这些引物被设计为以大约1kb的间隔扫描人类香港2号从转录起始位点上游5kb到内含子1跨越25kb的基因组区域。正如我们之前的研究所报告的那样，扫描ChIP证实了一个c-Myc结合区域，该区域是位于内含子1中高度保守的E盒中的结合信号（图。​（图6，6，上部面板，区域6）(38). 我们发现HIF-1结合在启动子区域（图。​（图6，6，中间面板，区域3或4），其中还包含高度保守的HIF反应元件。来自非抗体对照和对照IgG抗体样本的样本显示背景信号，表明c-Myc或HIF-1结合的特异性（参见补充材料中的图S4）。值得注意的是，HIF-1结合区距离内含子c-Myc结合区至少1 kb，这表明c-Myc和HIF-1可以独立地、协同地相互作用香港2号基因。

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图6。

扫描ChIP分析香港2号基因。人类香港2号通过ChIP扫描基因以确定c-Myc（顶面板）或HIF-1（中面板）DNA结合区域。Labeled regions (amplicons 1 to 22) of the香港2号实时PCR定量检测基因。对未经四环素处理的低氧（72小时）P493-6细胞中沉淀的片段染色质进行PCR，该细胞含有抗c-Myc或抗HIF-1α，无抗体或对照IgG抗体（无抗体和IgG对照背景信号参见补充材料中的图S2）。结合活性表示为染色质DNA总输入量的百分比。底部面板显示了人类中保守的典型E盒（大箭头）、保守的HIF-1结合位点（小箭头）和外显子1的位置香港2号基因组序列。扫描ChIP的放大器由香港2号基因和标记。误差条表示两个或三个独立重复反应的标准偏差。

c-Myc和HIF-1协同诱导PDK1向糖酵解的代谢转换。

PDK1被HIF-1在低氧条件下直接诱导，通过抑制线粒体呼吸介导向糖酵解的代谢转换(37,61). 此外，据报道，通过ChIP分析，c-Myc可以在启动子阵列中结合PDK1的启动子区域(47). 如前所述，c-Myc单独在非缺氧条件下对PDK1表达的影响最小(37). 在缺氧或CoCl诱导的HIF-1α存在下₂，c-Myc进一步增强PDK1的表达（图。7A和B). 同样，组成活性CA5-HIF-1α的异位表达允许c-Myc诱导P493-6细胞和肿瘤异种移植物中PDK1的表达（图。1B和C). 此外，shRNA敲低HIF-1α降低了低氧条件下PDK1的诱导（图。​（图4B）。4B类). 然而，我们注意到与图中所示结果相比，在正常氧条件下Myc诱导后，对照细胞中PDK1表达的变化。​图1C。1摄氏度我们推测这是由于PDK1在非缺氧条件下相对较低表达的波动所致。然而，这些观察结果表明，在缺氧肿瘤细胞中观察到丙酮酸转化为乳酸的增加可能是c-Myc和HIF-1协同诱导PDK1的结果。

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图7。

c-Myc和HIF-1增强P493-6细胞中PDK1的表达。（A） PDK1的mRNA水平通过实时RT-PCR测定。误差线表示两个独立重复反应的标准偏差。（B） 低氧（或CoCl）中PDK1表达的免疫印迹分析₂或非缺氧P493-6细胞，用或不用四环素处理。Actin显示为加载控件。（C） 通过PDK1 siRNA或对照siRNA在P493-6细胞中降低PDK1表达的免疫印迹分析。氯化钴₂治疗用于诱导HIF-1依赖性PDK1的表达。Actin显示为加载控件。（D和E）在含有或不含CoCl的P493-6细胞培养基中的乳酸积累₂诱导PDK1表达的治疗。PDK1通过siRNA（D）或PDK抑制剂二氯乙酸（DCA）（E）处理而被抑制。乳酸浓度归一化为总活细胞。误差条表示两到三个独立实验的平均值的标准误差。

这些观察结果可以解释图。​图2C2摄氏度在HIF-1α的存在下，c-Myc协同增加了乳酸的产生，而c-Myc不单独增加乳酸的产生。通过siRNA转染抑制PDK1（图。​（图7C）7摄氏度)或用PDK抑制剂二氯乙酸处理，导致乳酸生成显著降低（图。7D和E)，证实PDK1在c-Myc和HIF-1介导的乳酸生成中的作用。然而，CoCl₂众所周知，这种治疗可以稳定HIF-1α，进而激活LDHA等目标糖酵解酶基因。在这方面，CoCl₂治疗可能不仅通过PDK1诱导而且通过升高的LDHA增加乳酸的产生。由于CoCl升高了LDHA₂可能会增加基础乳酸的产生，而PDK1的抑制会减弱基础乳酸的生成，因此PDK1抑制不会完全降低乳酸的生成。（图。​（图7D第7天).

PDK1基因调控区中c-Myc和HIF-1的DNA结合。

为了确定c-Myc和HIF-1协同刺激PDK1表达的性质，我们进行了ChIP扫描，以精确定位这两个因子的结合区域。我们以前报道过通过免疫沉淀富集的HIF-1相关染色质片段覆盖了外显子1和内含子1的边界，内含子1包含了一组共有HIF-1结合位点(37). 为了进一步精确定位HIF-1结合位点，采用系统发育足迹法来确定保守的共识HIF-1位点。如图所示。​图8，8高度保守的共有位点位于外显子1（5′-G/ACGTG-3′），与HIF-1显著结合，而内含子1为典型的c-Myc结合位点（E盒，5′-CACGTG-3′），主要与c-Myc相结合。c-Myc和HIF-1结合的特异性通过无抗体对照实验和对照IgG样品验证（参见补充材料中的图S5）。与HK2基因相似，ChIP表明c-Myc和HIF-1结合非重叠基因组区域。

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图8。

扫描ChIP分析PDK1系列基因。的标记区域（扩增子1至9）PDK1系列实时PCR定量扩增基因。误差线表示两个或三个独立重复反应的标准偏差。符号与图中的符号相同。​图66.

c-Myc和HIF-1协同诱导VEGF。

除了通过调节诸如香港2号和PDK1系列肿瘤的进展高度依赖于血管生成，血管生成是肿瘤的标志之一。在肿瘤发展过程中促进血管生成的一个关键机制是HIF-1介导的VEGF转录激活，VEGF通过有丝分裂刺激内皮细胞向新血管募集(67). 早期使用转基因动物模型的研究报告称，c-Myc缺陷小鼠在血管发育、血管生成和红细胞生成方面表现出严重缺陷，表明c-Myc参与调节VEGF表达和血管生成(67,77). 使用P493-6系统，我们试图确定与HK2和PDK1相似的VEGF表达是否也受到c-Myc和HIF-1的调节。c-Myc可诱导VEGF在mRNA（通过实时RT-PCR测定）和蛋白质（通过ELISA测定）水平上的表达。缺氧进一步增强了VEGF的表达（图。9A和B). 扫描ChIP分析显示c-Myc和HIF-1与细胞启动子区两侧的染色质片段相关血管内皮生长因子基因（图。​（图9B，9亿，区域5；另请参见补充材料中的图S6）。虽然不存在保守的典型c-Myc结合位点（E盒），但c-Myc的DNA结合似乎定位于HIF-1结合的同一基因组区域。c-Myc结合似乎进入内含子1，这是c-Myc在其他基因中结合的特征(84). 这些数据表明c-Myc和HIF-1可以结合重叠和非重叠的结合位点血管内皮生长因子.

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图9：。

c-Myc和HIF-1增强VEGF表达。（A） 通过实时RT-PCR和ELISA分别测定VEGF的mRNA和蛋白水平。误差线表示两个独立重复反应的标准偏差。（B） c-Myc和HIF-1与血管内皮生长因子如图所示，通过扫描ChIP分析测定基因。​图66.

讨论

在这项研究中，我们提供了支持我们最近观察的分子线索，表明HIF-1α对c-Myc介导的肿瘤发生至关重要(17). 此外，我们的体内异种移植试验表明，通过稳定的HIF-1α突变体获得功能增强了c-Myc介导的P493-6细胞的致瘤潜能（图。​（图1）。1). 然而，P493-6细胞的增殖在体外缺氧时显著减慢（参见补充材料中的图S2，也参见下文），而体内肿瘤生长被HIF-1和c-Myc加速。值得注意的是，体内肿瘤发生需要大量的P493-6细胞，这意味着肿瘤发生还涉及其他因素(17). 然而，我们在本研究中使用的体外模型允许一个实验系统来研究HIF-Myc相互作用，这可以在体内进一步调节。尽管有此警告，但我们在此证明，缺氧适应（包括葡萄糖摄取增加、糖酵解增强和VEGF水平升高）是通过HIF-1与c-Myc表达失调的协同作用来刺激的。

最近的各种研究表明，HIF-1α负调控c-Myc的转录活性并抑制c-Myc生理作用(9,24,42-44,55,80). 理所当然的是，在正常细胞中，当细胞增殖信号增强时，c-Myc就会表达MYC公司表达，例如在伤口愈合中，缺氧应该是血流减少和组织营养限制的信号。因此，通过HIF-1诱导的缺氧可能会触发细胞生长停滞，内皮细胞除外，并改变细胞代谢。事实上，我们已经发现缺氧会导致细胞生长停滞和内源性MYC公司体外表达（图。​（图2A；2安培; 参见补充材料中的图S2）(18). 然而，即使在缺氧条件下，也没有在P493-6细胞中观察到p27表达，这与之前报道的研究一致(60). 检测到极低水平的p21；然而，我们没有观察到缺氧条件下p21的增加（图。​（图4B）。4B类). 相反，p21似乎在缺氧时通过一种未知机制而降低。

图中的观察结果。​图11组成性HIF-1表达增强体内Myc介导的P493-6肿瘤发生似乎与体外P493-6细胞在缺氧条件下无法增殖相矛盾，如图所示。​图2A2安培以及补充材料中的图S2。那么HIF-1如何增加Myc介导的肿瘤发生？我们推测，在体内肿瘤发生所需的大量P493-6细胞中，一个亚群获得了额外的因子，这些因子允许建立依赖于Myc和HIF的肿瘤块。尽管我们在体外研究Myc-HIF相互作用的尝试因这些差异而有细微差别，但我们相信，从我们的研究中获得的见解对于进一步了解体内Myc和HIF之间的相互作用是必要的(17).

然而，这些早期的研究并未涉及HIF-1与c-Myc在以下情况下的相互作用：MYC公司表达失调，正如人们期望在肿瘤中发现的那样，这种肿瘤可能是由激活的MYC公司致癌基因。对各种模型系统的研究表明，c-Myc功能通过调节参与细胞粘附、增殖、生长和代谢的靶基因，对细胞增殖和正常胚胎发育起着重要作用(12,27,84). 以前，我们也报道过c-Myc除了诱导糖酵解酶基因外，还促进线粒体生物发生和呼吸(38,46,59,78). 在当前的研究中，我们发现携带失调c-Myc的P493-6细胞在非缺氧条件下消耗更多的葡萄糖，但乳酸生成没有增加，因为c-Myc促进线粒体生物生成和呼吸（图。2B和C). c-Myc的这些活性表明，它可以将正常细胞中的细胞生长和细胞周期机制与细胞能量生产系统耦合。因为许多癌细胞表现出Warburg效应或有吸收葡萄糖并将葡萄糖转化为乳酸的倾向，而不是通过氧化磷酸化代谢葡萄糖(2,7,15,19,36,76,82,83)，我们试图了解c-Myc表达失调如何在缺氧时与HIF-1相互作用，以介导Warburg效应和对肿瘤微环境的适应。

使用P493-6系统，我们确定c-Myc的强制过表达是否可以使c-Myc从HIF-1α的稳态调节中解放出来。已知HIF-1能激活糖酵解酶和PDK1编码基因的转录，这似乎是在缺氧微环境下通过从氧化磷酸化到糖酵化的代谢转换实现的关键缺氧适应(37,61). 此前，我们全面剖析了c-Myc及其靶糖酵解酶基因的转录网络，证明c-Myc几乎激活了所有糖酵化酶基因，其中许多基因在缺氧时也被HIF-1α激活(38,75). 与先前的研究相反，缺氧或CoCl诱导的HIF-1α₂进一步加速P493-6细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成。这表明HIF-1介导的HIF-1靶点PDK1关闭线粒体功能是丙酮酸转化为乳酸所必需的（图。​（图7）。7). 扫描ChIP分析c-Myc和HIF-1的DNA结合香港2号和PDK1系列基因表明c-Myc和HIF-1独立地结合不同的基因组区域（图。​（图66和​和8）。8). 这些观察结果表明，在c-Myc失调的情况下，HIF-1α不再抑制c-Myc活性，而是二者协同作用，以处理某些共同的靶基因，例如香港2号,PDK1系列、和血管内皮生长因子.

有趣的是，c-Myc和HIF-1可以协同激活HK2和PDK1，这是糖酵解代谢和线粒体功能的关键调节器。特别是，除了其在葡萄糖代谢中的速率控制作用外，HK2在大多数人类癌症中过度表达，并抑制促凋亡分子，包括线粒体外膜上的Bad和Bax，HK2通过整合葡萄糖代谢和凋亡发挥关键协调器的作用(13,23,26,49,63,64,68). PDK1基因最近被鉴定为HIF-1直接靶基因，通过抑制将丙酮酸转化为乙酰辅酶a的线粒体丙酮酸脱氢酶复合物，使线粒体三羧酸循环和呼吸失活(37,61). 二氯乙酸对PDK的抑制最近被证明是抗肿瘤的，这表明PDK活性对体内肿瘤发生至关重要(5). c-Myc结合保时捷德国（PDK）在ChIP研究中报告了启动子(47)，我们的扫描ChIP分析证实c-Myc结合了PDK1系列该基因即使在非缺氧条件下（数据未显示），甚至在PDK1表达未被诱导的情况下。这些观察结果与我们在P493-6系统中的发现一致，即c-Myc经常与非稳态mRNA水平诱导的基因结合(84). 其他信号，如缺氧，将提供额外的转录因子，如HIF-1，以诱导c-Myc结合的基因。我们的研究表明，通过HIF-1的缺氧对PDK1的完全诱导是必要的，PDK1可能会抵消c-Myc介导的线粒体功能在非缺氧条件下的激活。相反，HIF-1最小程度地诱导PDK1的c-Myc表达降低（图。7A和B). 这些观察结果表明，华堡效应很可能是HIF-1与失调的c-Myc协同作用的结果。

除了有效的代谢转换为糖酵解外，新血管或新生血管的形成也是一个必要的适应过程，以改善缺氧肿瘤区域的氧气和营养物质输送。根据各种体内模型系统的数据，c-Myc被认为是胚胎发育和肿瘤发生过程中有效的血管生成诱导剂(三,77). 最近的一项研究表明，缺氧进一步增加了体内转基因模型中c-Myc介导的VEGF表达和血管生成，表明HIF-1与c-Myc协同诱导VEGF的表达和血管形成表型(40). 然而，这些研究并没有研究c-Myc和HIF-1协同激活VEGF表达的机制。与HK2和PDK1类似，VEGF是由HIF-1和失调的c-Myc协同诱导的（图。​（图9A）。9安). 此外，我们在包含HIF-1保守推测结合位点簇的基因组区域中发现c-Myc和HIF-1的强DNA结合（图。​（图9B）。9亿). 我们的研究支持c-Myc和HIF-1增强VEGF诱导的分子机制，并表明c-Myc与HIF-1的协同作用可能有助于更广泛的致癌过程。

HIF-2α的作用可以排除，因为在P493-6细胞的mRNA和蛋白质水平上都无法检测到HIF-2β。然而，有新的证据表明HIF-2α可能在肿瘤发生中发挥更显著的作用(10,11,39,41,51,79). 尽管最近的研究报道，对缺氧的适应性反应，如糖酵解酶基因的诱导，主要由HIF-1α介导(25,31)，需要进一步研究HIF-2α对c-Myc转录和致癌活性的影响。

有趣的是，在HIF-1和c-Myc均表达的条件下，在P493-6细胞中未观察到其他糖酵解酶蛋白（包括HK1、LDHA、ENO和GAPD）的显著增强表达（参见补充材料中的图S3B）。这些酶与HK2、PDK1和VEGF之间的差异需要进一步研究。然而，可以想象，糖酵解酶的表达也在转录后水平上受到调节，因为c-Myc结合并诱导LDHA、ENO和GAPD的mRNA水平(38). 需要进一步的研究来解决c-Myc和HIF-1如何在转录水平上协同工作。当两个因子都结合时，询问是否有独特的或额外的共激活因子被招募到调节区域将是非常有兴趣的。

总之，我们在这里报告称，失调的c-Myc与HIF-1的协同作用提高了P493细胞的致瘤潜能，并且我们证明这种协同作用通过诱导关键蛋白HK2、PDK1和VEGF加快了糖酵解代谢和血管生成。我们的ChIP研究确定了c-Myc和HIF-1与这些关键基因的结合，这两种转录因子以协同方式显著提高了这些关键基因水平。特别是，我们的研究强调了区分HIF-1对原癌基因正常作用的影响和那些逃避正常体内平衡机制的失调癌基因的作用的重要性。

补充材料

致谢

脚注

参考文献