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临床投资杂志。2007年2月1日；117(2): 326–336.
在线发布2007年1月18日。 数字对象标识：10.1172/JCI28833号
预防性维修识别码：项目经理1765515
PMID：17235397

在Myc诱导的淋巴瘤模型中，自噬抑制增强治疗诱导的凋亡

拉维·K·阿马拉瓦迪,1,2 Duonan余,三 朱利安·卢姆,2 Thi Bui公司,2 玛丽亚·克里斯托弗鲁,4 杰拉德·I·埃文,4 安德烈·托马斯·蒂霍连科（Andrei Thomas-Tikhonenko）,三和克雷格·汤普森1,2
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摘要

自噬是一种溶酶体依赖的降解途径，在化疗或放疗的肿瘤细胞中经常被激活。在治疗后的癌细胞中观察到的自噬是一种允许肿瘤细胞存活治疗的机制，还是一种启动非凋亡形式的程序性细胞死亡的机制，仍存在争议。为了解决这个问题，自噬在Myc公司-来源于细胞的淋巴瘤诱导模型第53页TAM公司/第53页TAM公司小鼠（带有急诊室表示雌激素受体)已检查。由于缺乏核p53，这些肿瘤对凋亡具有抵抗力。全身应用三苯氧胺导致p53激活和肿瘤复发。p53的激活与凋亡细胞的快速出现和存活细胞自噬的诱导有关。氯喹或氯喹抑制自噬自动液位计5短发夹RNA（shRNA）增强了p53激活或烷基化药物治疗诱导肿瘤细胞死亡的能力。这些研究提供了证据，证明自噬在使用凋亡激活剂治疗的肿瘤细胞中起着生存途径的作用，并为自噬抑制剂（如氯喹）与旨在诱导人类癌症凋亡的疗法相结合提供了理论依据。

介绍

大自噬（以下简称自噬）是一个进化保守的过程，它允许细胞通过形成双膜小泡（自噬体）来隔离细胞质内容物，并通过自噬小泡与溶酶体的融合将其靶向降解，从而形成单膜自溶小体。已经观察到一些抗肿瘤疗法可以诱导人类癌细胞株的自噬(1——4). 由治疗诱导的自噬是否有助于肿瘤细胞死亡，或代表对治疗介导的细胞死亡的抵抗机制仍不确定。两个支持自噬作为抗肿瘤药物疗效反映的观察结果是：（a）自噬持续激活可导致程序性细胞死亡(5)和（b）自噬调节器beclin 1(BECN1公司)是一种单倍体抑癌基因，当其过度表达时会诱导自噬(6). 这些发现表明，刺激自噬可能对癌细胞有害，抑制自噬的治疗可能导致肿瘤生长增强。

越来越多的证据表明，自噬也可以代表一种适应性策略，通过这种策略，细胞可以清除受损的细胞器，并在生物能量应激下生存下来。自噬通过以细胞质蛋白质和细胞器为靶点进行溶酶体降解，在再循环细胞器和蛋白质方面发挥作用，这些细胞器和蛋白可能会因激活癌基因和癌症治疗相关的细胞应激产生的活性氧物种增加而受损(7,8). 当细胞缺乏细胞外营养或生长因子时，自噬也能促进抗凋亡细胞的存活。用氯喹（CQ）药物治疗依赖自噬存活的细胞会导致细胞快速死亡(9).

CQ是一种溶酶运动药物，可提高溶酶体内的pH值(10)并破坏自噬蛋白降解(11). 通过阻断自噬途径的最后一步，CQ治疗(9)或溶酶体蛋白LAMP-2的敲除(12)导致无效自噬体的积累和依赖自噬生存的细胞的死亡。由于CQ在动物中具有良好的治疗指数，因此可以作为一种工具来研究自噬在小鼠肿瘤生长中作为治疗应激反应的作用。

为了检测CQ的作用及其对体内肿瘤细胞自噬的调节，建立了B细胞淋巴瘤小鼠模型。该模型利用p53–雌激素受体敲除小鼠(第53页TAM公司/第53页TAM公司)允许在体内对p53激活的影响进行时间解剖(13). 这些小鼠的骨髓细胞在体内感染了受体小鼠两侧高度多重表达Myc的逆转录病毒。这就产生了多克隆Myc/p53ER基因TAM公司具有B细胞表型的淋巴瘤。这些肿瘤可以用于治疗研究，因为它们能够被过继转移到同基因小鼠的侧翼。在缺乏治疗的情况下，产生的肿瘤会迅速生长，因为它们是有效的Myc公司积极的，第53页无效的。全身注射三苯氧胺（TAM）后，p53ER融合蛋白移位到细胞核，恢复p53功能，启动细胞凋亡和肿瘤退行。在肿瘤潜伏期一段时间后，尽管持续TAM治疗，100%的动物仍会出现肿瘤复发。

在本研究中，CQ在激活p53或进行细胞毒性化疗后显著促进肿瘤退行性和延迟肿瘤复发。在治疗应激后凋亡存活的肿瘤细胞中，自噬被激活。低微摩尔剂量的CQ治疗抑制肿瘤细胞的自噬依赖性生存，其作用类似于基本自噬基因的基因敲除自动液位计5增强p53诱导的凋亡细胞死亡。将这些剂量的CQ与短发夹RNA（shRNA）结合自动液位计5p53激活后没有进一步增加细胞死亡。这项研究提供了证据，证明肿瘤细胞可以通过自噬过程在治疗诱导的细胞凋亡中存活，并为进一步研究自噬抑制剂作为抗癌剂的增效剂提供了理论依据。

结果

CQ增强了p53诱导的肿瘤退化。

这个第53页TAM公司融合基因由内质网的一个转录不活跃的激素结合区组成(急诊室TAM公司) (14)融合到Trp53基因抑癌基因(15). 小鼠中编码p53ER的敲除等位基因纯合子TAM公司(Trp53基因KI/KI)，p53依赖性基因表达由TAM的全身给药诱导(13). 为了产生B细胞淋巴瘤，从Trp53基因KI/KI如前所述，用LMycSN逆转录病毒在体内转导小鼠和小鼠(16,17).

为了检测在没有p53激活的情况下CQ治疗的体内抗肿瘤作用，从Myc/p53ERTAM公司淋巴瘤和皮下注射到同基因小鼠的侧翼。肿瘤形成后，根据肿瘤体积匹配小鼠，并随机分配小鼠接受PBS或60 mg/kg/d CQ静脉注射（图​（图1A）。1A） ●●●●。该剂量接近先前报告的LD5068–78 mg/kg(18). 按这些剂量治疗的小鼠没有观察到毒性。与PBS对照组相比，60 mg/kg/d CQ腹腔注射治疗导致肿瘤生长速度轻度但可重复的损害。然而，在任何CQ处理的动物中均未观察到肿瘤消退。每天使用60 mg/kg/d的CQ衍生物羟基氯喹（HCQ）治疗也会导致类似的肿瘤生长障碍（数据未显示）。

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CQ在p53激活和不激活的情况下对肿瘤细胞凋亡的影响Myc/p53ERTAM公司淋巴瘤。

(A类)CQ抑制肿瘤生长。主单元中的单元Myc/p53ERTAM公司在6只同系C57BL/6×129F1小鼠体内采集并传代肿瘤。将细胞皮下注射到小鼠两侧。当肿瘤体积超过1000毫米时三，小鼠每天接受PBS腹腔注射或60 mg/kg/d CQ腹腔注射。结果显示为平均±SD每日肿瘤体积，是多项实验的代表*P（P）< 0.05. (B)CQ在p53诱导的肿瘤消退后延迟肿瘤复发。Myc/p53ERTAM公司18只C57BL/6×129F1小鼠侧翼皮下注射细胞。一旦肿瘤体积达到1500毫米以上三，小鼠每天接受1 mg/d TAM i.p.+生理盐水（TAM/PBS）或1 mg/d TA M i.p.+60 mg/kg/d CQ i.p.（TAM/CQ）的治疗（箭头所示）。结果显示了代表性实验中各组的每日肿瘤体积（平均值±标准偏差）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.005.

为了确定细胞凋亡治疗激活后CQ治疗的效果，Myc/p53ER基因TAM公司生成淋巴瘤，根据肿瘤体积匹配小鼠，并随机分配给每日TAM加PBS腹腔注射（TAM/PBS）或每日TAM再加60 mg/kg/d CQ腹腔注射（TAM/CQ）。TAM处理导致p53ER的核定位TAM公司融合蛋白和快速诱导凋亡（数据未显示）。TAM/PBS治疗的肿瘤在几天内消退，但尽管继续TAM治疗，所有肿瘤仍恢复生长。与TAM/PBS治疗相比，TAM/CQ治疗显著延迟了肿瘤复发（图​（图1B）。1B） ●●●●。在单独的实验中，60 mg/kg/d HCQ i.p.也会导致显著延迟复发（数据未显示）。在4个单独实验过程中治疗的所有小鼠中，81%接受TAM/CQ或TAM/HCQ治疗的小鼠观察到肿瘤对治疗反应的完全临床退化，而8%接受TAM/PBS治疗的小鼠(P（P）< 0.005).

自噬在p53依赖性凋亡存活的肿瘤细胞中被激活。

在多种癌细胞系中观察到致癌或化疗应激后自噬的激活(11,14). 为了进一步了解CQ和/或p53激活对该肿瘤模型中肿瘤细胞自噬的影响，在p53未激活的情况下，对用PBS或60 mg/kg/d CQ腹腔注射治疗的小鼠以及在p53激活后的连续时间点用TAM/PBS或TAM/CQ治疗的小鼠的淋巴瘤组织进行电子显微镜检查。虽然在PBS治疗的肿瘤中发现了含有罕见自噬体的细胞，但在Myc/p53ERTAM公司在没有p53激活的情况下，用CQ治疗肿瘤96小时（图​（图2A）。2A） ●●●●。CQ破坏溶酶体结构和功能(19)，阻止有效的自噬降解，导致无效自噬体的积累(11,20,21). 第一次给予TAM八小时后，p53激活导致大多数肿瘤细胞发生以凋亡为特征的形态学变化，包括染色质凝聚、核和细胞质泡状变以及核碎裂。通过聚焦于核形态和细胞质膜完整的细胞，在p53诱导的凋亡存活下来的两个治疗组的肿瘤中发现了大量肿瘤细胞。在非凋亡细胞中，TAM/PBS处理导致在24小时和48小时内出现大的双膜小泡。到48小时，随着肿瘤开始复发，大多数肿瘤细胞的残留自噬体变小。相反，TAM/CQ处理的肿瘤中的活肿瘤细胞在p53激活后8小时积累自噬体，到24小时时，活肿瘤细胞数量较少，并且含有大量未降解或部分降解的无效自噬体内物。到48小时，TAM/CQ治疗的肿瘤主要由凋亡细胞的残余组成。

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有CQ和无CQ激活p53对自噬体积累的影响。

(A类)肿瘤消退过程中自噬体变化的时间进程。PBS或CQ单独治疗96小时后以及TAM治疗开始后8小时、24小时和48小时收集的淋巴瘤组织的电子显微照片。箭头，双膜囊泡。比例尺：2μm。原始放大倍数，×10000。(B)自噬体增多的肿瘤细胞定量。对Myc/p53ERTAM公司根据所给治疗方案，在指定的时间点发生淋巴瘤。每个非凋亡细胞的自噬体数量按照方法（平均值±标准偏差）进行测定*P（P）< 0.005.

每个非凋亡细胞自噬体数量的量化（图​（图2B）2B） 在TAM治疗开始后24小时，单独的p53激活（TAM/PBS）导致自噬体的数量比单独用PBS治疗的肿瘤增加8倍。TAM/CQ治疗的肿瘤早期出现大量自噬体。在没有p53激活的情况下以及在p53激活后的每个时间点，CQ治疗都会导致每个非凋亡细胞的自噬体数量显著增加。

CQ处理增强p53诱导的细胞凋亡。

在TAM治疗开始48小时后，与TAM/PBS或TAM/CQ治疗的肿瘤相比，单独使用PBS治疗的肿瘤的低倍（×4000）电子显微照片显示，TAM/CZ治疗的肿瘤细胞广泛死亡（图​（图3A）。三A） ●●●●。在电子显微镜下观察到TAM/CQ治疗肿瘤中92%±5%的肿瘤细胞的凋亡形态学特征，而TAM/PBS治疗肿瘤中的肿瘤细胞凋亡形态学特征为3%±3%（图​（图3B）。三B） ●●●●。为了进一步描述这种细胞死亡，对肿瘤标本进行TUNEL染色，以评估治疗肿瘤中发生凋亡的细胞数量（图​（图3C）。三C） ●●●●。在开始治疗后8小时，与PBS和CQ治疗的肿瘤相比，TAM/PBS和TAM/CQ治疗均导致TUNEL阳性肿瘤细胞显著增加。TAM/PBS治疗的肿瘤中TUNEL阳性细胞的数量减少了48小时，但TAM/CQ治疗的肿瘤没有减少。治疗肿瘤中每个高倍视野TUNEL阳性细胞百分比的量化（图​（图3C）三C） 在8小时时，发现PBS和CQ治疗的肿瘤之间以及TAM/PBS和TAM/CQ治疗肿瘤之间TUNEL阳性细胞的百分比没有显著差异。24小时后，与TAM/PBS治疗的肿瘤相比，TAM/CQ治疗的肿瘤中TUNEL阳性肿瘤细胞的百分比显著增加。当TAM/CQ治疗的肿瘤与TAM/PBS治疗的肿瘤相比，TUNEL阳性肿瘤细胞的百分比相差7倍时，这种差异持续到48小时(P（P）< 0.001). 作为检测治疗肿瘤中肿瘤细胞凋亡的独立指标，对TAM/PBS-和TAM/CQ治疗肿瘤的肿瘤细胞裂解物进行裂解caspase-3的Western blot分析。在TAM/PBS或TAM/CQ启动后8小时获得的肿瘤裂解液中观察到裂解caspase-3增加。裂解caspase 3在48小时获得的TAM/PBS-处理的肿瘤细胞裂解液中不存在，但在48小时得到的TAM/CZ处理的肿瘤裂解物中存在（数据未显示）。

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有无CQ激活p53对细胞凋亡的影响。

(A类)p53激活后CQ诱导的细胞死亡。TAM治疗前和TAM/PBS或TAM/CQ治疗48小时后收集的淋巴瘤组织的电子显微照片。比例尺：10μm。原始放大倍数，×4000。(B)利用凋亡形态学证据对肿瘤细胞进行量化。对Myc/p53ER基因TAM公司根据所给治疗方案，在指定的时间点发生淋巴瘤。按方法（平均值±SD）所述，在×4000倍放大下测定每个场的凋亡细胞百分比。(C)在指定的时间点对从治疗肿瘤获得的组织进行TUNEL染色。通过荧光显微镜获得了具有代表性的图像。红色荧光显示TUNEL阳性细胞。蓝色荧光显示细胞核DAPI染色。(D类)TUNEL阳性肿瘤细胞的定量。每个高倍视野中TUNEL阳性细胞的百分比报告为平均值±SD。

CQ通过抑制自噬增强p53依赖性凋亡。

为了确保通过电子显微镜观察到的自噬体数量的变化是由于全身给药对肿瘤细胞自噬途径的直接作用，而不是由于治疗后肿瘤变性引起的肿瘤微环境的变化，GFP-LC3（LC3，酵母Atg8的哺乳动物同源物）将融合基因逆转录到从原代细胞中获得的大量细胞中Myc/p53ERTAM公司淋巴瘤和GFP阳性细胞在培养基中传代。LC3在自噬过程中从LC3-I加工到LC3-II。LC3-II插入新形成的自噬体膜(22). GFP-LC3的表达提供了一种追踪活细胞自噬体形成变化的方法(23). 未经处理的GFP-LC3的分布Myc/p53ERTAM公司/GFP-LC3型细胞呈弥散型细胞质（图​（图4A）。4A） ●●●●。CQ调节肿瘤细胞自噬的能力通过治疗后LC3阳性小泡的积聚得到证实Myc/p53ERTAM公司/GFP-LC3型CQ细胞。用4-羟基三苯氧胺（hTAM）激活p53导致点状LC3相关小泡的数量增加，通过与hTAM和CQ的联合治疗进一步增强。无论hTAM是否存在，CQ处理细胞中自噬体的积累都是剂量依赖性的（图​（图4B）。4B） ●●●●。在缺乏hTAM的情况下，500 nM至5μM的CQ剂量导致具有点状GFP-LC3荧光的细胞百分比增加2倍至10倍。单用hTAM处理后，点状GFP-LC3荧光的细胞百分比增加了10倍。在hTAM治疗期间添加CQ（1-5μM）导致点状GFP-LC3荧光细胞的百分比呈剂量依赖性增加。治疗后48小时测量时，这些差异持续存在，没有显著变化（数据未显示）。为了确保CQ调节自噬的能力独立于p53，第53页+/+GFP-LC3型和第53页–/–GFP-LC3型制备小鼠胚胎成纤维细胞。CQ诱导MEF中点状LC3-相关囊泡的积聚第53页-独立方式（图​（图4C）。4C） ●●●●。治疗第53页+/+GFP-LC3型含hTAM的MEF未产生点状LC3荧光（数据未显示）。这一结果证实了在Myc/p53ERTAM公司用hTAM治疗的淋巴瘤细胞是由于hTAM诱导p53ER的激活TAM公司融合蛋白。自ER以来TAM公司蛋白结构域是hTAM处理的ER转录失活的点状GFP-LC3荧光Myc/p53ERTAM公司细胞是p53介导的效应。

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有和无CQ激活p53对LC3重定位的影响。

(A类——C)GFP-LC3荧光。绿色，GFP-LC3；蓝色，DAPI。(A类)大量初级人口Myc/p53ERTAM公司将GFP-LC3融合蛋白稳定表达的淋巴瘤细胞用250 nM hTAM和不用5μM CQ处理。每天更换细胞培养基。在24小时和48小时用荧光显微镜对细胞进行固定和成像。给出了48小时时细胞的代表性图像。(B)量化每细胞（点状）具有4个以上GFP-LC3点状细胞的细胞百分比，与在24小时用增加剂量的CQ（含和不含hTAM）处理的每细胞（弥散）少于4个GFP-LC2点状细胞相比。(C)CQ以p53依赖的方式调节自噬。第53页+/+和第53页–/–表达GFP-LC3的MEF用CQ处理。24小时固定细胞并成像。

为了证实体内观察到的CQ的抗肿瘤作用是由于CQ抑制自噬生存的能力所致，将CQ治疗肿瘤细胞与使用shRNA对抗自噬基因的自噬遗传抑制进行了比较自动液位计5（第5页）。shATG5的表达通过阻止ATG5-ATG12复合物的形成来阻断近端步骤的自噬，而ATG5-ATM12复合物是自噬体生成所必需的(24). 不沉默小鼠或人类基因的shRNA（发夹对照，HC）和2个不同的shRNA序列自动液位计5将（shATG5发夹2[h2]，shATG5-发夹[h7]）克隆到对照表达载体pKD中(9)并导入从Myc/p53ERTAM公司B细胞淋巴瘤。表达shATG5 h2的细胞中ATG5-ATG12复合物的表达水平降低(氢气)和shATG5 h7(h7（小时7）)但在表达HC的细胞中没有(HC公司)或向量(五)经Western blot证实（图​（图5A）。5A） ●●●●。体外hTAM处理激活p53后，肿瘤细胞发生凋亡。p53与hTAM的激活氢气和h7（小时7）ATG5水平长期受到抑制的细胞导致细胞死亡增加HC公司单元格（图​（图5B）。5B） ●●●●。据报道，自噬通过清除受损细胞器的能力，在应对压力时促进细胞存活(25)以及循环细胞内物质以维持生物能量学的能力(26). 为了确定慢性自噬抑制的促凋亡作用是否可以通过提供渗透性营养素来支持生物能量学来逆转，用hTAM和丙酮酸甲酯处理细胞。丙酮酸甲酯是一种葡萄糖代谢的细胞发酵中间体，以前有报道称，它可以维持生长因子和/或营养素缺乏细胞的活性，在这些细胞中，自噬受到损害(9). 在培养基中添加丙酮酸甲酯未能挽救在氢气细胞以及h7（小时7）用hTAM激活p53后的细胞（图​（图5C）。5C） ●●●●。

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p53激活伴或不伴ATG5敲除对肿瘤细胞死亡的影响。

(A类)抗ATG5的蛋白印迹Myc/p53ER基因TAM公司/向量单元格（V），Myc/p53ERTAM公司/HC公司细胞（HC），Myc/p53ER码TAM公司/shATG5氢气电池（h2），以及Myc/p53ERTAM公司/shATG5 h7型细胞（h7）。肌动蛋白被用作加载控制。(B)激活p53HC公司和第5页细胞。HC公司,氢气、和h7（小时7）淋巴瘤细胞每天接受200 nM hTAM治疗。(C)激活p53和丙酮酸甲酯（MP）。HC公司,氢气、和h7（小时7）淋巴瘤细胞每天用hTAM加1 mM MP治疗(B和C)每日计数台盼蓝排除法测定的活细胞数。报告值为代表性实验中三份样品的平均值±SD。

在HC或2种不同shATG5表达载体中的1种稳定转染细胞中，检测了CQ治疗对hTAM激活p53后肿瘤细胞死亡的影响(氢气,h7型; 图​图5A）。5A） ●●●●。CQ处理（1-5μM）HC公司细胞以剂量依赖的方式增强了对p53诱导的肿瘤细胞死亡反应（图​（图6A）。6A） ●●●●。在这个剂量范围内，仅CQ对肿瘤细胞的生存能力或增殖没有可复制的影响（补充图1；可与本文一起在线获取；doi:10.1172/JCI28833DS1）。相反，在这些剂量下，CQ治疗未能增强shATG5转染细胞克隆的细胞死亡（图​（图6，6、B和C）。

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CQ或ATG5基因敲除联合p53激活对肿瘤细胞死亡的影响。

(A类)激活p53和CQHC公司细胞。HC公司淋巴瘤细胞每天用200 nM hTAM加1μM、3μM或5μM CQ治疗(B)激活p53和CQ氢气淋巴瘤细胞。HC公司每天用hTAM处理细胞，并与氢气每天用hTAM或hTAM加1μM、3μM或5μM CQ处理细胞(C)p53加CQ在h7（小时7）淋巴瘤细胞。每天用hTAM处理HC细胞，并与h7（小时7）每天用hTAM或hTAM加1μM、3μM或5μM CQ处理细胞(A类——C)每日计数台盼蓝排除法测定的活细胞数。报告值为代表性实验中三份样品的平均值±SD。

CQ可增强肿瘤消退，并抑制烷基化药物治疗后的肿瘤复发。

在人类淋巴瘤的治疗中，环磷酰胺等烷基化剂是一线疗法(27——29). 为了确定自噬的抑制是否可以增强烷化药物治疗对细胞凋亡具有耐药性的肿瘤的疗效Myc/p53ERTAM公司用环磷酰胺单独或联合CQ治疗淋巴瘤Myc/p53ERTAM公司淋巴瘤用50 mg/kg环磷酰胺腹腔注射单剂量治疗，然后用PBS或60 mg/kg/d CQ腹腔注射治疗。然后每天重复PBS或CQ治疗13天（图​（图7A）。7A） ●●●●。环磷酰胺加或不加CQ均能使所有治疗小鼠的肿瘤完全消退。CQ联合治疗显著促进肿瘤消退，延缓肿瘤复发。环磷酰胺/PBS治疗组和环磷酰胺/CQ治疗组动物治疗24小时后的平均肿瘤体积为2966±673 mm三和1489±524毫米三分别为(P（P）< 0.001). 在环磷酰胺中添加CQ使肿瘤复发的平均时间增加了一倍多。PBS治疗小鼠的肿瘤（图​（图5）5)平均4.1±1.2天后复发，而有限的CQ疗程将肿瘤复发延迟至平均9.3±3.5天(P（P）<0.01）（图​（图7B）。7B） ●●●●。

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添加和不添加CQ的烷基化化疗对Myc/p53ERTAM公司淋巴瘤。

(A类)从原发肿瘤中获取细胞，并在同基因C57BL/6×129F1小鼠体内传代。Myc/p53ERTAM公司将细胞皮下注射到小鼠两侧。一旦肿瘤达到1700毫米以上三根据肿瘤大小匹配小鼠，用50 mg/kg环磷酰胺腹腔注射一次，然后每日PBS腹腔注射（顶部面板）或60 mg/kg/d CQ腹腔注射（底部面板），共治疗13天。显示单个小鼠的每日肿瘤体积。CY，环磷酰胺。(B)环磷酰胺/PBS和环磷酰胺/CQ处理小鼠的肿瘤复发时间（平均值±SD）*P（P）= 0.003. (C)GFP-LC3荧光。绿色，GFP-LC3；蓝色，DAPI。大量初级人口Myc/p53ERTAM公司用50μM MNNG处理稳定表达GFP-LC3融合蛋白的淋巴瘤细胞，加或不加10μM CQ。每天更换细胞培养基。在24小时和48小时用荧光显微镜对细胞进行固定和成像。给出了48小时时细胞的代表性图像。(D类)量化治疗后24小时和48小时，每个细胞（点状）具有4个以上GFP-LC3点的细胞百分比，与每个细胞（弥散）少于4个GFP-LC2点的细胞相比。(E类)MNNG在HC公司和shATG5型细胞。第0天，2×106细胞/mlHC公司,氢气、和h7（小时7）淋巴瘤细胞被镀上，并用20μM MNNG（红色）或20μM MINNG加5μM CQ（蓝色）处理。在治疗24小时和48小时后，通过台盼蓝排除法测定活细胞数。报告值是代表性实验三份样品的平均值±SD。

为了研究烷基化化疗对自噬的影响，Myc/p53ERTAM公司细胞表达GFP-LC3型分别用烷基化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）和CQ（图​（图7C）。7C） ●●●●。MNNG是一种烷化剂，可以以p53非依赖性的方式诱导细胞凋亡(30). CQ治疗或MNNG治疗单独导致具有点状LC3荧光的活细胞百分比增加，表明自噬体积聚。与DMSO对照组相比，MNNG和CQ联合治疗24小时和48小时后，点状LC3荧光增加了9倍和17倍（图​（图7D）。7D） ●●●●。为了进一步比较细胞毒治疗后基因自噬抑制与CQ的效果，在MNNG治疗中使用CQ和不使用CQ进行了效果测试HC公司,氢气、和h7（小时7）细胞。在24小时和48小时，与5μM CQ联合治疗显著增强了MNNG治疗的细胞毒性作用HC公司淋巴瘤细胞与治疗氢气或h7（小时7）仅含MNNG的细胞。CQ治疗并没有进一步增加烷基化剂诱导的细胞死亡氢气或h7（小时7）单元格（图​（图7E）。7E） ●●●●。

讨论

本研究中描述的结果提供了证据，证明自噬可能是一种适应性机制，有助于肿瘤细胞存活和抵抗治疗诱导的凋亡。p53在Mycp53ER公司TAM公司肿瘤导致肿瘤细胞凋亡，在p53诱导的急性凋亡诱导下存活的肿瘤细胞表现出活跃的自噬。促溶酶体药物CQ对自噬囊泡清除的损害与细胞凋亡增强、肿瘤消退以及肿瘤复发延迟相关。这似乎是由于肿瘤细胞中自噬的直接促生存作用，因为自噬被两种药物抑制自动液位计5体外诱导p53时，shRNA或CQ增强肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞恢复。

CQ有破坏溶酶体功能的能力(10)，抑制自噬的最后一个关键步骤，即自噬小体内容物的酸依赖性降解，导致无法清除的自噬囊泡积聚(11). 尽管较高剂量的CQ可能会产生额外的有害影响(31,32)在肿瘤细胞活力方面，本文研究的CQ剂量未能在体内引起肿瘤消退或在体外诱导肿瘤细胞死亡。CQ对p53激活或烷基化药物治疗的反应是增加肿瘤细胞死亡的能力与其损害自噬的能力相关。在自噬被shATG5基因抑制的细胞中，观察到p53激活或烷基化药物治疗导致肿瘤细胞死亡的类似增加。CQ治疗未能进一步增加p53活化或烷基化药物治疗后缺乏功能性自噬细胞的细胞死亡。因此，在这里研究的剂量下，抑制自噬可能是CQ主要抗肿瘤作用的基础。总之，这些数据表明，自噬抑制剂可以提高旨在诱导肿瘤细胞凋亡的治疗策略的疗效。

先前的研究已经导致了自噬在肿瘤细胞生物学中作用的相互矛盾的观点。抑制或缺乏自噬基因已被证明可增强肿瘤发生(6)从而得出结论，快速生长的肿瘤下调了自噬。与这一发现一致的是，自噬相关的肿瘤抑制基因BECN1公司在许多乳腺癌中被单等位基因删除，导致肿瘤细胞自噬减少(33,34). 这些观察结果表明，自噬可以抑制肿瘤细胞的生长，并增加了药物抑制自噬可能促进肿瘤细胞生长和存活的可能性。相反，最近的研究表明，自噬在哺乳动物细胞生物学中发挥着重要作用，它为细胞提供了一种适应机制，使其能够在生长因子或营养缺乏导致的生物能量应激中生存(9). 其他研究人员使用Akt驱动的凋亡缺陷异种移植模型，发现自噬具有类似的肿瘤保护作用。在这个模型中，自噬在生长肿瘤中心的肿瘤细胞中被激活，并用于保护肿瘤细胞免受由激活的癌基因和体内肿瘤细胞通常遇到的营养限制条件联合诱导的坏死。有趣的是，到目前为止还没有报道过双等位基因失活的肿瘤BECN1公司或者另一个自噬基因被观察到，这表明自噬作为一种诱导生存机制的保存是肿瘤发生所必需的。肿瘤发生过程中自噬基因单等位基因丢失的选择可能与自噬清除受损或过剩细胞器的功能有关(35,36). 酵母缺陷UTH1，编码一种线粒体蛋白，有效靶向线粒体进行自噬降解(37)对某些类型的氧化损伤过敏(38). 因此，长时间长期抑制自噬将导致细胞氧化剂积累，损害DNA，增加细胞转化的可能性。自噬在抑制细胞氧化损伤积累方面的作用可能解释了自噬对抑制肿瘤发生的作用，同时对既定肿瘤遇到的各种类型的细胞应激具有肿瘤保护作用。

由于在抗癌治疗后已建立的癌细胞系中观察到大量自噬的报道，因此进行了本研究(1——三,39). 上述数据证明了体内肿瘤细胞对p53激活的自噬诱导，p53是一种常见的抗肿瘤治疗诱导的基因。有人认为，在对细胞凋亡具有抵抗力的癌细胞系中，放射或化疗诱导细胞死亡的能力取决于自噬执行的II型程序性细胞死亡(40). 在Myc公司-诱导的淋巴瘤细胞（ATG5是一种重要的自噬基因）被击倒后，并没有损害p53诱导的细胞死亡，这表明凋亡激活的自吞噬程序不会导致细胞死亡。相反，自噬在这种情况下起着生存作用，因为shRNA的表达直接针对自动液位计5在淋巴瘤细胞中，p53激活后细胞死亡增加。这些数据表明，自噬可能是一种适应性反应，使癌细胞在凋亡刺激下存活下来，否则会导致其死亡。

肿瘤细胞表达自动液位计5shRNA的生长表明，一旦肿瘤增殖建立，体外细胞的生长和存活并不一定需要自噬。然而，我们的数据表明，在Myc/p53ER基因TAM公司肿瘤生长是基于自噬小泡的积累，当其被溶酶体清除时被CQ抑制。当肿瘤细胞面临诱导凋亡的细胞应激时，自噬起到保护细胞免受死亡的作用。在细胞凋亡应激中抑制自噬可增强细胞凋亡。由于自噬在应激时有助于细胞存活，因此即使以单倍体的方式表达，自噬似乎也有可能提高遭受潜在灾难性应激的肿瘤细胞的存活率。

本研究中用于研究凋亡应激后自噬作用的肿瘤和肿瘤细胞是通过表达野生型人类产生的c-Myc公司在p53ER-敲除小鼠的骨髓细胞中。除了Burkitt淋巴瘤外，其中染色体易位与c-Myc公司3个免疫球蛋白基因中的1个基因，导致其在B细胞中的组成性表达(41)，失调c-Myc公司通过基因扩增(42——44),c-Myc公司点突变(45)或组成转录和翻译后激活(46,47)与多种恶性肿瘤的发病机制有关，包括肺癌、结肠癌和乳腺癌。Myc作为影响葡萄糖代谢的基因转录调节因子的作用及其诱导细胞凋亡的倾向(48)当在非转化细胞中强烈表达时，增加了在这些肿瘤中观察到自噬的可能性，自噬可能是在治疗应激的基础上引入的一种特殊后果Myc公司-诱导细胞应激。然而，最近发现在另一种由癌基因驱动的肿瘤模型中，自噬可以促进肿瘤存活阿克特(49). 当Akt被激活时，也会增加糖酵解代谢并控制细胞凋亡。在这些肿瘤中，自噬被激活并优先保护生长中心的肿瘤细胞阿克特-营养和氧气有限的驱动型、凋亡缺陷型肿瘤。这表明激活Warburg效应并驱动糖酵解表型的癌基因，如Akt，在多种肿瘤中常见，可能会使肿瘤细胞倾向于增加自噬，作为营养限制下的生存策略。然而，在Myc/p53ERTAM公司在自噬被基因沉默的肿瘤细胞中观察到p53诱导的细胞凋亡增强，可渗透性营养物质丙酮酸甲酯并不能挽救这种增强。自噬不仅可以通过循环细胞成分来支持生物能量学，还可以通过清除受损的细胞器来促进细胞存活，细胞应激后细胞器的积累会进一步损害细胞。对p53诱导的应激和细胞毒化疗产生的自噬反应可能为肿瘤细胞清除受损的细胞器提供了一种手段。以及自噬作为肿瘤生存途径的作用证据阿克特-驱动肿瘤，本研究提供的数据Myc公司-驱动性淋巴瘤提示自噬可能是癌基因转化细胞的普遍生存功能。需要进一步的研究来充分了解其他致癌基因和抑癌基因在决定联合自噬抑制和细胞凋亡诱导的结果中的作用。然而，许多现有的和实验性的癌症化疗方法都试图诱导肿瘤细胞凋亡。这里的数据表明，对p53激活或烷基化药物治疗的自噬反应可以促进肿瘤细胞抵抗凋亡的能力。这些研究确定CQ和相关化合物HCQ是可在体内使用的自噬抑制剂。

目前的数据表明，CQ可能是一种重要的辅助药物，可以在不增加毒性的情况下提高现有化疗策略的疗效。CQ与TAM或烷基化剂环磷酰胺的联合治疗不会对治疗动物产生额外毒性。这与几十年来CQ在疟疾预防患者中安全使用的事实是一致的(50)用于治疗风湿性关节炎，通常与甲氨蝶呤联合使用(51). CQ衍生物的化学结构允许它们作为弱碱，被困在酸性隔间中。由于糖酵解肿瘤的特点是比周围正常组织酸性更强(52)，与正常组织相比，CQ衍生物可以优先在肿瘤组织中积累，并在抑制肿瘤中的自噬方面显示出更大的功效。小鼠对CQ的系统给药剂量大致相当于用于治疗疟疾或类风湿关节炎的人类剂量，在20天内耐受性良好。尽管据报道，CQ除了能够抑制自噬外，还具有多种其他细胞效应，但低剂量CQ增强p53诱导的凋亡的能力取决于其对自噬的影响。同时自动液位计5shRNA独立地增强p53诱导的细胞死亡，当肿瘤细胞表达自动液位计5shRNA用低剂量CQ处理。然而，在高剂量（10μM或更大）下，CQ处理可能具有自噬无关效应（补充图1）。

尽管在最大耐受剂量下的CQ衍生物（如HCQ）可能达到接近10μM的血药浓度峰值，但在类风湿关节炎使用的标准剂量下，HCQ作为单一药物的许多药代动力学研究已确定稳态血药浓度在2–3μM范围内(53,54). 总之，这些数据为进一步研究包括CQ衍生物和全身化疗和/或放疗在内的联合方案提供了理论基础，以提高现有癌症治疗的疗效。数据表明，如果能与凋亡诱导剂结合使用，开发更特异的自噬抑制剂可能具有临床益处。

方法

肿瘤生成和组织分离。

所有实验均按照批准的动物安全协议进行。宾夕法尼亚大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准了这些实验的动物护理和使用。第53页TAM公司/第53页TAM公司小鼠由M.A.Christophorou、D.Martin-Zanca（美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所弗雷德里克癌症研究中心BRI-基础研究计划）和G.I.Evan创建。所有实验均使用从Jackson实验室获得的8至10周龄C57BL/6×129F1小鼠进行。骨髓细胞采集和骨髓衍生肿瘤的产生遵循了之前描述的方案(16). 在原发性肿瘤形成后，通过70μm尼龙网（BD Biosciences）传代在冰镇PBS中收集肿瘤细胞，并通过皮下注射到同基因小鼠的两侧进行体内扩增。为了进行组织分析，所有动物都被一氧化碳单独处死2窒息后立即采集组织。在冷冻的PBS中采集肿瘤。对于每个肿瘤，将肉眼可见的肿瘤组织切片固定在10%福尔马林中，用于制备石蜡包埋切片，并将戊二醛用于电子显微镜（见下文）。通过手动搅拌RIPA缓冲液中剩余的肿瘤组织，获得肿瘤细胞裂解物。

药物管理和肿瘤测量。

对于TAM治疗，通过超声波将激素粉末（Sigma-Aldrich）分散在花生油（Sigma-Aldrich）中，浓度为10 mg/ml。通过每天腹腔注射TAM，剂量为每只小鼠1 mg。CQ（Sigma-Aldrich）和HCQ（Spectrum Chemicals Ltd.）均溶解于PBS中并经静脉注射。对于体外研究，CQ溶解于PBS.hTAM（Sigma Aldrich。将环磷酰胺（Sigma-Aldrich）溶解在PBS中。在PBS（Sigma-Aldrich）中稀释丙酮酸甲酯。对于涉及体外MNNG处理细胞的实验，将细胞重悬于含有10%FBS和指定药物的RPMI中，并在37°C下孵育15分钟。如图所示，以适当剂量±CQ将细胞旋转下来，并用LPS和IL-7重新悬浮在新鲜培养基中。每天以这种方式重新处理细胞。每天使用卡尺测量肿瘤，并使用以下公式计算肿瘤体积：（mm三) =A类×B× [(A类+B)/2].A类和B分别是每个肿瘤的最大长度和宽度测量值。

细胞培养。

对于体外实验，1个初级Myc/p53ERTAM公司肿瘤在冷PBS中收获，肿瘤细胞通过70μm尼龙网（BD Biosciences）过滤，以分离大量肿瘤细胞。然后将细胞冷冻在等分试样中，以备将来进行实验。所有体外实验均在完全培养基中进行，该培养基由添加10%热灭活FBS（Gemini Bio-Products）、10 U/ml青霉素/链霉素和2 mM的RPMI 1640培养基（Invitrogen）组成我-谷氨酰胺（Invitrogen）。此外，每天添加10μg/ml脂多糖（Sigma-Aldrich）和0.2 ng/ml IL-7（研发系统）。对于所有体外实验，每天都要更换培养基、补充剂和药物治疗。使用Coulter Z2颗粒分析仪或台盼蓝排除法评估细胞数量。对于MTS分析，2×105在含有IL-7、LPS和指定药物治疗的RPMI培养基中，将细胞/孔镀在96个板中。24小时后，添加CellTiter 96水含量测定（Promega）中提供的MTS试剂，并根据制造商的建议分析结果。这个第53页+/+,第53页–/–,第53页+/+GFP-LC3型、和第53页–/–GFP-LC3型MEF细胞系在补充10%热灭活FBS（Gemini Bio-Products）、10 U/ml青霉素/链霉素和2 mM的DMEM培养基中传代我-谷氨酰胺（Invitrogen）。

免疫印迹。

培养细胞在RIPA缓冲液中溶解。通过手动搅拌肿瘤组织并在RIPA中溶解获得肿瘤裂解物。对裂解液进行蛋白质含量标准化，并在14%NuPAGE凝胶（Invitrogen）上通过SDS-PAGE进行解析。用抗裂解半胱天冬酶-3（兔单克隆抗体，1:000；细胞信号技术）抗体检测硝化纤维印迹；抗肌动蛋白（小鼠单克隆抗体，1:10000；Sigma-Aldrich）；和抗ATG5（兔多克隆抗体，1:2000；日本东京东京医科牙科大学北水岛分校赠送）。

自噬体和凋亡的电子显微镜定量。

立即用2.5%戊二醛/2%甲醛和0.1M碳酸钠将肿瘤组织固定，并在4°C下保存至包埋。细胞用2%四氧化锇固定；然后使用乙醇和环氧丙烷进行梯度脱水。然后将细胞嵌入LX-112培养基（Ladd）中，将切片切割成超薄（90 nm），放置在未涂层的铜网格上，并用0.2%柠檬酸铅和1%醋酸铀酰进行染色。使用80 kV的JEOL-1010电子显微镜（JEOL）检查图像。为了使用肿瘤组织的电子显微照片量化活细胞，获得了每个肿瘤中多个不同低倍视野的25个单个细胞的高倍显微照片（×12000–20000）。如果核膜和细胞质膜保持完整，则认为细胞是非凋亡的。对于凋亡细胞的定量，细胞质和细胞核起泡、染色质浓缩或凋亡小体的细胞被评为凋亡细胞。为了定量每个活细胞的自噬小泡，对每个非凋亡细胞的双膜小泡的数量进行评分。数据表示为平均值±标准偏差。

TUNEL染色和荧光成像。

按照制造商的说明，使用原位细胞死亡检测试剂盒TMR Red（Roche Diagnostics）对从肿瘤中采集的石蜡包埋组织进行TUNEL染色。DAPI复染用于量化细胞核完整的细胞。通过将TUNEL阳性细胞数除以DAPI阳性细胞核数，在×100倍放大下，计算每个肿瘤样本的4个视野中TUNEL阴性细胞的百分比。对于GFP-LC3荧光成像，Myc/p53ERTAM公司/GFP-LC3型,第53页+/+GFP-LC3型、和第53页–/–绿色荧光蛋白-LC3（见下文）将细胞暴露于指示的处理中，并在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，清洗3次，然后离心到载玻片上。DAPI复染用于鉴定细胞核完整的细胞。所有荧光成像均在尼康Eclipse E800荧光显微镜上以×100倍放大率进行数字捕获。

构建、逆转录病毒感染和RNA干扰。

将shRNA非靶向载体pLKO-puro（Sigma-Aldrich）的U6启动子和发夹序列克隆到TOPO pCR 2.1（Invitrogen）中，并将BamHI/SnaBI片段切除并克隆到pKD表达载体中以创建HC载体。两个不同的shRNA序列自动液位计5如前所述，生成（shATG5 h2，shATG5h7）并克隆到pKD表达载体（由pBABE-GFP构建）中(9). 质粒MIGR1/GFP-LC3通过克隆XhoI公司pEGFP-C1/LC3载体的GFP-LC3编码序列的5′位点（日本川崎市日本科学技术厅CREST的T.Yoshimori慷慨捐赠）。这个XhoI公司/限制酶包含GFP-LC3型将融合基因插入MIGR1的多克隆位点，生成MIGR1/GFP-LC3质粒。为了生产高滴度逆转录病毒，用逆转录病毒载体（5μg）和辅助DNA（2.5μg），使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）共转染293T细胞。使用以下逆转录病毒载体：MIGR1/GFP-LC3、pKD、pKD/HC、pKD/shATG5 h2和pKD/shATG5 h7。收集经调节的培养基，并通过0.45-μM过滤器进行过滤。然后用培养上清液转导Myc/p53ERTAM公司细胞，第53页+/+MEF，以及第53页–/–MEF公司。下一个，2×106细胞在含有MIGR1/GFP-LC3、pKD、pKD/HC、pKD/shATG5 h2或pKD/shATG5 h7的1 ml条件培养基中，加入8μg/ml溴化六甲菊酯（Polybrene；Sigma-Aldrich）。对于Myc/p53ERTAM公司在24孔板中以所指示的浓度加入细胞、新鲜IL-7和LPS。粘附细胞被感染并孵育4-5小时。对于悬浮细胞，培养板在1015旋转克在室温下培养1小时，然后在37°C下培养2小时。感染以这种方式重复3次。然后将细胞重新悬浮在适当的培养基中，并在培养基中扩增3天。将转导的细胞分选为GFP阳性细胞（MoFlo；细胞形成）并进一步培养。

统计。

使用双尾学生的平均值进行比较t吨测试。P（P）<0.05在所有计算中均被视为具有统计学意义。所有数据分析均使用GraphPad QuickCalcs版本1执行。

补充材料

补充数据：
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致谢

作者感谢Neelima Shah在电子显微镜方面的技术援助，感谢Qian-Chun Yu、Hongwei Yu和Yan Wang在组织加工方面的技术帮助。我们还要感谢汤普森实验室的成员，特别是罗兰·诺布劳赫、罗素·琼斯、莫妮卡·布扎伊和赵方平，他们进行了有益的讨论。NIH（R25-CA87812给R.K.Amaravadi；R01-CA 102709给D.Yu和A.Thomas-Tikhonenko；R01-CA104838-01A1给T.Bui和C.B.Thompson）和白血病和淋巴瘤学会（给J.J.Lum）提供了资助。

脚注

使用的非标准缩写： BECN1公司,贝克林1; CQ，氯喹；雌激素受体；h2，发夹2；h7，发夹7；HC，发夹控制；HCQ，羟基氯喹；hTAM，4-羟基他莫昔芬；LC3，酵母Atg8的哺乳动物同源物；MEF，小鼠胚胎成纤维细胞；MNNG，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍；短发夹RNA；TAM、他莫昔芬。

利益冲突：提交人声明不存在利益冲突。

本文引文： 临床杂志。投资。 117:326–336 (2007). doi:10.1172/JCI28833

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会