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.2000年8月15日；19(16):4298-309.
doi:10.1093/emboj/19.16.4298。

von Hippel-Lindau抑癌蛋白调节低氧诱导因子-1α的机制

K塔尼莫托 1, Y马基诺, T佩雷拉, L波林格
附属公司

von Hippel-Lindau抑癌蛋白调节低氧诱导因子-1α的机制

K塔尼莫托等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

在常氧细胞中，低氧诱导因子-1α（HIF-1α）通过泛素蛋白酶体途径迅速降解，HIF-1 alpha活化为功能形式需要蛋白质稳定。在这里，我们表明，von Hippel-Lindau（VHL）抑癌基因的产物通过与HIF-1α的氧依赖性降解域核心的相互作用，在正常氧条件下介导HIF-1 alpha的泛素化和蛋白酶体降解。VHL介导与HIF-1α相互作用的区域与VHL晶体结构内观察到的假定大分子结合位点重叠。VHL的这个基序也代表了肿瘤中的一个突变热点，其中一个突变破坏了与HIF-1α的相互作用和随后的降解。有趣的是，HIF-1α内的VHL结合位点与一个最小的转录激活域重叠。VHL对HIF-1α降解的保护是一种多步骤机制，包括缺氧诱导的HIF-1 alpha核移位和核内缺氧依赖信号。在此过程中，HIF-1α未释放VHL。最后，HIF-1α蛋白水平的稳定本身并没有完全绕过缺氧信号产生反式激活反应的需要。

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数字

无
图1。VHL在常氧条件下介导HIF-1α的蛋白酶体降解。(A类)在常氧条件下HIF-1α的表达。增加量的pFLAG CMV2/HIF-1α[0.2µg（+）、0.5µg2)或缺氧（1%O2)，如图所示。使用抗FLAG抗体通过免疫印迹分析全细胞提取物。(B类)VHL存在下HIF-1α的降解。pFLAG CMV2/HIF-1α与空载体或野生型VHL表达载体（pCMX/VHL）共同转染COS7细胞。使用抗FLAG或抗VHL抗体通过免疫印迹分析全细胞提取物。(C类)VHL介导HIF-1α的蛋白酶体降解。用pFLAG CMV2/HIF-1α和pCMX/VHL转染细胞，在收获前在没有或存在5µM MG-132的情况下培养6 h，并按照（B）中的方法分析细胞提取物。(D类)VHL不影响二恶英受体（DR）蛋白水平。在不存在或存在pCMX/VHL的情况下，用FLAG标记的二恶英受体表达载体（pCMV/DR/FLAG）转染COS7细胞，并按（B）中所述进行分析。分子量（kDa）标记的流动性显示在印迹的右侧。
无
图2。VHL需要两个功能域来诱导HIF-1α降解。(A类)VHL的GAL4融合野生型（wt）、缺失或单氨基酸点突变（pmt）形式的示意图。(B类)VHL直接与HIF-1α相互作用。等浓度的在体外翻译的35S标记的全长HIF-1α与在体外翻译的野生型GAL4/VHL或VHL缺失突变体或仅跨越GAL4 DNA结合域的GAL4-DBD。按照材料和方法中的描述，使用抗GAL4抗体（上面板）或对照免疫前血清（下面板）进行共免疫沉淀分析。通过SDS-PAGE和放射自显影术分析沉淀物质。对于负载控制，输入的10%35标有S的HIF-1α如车道1所示。(C类)肿瘤衍生的点突变损害VHL和HIF-1α之间的相互作用。体外如（B）所示，通过共同免疫沉淀培养和分析翻译的蛋白质。(D类)肿瘤衍生的点突变型VHL不能诱导HIF-1α降解。如图所示，pFLAG CMV2/HIF-1α在COS7细胞中短暂共表达，无GAL4融合的野生型或突变型VHL。细胞在常压下培养24小时，制备全细胞提取物，并使用抗FLAG或抗VHL抗体进行免疫印迹分析。分子量（kDa）标记的流动性显示在印迹的右侧。
无
图3。VHL靶向HIF-1α的氧依赖性降解域。(A类)FLAG标记的野生型HIF-1α或指示的HIF-1β缺失突变体在COS7细胞中在无VHL或有VHL的情况下在常氧下短暂共存。如图1所示，制备并分析全细胞提取物。ODD，氧依赖性降解域；N-和C-TAD、N-和C-末端交易激活域。(B类)35用等浓度的在体外翻译的GAL4融合蛋白仅跨越全长HIF-1α或GAL4-DBD。用抗GAL4抗体（上表）或对照非特异性兔抗血清（下表）进行共免疫沉淀分析。通过SDS-PAGE和放射自显影术分析沉淀物质。对于负载控制，输入的10%35显示了标有S的VHL。(C类)跨越所示HIF-1α片段或仅GAL4的VHL、GAL4融合蛋白通过在体外翻译和分析如（B）所示。
无
图4。HIF-1α的最小N-TAD是VHL介导的泛素化和蛋白酶体降解的靶点。(A类)人类（h）和小鼠（m）HIF-1α和EPAS-1的N-TAD序列的比对显示了一个保守的核心序列基序。氨基酸取代的位置显示在突变体（mt）N-TAD中。(B类)N-TAD PYI基序的突变消除了HIF-1α和VHL之间的相互作用。35用等浓度的在体外翻译的FLAG标记野生型、突变的N-TAD或FLAG表位。使用抗FLAG抗体进行共免疫沉淀测定，并通过SDS–PAGE和放射自显影进行分析。对于加载控制，10%的输入35显示了S标记的VHL。(C类)PYI突变可抵抗VHL介导的降解。如图所示，在没有或存在不断增加的VHL浓度（1.0µg，+；2.0µg/6-cm培养皿，++）的情况下，在COS7细胞中短暂共表达FLAG或FLAG标记的野生型或突变型N-TAD（1µg/6cm培养皿），并在常压下培养24小时。制备全细胞提取物，并使用抗FLAG或抗VHL抗体进行免疫印迹分析。(D类)VHL介导N-TAD的泛素化。在常氧条件下，在有或无VHL的COS7细胞中与MG132结合6小时，FLAG或FLAG标记的野生型或突变型N-TAD和HA-标记的泛素暂时共存。用抗FLAG免疫沉淀全细胞提取物后，用抗HA免疫印迹法检测泛素化形式的N-TAD（上图）。10%的输入全细胞提取物显示在下面的两个面板中。(E类)N-TAD中单个赖氨酸替代精氨酸后对蛋白质稳定性的影响。野生型或突变型N-TAD在293细胞中瞬时表达，并在常氧或缺氧条件下培养12小时。全细胞提取物的制备和分析如（C）所示。分子量（kDa）标记的流动性显示在印迹的右侧。
无
图5。保护HIF-1α免受VHL介导的降解需要HIF-1β的核移位和低氧依赖性核内信号。(A类)VHL的亚细胞定位。用pCMX/VHL转染COS7细胞，表达24小时后，在常氧或缺氧条件下培养6小时。用抗VHL抗体间接免疫荧光法测定亚细胞定位。(B类)GFP–HIF-1α嵌合蛋白的亚细胞分布。跨越野生型或突变型HIF-1α的GFP融合蛋白在COS7细胞中瞬时表达并如上培养。照片是用蔡司荧光显微镜拍摄的。(C类)VHL对野生型和突变型HIF-1α降解的影响，表现为组成性细胞质或核定位。FLAG标记的HIF-1α野生型或突变型在缺乏或存在VHL的情况下瞬时表达，并在常氧或缺氧条件下培养12小时。如图1所示，制备并分析全细胞提取物。
无
图6。VHL、Arnt和HIF-1α形成三元核配合物。(A类)缺氧细胞中HIF-1α不释放VHL。GAL4、GAL4/HIF-1α和/或VHL在有MG132存在的COS7细胞中在正常氧或缺氧条件下短暂共表达一段时间。在用抗GAL4（上面板）或对照（中面板）抗体对全细胞提取物进行免疫沉淀后，使用抗VHL抗体通过免疫印迹检测VHL。下面板显示了10%的输入全细胞提取物。(B类)与Arnt的关联。GAL4或GAL4/HIF-1α在COS7细胞中瞬时表达，在常氧或缺氧条件下无Arnt或VHL存在或缺失6 h，并如上所述进行分析。
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图7。突变体N-TAD维持缺氧诱导的反式激活反应。(A类)PYI突变体N-TAD的组成稳定性。GAL4融合的野生型和突变型N-TAD在COS7细胞中在常氧或缺氧条件下瞬时表达12小时。如图1所示，制备并分析全细胞提取物。(B类)突变体N-TAD的低氧诱导反式激活功能。如材料和方法中所述，使用GAL4反应荧光素酶报告基因监测GAL4融合野生型或突变N-TAD蛋白的转录激活功能。转染后6小时，细胞在常氧或缺氧条件下培养36小时。报告基因活性的表达与GAL4 DNA结合域在常压下的活性有关，并与内部控制的β-半乳糖苷酶活性标准化。数值代表三个独立实验的平均值±SD。(C类)PYI突变体在常氧细胞中稳定全长HIF-1α。FLAG标记的野生型和突变型HIF-1α在缺乏或存在VHL的情况下瞬时表达，并如上所述进行分析。(D类)野生型和突变型HIF-1α蛋白的转录激活功能如（B）所示。
无
图8。HIF-1α功能的条件调节模型。在常氧条件下（左侧面板），HIF-1α通过VHL靶向泛素蛋白酶体降解。VHL的阴影区表示肿瘤中的突变热点，分别与VHL的HIF-1α或伸长C结合域（CBD）一致。这两个结构域中任何一个的突变都会稳定HIF-1α蛋白。缺氧（右图）通过诱导核易位和一个尚未确定的核调节信号抑制HIF-1α的降解，该信号可能与伙伴DNA结合因子、Arnt、转录辅激活物和/或氧化还原调节物Ref-1的招募有关。详见正文。
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