自噬是一种非常保守的溶酶体途径，用于降解长寿命蛋白质和细胞质细胞器。它包括形成被称为自噬体的双膜囊泡，以隔离细胞质物质，以及随后自噬体与溶酶体的融合，从而导致细胞质物质的降解(莱文和克林斯基2004). 环境应激（例如营养素饥饿、缺氧、热休克）和细胞内应激（例如受损的线粒体、多余的过氧化物酶体、蛋白质聚集体、病原体）均可刺激自噬(莱文和克林斯基2004;水岛2005). 一旦受到刺激，自噬有助于减轻细胞内和细胞外应激的有害影响。
多年来，人们一直认为自噬是细胞和生物体对饥饿的一种生存反应。例如，当环境营养素的供应受到限制时，自噬可以产生代谢底物的来源，以维持细胞的ATP生成、蛋白质合成和脂肪酸合成，从而维持细胞生存所需的细胞活性(Lum等人，2005年). 这种对饥饿的自噬反应在包括酵母、蠕虫、苍蝇和小鼠在内的各种生物体中得到了很好的研究。自噬丧失导致固氮酵母死亡，dauer形成缺陷秀丽隐杆线虫，对饥饿过敏果蝇属以及胎盘营养素供应终止后小鼠的出生后早期死亡(Tsukada和Ohsumi 1993年;Melendez等人，2003年;Kuma等人，2004年;Scott等人，2004年). 这些证据支持自噬是细胞和生物体的生存机制的观点。
然而，最近的几项研究表明，自噬在细胞水平上也发挥着生产作用。根据形态学证据，有人认为自噬在发育过程中以及对毒素或应激刺激的反应中会导致非凋亡自噬细胞死亡(莱文与袁2005). 此外，研究表明，在不同条件下，RNA干扰（RNAi）敲除必要的自噬基因可抑制多种细胞类型中的非凋亡细胞死亡(Shimizu等人，2004年;Yu等人，2004年;Reef等人，2006年). 总之，这些新发现强烈表明自噬在细胞水平上具有生产功能。在生物体水平上，过度自噬与失神经肌纤维的严重消耗有关运行1突变小鼠(Wang等人，2005年)表明自噬可能对生物体有害。然而，自噬是否会导致生物体死亡尚不清楚。
尽管进行了深入的研究，但直到最近，自噬作为一种生存机制和一种生产机制如何发挥这些看似相反的作用仍然是个谜。研究Bcl-2和Beclin 1相互作用的生物学意义是理解自噬在细胞存活方面发挥双重作用的机制的一条重要线索(Pattingre等人，2005年). 研究人员发现，Bcl-2蛋白与Beclin-1结合，并抑制酵母和哺乳动物细胞中Beclin 1依赖的自噬。此外，他们发现不结合Bcl-2的Beclin 1突变体表现出过度的自噬水平，并促进MCF7细胞中自噬基因依赖性细胞死亡。基于这些新发现，一个理解自噬在细胞生存和细胞死亡中作用的新模型出现了：自噬的生理水平对正常细胞内环境稳定至关重要，并起着促进生存的作用，而过多的自噬水平会促进自噬细胞死亡，并在细胞水平上发挥生产作用(Pattingre等人，2005年). 假设同一机制可能导致自噬在多细胞生物的生存中具有双重作用，这似乎是合理的。例如，生理水平的自噬可以通过在饥饿期间提供能量在生物体中起到促进生存的作用(Kuma等人，2004年)而过度的自噬可能通过对生存所必需的组织造成损伤而发挥生产作用。
在本研究中，我们使用秀丽线虫作为评估自噬在遭受饥饿的多细胞生物生存中是否发挥双重作用的模型系统。我们发现自噬水平不足是由基因敲除引起的贝克-1促进饥饿中的蠕虫死亡。相反，gpb-2型对饥饿过敏的突变体(You等人，2006年)饥饿时自噬水平过高贝克-1可以拯救因饥饿导致的死亡gpb-2型突变体。总之，这些发现表明，自噬根据其激活水平在生物体水平上既可以发挥促生作用，也可以发挥生产作用。
结果
在饥饿期间，自噬是蠕虫最佳生存所必需的
测试自噬在患者生存中的作用秀丽线虫在饥饿期间，我们使用RNAi抑制自噬。由于自噬被突变完全阻断的动物非常不健康(unc-51号机组突变体）（数据未显示）或死亡(贝克-1突变体）(Takacs-Vellai等人，2005年)，我们认为RNAi的部分抑制更适合于研究饥饿期间自噬的作用。我们瞄准了贝克-1用于RNAi。贝克-1是秀丽线虫酵母直系自动液位计6对自噬过程至关重要(Melendez等人，2003年). 耗尽贝克-1RNAi功能降低了饥饿后野生型蠕虫的存活率(; 有关饥饿存活分析的详细信息，请参见材料和方法）。
需要自噬才能使秀丽线虫在饥饿期间。按照材料和方法进行饥饿存活分析。本图和后续图中所示的每一条饥饿存活曲线都是一项具有代表性的试验的结果。其他试验列于. (A类)在没有食物的情况下，在M9缓冲液中培养指定时间后，在含有HB101细菌的NGM平板上存活至成年的蠕虫百分比。误差条是假设泊松分布估计的标准误差。(B类)对照RNAi动物咽肌自噬的定量bec-1（RNAi）中的动物A类误差条表示比例的标准误差。(*)P（P）< 0.001. (C)饥饿9天后对照RNAi动物的代表性图像。对照RNAi动物的差分干涉对比图(左边)和绿色荧光图像(正确的). 箭头所示为标志前自噬体和自噬体内结构的代表性GFPбLGG-1阳性点状结构。在插图，框标记的区域将被放大并增强对比度。(天)的代表性图像bec-1（RNAi）饥饿9天后的动物。差分干涉对比度图像bec-1（RNAi）动物(左边)和绿色荧光图像(正确的). (E类)对照RNAi动物和bec-1（RNAi）饥饿后的动物。每个点代表一个单独的蠕虫。水平线表示平均值（线）和SEM（误差线）。(*)P（P）<0.0001（学生的t吨-测试）。(F类)存活和非存活的回溯泵送率bec-1（RNAi）饥饿后的动物。每个点代表一个单独的蠕虫。水平线表示平均值（线）和SEM（误差线）。(*)P（P）<0.0001（学生t吨-测试）。
因为进食器官，咽部，对从饥饿中恢复至关重要(You等人，2006年)，我们测量了咽肌的自噬。我们产生了一株携带整合转基因的菌株，该菌株表达GFP标记的lgg-1型，是一种特异的自噬荧光标记(Melendez等人，2003年;水岛2004). 当诱导自噬时，GFPLGG-1从其弥漫的细胞质细胞定位改变为形成点状结构，标记前自噬体和自噬体膜(). 我们发现饥饿诱导咽肌自噬，并且贝克-1RNAi治疗降低饥饿诱导的自噬量(). 我们还测试了另一种RNA干扰对自噬过程的影响秀丽线虫酵母自噬基因的同源序列。RNAi介导的干扰秀丽线虫酵母直系自动液位计7饥饿后野生型蠕虫存活率降低，咽肌自噬也减少（补充图S2）。这表明贝克-1饥饿期间野生型蠕虫存活的RNAi是由于自噬缺陷，而不是其他潜在功能的缺陷贝克-1.生存bec-1（RNAi）蠕虫可以通过添加食物来拯救()表明bec-1（RNAi）蠕虫在饥饿期间缺乏营养，可能是由于自噬减少所致。
为了理解为什么饥饿会在抑制自噬的同时杀死蠕虫，我们测试了自噬减少是否会影响咽部的活动。我们发现了贝克-1RNAi治疗降低泵送速率()而泵吸可以通过添加食物来挽救，这表明在饥饿期间需要自噬来维持咽部的基本活动。接下来我们测试了抽水是否可以预测存活率。为了确定基础泵送率对生存的重要性，我们统计了饥饿后仍活着的个体蠕虫的泵送率，评估了它们的生存率，然后将最终死亡的蠕虫的平均泵送率与存活的蠕虫的平均泵送率进行了比较(). 饥饿后，最初具有高抽吸率的蠕虫比那些抽吸率低的蠕虫存活得更好；抽水预测存活率的准确率高达80%。我们的发现，结合之前的研究表明，咽部对饥饿的恢复很重要(You等人，2006年)这表明维持基本的抽吸速率对饥饿后蠕虫的存活可能很重要。综上所述，这些结果表明，在饥饿期间，自噬是野生型蠕虫最佳生存所必需的，可能为维持细胞活性提供能量来源或基本营养素。
过度激活的毒蕈碱型乙酰胆碱信号诱导过度自噬并导致饥饿期间蠕虫死亡
此前，我们发现饥饿通过毒蕈碱型乙酰胆碱受体信号通路（毒蕈碱乙酰胆碱接收器→Gqα→PKC→MAPK）激活咽肌中的MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）(You等人，2006年). 此外，饥饿信号会导致咽部肌肉的生理变化，从而增加其活动。然而，当饥饿信号被过度激活时gpb-2型（一种参与RGS介导的Gqα通路抑制的G蛋白β亚单位）突变株中毒蕈碱乙酰胆碱受体信号不能下调，饥饿反而会导致咽部肌肉损伤，导致异常活动，最终导致饥饿恢复后死亡(You等人，2006年).
导致蠕虫咽部肌肉变化的环境线索（饥饿）也可以触发自噬(莱文和克林斯基2004). 此外，已知过度激活的自噬会导致细胞水平的损伤(Codogno和Meijer 2005;Kroemer和Jaattela 2005年;莱文与袁2005)；这让人联想到过度激活的毒蕈碱信号导致蠕虫咽肌功能失常的方式。基于这些相似性，我们假设在gpb-2型突变体诱导无限制的自噬，进而导致咽部肌肉损伤，最终导致饥饿后死亡。
为了测试这一点，我们检测了gpb-2型饥饿期间的突变体。如前所述(You等人2006),gpb-2型突变体比野生型蠕虫对饥饿更敏感(). 此外，我们还发现，饥饿后，人的咽肌过度诱导自噬gpb-2型GFP–LGG-1点状结构测量的突变与野生型蠕虫的比较(). GFP–LGG-1点状结构的增加在gpb-2型突变体是由自噬体周转缺陷引起的，因为用溶酶体抑制剂（NH4Cl）增加了GFP–LGG-1点状结构的积累（补充图S3）。我们还通过免疫印迹法检测GFP｜LGG-1的修饰，证实了自噬的诱导(水岛2004). 饥饿后，磷脂酰乙醇胺结合的LGG-1（PE-LGG-1｜GFP）与LGG-1的比值在gpb-2型与野生型蠕虫相比的突变体()表明自噬在gpb-2型与饥饿后的野生型蠕虫进行比较。饿死gpb-2型突变体很可能是由咽肌功能障碍引起的，而不是细胞死亡，因为咽肌细胞gpb-2型突变体没有表现出明显的细胞死亡，饥饿后它们仍然能够收缩。此外塞得-3无法挽救的死亡gpb-2型饥饿期间的突变（数据未显示），表明与凋亡无关。为了测试毒蕈碱乙酰胆碱受体信号是否参与自噬的调节，我们使用毒蕈碱信号抑制剂，如阿托品（毒蕈碱受体拮抗剂）和U0126，其通过抑制上游激酶MEK阻止MAPK激活(You等人，2006年). 阿托品或U0126治疗可减少gpb-2型饥饿期间的突变体()也部分缓解了gpb-2型突变体(). 此外，我们发现mpk-1型编码由饥饿激活的MAPK，也减少了gpb-2型饥饿期间的突变体()抑制饥饿过敏表型(). 综上所述，这些数据表明，在饥饿条件下，毒蕈碱乙酰胆碱受体信号过度激活gpb-2型突变体导致过度自噬。此外，过度自噬与饥饿死亡相关gpb-2型突变体强烈表明，无限制的自噬可能导致死亡。重要的是要注意mpk-1型救出死者gpb-2型突变体非常有效，但在减少自噬方面不如阿托品有效。其他未知机制也可能导致饥饿死亡gpb-2型突变体。
过度激活的毒蕈碱信号诱导过多的自噬水平并导致死亡gpb-2型饥饿后的突变体。(A类,天,F类,H（H）)在不含阿托品（10 mM）或U0126（25μM）的食物的情况下，在M9缓冲液中孵育指定时间后，定量显示基因型的咽肌自噬。误差条表示比例的标准误差。(*)P（P）<0.0001，除2 d in外F类和H（H），其中P（P）< 0.005. 典型图像见补充图S1。(B类,E类,G公司,我)年存活至成年的动物百分比A类,天,F类、和H（H）误差条是假设泊松分布估计的标准误差。(C)通过Western blotting测定PE结合的LGG-1–GFP和LGG-1-GFP的相对水平。制备饥饿的L1蠕虫，并使用抗GFP抗体进行免疫印迹分析。箭头表示LGG-1–GFP和PE结合的LGG-1-GFP。Western blot是两个独立实验中观察到的结果的代表。
为了鉴定负责自噬调节的毒蕈碱乙酰胆碱受体信号传导的下游靶基因，我们使用RNAi来减少几个候选基因的表达。其中一个是dapk-1型，的秀丽线虫死亡相关蛋白激酶（DAP激酶）的直系图。先前的细胞培养研究表明DAP激酶介导自噬(Inbal等人，2002年)以及ERK在细胞培养中可以磷酸化和激活DAP激酶的事实(Chen等人，2005年)，使我们假设毒蕈碱信号通过DAP激酶调节自噬。我们发现了dapk-1型RNAi可减少饥饿诱导的自噬，并部分缓解gpb-2型突变体(). 为了验证RNAi结果，我们dapk-1 gpb-2双突变体并发现dapk-1型还能减少饥饿诱导的自噬()并部分挽救了gpb-2型突变体(). It is unlikely that mutation ofdapk-1型抢救死亡gpb-2型饥饿期间的突变通过抑制细胞凋亡塞得-3没有拯救死亡gpb-2型突变体（数据未显示）。自突变以来适配器-1仅部分获救gpb-2型突变体，很可能其他未知信号分子也在毒蕈碱信号下游发挥作用，调节自噬。事实上，我们发现rgs-2型，G蛋白信号传导的调节因子，进一步减少dapk-1 gpb-2突变体和拯救死亡dapk-1 gpb-2饥饿期间(). 然而，RGS-2有可能通过GOA-1负调控毒蕈碱信号，从而减少自噬，GOA-1是RGS-2的靶点，已知可拮抗毒蕈碱的信号(Miller等人，1999年). 为了测试这种可能性，我们检测了MPK-1在dapk-1 gpb-2型;rgs-2型突变体。我们发现MPK-1在dapk-1 gpb-2;rgs-2型突变体gpb-2型突变体()表明RGS-2不太可能通过反馈回路对毒蕈碱信号进行负调控。之前的一项研究表明，GAIP是rgs-2型，ERK下游的功能调节细胞培养中的自噬(Ogier-Denis等人，2000年)进一步支持了我们的假设，即RGS-2在毒蕈碱信号下游发挥作用，调节自噬。因此，这些结果表明，DAPK-1在自噬调节中，可能与RGS-2一起，在毒蕈碱信号的下游或平行发挥作用，至少部分如此。
DAPK-1在自噬调节中作用于毒蕈碱信号的下游或与其平行，可能与RGS-2有关。(A类,C)在没有食物的情况下，在M9缓冲液中孵育指定时间后，定量显示基因型的咽肌自噬。误差条表示比例的标准误差。(*)P（P）< 0.005; (**)P（P）< 0.0001. (B类,天)年存活至成年的蠕虫百分比A类和C误差条是假设泊松分布估计的标准误差。(E类)通过Western blotting测定磷酸化MPK-1和MPK-1的相对水平。在鸡蛋制备后32.5小时制备饥饿的L1蠕虫，并使用抗磷酸-MPK-1抗体和抗MPK-1抗体通过免疫印迹进行分析。Western blot是两个独立实验中观察到的结果的代表。
过度的自噬会导致咽肌的缺陷gpb-2型突变并导致死亡
直接检查过度自噬在饥饿死亡中的作用gpb-2型突变体，我们通过以下方式抑制这些突变体中的自噬贝克-1RNAi。贝克-1RNAi治疗减少饥饿者咽肌的自噬gpb-2型突变体(). 它还部分挽救了饥饿者的死亡gpb-2型突变体()表明过度的自噬导致了gpb-2型饥饿条件下的突变体。我们还通过以下方式验证了这些结果atg-7RNAi（数据未显示）。
不受限制的自噬导致gpb-2型突变并导致饥饿后死亡。(A类)在没有食物的情况下，在M9缓冲液中培养指定时间后，在含有HB101细菌的NGM平板上存活至成年的蠕虫百分比。误差条是假设泊松分布估计的标准误差。(B类)自噬的定量A类.bec-1（RNAi）减少了gpb-2型在饥饿期间。误差条表示比例的标准误差。(*)P（P）< 0.0001. 典型图像见补充图S1。(C,天)gpb-2型对照RNAi动物(C)和gpb-2型;bec-1（RNAi）动物(天)饥饿2天后，生长出表达GFP的细胞大肠杆菌. (左侧)差分干涉对比度图像。(赖特)绿色荧光图像。箭头在C表明肠道中有不规则细菌。棒材，20μm。
饥饿会导致gpb-2型饥饿后会发生突变，这样蠕虫就无法碾碎细菌食物(You等人，2006年). 研究过度自噬对gpb-2型咽部肌肉研磨细菌能力的突变体，我们使用表达GFP的大肠杆菌(You等人，2006年). 如果蠕虫能够有效地研磨细菌，那么它们的肠道中就无法观察到绿色荧光。然而，如果不是这样的话，肠道就会出现未接地细菌的荧光(You等人，2006年),gpb-2型突变株在饥饿后不能研磨细菌(). 相反gpb-2型突变体，其中贝克-1RNAi可在饥饿后研磨细菌，从而降低表达(). 总之，这些结果表明过度的自噬会导致gpb-2型突变体，并最终导致饥饿后的死亡。然而，其他组织中过度的自噬可能导致gpb-2型突变体。
毒蕈碱信号在调节饥饿期间的自噬中起作用
我们的数据gpb-2型突变体表明，过度激活的毒蕈碱信号在饥饿期间诱导过度自噬。为了评估毒蕈碱乙酰胆碱受体信号是否也可以调节饥饿期间野生型蠕虫的自噬，我们通过阿托品治疗来抑制毒蕈碱信号。与对照组相比，阿托品治疗使咽肌自噬降低到基础水平以下()表明阻断毒蕈碱信号可以降低饥饿期间野生型蠕虫的自噬水平。阿托品治疗也会降低饥饿后野生型蠕虫的存活率()证实了自噬的生理水平是野生型蠕虫在饥饿状态下最佳生存所必需的。用阿托品治疗的野生型蠕虫的存活率可以通过添加食物来部分挽救()这表明阿托品对饥饿期间野生型蠕虫存活的影响可能是由于自噬减少，而不仅仅是药物毒性。我们还发现，与阿托品治疗相比，U0126治疗减少了咽肌自噬（数据未显示），减少了饥饿后野生型蠕虫的存活率(). 相反，Ras获得功能突变（在密码子13处有Gly-to-Glu替代，并模拟过度激活的毒蕈碱信号对MAPK的影响）在饥饿期间诱导咽肌过度自噬(). 它还降低了饥饿后蠕虫的存活率(). 因此，过度激活的毒蕈碱信号在饥饿期间使自噬水平高于生理水平。综上所述，这些数据表明毒蕈碱乙酰胆碱受体信号对饥饿状态下野生型蠕虫的自噬具有积极调节作用，对饥饿野生型蠕虫病的最佳生存至关重要。
毒蕈碱信号在饥饿期间积极调节自噬。(A类)用阿托品（10 mM）治疗的野生型动物在M9缓冲液中无食物孵育指定时间后咽肌自噬定量。(C)咽肌自噬的定量研究ras（玻璃纤维）动物。误差条表示比例的标准误差。(*)P（P）< 0.01. (B类,天)年存活至成年的蠕虫百分比A类和C误差条是假设泊松分布估计的标准误差。典型图像见补充图S1。(E类)自噬在小鼠生存中的双重作用模型秀丽线虫.
讨论
自噬在多细胞生物饥饿生存中的双重作用
我们的研究结果表明，生理水平的自噬是细胞最佳存活所必需的秀丽线虫在饥饿期间，毒蕈碱乙酰胆碱受体信号对诱导生理水平的自噬很重要。相反，自噬水平不足或过高会导致秀丽线虫对饥饿过敏。这些结果使我们得出结论，在饥饿期间，自噬可以在生物体水平上发挥相反的作用，促进生存或死亡，这取决于自噬的水平(). 自噬在生存方面发挥双重作用的机制直到最近才被很好地理解。正如引言中所描述的那样，先前的研究提出了一个有趣的可能性，即自噬的水平在决定生殖器角色还是生产角色中至关重要(Pattingre等人，2005年). 我们的结果提供了体内证据，表明一个类似的模型可能适用于整个生物体水平：生理水平的自噬是先存的，而自噬水平不足或过多则会产生。
毒蕈碱型乙酰胆碱途径作为自噬诱导信号通路
在过去的十年中，人们发现了调节自噬的分子机制(莱文和克林斯基2004;Codogno和Meijer 2005;尤里米苏和克林斯基2005). 尽管取得了这一重大进展，但在生物体水平上参与自噬调节的信号通路仅在自噬抑制信号的背景下得到了广泛的表征。众所周知，I型PI3K–mTOR信号通路在细胞和生物体水平上负向调节自噬(Scott等人，2004年;Shintani和Klonsky 2004;Codogno和Meijer 2005). 尽管eIF2α激酶、ERK1/2和DAP激酶途径等多种途径被认为是细胞水平上的自噬诱导信号途径(Inbal等人，2002年;Talloczy等人，2002年;Pattingre等人，2003年)关于多细胞生物中的自噬诱导信号通路，人们知之甚少。我们的结果表明，毒蕈碱型乙酰胆碱途径在小鼠咽肌中作为自噬诱导信号通路发挥作用秀丽线虫在饥饿期间。我们发现在饥饿期间，毒蕈碱信号过度激活gpb-2型突变体导致咽肌过度自噬，而通过抑制剂或突变抑制毒蕈碱信号可以减少咽肌的自噬。此外，我们发现dapk-1型或rgs-2型减少饥饿诱导的自噬并部分挽救gpb-2型在饥饿期间，表明DAPK-1和RGS-2可能在毒蕈碱信号的下游或平行作用于自噬的调节，至少部分如此。我们的结果与之前的研究相结合，表明饥饿激活了小鼠咽部肌肉中的毒蕈碱乙酰胆碱信号秀丽线虫(You等人，2006年)提示毒蕈碱乙酰胆碱信号通路可能通过DAP激酶和RGS-2对饥饿反应的自噬进行正向调节。
先前的研究表明，毒蕈碱型乙酰胆碱信号通路通过改变咽部肌肉生理学来增加泵送速率，以增强喂食反应，作为对饥饿的反应(You等人，2006年). 当食物再次供应时，这种变化可能会使蠕虫更有能力消化食物。因为很明显，这种变化是一个需要能量的过程，所以问题仍然是如何在饥饿期间提供能量来增加泵送速度。众所周知，自噬可以提供能量来维持能量平衡(Kuma等人，2004年;Lum等人，2005年)一个有趣的可能性是，毒蕈碱型乙酰胆碱信号通路诱导的咽肌自噬可能提供增加泵吸速率所需的能量。事实上，我们的结果显示自噬减少了贝克-1RNAi在饥饿期间降低泵送速率支持这种可能性。
一些证据表明自噬可能在肿瘤发展中起重要作用(Cuervo 2004年;Kondo等人，2005年;Levine和Yuan 2005年;莱文2006). 自噬可以通过清除受损的细胞器和促进自噬细胞死亡来抑制癌症的发展。另一方面，自噬可以为远离血液供应的癌细胞提供能量，从而促进癌症的发展，因为血液中的营养物质极其有限。我们观察到Ras信号通路的过度激活会诱导自噬，结合先前的研究表明Ras信号在各种癌症中经常被过度激活，导致了一个有趣的假设，即被过度激活的Ras信号激活的自噬可能有助于癌细胞在营养有限的条件下存活。然而，必须谨慎地看待这个假设，因为已知Ras信号在其他系统中抑制自噬，而自噬可以根据情况发挥肿瘤抑制作用(Kondo等人，2005年;莱文与袁2005;莱文2006). 然而，如果抑制自噬影响大型肿瘤中心区域的癌细胞存活，这将是一个有趣的试验，因为那里的营养供应有限。
材料和方法
应变
按照说明保持菌株(布伦纳1974)19°C时。所有的虫子都被养活了大肠杆菌HB101细菌。adEx2066[rol-6（d）lgg-1｜GFP]是K.Jia和B.Levine赠送的一个染色体外阵列，表达N末端GFPLGG-1(Melendez等人，2003年).广告Ex2066通过γ辐射整合，然后与N2异交七次，形成整合线，adIs2122[lgg-1｜GFP rol-6（df）]。广告编号2122用作所有实验的野生型对照。使用标准遗传程序产生以下菌株：gpb-2（ad541）Ⅰ；adIs2122型,mpk-1（ku1）III；广告编号2122,gpb-2（ad541）I；mpk-1（ku1）III；adIs2122型,let-60（n1046sd，上午）IV;adIs2122，gpb-2（ad541）I；塞得-3（n717）IV;adIs2122，dapk-1（gk219）I；adIs2122，gpb-2（ad541）dapk-1（gk219）I；adIs2122，gpb-2（ad541）I；rgs-2（vs22）X；adIs2122，gpb-2（ad541）dapk-1（gk219）I；rgs-2（对22）X；广告编号2122。
RNA干扰
通过喂食进行RNAi，如所述(Kamath等人，2003年)除了一些修改。简言之，将RNAi克隆在37°C下接种于LB加10μg/mL四环素和75μg/mL氨苄西林中过夜。用0.4 mM IPTG诱导2小时后，将RNAi克隆接种到NG–氨苄西兰–IPTG平板上。将L1动物转移到含有诱导表达RNAi克隆的细菌或携带空RNAi喂养载体的RNAi平板上作为对照，并允许其长大成人。在它们产卵后，将成虫从RNAi板中取出。然后将平板培养21小时（野生型）或17小时（ingpb-2型突变体）。从RNAi平板上收集L1蠕虫，并用M9溶液冲洗三次。收集的L1蠕虫用于饥饿存活分析。RNAi平板上的培养时间允许我们调整RNAi治疗的强度。由于自噬对于野生型在饥饿期间的最佳生存是必要的，我们预计这太有效了bec-1（RNAi）也会减少gpb-2型蠕虫；预期只有在部分击倒贝克-1表达式。事实上，在初步的探索性实验中，bec-1（RNAi）超过17小时实际上降低了gpb-2型蠕虫。
饥饿生存分析
按所述进行饥饿存活分析(You等人，2006年)几乎没有修改。从RNAi平板收集L1蠕虫或通过卵子制备进行同步后，我们将其在3 mL灭菌M9缓冲液中培养，培养时间如图或19°C时。在每个时间点，将每个样品管中的一份样品放在一个接种有大肠杆菌HB101.在19°C下进一步生长3d后，测定存活至L4或成年期的蠕虫数量。饥饿第0天开始的数量用作对照，并作为分母来计算饥饿后蠕虫恢复的百分比。
液体培养用细菌制剂
大肠杆菌HB101按说明制备(You等人，2006年)几乎没有修改。安大肠杆菌在光学密度为1.0～1.2（600 nm）的LB肉汤中培养的HB101用M9缓冲液洗涤三次，并在相同体积的M9缓冲溶液中再次悬浮。这个大肠杆菌将HB101悬浮液以1:4至1:6的稀释度添加到蠕虫液体培养物中，以便在饥饿存活分析期间提供食物。
秀丽线虫自噬分析
按照说明进行自噬分析(Melendez等人，2003年)几乎没有修改。为了进行自噬的光镜分析，在每个时间点收集携带表达GFP｜LGG-1融合的整合转基因的饥饿L1动物。使用蔡司Axioplan 2复合显微镜（蔡司公司）在L1动物的咽肌中观察到GFP阳性点状区域。测定GFP阳性点状区动物的百分比。对于自噬的Western blot分析，在每个时间点制备携带表达GFP｜LGG-1融合的整合转基因的饥饿L1动物，并使用抗GFP抗体进行免疫印迹分析。使用ImageJ（版本1.36b，美国国立卫生研究院）通过密度测定法计算PE结合LGG-1–GFP和LGG-1-GFP的相对水平。
统计分析
使用χ分析各组之间的统计差异2独立性测试，除非另有说明。
