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基因发育。2002年6月15日；16(12): 1466–1471.
数字对象标识：10.1101/gad.991402
预防性维修识别码：项目经理186346
PMID：12080085

FIH-1是一种天冬酰胺羟化酶，调节低氧诱导因子的转录活性

大卫·兰多,1,4 丹尼尔·皮特,1,4 杰弗里·戈尔曼,2 院长A.惠兰,2 默里·L·怀特劳,1,5和理查德·布鲁克三，5
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

哺乳动物细胞通过低氧诱导因子HIF介导的转录反应途径适应低氧条件。在常氧条件下，HIF转录活性受到C末端反式激活域内天冬酰胺残基羟基化的抑制，从而阻断与辅活化因子的结合。在这里，我们发现先前显示与HIF相互作用的蛋白质FIH-1是天冬酰胺羟化酶。与已知的羟化酶酶一样，FIH-1是一种依赖铁（II）的酶，它使用O分子2以修饰其基底。与最近发现的调节HIF稳定性的脯氨酰羟化酶一起，这类氧依赖酶包含缺氧反应途径的关键调节成分。

关键词：天门冬氨酰羟化酶，缺氧，氧敏感，HIF

几乎所有哺乳动物细胞都具有识别局部氧气可用性变化的能力。当氧气水平较低（缺氧）时，一个保守的缺氧反应途径被激活。该途径的中心是普遍表达的转录因子缺氧诱导因子（HIF）(Semenza 1999年). HIF是由α亚单位、HIF-1α或副产物HIF-2α或HIF-3α组成的异二聚体(Tian等人，1997年;Gu等人，1998年;O'Rourke等人，1999年;Srinivas等人，1999年)和HIF-1β亚单位，也称为芳香烃受体核转运体（ARNT）(Wang等人，1995年). 虽然HIF-1β的表达和活性水平在很大程度上不受氧水平变化的影响，但HIF-α亚单位在缺氧条件下受到强烈诱导。

氧调节HIF-α活性的两个主要机制已经确定。在常氧条件下，HIF-α亚单位内的氧依赖性降解域（ODD）被von-Hippel-Lindau抑癌基因（pVHL）的产物识别(Maxwell等人，1999年). pVHL是一种蛋白质-泛素连接酶复合物的组成部分，它以蛋白酶体降解α亚单位为目标(Maxwell等人，1999年;Cockman等人，2000年;Ohh等人，2000年;Tanimoto等人，2000年). HIF-α的pVHL识别依赖于ODD内脯氨酸残基的羟基化(Ivan等人，2001年;Jaakkola等人，2001年;Yu等人，2001年). 在缺氧条件下，脯氨酰羟基化被阻断，导致HIF-α稳定性和蓄积增加(Ivan等人，2001年;Jaakkola等人，2001年;Yu等人，2001年). 这种翻译后修饰是由脯氨酰羟化酶家族进行的，其结构和功能与先前表征的羟化酶相似(Bruick和McKnight 2001;爱泼斯坦等人，2001年). 与这些酶一样，HIF脯氨酰羟化酶使用Fe（II）结合O2羟基化2-酮戊二酸和目标脯氨酸残基(Bruick和McKnight 2001;爱泼斯坦等人，2001年). 由于这些酶直接与氧结合，推测它们可能是缺氧反应途径中的关键氧传感器。

除了诱导HIF的稳定性外，缺氧条件还促进HIF-αC-末端反式激活结构域（CAD）与p300等共激活因子相互作用的能力(Ema等人，1999年;Carrero等人，2000年;Kung等人，2000年;Gu等人，2001年). 最近研究表明，在常压条件下，通过CAD中保守的天冬酰胺残基的羟基化，HIF-α与p300的结合被阻断(Lando等人，2002年). 天冬氨酸羟基化被缺氧消除，允许HIF向低氧反应靶基因募集更大的转录器(Lando等人，2002年). 与HIF脯氨酰羟化酶一样，内源性HIF天冬酰胺羟化酶活性可以被2-酮戊二酸竞争性抑制剂和铁螯合剂阻断(Lando等人，2002年)这表明这种酶可能也类似于已知的羟化酶。这种天冬酰胺基羟化酶有望与O结合2可能在缺氧反应途径中扮演第二个氧传感器的角色。在本研究中，我们发现一种天冬酰胺羟化酶能够修饰HIF-1α和HIF-2αCAD内的关键天冬酰胺残基，从而抑制HIF活性。

结果和讨论

据预测，FIH-1类似于2-酮戊二酸和Fe（II）依赖的加氧酶

使用O的铁（II）依赖酶2氧化2-酮戊二酸和多肽或代谢物底物在自然界中普遍存在。已确定该家族几个成员的结构，揭示了构成酶核心的保守双链β-螺旋(Roach 1995年;Valegård等人，1998年;Zhang等人，2000年;Clifton等人，2001年). 在这个褶皱中有一个关键的His-X-Asp/Glu二元体和C末端，其残基负责结合铁原子(Hegg和Que 1997). 序列图谱搜索已被用于识别以前未检测到的该酶家族成员(Aravind和Koonin 2001). 根据这些指南，进行了额外的序列分析，以确定候选羟化酶酶。特别令人感兴趣的是，抑制HIF-1（FIH-1）的蛋白因子被预测含有一个β螺旋核心，其特征是2-羟戊酸和铁（II）依赖性氧化酶的2-组氨酸-1-羧酸三联体诊断（图。​（图1）。1). 最近发现FIH-1通过与HIF-1α和pVHL的CAD直接相互作用抑制CAD的活性(Mahon等人，2001年). 这些特性强烈表明，FIH-1可能通过调节辅活化子募集的天冬酰胺残基的羟基化抑制CAD活性(Lando等人，2002年).

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预测FIH-1的二级结构。使用Jpred生成多序列比对(Cuff等人，1998年)用于人类FIH-1的氨基酸残基179–300。相关蛋白质由其gi登录号表示。预测为延伸构象的片段（β链）用箭头表示。相同残留物用黑色阴影表示，类似残留物则用灰色阴影表示。星号表示特征化羟化酶中Fe（II）结合的关键氨基酸。

FIH-1抑制HIF-αCAD活性

O（运行）2-CAD活动的依赖性调节可以与O解耦2-HIF-α稳定性的依赖性调节(Jiang等人，1997年;Ema等人，1999年;O’Rourke等人，1999年;Carrero等人，2000年;Gu等人，2001年)通过将CAD与O融合2-不敏感Gal4 DNA结合域（GalDBD）。将GalDBD融合物与来自HIF-1α或HIF-2α的末端100氨基酸进行转染，在Gal4报告基因的控制下驱动荧光素酶报告基因的表达（图。​（图2A）。2A） ●●●●。正如Mahon及其同事所观察到的(Mahon等人，2001年)，野生型（wt）FIH-1的联合转染以剂量依赖的方式抑制荧光素酶报告子的CAD依赖性表达（图。​（图2A）。2A） ●●●●。因为抑制CAD活性的天冬酰胺羟化酶活性依赖于铁（II）(Lando等人，2002年)，铁螯合所需的预测HXD二元体的突变有望消除FIH-1对Gal4-CAD嵌合体的影响。与此假设一致，His 199（H199A）或Asp 201（D201A）突变为Ala可阻止FIH-1抑制HIF CAD活性（图。​（图2A）。2A） ●●●●。2-氧戊二酸依赖性羟化酶酶也可在体内被竞争性抑制剂二甲基-氧戊二酰甘氨酸（DMOG）抑制，DMOG是2-氧戊二酸的细胞渗透类似物(Jaakkola等人，2001年). 如图所示​图2B，2B、 DMOG抑制了依赖FIH-1的CAD活性抑制。总之，这些数据表明FIH-1可能是一种依赖于2-酮戊二酸和铁（II）的加氧酶。

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FIH-1对HIF-1α和HIF-2α转录激活域活性的影响。(A类)293T细胞与Gal4 DNA结合域（GalDBD）或所示GalDBD/HIF-1α727–826或GalDBT/HIF-2α774–874嵌合体、Gal4反应元件驱动荧光素酶报告子和所示野生型FIH-1（wt）或H199A或D201A替代突变体的表达载体共转染。(B类)293T细胞与GalDBD/HIF-1α727–826或Gal/HIF-2α774–874嵌合体、Gal4反应元件驱动荧光素酶报告子和200 ng野生型FIH-1质粒共同转染。转染细胞接受递增（0–200μM）二甲基氧肟基甘氨酸（DMOG）处理。数据是三次转染+/-S.D.的平均值。

FIH-1通过阻止CAD与p300的关联抑制HIF-α转录活性

在常氧条件下，HIF-αCAD与辅活化因子p300的CH1结构域的关联被保守天冬酰胺残基的羟基化阻断(Lando等人，2002年). 为了验证FIH-1是负责调节p300与CAD相互作用的天冬酰胺羟化酶的假设，p300的重组CH1结构域被表达为谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合并用于下拉35S标记的HIF-2αCAD。如图所示​图3A三A（车道4），GST-p300与CAD相关（HIF-2α残基774-874）。然而，CAD与重组野生型FIH-1（表达为麦芽糖结合蛋白（MBP）融合）的预培养严重抑制了与GST-p300的关联（图。​（图3A，三A、 车道5）。FIH-1依赖性抑制需要添加2-酮戊二酸盐、Fe（II）和抗坏血酸，与假定的羟化酶活性一致（图。​（图3A，三A、 车道5、7）。FIH-1假定的Fe（II）结合位点（D201A）的破坏阻断了重组FIH-1的活性（图。​（图3A，三A、 车道6）。DMOG和Co（II）是羟化酶活性的竞争性抑制剂，也可防止FIH-1干扰CAD–p300相互作用（图。​（图3A、B）。三A、 B）。天冬酰胺残基突变为丙氨酸（HIF-2α为N851A）可阻止体内CAD羟基化，并导致CAD与p300的结构性关联，即使在正常氧条件下也是如此(Lando等人，2002年). N851A突变同样使CAD–p300相互作用对体外FIH-1不敏感（图。​（图3A、B）。三A、 B）。FIH-1同样能够阻断p300与HIF-1αCAD的关联（数据未显示）。除了通过羟基化防止p300与CAD关联外，FIH-1还可以直接与p300竞争CAD绑定。然而，在缺乏过量Fe（II）和2-酮戊二酸盐的情况下，FIH-1无法阻止p300与CAD的结合（图。​（图3A，三A、 车道7），尽管在这些条件下它仍然能够约束CAD(Mahon等人，2001年).

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FIH-1对HIF-2α774-874的体外羟化抑制与p300的相互作用。35在Fe（II）、抗坏血酸（asc）和2-氧戊二酸（2OG）或羟化酶抑制剂DMOG存在下，用MBP-FIH-1（wt或D201A突变体）处理S-标记的HIF-2α774-874野生型（wt）或N851A突变体，然后用固定化GST-p300 CH1孵育。35在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，观察到与GST-p300 CH1结构域结合的S标记HIF-2α774-874。1 mM CoCl抑制FIH-1活性2(A类)或2 mM DMOG(B类).

FIH-1羟基化HIF-αCAD中的关键天冬酰胺残基

为了证实FIH-1具有天冬酰胺羟化酶活性，重组MBP-FIH-1与纯化的HIF-2αCAD（残基774-874）孵育（+/-DMOG），表达为Trx6H融合蛋白大肠杆菌使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），在用活性FIH-1制备的样品中，含有Asn 851的胰蛋白酶肽片段显示含有16道尔顿的额外质量，与羟基化一致（图。​（图4A，4A、 +2OG）。含DMOG反应的碎片没有质量增加。为了鉴定改性残留物，用串联质谱法进一步分析每个样品中的相关胰蛋白酶肽。碎片模式的比较显示Asn 851含有额外的氧原子（图。​（图4B）。4B） ●●●●。这些数据表明，FIH-1是一种天冬酰胺羟化酶，通过阻止CAD与辅活化因子p300的关联来抑制HIF转录活性。

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HIF-1α774–874在体外被FIH-1有效地羟基化残基Asn 851。(A类)在2-酮戊二酸盐（2OG，上面的频谱）或DMOG(降低频谱）。在2OG存在下处理后，胰蛋白酶肽YDCEVNVPVPGSTLLQGR（846–864）羟基化（+16道尔顿），而非DMOG（放大如下）。(B类)分别用2-酮戊二酸（2OG）或DMOG处理FIH-1后，对羟基化和非羟基化HIF-2α846–864胰蛋白酶肽进行串联质谱测序，显示羟基化残基为Asn 851。例如，在2090.9未修饰肽中观察到了b型和y型片段离子，该肽几乎覆盖了整个肽序列(降低频谱）。修饰的2106.9肽产生了一些片段离子(上面的光谱）相同米/z（z）值作为未修饰肽。这些巧合片段对应于序列中不含Asn 851的部分。在米/z（z）+16道尔顿的值大于包含未修改序列片段的Asn 851（在上面的面板）。重合和+16道尔顿碎片离子的边界用符号N+表示上面的面板。

FIH-1在低氧反应途径中的作用

因为HIF脯氨酰和天冬酰胺羟化酶都使用分子O2作为底物，可以合理预测这些酶可能是缺氧反应途径中的直接氧传感器。还需要进一步的研究来确定这些酶对氧的亲和力是否可以解释缺氧反应对氧变化的敏感性2体内试验。当在293T细胞中高水平过度表达时，FIH-1确实在正常氧条件下抑制CAD活性（图。​（图2）。2). 如果FIH-1活性是一种氧传感器，那么这种抑制活性应该在缺氧条件下受到抑制。事实上，在缺氧条件下观察到HIF脯氨酰羟化酶对HIF活性的抑制作用受到抑制(Bruick和McKnight 2001年). 然而，当高水平转染时，FIH-1仍然能够在低氧浓度下抑制HIF-1αCAD活性(Mahon等人，2001年). 当FIH-1以低得多的水平转染时，观察到类似的效果（图。​（图5）。5). 尽管在缺氧条件下，即使低水平的过表达FIH-1也可能保留足够的活性来抑制CAD，但这一结果增加了FIH-1活性的调节可能不仅仅受其对O的亲和力调节的可能性2.

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缺氧对FIH-1反式激活结构域活性抑制的影响。用Gal4-tk-luc报告基因DNA、HIF-1α727–826/Gal4嵌合体（野生型或N803A替代突变）和FIH-1（野生型或者D201A替代突变）或LacZ对照物转染人类胚胎肾293细胞。细胞在常压条件下培养19小时，或在常压下培养5小时，然后在低氧条件下培养14小时（0.5%O2). FIH-1，而不是D201A突变体，在低氧（0.5%O）下抑制CAD激活2)条件。在这些条件下，由于荧光素酶的基线活性水平处于检测水平，因此在常压条件下未观察到FIH-1对CAD活性的抑制。天冬酰胺突变为丙氨酸使CAD对FIH-1或氧浓度不敏感。

暴露于低氧水平时完全诱导缺氧反应途径需要稳定HIF-α转录因子和激活CAD(Lando等人，2002年). 每一个事件都取决于在正常氧条件下对HIF进行负调节的羟化酶的消退。虽然通过构建包含ODD或CAD的嵌合体，这两种调控模式可以明显地相互解耦，但调控这两种模式的机制似乎是相互关联的(Mahon等人，2001年). 体外结合研究表明，FIH-1和pVHL相互作用，可能是在正常氧条件下通过多种机制抑制HIF的更大复合物的一部分(Mahon等人，2001年)虽然通过羟基化调节CAD似乎不需要pVHL(Sang等人，2002年). 这种协同作用可能有助于严格控制HIF活性并防止HIF靶基因的错误表达，其中许多基因会促进实体肿瘤的形成(Maxwell等人，2001年).

材料和方法

质粒构建

通过PCR产生HIF CAD（小鼠HIF-2α774–874和人类HIF-1α727–826），并克隆到pET-32a（Novagen）中，通过N-末端硫氧还蛋白-6组氨酸标签（Trx6H）进行细菌表达。人类p300的CH1结构域（氨基酸300–528）被克隆到pGEX 4T3（Amersham）中，用于细菌表达和N末端GST融合。通过RT-PCR产生人类FIH-1编码区，并克隆到pcDNA3.1/V5-HIS载体（Invitrogen）和pMBP-parallel1载体(Sheffield等人，1999年).

转染

用Gal4或HIF CAD/Gal4嵌合体转染在24孔托盘中DMEM/10%胎牛血清中生长的HEK 293T细胞(Lando等人，2002年; 200 ng/孔），G5E1b-Luc报告子（100 ng/孔。6 h后，转染细胞接受增加的（0–200μM）二甲基氧肟基甘氨酸（DMOG）处理16 h。使用双荧光素酶试验（Promega）测量荧光素素酶活性，并将其报告为荧光素酶活性与对照肾小球报告活性的比值。Western blot分析证实，转染野生型、H199A和D201A FIH-1构建物表达等量的蛋白质（数据未显示）。

人胚胎肾293细胞（5×10424孔板（5×10）中的电池/孔4)用125μM CaCl沉淀法制备的DNA转染含有HyQ DME（高糖）培养基和10%胎牛血清的培养基2存在1×BES缓冲液（140 mM NaCl，25 mM BES，0.75 mM Na2人事军官4pH为6.95）。将含有5 ng Gal4-tk-luc报告基因DNA、25 ng HIF-1α727–826/Gal4嵌合体（野生型或N803A突变体）和10 ng lacZ、FIH-1或FIH-1 D201A突变体的沉淀混合物添加到每个孔中。细胞在常压条件下培养19小时，或在常压下培养5小时，然后在低氧条件下培养14小时（0.5%O2). 将细胞重新悬浮在100μL的裂解缓冲液中（pH 7.8的30 mM Tricine、8 mM MgOAc、0.2 mM EDTA、1%Triton X-100、100 mMβ-Me、1.5 mM ATP、0.5 mM CoA和0.5 mM荧光素）。荧光素酶活性用微量滴定板光度计（Torcon仪器）测量。

蛋白质表达

BL21（DE3）中GST-p300 CH1的表达大肠杆菌用0.1 mM IPTG在25°C下诱导细胞1.5 h。细胞颗粒在含有20 mM Tris-HCl（pH 8）、100 mM NaCl、10μM ZnCl的缓冲液中溶解2、0.5%NP-40、0.5 mM DTT、1 mM PMSF和0.3μg/mL溶菌酶，并在冰上超声处理。离心后，上清液与谷胱甘肽-淀粉树脂（Scientifix）结合，并用200体积的裂解缓冲液清洗。Trx6H HIF-2α774–874在BL21中表达（DE3）大肠杆菌用1 mM IPTG在37°C下诱导细胞1.5 h。在含有1 mM PMSF的结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl，5 mM咪唑）中通过超声溶解细胞颗粒。离心后，将裂解物与Ni-IDA琼脂糖（Scientifix）在4°C下培养1 h，并用200体积的结合缓冲液清洗；用含有250 mM咪唑的结合缓冲液洗脱Trx6H HIF-2α774-874蛋白。BL21（DE3）大肠杆菌用0.2 mM IPTG在30°C下诱导表达MBP–FIH-1融合的细胞4.5h，并在TH缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.9，150 mM NaCl，1 mM PMSF）中通过超声溶解细胞颗粒。离心后，添加直链淀粉琼脂糖（Scientifix），将样品在4°C下培养1 h，并用200体积的TH缓冲液洗涤，用含有10 mM麦芽糖的TH缓冲器洗脱MBP–FIH-1蛋白。使用PD-10柱（Amersham）脱盐蛋白质样品。

GST下拉分析

35使用TNT偶联网织红细胞裂解物系统（Promega）和35S-L-Met（Amersham Pharmacia Biotech），并在含有4 mM抗坏血酸和1.5 mM FeSO的缓冲液中用FIH-1在30°C下处理1小时4在2 mM 2-酮戊二酸或2 mM DMOG存在下。将约1μg固定化GST-p300 CH1添加到25μL35500μL反应缓冲液中的S-Trx6H HIF-2α774–874（20 mM Tris-HCl，pH 8，150 mM NaCl，20μM ZnCl21 mM DTT，1 mM PMSF），并在4°C下孵育1 h。用1 mL含有0.1%NP-40的反应缓冲液洗涤蛋白结合树脂4次。结合蛋白用SDS样品缓冲液洗脱，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

体外羟基化产物的质谱分析

为了进行质谱分析，将10μg纯化的Trx6H HIF-2α774–874和MBP–FIH-1蛋白混合在100μL羟化缓冲液（pH 7.5下的40 mM Tris-HCl、10 mM KCl、1 mM DTT、1 mM-PMSF、3 mM MgCl）中2，4 mM抗坏血酸，1.5 mM硫酸亚铁4)含有4 mM 2-酮戊二酸或DMOG。在30°C下孵育1小时后，用Ni-IDA琼脂糖亲和纯化Trx6H HIF-2α774–874。制备肽片段并通过MALDI-TOF-MS进行分析(Lopaticki等人，1998年;Wallis等人，2001年)并通过MS/MS进行部分序列分析(Wallis等人，2001年)如前所述(Lando等人，2002年).

致谢

我们感谢S.Pyke在DMOG合成方面提供的帮助，以及Steve McKnight提供的有益建议。R.K.B由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）颁发的国家研究服务奖（National Research Service Award）和一位匿名捐赠者向Steve McKnight提供的无限制捐赠基金资助。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

脚注

电子邮件ua.ude.edialeda@waletihw.yarrum公司; 传真0011-1-214-648-3346。

电子邮件ude.demws.mehcoib@kciurb; 传真：（214）648-3346。

文章和出版物位于http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.991402。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社