跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
《美国病理学杂志》。2006年10月；169(4): 1251–1269.
数字对象标识：10.2353年/月2006年06月60日
预防性维修识别码：项目经理1698853
PMID：17003483

低氧-脱氧大鼠原代肝细胞中低氧诱导因子和低氧诱导因素调节性羟化酶的过氧化物酶体定位

扎伊达·汗，*†† 乔治·米哈洛普洛斯，*†和唐娜·比尔·斯托兹†§
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

许多与病理生理学有关的信号受低氧诱导因子（HIF）控制，HIF是诱导低氧反应基因表达的转录因子。HIFs由一个O家族进行翻译后调节2-依赖性HIF羟化酶：四种脯氨酰4-羟化酶和一种天冬酰胺羟化酶。大多数这些酶在静息状态下的肝脏中含量丰富，而静息状态的肝脏由于其生理性O2梯度，它们可以存在于核池和细胞质池中。在本研究中，我们分析了在低氧-再氧条件下培养的原代大鼠肝细胞中内源性HIF及其调节性羟化酶的细胞定位。在肝细胞中，缺氧将HIF-1α靶向过氧化物酶体，而不是细胞核，在那里它与von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白和HIF羟化酶共同定位。共焦免疫荧光显微镜显示HIF羟化酶在缺氧时从细胞核转移到细胞质，在复氧时过氧化物酶体积累增加。这些结果通过免疫透射电镜和Western blotting证实。令人惊讶的是，在静息肝组织中，观察到HIF羟化酶的静脉周围定位，与低pO区域一致2总之，这些研究确定过氧化物酶体是肝细胞内源性HIF途径亚细胞定位和功能的高度相关位点。

氧稳态依赖于几乎所有生物体生存所需的高度保守机制。在大多数设置中，O2交付和消费随着代谢需求的增加而增加；然而，组织氧合的极端变化可能是有害的。哺乳动物细胞使用O2-感知和适应微环境波动的响应路径。这个普遍存在的系统涉及低氧诱导因子（HIF），即上调低氧反应基因表达的转录因子。HIF是转录因子的基本螺旋-环-螺旋Per-ARNT-Sim（bHLH-PAS）家族的成员，包括三个HIF-α亚基（HIF-1α、HIF-2α/EPAS1、HIF-3α/IPAS）和三个HIFβ亚基（HIF-1β/ARNT1、HIF-2β/ARNT2和HIF-3β/ARNT3）。HIF-α亚单位仅与HIF-β亚单位二聚。相反，HIF-β亚单位也可以与芳基烃受体二聚，与异种生物代谢相互作用。1

HIF-1α首先由Wang和Semenza鉴定，2它是研究O细胞机制的原型2感应。在常氧条件下，细胞溶质HIF-1α蛋白组成性表达，但由于翻译后羟基化而迅速降解。HIF-1α由一个含有天冬酰胺的反式激活（CTAD）结构域组成三和富含脯氨酸的氧依赖降解域，4这两者对HIF功能至关重要。这些结构域通过最近确定的非血红素HIF天冬酰胺和脯氨酰羟化酶进行酶修饰，这些酶是双加氧酶超家族的成员，其活性需要2-氧代叶酸（2-OG）、铁（II）、抗坏血酸，最重要的是分子O2.当O2HIF-脯氨酰4-羟化酶（PHD）在氧依赖性降解域中对关键脯氨酸进行了大量的羟基化（HIF-prolyl-4-hydroxylases被各种群称为PHD、EGLNs或HPHs。在本研究中，我们参考PHD命名法。PHD1/PHD2/PHD3分别相当于HPH3/HPH2/HPH1或EGLN2/EGLN1/EGLN3。）允许von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白（pvHL）标记HIF-1α以进行多泛素化和随后的蛋白酶体降解。5,6这种持续的周转导致HIF-1α在常氧条件下的半衰期非常短。7此外，常氧通过天冬酰胺羟化酶（抑制因子HIF-1（FIH-1））抑制HIF-1α转录活性，该因子作用于CTAD中的天冬酰胺残基，8为系统提供了又一个刹车。

因为他们需要O分子2，HIF羟化酶可以被视为主要O2细胞内的传感器，防止在有氧的情况下HIF依赖的异常转录2因此，当细胞经历缺氧应激时，HIF-1α的羟基化和降解受到抑制。9、10因此，HIF-1α稳定，在细胞质中积累，并转移到细胞核，在那里与组成性表达的核结合伙伴HIF-1β形成异二聚体。11交易激活后，12,13HIF-1异二聚体与靶基因启动子或增强子区的低氧反应元件、共有序列结合。14迄今为止，已经鉴定了70多个HIF诱导的基因，编码EPO、VEGF-A、iNOS、PAI-1、c-MET、IGFBP-1和所有糖酵解酶等适应性蛋白。15,16

因为它的生理O2梯度，肝脏是维持O2体内平衡对于其特殊功能至关重要。尽管在起源于肝癌细胞系的HIF方面进行了许多开创性工作，14人们对其在肝脏中的调节知之甚少。与其他器官不同，肝脏的大部分血液供应来自门静脉，门静脉携带O值较低的静脉血2紧张。慢性肝病或急性损伤（如缺血再灌注损伤）会进一步破坏这种梯度。哦2因此，在研究肝脏HIF途径时，分区是一个额外的考虑因素，并且已经描述了所有三个HIF-α亚单位的静脉周围mRNA表达。17虽然PHD1至PHD3在小鼠肝脏中高度表达，18HIF羟化酶在肝脏生理和病理学中的意义尚不清楚。为了更好地了解缺氧/复氧对内源性HIF途径的影响，我们研究了HIF及其调节性羟化酶在原代大鼠肝细胞中的亚细胞分布。我们发现，在肝细胞中，HIF-1α靶向过氧化物酶体而非细胞核，在那里它与vHL和HIF羟化酶共同定位。过氧化物酶体隔离可能为肝脏中的HIF信号提供额外的调节点。

材料和方法

材料

除非另有说明，否则所有化学品均来自西格玛（密苏里州圣路易斯）。抗体来源和条件概述于表1。

表1

本研究中使用的抗体和条件

蛋白质一级抗体稀释（来源和目录号）荧光二次抗体稀释（来源）
HIF-1α1:500 WB NB100-105；1:1000 IHC B100-131；NB100-123为1:100；所有Ms单抗（NO）Gt anti-Ms Cy3 1:1000（JA）
HIF-2αNB100-132 Ms单克隆抗体；1:100如果（否）Gt anti-Ms Cy3 1:1000（JA）
HIF-3α601-401-435 Rbt抗体；1:100如果（RO）Gt抗Rbt IgG Alexa 488 1:500（MO）
HIF-1βNB100-110 Rbt抗体；1:100如果（否）Gt抗Rbt IgG Alexa 488 1:500（MO）
第一阶段NB100-310 Rbt抗体；1:1000 WB，IHC；1:100 IF；1:50 TEM（否）Gt抗Rbt IgG Alexa 488 1:500（MO）
PHD2级NB100-138 Rbt抗体；1:1000 WB，IHC；1:200 IF；1:50 TEM（否）Gt抗Rbt IgG Alexa 488 1:500（MO）
第3阶段NB100-139 Rbt抗体；1:1000 WB，IHC；1:100 IF；1:50 TEM（否）Gt抗Rbt IgG Alexa 488 1:500（MO）
博士4NB100–295 Rbt抗体；1:100 WB，IF；1:1000国际卫生标准；1:50 TEM（否）Gt抗Rbt IgG Alexa 488 1:500（MO）
FIH-1型NB100-428 Rbt抗体；1:100 WB；1:1000国际卫生标准；1:200 IF；1:50 TEM（否）Gt抗Rbt IgG Alexa 488 1:500（MO）
VHL（甚高频）SC1535-R20 Gt抗体；1:100如果（SC）Dky抗Gt IgG Alexa 488 1:500（MO）
过氧化氢酶（过氧化物酶体）单抗女士；1:50 TEM（国际单位制）不适用
W90080C Shp pAb；1:1000 WB；1:200国际单项体育联合会（BI）Dky抗Shp IgG Cy3 1:200（JA）
PMP70（过氧化物酶体）ALX210205C100 Rbt抗体；1:500 WB（铝）不适用
Pan-actin（装载控制）单抗1501单抗；1:2000 WB（瑞士）不适用

Dky，驴；Gt，山羊；IF，免疫荧光；IHC、免疫组织化学；单克隆抗体；Ms，鼠标；pAb，多克隆抗体；Rbt，兔；Shp，绵羊；透射电镜、免疫透射电镜；WB、Western blotting；AL，Alexis Corp.，加利福尼亚州圣地亚哥；AM，阿默沙姆，乌普萨拉，瑞典；BI，生物设计国际，萨科，ME；CH，Chemicon，加利福尼亚州特梅库拉；NO，Novus Biologicals，科罗拉多州利特尔顿；JA，Jackson Immunoresearch，宾夕法尼亚州西格罗夫；MO，分子探针，尤金，俄勒冈州；RO，Rockland Immunochemicals，宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔；VE，Vector Laboratories，加利福尼亚州伯灵盖姆；SA，圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州圣克鲁斯；SI，Sigma，密苏里州圣路易斯

(表继续)

表1A

继续的

免疫-TEM稀释金结合二级抗体（来源）用于Western blotting稀释的HRP结合二级抗体（来源）免疫组织化学稀释生物素化二级抗体（来源）
不适用Dky抗Ms IgG 1:75000（JA）抗-Ms ImmPRESS试剂（VE）
不适用不适用不适用
不适用不适用不适用
不适用不适用不适用
Gt抗Rbt IgG 10-nm金1:25（AM）Dky抗Rbt IgG 1:75000（JA）Gt抗Rbt IgG 1:500（CH）
Gt抗Rbt IgG 10-nm金1:25（AM）Dky抗Rbt IgG 1:75000（JA）Gt抗Rbt IgG 1:500（CH）
Gt抗Rbt IgG 10-nm金1:25（AM）Dky抗Rbt IgG 1:75000（JA）Gt抗Rbt IgG 1:500（CH）
Gt抗Rbt IgG 10-nm金1:25（AM）Dky抗Rbt IgG 1:75000（JA）Gt抗Rbt IgG 1:500（CH）
Gt抗Rbt IgG 10-nm金1:25（AM）Dky抗Rbt IgG 1:75000（JA）Gt抗Rbt IgG 1:500（CH）
不适用不适用不适用
Gt抗-Ms 5-nm金1:25（AM）不适用不适用
不适用Dky抗Shp IgG 1:20000（JA）不适用
不适用Dky抗Rbt IgG 1:75000（JA）不适用
不适用Dky anti-Ms IgG 1:75000（JA）不适用

肝细胞培养

根据匹兹堡大学动物护理和使用委员会的指导原则对动物进行治疗。采用改良的两步胶原酶灌注技术从雄性Fisher 344大鼠（印第安纳波利斯州哈兰市）分离大鼠肝细胞。19、20将新鲜分离的存活率>90%的肝细胞（通过台盼蓝排除法评估）添加到平板培养基中（含有50μg/ml牛胰岛素和0.1%庆大霉素的最低必需培养基）。将肝细胞以3-4×10的密度放置在鼠尾胶原I涂层培养皿上6电池/100-mm塑料盘或1至2×105细胞/22-mm胶原蛋白涂层玻璃盖玻片（BD Biocoat，Bedford，MA），在37°C（5%CO）下培养2)，并在2-4小时后检查单层的粘附性。粘附后，将培养基改为无血清的基础肝细胞生长培养基（不含ITS、地塞米松或生长因子）。21第二天，在37°C的标准5%CO中培养常氧细胞6小时2湿化培养箱（贺利氏，阿什维尔，北卡罗来纳州），同时在37°C和1%氧气中培养平行组缺氧细胞6小时2ProOxC系统与5%CO平衡2/95%牛顿2（纽约州雷德菲尔德的Biospherex）。缺氧的程度和时间是根据HIF诱导转录的既定方案选择的。22将重复的低氧培养物放回常氧培养箱中隔夜（18小时）复氧。通过在低氧培养期间用200μm Hypoxyprobe-1 Plus（Chemicon，Temecula，CA）培养细胞，并随后检测吡美唑加合物，对低氧培养进行评估。23通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）活性和乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试验（加州山景城Biovision）证实细胞存活。24、25在指定的时间点，立即在冰上采集肝细胞以获取蛋白质或RNA，或将其固定在2%多聚甲醛中进行成像（如下所述）。

肝癌细胞系培养、移植和在体内肿瘤形成

先前冷冻储存的JM1 Fisher 344大鼠肝癌细胞26生长在含有Dulbecco改良Eagle培养基的T-75烧瓶中，该培养基补充有2 mmol/L葡萄糖、2 mmol/L我-谷氨酰胺、10%胎牛血清和0.1%庆大霉素。一旦汇合，JM1细胞被胰蛋白酶化并在Hanks的平衡盐溶液中洗涤。将300万个细胞移植到8至10周龄、180至200 g、雄性Fisher 344大鼠的每个肝脏中，方法是用26 gauge的针头通过外科手术注入肠系膜上静脉。阴性对照大鼠注射无细胞Hanks平衡盐溶液。同系移植2周和4周后，大鼠在处死前1小时腹腔内注射100 mg/kg剂量的Hypoxyprobe（盐酸吡莫硝唑）低氧标记物，溶解于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。然后采集肝脏，进行snap冷冻和/或组织学处理。福尔马林固定组织包埋在石蜡块中。共进行了两个系列，每个系列由三只大鼠组成：对照组（单独使用载体）、2周肝癌和4周肝癌。

免疫透射电镜（Immuno-TEM）

大鼠肝脏灌流固定，用2%多聚甲醛将培养的原代大鼠肝细胞固定在PBS中（细胞为1小时，组织为过夜），并按所述进行处理和分析。27在JEM 1210电子显微镜（JEOL，Peabody，MA）上观察切片，并使用底部安装的2k AMT数码相机（Advanced Microscopy Technologies，Danvers，MA）获得数字图像。

扫描激光共聚焦免疫荧光显微镜

将培养在I型胶原涂层盖玻片上的原代大鼠肝细胞置于冰上，并在含有1:200稀释的蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）的冷PBS中快速清洗，将其固定在PBS中2%的对甲醛中15分钟，然后按照所述进行处理。27背景的原始缺失阴性对照仅用抗体稀释液处理。HIF-1α和HIF-2α免疫荧光染色采用制造商推荐的改良方法进行（Novus Biologicals，Littleton，CO）。简而言之，细胞在4°C下用2%牛血清白蛋白/0.1%Triton X-100在PBS中渗透并隔夜封闭。随后用0.5%牛血清白蛋白在PBS进行标记。所有荧光标记均在Fluoview 1000共焦扫描显微镜上成像（奥林巴斯，梅尔维尔，纽约州）。在每个抗体标记实验中，成像条件保持在相同的设置下，使用阴性对照执行初始门控。

免疫组织化学

将福尔马林固定或锌固定肝组织的连续切片切割成5μm厚的Superfrost Plus玻璃载玻片（宾夕法尼亚州匹兹堡Fisher Scientific），并在65°C下热固定1小时。除Hypoxyprobe和HIF-1α外，所有免疫组化均根据制造商的方案使用Vectastain Elite ABC试剂盒进行（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories）。简言之，在切片脱蜡和再水化后，内源过氧化物酶活性在含有3%H的甲醇中猝灭20分钟2哦2在煮沸的10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中缓慢冷却，进行10分钟的抗原回收。在室温下用Blueblock（宾夕法尼亚州匹兹堡热电公司）阻断切片30分钟，然后在4°C下用一级抗体培养过夜。背景的原始缺失阴性对照仅用抗体稀释液处理。在室温下用亲和纯化的生物素化二级抗体孵育30分钟后，用ABC试剂处理切片，然后用二氨基联苯胺显色剂（Vector Laboratories）处理。使用小鼠ImmPRESS试剂（Vector Laboratories）进行HIF-1α染色。缺氧探针染色遵循制造商的方案（Chemicon）。所有切片均用苏木精复染，脱水，并盖上Cytoseal（Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI）。

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

在RNAzol B（Iso-Tex，Friendswod，TX）中裂解细胞，并使用RNeasy试剂盒和DNA酶处理纯化总RNA（Qiagen，Valencia，CA）。逆转录总RNA（500 ng），并使用Jumpstart ReadyMix用热启动PCR扩增得到的cDNA模板塔克聚合酶符合制造商的建议（Sigma）。引物对概述见表2在1.2%琼脂糖TBE凝胶上观察PCR产物，用溴化乙锭染色，并用AlphaImager软件（Alpha Innotech，San Leandro，CA）成像。

表2

本研究中使用的RT-PCR引物对

基因靶点接入号码（均为鼠）正向底漆（FP）/反向底漆（RP）大小（bp）
HIF-1αAF057308型5′-TGCTTGGTGCTGATTTGTGA-3′209
5′-GGTCAGATGATCAGAGTCCA-3′
HIF-2α注册号2778285′-TGACTTCACTCATCCTTGCGACCA-3′443
5′-ATTCATAGGCAGAGCGCAAGTA-3′
HIF-3α注册号2778275′-AAGAGGGTATCCCAGGCAACAGT-3′361
5′-TGTACGGAGCACACATCTCCAAGT-3′
HIF-1βU61184型5′-TGCACCAACACACGTGAAGAAC-3′915
5′-TGGTTGCTGATGTGGCTGAAC-3′
第一阶段NM_001004083号5′-AGCAACAGCACTACCATAGCAGT-3′755
5′-TGTGACACGGGTACTTGAACACCT-3′
PHD2级NM_1783445′-AAGATCACCTGGATCGAGCGAA-3′426
5′-TCGCTCGTCTGCATCGAAATACA-3′
第3阶段NM_0193715′-AGAGGCACCTTGAACCCTAACA-3′897
5′-TTGCTTGGAAGTCTGCATGGCTG-3′
FIH-1型XM_219961号5′-TGCAGCAAACTCAATGACACCG-3′821
5′-TCAAGAGAGAGTGTGAGAGAACCT-3′
VEGF-A全亚型纳米_0318365′-CTCACCAAGCAGCACACATA-3′160
5′-AAAATGCTTTCTCCGCTCTGA-3′
PAI-1型NM_0126205′-GACAATGGAAGAGCACATG-3′205
5′-ACCTCGATCTTTGACCTTTG-3′
ADM公司NM_0127155′-GGCAGCATTGAACAGTCG-3′223
5′-AAGGCAGTGGCTCAGACC-3′
GAPDH公司NM_017008号5′-CTCACTGGCATGGCCTCCG-3′200
5′-ACCACTCTGTGTAGCC-3′
β-肌动蛋白BC063166号5′-GAGCTATGGAGCTGCCTGACG-3′361
5′-AGCACTTGCGGTCCACGATG-3′

核提取物的制备

对于HIF-Western分析，如前所述，从快速冷冻的大鼠肝组织和在5×100mm胶原包被板上培养的原代肝细胞中提取核蛋白28; 然而，低渗缓冲液中没有牛奶。

膜富集组分的制备

将培养在5×100-mm平板上的肝细胞清洗并刮入10ml冰镇等渗隔离缓冲液[0.1 mmol/L乙二胺四乙酸，250 mmol/L蔗糖，4%PEG-6000，5μmol/L MES（pH 7.4），加上新鲜的1:100蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）]中，再悬浮在2ml隔离缓冲液中，并通过冰上的氮气空化（600 psi/15分钟；伊利诺伊州莫林市帕尔炸弹）进行溶解。27以10000×克分离细胞核部分（颗粒）和细胞溶质/膜部分（上清液）。超速离心后（10分钟，100000×克Beckman Airfuge，A-100转子；Beckman Coulter，Fullerton，CA）在富含细胞器的膜组分中获得了上清液完整过氧化物酶体，细胞质蛋白保留在细胞溶质组分中。将膜部分溶解在1%十二烷基硫酸钠中。所有馏分在使用前均储存在−80°C下。通过过氧化物酶体膜蛋白PMP70的Western blotting证实了膜中完整过氧化物酶体的分离。

西方印迹法

蛋白质浓度通过BCA分析测定（Pierce，Rockford，IL），20至50μg蛋白质在2×Laemmli缓冲液中加热至65°C，并在10%或12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离。29在电转移到Immobilon聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，MA）上后，用Ponceau S对蛋白带进行可逆染色，以确认完全转移。在含有5%脱脂奶粉的吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水中封闭膜1小时，然后在4°C下用1%或5%脱脂牛奶/TBST中稀释的初级抗体孵育过夜。将膜洗涤，并在室温下与在1%脱脂奶粉/TBST中稀释的辣根过氧化物酶偶联的第二抗体孵育1.5小时。在几次TBST洗涤后，将膜与Supersignal West Pico增强化学发光孵育，并暴露于CL Xpose膜（Pierce）。对于设计用于最大灵敏度的Western blot，将三种小鼠抗HIF-1α单克隆抗体（NB100-131、NB100-123、NB100-105；Novus）组合在一起，并在含有50至100μg核提取物的Westernblot上以1:500的比例使用。

HIF-1α酶联免疫吸附试验（ELISA）

为了确保样品的盐和洗涤剂浓度与基于ELISA的转录因子分析相兼容，使用试剂盒附带的缓冲液制备核提取物变速箱-根据制造商的方案（Active Motif，Carlsbad，CA）使用用于HIF-1αDNA结合的AM ELISA。30

结果

大鼠原代肝细胞缺氧培养的建立

为了研究低氧再氧对肝细胞内源性HIF蛋白的影响，我们首先对我们的在体外培养体系。我们分离并电镀原代大鼠肝细胞，使其粘附并平衡过夜（18小时）。第二天，我们在6小时常氧（对照）、6小时缺氧（1%氧）条件下培养它们2)或6小时缺氧，然后隔夜（18小时）复氧。为了初步确认我们的肝细胞确实缺氧，我们使用了缺氧标记物吡曼尼唑（图1A）是一种氮杂环药物，其通过细胞硝基还原酶的低氧依赖性激活导致细胞大分子和药物本身之间形成共价的胞内加合物。23如中所示图1A，缺氧细胞确实对加合物进行了染色，随后显示细胞核（Hoechst）和F-actin（指骨样蛋白）染色的图像证实了缺氧培养后细胞是活的。我们还定期评估肝细胞活性，并发现与正常毒性对照组相比，低氧培养组的存活率（MTT试验）为～73.7%，细胞毒性（LDH试验）为约20.6%（图1B）.通过RT-PCR对基因表达的分析进一步证实了HIF靶基因的低氧诱导PAI-1型，肾上腺髓质素、和血管内皮生长因子-A但不是家政基因GAPDH公司 （图1C）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh010067012001.jpg

建立缺氧培养物。原代大鼠肝细胞在常氧（对照）或缺氧（1%O2)持续6小时。将平行低氧培养物放回常氧培养箱进行18小时复氧。答：缺氧6小时后，对肝细胞中的吡美哒唑加合物（绿色，FITC-偶联一级抗体）进行共焦免疫荧光检测，证实缺氧孵育。B类：MTT和LDH活性评估的代表性数据显示为常氧控制的百分比。抄送：RT-PCR显示已知HIF靶基因上调，PAI-1型，肾上腺髓质素、和血管内皮生长因子-A亚型，表明肝细胞存在典型的缺氧反应。比例尺=5μm。

低氧不诱导HIF-1α在原代大鼠肝细胞中的核定位

在评估缺氧培养条件后，我们接下来试图从HIF-1α开始，研究内源性HIF在原代大鼠肝细胞中的表达。有趣的是，尽管我们观察到高强度聚焦-通过RT-PCR检测1α（图2A），我们无法通过成像或Western blotting检测缺氧原代大鼠肝细胞中HIF-1α蛋白的核诱导（图2、B和C）。我们使用原代大鼠肝细胞和JM1细胞的平行培养物重复了我们的实验，JM1细胞是一种来源于Fisher 344大鼠肝细胞核的同基因大鼠肝癌细胞系。26即使使用相同的实验条件进行分析，我们也只能在JM1细胞中检测到核HIF-1α，而不能检测到肝细胞。如中所示图2、B和C共聚焦免疫荧光和最大灵敏度Western blots均观察到肝细胞中无核HIF-1α。基于ELISA的DNA结合试验也证实了肝细胞缺乏HIF-1α反应性（图2D）此外，当JM1细胞重新导入正常Fisher 344大鼠肝脏时，产生的肿瘤包含许多缺氧区域（图3，A–C）肿瘤细胞在这些区域高表达核HIF-1α；然而，正常邻近的受压肝脏仅含胞质HIF-1α染色（图3、D和E）这表明对肝脏的过度慢性缺氧损伤不足以诱导肝细胞核HIF-1α。综合起来，结果是图1至3提供证据表明，虽然肝细胞确实对缺氧有反应，但HIF-1α对这种适应的作用可能是轻微的或暂时的。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120002.jpg

原代大鼠肝细胞中无核HIF-1α诱导。原代大鼠肝细胞在常氧（对照）或缺氧（1%O2)在6小时的条件下。将平行的低氧培养物放回常氧培养箱中进行18小时的复氧。答：RT-PCR显示肝细胞培养物中HIF-1α、HIF-2α、HIF3α和HIF-1β的表达。B类：核提取物的最大敏感性Western blot显示，与JM1肿瘤细胞相比，原代肝细胞中缺乏HIF-1α诱导。在正常大鼠肝脏（NRL）组织和JM1肿瘤组织核提取物中观察到类似的模式。抄送：共聚焦免疫荧光扫描图像显示缺氧时HIF-1α在同基因JM1大鼠肝癌细胞中的核定位，但在原代大鼠肝细胞中没有。比例尺=10μm。医生：通过转录因子ELISA评估HIF-1αDNA结合，进一步证实正常肝细胞核提取物中缺乏HIF-1β活化。相反，JM1肝癌细胞在相同的缺氧条件下确实表现出HIF-1α激活。阳性对照为CoCl2-进一步的内部控制是通过添加过量野生型（WT）寡核苷酸竞争性抑制HIF-1α结合，而添加过量突变型（MUT）寡核苷酸则无影响。这些结果，连同图1和图2表明尽管肝细胞确实对缺氧有反应，但HIF-1α对这种反应的贡献可能很小或很短暂。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120003.jpg

同基因大鼠肝癌缺氧区域的比较。将JM1 Fisher 344大鼠肝癌细胞移植到同系大鼠肝脏。肿瘤形成4周后，大鼠腹腔内注射Hypoxyprobe标记物，并进行吡美哒唑加合物的免疫染色(A–C).答：肿瘤和受压正常邻近（宿主）肝脏中缺氧区域免疫组织化学定位的低倍显微照片。正常邻近肝脏显示从静脉周围区域发出的缺氧探针梯度，而门静脉周围没有显示标记。B类：低氧原阳性肿瘤细胞勾勒出肿瘤坏死区（N）。C： 低氧原阳性宿主肝脏（介于箭头)被双侧延伸的肿瘤压迫。医生：HIF-1α阳性核(箭头)肿瘤细胞围绕坏死中心（N），对应于B类。电子邮箱：肿瘤邻近肝细胞中HIF-1α核标记缺失（介于箭头)尽管在缺氧区域受到压迫(C类). 在这些肝细胞中，所有标记均为细胞质。原始放大倍数，×100。

HIF-1α在原代大鼠肝细胞中定位于过氧化物酶体

如所示图2C尽管HIF-1α在缺氧时不会转移到肝细胞核，但胞浆中HIF-1β似乎增加。鉴于我们的意外发现，我们决定进一步解剖缺氧肝细胞中HIF-1α的点状细胞质标记。共焦免疫荧光（图4A）发现缺氧后复氧肝细胞中内源性HIF-1α（绿色）和过氧化物酶体膜蛋白PMP70（红色）共存（黄色）。α表达载体和IGFBP-1报告基因构建体共转染的原代大鼠肝细胞中，HIF-1α，31接下来，我们决定比较其他内源性HIF转录因子在缺氧反应中的分布模式。与HIF-1α相比，我们确实观察到肝细胞中HIF-2α的核诱导，但这只是在复氧实验之后（图4B）HIF-2α（绿色）与核HIF-1β（红色）共定位（黄色），HIF-α的组成核结合伙伴。细胞质HIF-2α也有增加，但这并非与过氧化物酶体共定位（数据未显示）。有趣的是，在正常氧（对照）肝细胞的细胞核中观察到HIF-3α（绿色）的基本水平，并且在缺氧时HIF-3β从细胞核中移出（图4C）与HIF-2α不同，HIF-3α与过氧化物酶体酶过氧化氢酶（红色）共定位（黄色），表明与HIF-1α类似的靶向机制。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120004.jpg

原代大鼠肝细胞内源性HIF的亚细胞定位。原代大鼠肝细胞在常氧（对照）或缺氧（1%O2)持续6小时。将平行的低氧培养物放回常氧培养箱中进行18小时的复氧。答：共焦激光扫描免疫荧光显微镜显示HIF-1α（绿色）与过氧化物酶体膜标记物PMP-70（红色）在复氧后共定位（黄色）。注意过氧化物酶体的环状红色轮廓。肝细胞皮层下膜细胞骨架被Alexa Fluor 647指骨样蛋白（蓝色）标记，HIF-1α（绿色）通常也共同定位于这些位点。B：与HIF-1α不同，低氧再氧导致HIF-2α（绿色）的核诱导，其与组成的HIF-1β（红色）共定位（黄色）。抄送：正常肝细胞中观察到核HIF-3α（绿色），缺氧再氧化导致过氧化物酶体中过氧化氢酶（红色）的共同定位。N、 核心。比例尺=5μm。插图显示在×2大面板上。

HIF羟化酶在静息肝脏中定位于过氧化物酶体

由于与HIF转录因子相比，对HIF调节性羟化酶的了解要少得多，我们决定扩大我们的研究范围，以包括HIF羟化酶在完整大鼠和人类肝脏中的亚细胞分布。如中所示图5APHD4在中央静脉周围呈带状分布，这种带状模式与其他HIF羟化酶类似。这是令人惊讶的，因为静脉周围肝细胞暴露于最低的pO2沿着肝脏的生理O2梯度，使该区域不太适合HIF羟化酶活性。高倍镜下，我们发现在静脉周围区域，HIF羟化酶定位于一些肝细胞核；然而，细胞质中也有强烈的点状标记（图5、B和C）鉴于以往关于正常组织尤其是肝脏内源性HIF羟化酶的报道很少，这些发现很有意思。接下来，我们进行了额外的高分辨率研究，以确定静息状态下大鼠肝脏内源性HIF羟化酶的亚细胞定位。肝细胞细胞质中HIF羟化酶的颗粒池包含在特定的细胞器中。PHD2和PHD3定位于线粒体和过氧化物酶体（图5D）.如免疫透射电镜所示图5E，PHD2共同定位于过氧化物酶体中，过氧化物酶由过氧化氢酶和可识别的尿酸氧化酶晶核鉴定。虽然之前已经描述过瞬时转染PHD3（SM20）在大鼠交感神经元中的定位，32从未报道过任何已知的HIF羟化酶的过氧化物酶体定位。有趣的是，与其他HIF羟化酶不同，PHD1也定位于肝细胞的胆管膜（参见图7).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120005.jpg

静息肝脏内源性HIF羟化酶的亚细胞定位。这里显示的是观察到的定位模式的代表性图像。A–C：静脉周围(沉重的箭)PHD4在大鼠肝脏中的梯度分布，保留门脉周围区域(轻箭头). 点状标签(箭头)在大鼠肝静脉周围肝细胞中观察到PHD3(B类)和人肝脏中的PHD2(C类)（CV，中央静脉）。医生：免疫电镜显示大鼠肝脏过氧化物酶体（P）和线粒体（M）中的PHD3（10-nm金）。电子邮箱：大鼠肝脏中的PHD2用10-nm金颗粒标记，过氧化物酶体通过过氧化氢酶（5-nm金颗粒）和尿酸氧化酶晶核鉴定。比例尺：500μm(A类); 100微米(B类，C类); 100纳米(D类，E类).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120007.jpg

内源性PHD1在肝细胞中的亚细胞定位。答：PHD1在肝细胞细胞质内呈点状染色，并集中在胆管周围(箭头)静止的人类肝脏。B类：免疫电镜显示PHD1定位(箭头)靠近大鼠肝脏胆道膜（M，线粒体）。抄送：小管膜上也观察到PHD1信号(箭头)培养的正常大鼠原代肝细胞。医生：共焦免疫荧光显微镜观察过氧化氢酶（红色）和PHD1（绿色）标记的细胞。和其他HIF羟化酶一样，低氧再氧化导致PHD1可逆的核-细胞质易位。在这些治疗条件下，还观察到过氧化物酶体共定位增加（黄色，见插图）；然而，与其他HIF羟化酶不同，PHD1也定位于肝细胞膜(箭头)，N，核。插图表示大面板的×2放大倍数。比例尺：10μm(A类); 500纳米(B类); 5微米(C类，D类).

HIF羟化酶在原代大鼠肝细胞中的表达

为了研究缺氧-复氧对肝细胞中HIF羟化酶的影响，我们再次使用在体外培养体系。我们利用可用的大鼠序列，通过RT-PCR分析HIF羟化酶的基因表达，PHD1–3级和FIH-1型在我们的肝细胞培养物中发现第3阶段但不是PHD2级缺氧6小时（图6）。这与其他人之前的报告相比PHD2级和第3阶段都是低氧诱导基因；然而，这些发现是基于更长的缺氧潜伏期（18小时）。33

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120006.jpg

肝细胞培养中HIF羟化酶转录物的表达。原代大鼠肝细胞在常氧（对照）或缺氧（1%O2)在6小时的条件下。将平行的低氧培养物放回常氧培养箱中进行18小时的复氧。HIF羟化酶总RNA的RT-PCR分析表明肝细胞中转录物的组成性表达。第3阶段低氧使表达上调，与已发表的报道一致。使用人进行重复分析PHD4型引物不令人满意，大鼠序列博士4在实验时不可用。

缺氧诱导培养肝细胞HIF羟化酶的核质转移和过氧化物酶体分离

我们接下来使用了我们的在体外缺氧再氧模型，进一步表征培养肝细胞亚细胞定位和HIF羟化酶的动态关系。如中所示图7扫描激光共聚焦免疫荧光显微镜分析显示，缺氧时内源性PHD1（绿色）从细胞核转移到细胞质，这种穿梭在复氧时发生逆转。随着细胞核PHD1的减少，更多的PHD1与肝细胞膜相关，过氧化物酶体中PHD1和过氧化氢酶的共定位（黄色）增加。尽管核PHD1通过复氧恢复，但过氧化物酶体似乎仍能隔离相当一部分PHD1。图8，A–D，显示了PHD2到PHD4和FIH-1的类似结果；然而，只有PHD1定位于胆管（图7）过氧化物酶体池存在于常氧状态，但随着缺氧再氧增加而增加。即使在PHD4中也观察到了这一发现（图8C），这是在这些肝细胞培养物中表达最少的HIF羟化酶，表明在这些家族成员中存在常见的螯合事件。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120008.jpg

培养大鼠肝细胞内源性HIF羟化酶的亚细胞定位。原代大鼠肝细胞在常氧（对照）或6小时低氧（1%O2)条件。将平行低氧培养物放回常氧培养箱进行18小时复氧。共焦免疫荧光显微镜用于观察过氧化氢酶标记的细胞（红色）和指示的HIF羟化酶（绿色）。一般来说，缺氧再氧导致过氧化物酶体共同定位增加（黄色，见插入); 然而，每个羟化酶都有不同的表达水平。答：PHD2；B类：PHD3；抄送：PHD4；医生：FIH-1（N，细胞核）。插图表示从大面板放大2倍。比例尺=5μm。

免疫透射电镜和蛋白质分析证实HIF羟化酶在培养肝细胞中的过氧化定位

为了验证我们的显微镜观察结果，我们开始了对原代大鼠肝细胞的额外研究。培养的缺氧肝细胞的免疫电镜证实过氧化物酶体中存在PHD2，通过过氧化氢酶和尿酸氧化酶晶核鉴定（图9A）这也适用于其他HIF羟化酶，PHD4的标记量最小。如PHD3所示（图9B）与这些细胞中的过氧化物酶体相比，细胞核中明显缺乏这种蛋白质。接下来，我们在等渗缓冲液中对肝细胞进行亚细胞分离，以获得含有富含细胞器的膜组分的重颗粒。从培养的大鼠肝细胞分离的膜组分的免疫印迹进一步证实了过氧化物酶体组分中存在PHD1到PHD3和FIH-1（图9C）低氧再氧化也改变了一些HIF羟化酶的大小，表明翻译后修饰或存在其他亚型。例如，我们观察到核PHD1双链体快速迁移物种的减少，其他人也曾对此进行过描述。34,35

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120009.jpg

肝细胞内源性HIF羟化酶的过氧化物酶体定位。A类和B类：缺氧6小时大鼠原代肝细胞的免疫电镜观察。PHD2级(A类)和PHD3(B类)用10-nm金颗粒标记，而过氧化物酶体由过氧化氢酶（5-nm金颗粒）和尿酸氧化酶晶核识别(星号). N、 核心。抄送：在等渗缓冲液中的肝细胞亚细胞分级用于在富含细胞器的膜部分中获得核部分和完整的过氧化物酶体。Western blot显示HIF羟化酶在原代大鼠肝细胞核和膜部分的定位。PHD蛋白在不同条件和组分下表现出明显的亚型，尽管其重要性尚不清楚。经Western blot检测，两个组分中均未检测到PHD4。COS-7细胞核提取物作为每个蛋白的阳性对照。PMP-70 Western blot证实在膜组分中分离出完整的过氧化物酶体，在核组分中没有污染细胞膜。比例尺=50 nm。

缺氧复氧导致vHL的过氧化物酶体定位

在确定过氧化物酶体中存在HIF-1α和PHD后，我们接下来研究已知与HIF-1β转运相关的vHL是否也存在于此处。作为E3泛素连接酶多蛋白复合物（伸长素B和C、cullin2、环盒1）的底物识别单元，pvHL标记羟基化HIF-1α，用于26s蛋白体的多泛素化和降解。5,6如中所示图10vHL确实与HIF-1α和过氧化氢酶共同定位在过氧化物酶体中。这些发现可能表明HIF-1α穿梭到过氧化物酶体和HIF羟基化之间存在潜在联系。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjh0100670120010.jpg

vHL与HIF-1α的过氧化物酶体共定位。原代大鼠肝细胞在常氧（对照）或缺氧（1%O2)在6小时的条件下。将平行的低氧培养物放回常氧培养箱中隔夜复氧。共焦扫描激光免疫荧光显微镜显示过氧化物酶体共定位（淡黄色，箭头显示了HIF-1α（蓝色）、过氧化氢酶（红色）和VHL（绿色）在缺氧再氧肝细胞中的几个例子。N、 核心。比例尺=5μm。

讨论

我们的原代大鼠肝细胞培养中内源性HIFs和HIF调节羟化酶的亚细胞定位模式总结如下表3有趣的是，尽管我们观察到HIF-1型α通过RT-PCR（图2A）HIF靶基因的上调（图1C），我们无法通过成像、高灵敏度Western blot或ELISA检测缺氧原代大鼠肝细胞中HIF-1α蛋白的核诱导（图2）这可能是因为HIF-α在肝细胞中占优势，因为HIF-2α在缺氧再氧后确实移位到细胞核。此外，核HIF-3α在正常毒性肝细胞中的作用尚不清楚，因为已知存在几种剪接变体，包括可能作为诱饵（如IPAS）的剪接变体对其他HIF-α亚单位起负调控作用。36最近研究表明，HIF-2α和HIF-3α是转染原代大鼠肝细胞低氧诱导IGFBP-1转录的主要激活剂。31HIF-1α在肝细胞中的次要作用可能是因为它在缺氧时转移到过氧化物酶体而不是细胞核。这种过氧化物酶体输入伴随（或可能促进）HIF调节性羟化酶和vHL在低氧再氧化中的作用。

表3

原代大鼠肝细胞HIF通路内源性成员共焦免疫定位研究综述

蛋白质处理情况
本地化评论
诺莫西娅缺氧复氧
HIF-1α膜膜细胞质•复氧中的过氧化物酶体
•不在核心
HIF-2α细胞质细胞质细胞核细胞质•不在过氧化物酶体中
HIF-3α细胞核细胞质细胞质细胞核细胞质•过氧化物酶体
•缺氧时留下细胞核
HIF-1β核核核•组织
第一阶段核细胞质膜核质膜•过氧化物酶体
•胆管
PHD2级细胞核细胞质细胞质细胞核细胞质•缺氧时的过氧化物酶体
•一些线粒体
第3阶段细胞核细胞质细胞核细胞质细胞核细胞质•过氧化物酶体
•一些线粒体
博士4细胞核细胞质细胞核细胞质细胞核细胞质•过氧化物酶体
•最低丰度
•非常新颖的酶
FIH-1型细胞核细胞质细胞核细胞质细胞核细胞质•过氧化物酶体
VHL（甚高频）细胞质细胞质细胞质•过氧化物酶体
•不在核心

鉴于Groulx和Lee对肝细胞中vHL的观察非常有趣37在HeLa细胞中发现vHL参与不受pO影响的组成性核-细胞质穿梭2或核HIF-α底物水平。过氧化物酶体靶向序列PTS1和PTS2是参与过氧化物酶导入的共识序列，它们分别被过氧化物体导入受体Pex5和Pex7识别。38在对vHL的一级序列进行更仔细的研究后，我们在分子中间的N末端确定了一个潜在的100%典型PTS2导入序列，使该PTS位点成为我们比较的蛋白质序列中最具潜在活性的位点。此外，即使一个蛋白质的序列与典型的PTS位点不是100%相同，也描述了其他酶以具有类似但非传统PTS序列的过氧化物酶体为靶点；其中包括乙酰乙酰辅酶A硫酶，39丙氨酸：乙醛转氨酶，40异戊烯基二磷酸二甲基烯丙基二磷酸异构酶，41和iNOS。27,42事实上，缺乏PTS基序的超大蛋白寡聚体已被证明依附于其他传统过氧化物酶体蛋白，并以其固有的三维结构进入过氧化物酶基质。43具体来说，vHL的主要疏水β-结构域包含两个关键的亲水残基（His-115和Ser-111），它们必须与羟脯氨酸或H氢键2O分子。44、45理论上，vHL可以在与HIF-1α及其相关的HIF羟化酶络合时进入过氧化物酶体，而羟基化HIF-1β可能是它们之间的中间产物。由于实现原代肝细胞培养物的高效转染可能是一项挑战，因此在肝脏特异性vHL-null细胞中进行额外的实验46将为这些蛋白质的过氧化物酶体输入提供进一步线索。

我们的发现的意义可以进一步推断到肝脏的微环境，肝细胞和邻近细胞暴露在O的生理梯度下2以及来自门脉循环的其他营养物质。门静脉不仅对肝脏的低氧供血有显著贡献，而且pO也下降了约50%2沿着窦向中央静脉的方向，从60-65毫米汞柱（传入）到30-35毫米汞珠（传出）。47由于基础HIF-1α是组成性表达但迅速降解的，因此必须存在一种机制来平衡细胞对缺氧损伤的快速反应，同时在不需要时保持HIF-1β的核水平。核HIF羟化酶被认为参与调节HIF-1α的转换和活性，因为HIF-1β的降解可以在细胞核和细胞质中以相同的半衰期发生。48这表明，与p53不同，p53必须在降解前退出细胞核，核和细胞质蛋白酶体都完全有能力降解O中的HIF-1α2-依赖性方式，从而阻止甚至正在进行的HIF转录活动。此外，在体外酶动力学分析发现，PHD2和PHD3具有最高的脯氨酰羟基化活性，49这表明这些酶在静息肝脏中的强劲表达将抵消人们预期在静脉周围肝细胞中发现的HIF-1α活性。HIF-1α活性的缺乏与成人肾脏等器官形成对比，成人肾脏是一种重要的生理性O2传感器，通过增加EPO的生成，快速适应全身缺氧。50

一般来说，PHD可以在缺氧时从肝细胞核穿梭到细胞质。在复氧过程中，过氧化物酶体中存在大量内源性HIF羟化酶，这是一项新发现。与HIF相比，HIF羟化酶的亚细胞定位仅针对转染过表达每个酶的细胞系。PHD3同源物SM20的线粒体定位，32我们还观察到肝细胞中的一些线粒体定位（图5D）在瞬时转染人HIF羟化酶-GFP融合蛋白的U2OS细胞中，PHD1定位完全为细胞核，PHD2和FIH-1主要为细胞质，PHD3均匀分布于细胞核和细胞质之间。51相反，COS-1细胞转染显示PHD1到PHD3和FIH-1的细胞核和细胞质分布。52当FLAG标记的PHD4瞬时转染COS-7细胞时，它排除了细胞核并定位于内质网，尽管在其肽序列中没有发现一致的ER保留信号。53这些开创性实验可能有助于预测HIF羟化酶在不同细胞类型中的不同功能；然而，它们只会增加这些O的方式和位置的复杂性2-依赖性羟化酶被穿梭以应对缺氧。迄今为止，关于内源性HIF羟化酶在原代细胞中亚细胞定位的详细分析尚未发表。

在本研究中，我们确定了HIF-1α、vHL和HIF调节性羟化酶亚细胞定位的动态变化，所有这些都共同定位于肝细胞中的过氧化物酶体。问题在于，这些酶在过氧化物酶体中隔离的同时，是否积极地将关键脯氨酸残基羟基化。在发现HIF调节之前，胶原蛋白是唯一已知的含羟脯氨酸的蛋白质。与作用于三肽X-pro-gly的胶原脯氨酰4-羟化酶不同，HIF PHD需要更长（~19mer）的最小HIF衍生肽才能获得最佳活性。54此外，每个PHD可能优先羟基化HIF-1α氧依赖性降解域中的一个或两个脯氨酸残基，这表明其对急性和慢性适应具有特殊作用。54有趣的是，一个简短但不断增长的O列表正在出现2-PHD和FIH-1对非HIF蛋白的依赖性羟化，如RNA聚合酶II的大亚基（Rbp1）。55尽管PHD高度保守且普遍表达，但也有证据表明存在选择性剪接，一些变体不再能够使HIF-α羟基化。54这些亚型可能代表在蛋白质印迹中观察到的各种大小的PHD（图9C）一般来说，过氧化物酶体和胆管中存在大量羟化酶，在胆管膜周围观察到PHD1。虽然我们在肝细胞中观察到HIF-1α的过氧化物酶体池，但我们不确定过氧化物酶中的任何HIF羟化酶是否仍然保持活性，如果是，它们的潜在底物可能是什么。在iNOS的情况下，iNOS是肝细胞中的一种非常规过氧化物蛋白酶，过氧化物酶体中隔离的iNOS部分是一种不活跃的单体，可能保护细胞免受无能酶的伤害。42另一方面，植酸Co-A羟化酶是一种经典的含PTS2的酶，如果有缺陷，会导致Refsum病。56植酸Co-A羟化酶不仅在过氧化物酶体中具有活性，而且实际上是同一O的成员2-，铁2+-和2-氧黄嘌呤依赖性加氧酶家族作为HIF羟化酶；因此，过氧化物酶体内可能存在一种含有PHD和FIH-1活性所必需的辅因子的介质。57对现有测定羟化HIF肽的生化技术的改进在体外为检测完整过氧化物酶体中HIF羟化酶的酶活性提供了一种替代方法。

这个在体外低氧再氧模型改变氧饱和度2HIF羟化酶功能所必需的可用性。将HIF羟化酶靶向其他细胞器的潜在机制可能涉及氧再定向假说，58这表明线粒体呼吸的抑制可能导致O的亚细胞重定向2从线粒体到非呼吸性O2-独立隔间。在肝细胞中，过氧化物酶体代表一个这样的隔室，占总细胞体积的～1%，但消耗高达30%的O2在静止的肝脏中。59线粒体呼吸抑制剂（如NO）已被证明在缺氧时由于亚细胞O2从线粒体转向PHD。60,61最近的一项研究62已经表明HIF-1α可以积极下调线粒体O2通过抑制细胞系中的TCA循环来消耗。这导致对缺氧的适应，因为线粒体O2再分配导致细胞内O的相对增加2浓度和可用性。HIF-1α对线粒体的作用是功能性的，而非结构性的，慢性缺氧时可观察到细胞死亡减少。其他研究小组也将TCA循环作为细胞适应缺氧的代谢开关，因为TCA循环产生PHD辅因子2-OG等中间产物。63,64

总之，我们在肝细胞中发现了一种意外的亚细胞分布途径，以应对缺氧和复氧，其中HIF-1α和O2-传感羟化酶，它们通过羟化酶被调节并全部穿梭到过氧化物酶体，使得HIF-1α的核诱导是不可检测的。更详细地阐明这种隔离的分子机制，并精确地确定vHL或其他载体蛋白在这些条件下在肝细胞中的功能，将是一件有趣的事情。还应进一步考虑所需HIF羟化酶辅因子（Fe）的影响2+，2-OG，抗坏血酸），以及葡萄糖本身，因为与O类似2后者也分布在肝脏的梯度上。最后，体内与缺血再灌注模型的相关性可能为HIF调节羟化酶在肝损伤中如何改变提供新的见解。总之，我们的结果表明O的调节存在一个新的位点2-肝细胞中依赖性HIF途径，并且它们扩展了过氧化物酶体作为O的作用2在肝脏的氧化还原微环境中沉积。

致谢

我们感谢我们的同事William Bowen、Mark Ross、Fengli Guo博士、Mara Sullivan、Patricia Loughran博士、Lindsay Barua、Aimee Katsigrelos、Srey Gast和James Shray，感谢他们提供了卓越而慷慨的技术援助和关键而有益的讨论；Stephen Strom医生负责人体肝组织。

脚注

向Donna B.Stolz博士，匹兹堡大学医学院细胞生物学和生理学系，200 Lothrop St.，BST S-221，Pittsburgh，PA 15261发送转载请求。.ude.ttip@zlotsd：liam-E

由国家卫生研究院资助（向Z.K.授予PHS1T32EB001026，向D.B.S.授予CA76541，向G.K.M.授予CA35373和CA103958）。

工具书类

  • Chan WK，Yao G，Gu YZ，Bradfield CA。芳香烃受体和缺氧诱导因子信号通路之间的交叉对话。竞争和补偿的证明。生物化学杂志。1999;274:12115–12123.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang GL，Semenza GL。低氧诱导因子1在低氧转录反应中的一般参与。美国国家科学院程序。1993;90:4304–4308. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 姜博华，郑建中，梁世伟，罗伊R，塞门扎GL.低氧诱导因子1alpha的反式激活和抑制域。氧张力对转录活性的调节。生物化学杂志。1997;272：19253–19260。[公共医学][谷歌学者]
  • Masson N、Willam C、Maxwell PH、Pugh CW、Ratcliffe PJ。脯氨酰羟基化激活的低氧诱导因子-α链中两个破坏域的独立功能。EMBO J。2001;20:5197–5206. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jaakkola P、Mole DR、Tian YM、Wilson MI、Gielbert J、Gaskell SJ、Kriegsheim Av、Hebestreit HF、Mukherji M、Schofield CJ、Maxwell PH、Pugh CW、Ratcliffe PJ。通过O2调节的脯氨酰羟基化将HIF-α靶向von Hippel-Lindau泛素化复合物。科学。2001;292:468–472.[公共医学][谷歌学者]
  • Bruick RK，McKnight SL。修饰HIF的脯氨酰-4-羟化酶保守家族。科学。2001;294:1337–1340.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang GL，Jiang BH，Rue EA，Semenza GL.低氧诱导因子1是一种受细胞氧张力调节的碱性螺旋-环-螺旋-PAS异二聚体。美国国家科学院程序。1995;92：5510–5514。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lando D、Peet DJ、Gorman JJ、Whelan DA、Whitelaw ML、Bruick RK。FIH-1是一种调节低氧诱导因子转录活性的天冬酰胺羟化酶。基因发育。2002;16:1466–1471. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ivan M、Kondo K、Yang H、Kim W、Valiando J、Oh M、Salic A、Asara JM、Lane WS、Kaelin WG.、。，Jr HIFalpha通过脯氨酸羟化作用靶向VHL介导的破坏：对O2传感的影响。科学。2001;292:464–468.[公共医学][谷歌学者]
  • Berra E、Benizri E、Ginouves A、Volmat V、Roux D、Pouyssegur J.HIF-脯氨酰羟化酶2是关键的氧传感器，可在常压下降低HIF-1α的稳态水平。EMBO J。2003;22：4082–4090。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jiang BH，Rue E，Wang GL，Roe R，Semenza GL。低氧诱导因子1的二聚体化、DNA结合和反式激活特性。生物化学杂志。1996;271:17771–17778.[公共医学][谷歌学者]
  • Kallio PJ，Okamoto K，O'Brien S，Carrero P，Makino Y，Tanaka H，Poellinger L.缺氧细胞中的信号转导：低氧诱导因子-1α诱导的核易位和CBP/p300辅激活子的招募。EMBO J。1998;17：6573–6586。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Freedman SJ、Sun ZY、Poy F、Kung AL、Livingston DM、Wagner G、Eck MJ。低氧诱导因子-1α招募CBP/p300的结构基础。美国国家科学院程序。2002;99:5367–5372. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Semenza GL，Nejfelt MK，Chi SM，Antonarakis SE。低氧诱导核因子与位于人类红细胞生成素基因3′的增强子元件结合。美国国家科学院程序。1991;88:5680–5684. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 斯科菲尔德CJ，拉特克利夫PJ。HIF羟化酶的氧气传感。Nat Rev Mol细胞生物学。2004;5:343–354.[公共医学][谷歌学者]
  • Semenza GL.HIF-1的羟基化：分子水平上的氧传感。生理学（贝塞斯达）2004;19:176–182.[公共医学][谷歌学者]
  • Kietzmann T、Cornesse Y、Brechtel K、Modaressi S、Jungermann K。大鼠肝脏中三种低氧诱导因子α亚单位（HIF1alpha、HIF2alpha和HIF3alpha）mRNA的静脉周围表达。生物化学J。2001;354:531–537. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lieb ME、Menzies K、Moschella MC、Ni R、Taubman MB。哺乳动物EGLN基因具有不同的mRNA表达和调节模式。生物化学细胞生物学。2002;80:421–426.[公共医学][谷歌学者]
  • Seglen采购订单。分离大鼠肝细胞的制备。方法细胞生物学。1976;13：29–83。[公共医学][谷歌学者]
  • Runge D、Runge DM、Jager D、Lubecki KA、Beer Stolz D、Karathanasis S、Kietzmann T、Strom SC、Jungermann K、Fleig WE、Michalopoulos GK。人类肝细胞的无血清长期培养：细胞形态、转录因子和肝脏特异性功能的维持。生物化学与生物物理研究委员会。2000;269:46–53.[公共医学][谷歌学者]
  • Block GD、Locker J、Bowen WC、Petersen BE、Katyal S、Strom SC、Riley T、Howard TA、Michalopoulos GK。由HGF/SF、EGF和TGF-α在化学定义（HGM）培养基中诱导的原代肝细胞培养中的群体扩张、克隆生长和特异分化模式。细胞生物学杂志。1996;132:1133–1149. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jiang BH、Semenza GL、Bauer C、Marti HH。低氧诱导因子1水平在生理相关的氧张力范围内呈指数变化。美国生理学杂志。1996;271：C1172–C1180。[公共医学][谷歌学者]
  • Ljungkvist AS、Bussink J、Rijken PF、Raleigh JA、Denekamp J、Van Der Kogel AJ。用双低氧标记物技术测量肿瘤低氧的变化。国际放射肿瘤生物学杂志。2000;48:1529–1538.[公共医学][谷歌学者]
  • Mosmann T.细胞生长和存活的快速比色分析：应用于增殖和细胞毒性分析。免疫方法杂志。1983;65:55–63.[公共医学][谷歌学者]
  • Korzeniwski C，Callewaert DM。天然细胞毒性的酶释放试验。免疫学方法杂志。1983;64:313–320.[公共医学][谷歌学者]
  • Novicki DL，Jirtle RL，Michalopoulos G.通过致癌物引发、苯巴比妥促进方案产生的两种大鼠肝癌细胞株的建立。体外试验。1983;19:191–202.[公共医学][谷歌学者]
  • Stolz DB、Zamora R、Vodovotz Y、Loughran PA、Billar TR、Kim YM、Simmons RL、Watkins SC。肝细胞中诱导型一氧化氮合酶的过氧化物酶体定位。肝病学。2002;36:81–93.[公共医学][谷歌学者]
  • Runge D、Runge DM、Bowen WC、Locker J、Michalopoulos GK。基质诱导培养大鼠肝细胞的再分化和CCAAT/增强子结合蛋白的变化。生物化学。1997;378:873–881.[公共医学][谷歌学者]
  • Laemmli UK。T4噬菌体头部组装过程中结构蛋白的裂解。自然。1970;227:680–685.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhang SX，Gozal D，Sachleben LR，Jr，Rane M，Klein JB，Gozal-E。缺氧通过RN46A神经元细胞中的血小板衍生生长因子（PDGF）-B/PDGF-β受体/磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号诱导自分泌-嘌呤生存途径。美国财务会计准则委员会J。2003;17:1709–1711.[公共医学][谷歌学者]
  • Scharf JG，Unterman TG，Kietzmann T.大鼠肝细胞原代培养中胰岛素样生长因子结合蛋白生物合成的氧依赖性调节。内分泌学。2005;146:5433–5443.[公共医学][谷歌学者]
  • Lipscomb EA、Sarmiere PD、Freeman RS。SM-20是一种新型线粒体蛋白，可导致神经生长因子依赖性神经元中caspase依赖性细胞死亡。生物化学杂志。2001;276:5085–5092.[公共医学][谷歌学者]
  • Marxsen JH、Stengel P、Doege K、Heikkinen P、Jokilehto T、Wagner T、Jelkmann W、Jaakkola P、Metzen E。缺氧诱导因子-1（HIF-1）通过诱导HIF-α-丙烯-4-羟化酶促进其降解。生物化学J。2004;381:761–767. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Appelhoff RJ、Tian YM、Raval RR、Turley H、Harris AL、Pugh CW、Ratcliffe PJ、Gleadle JM。脯氨酸羟化酶PHD1、PHD2和PHD3在缺氧诱导因子调节中的差异功能。生物化学杂志。2004;279:38458–38465.[公共医学][谷歌学者]
  • Tian YM，Mole DR，Ratcliffe PJ，Gleadle JM。通过交替引发产生的HIF-脯氨酰羟化酶PHD1不同亚型的表征。生物化学J。2006;397:179–186. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Makino Y、Kanopka A、Wilson WJ、Tanaka H、Poellinger L.抑制性PAS结构域蛋白（IPAS）是低氧诱导因子-3α基因座的低氧诱导剪接变体。生物化学杂志。2002;277:32405–32408.[公共医学][谷歌学者]
  • Groulx I，Lee S.氧依赖性泛素化和低氧诱导因子的降解需要von Hippel-Lindau抑癌蛋白的核质转运。分子细胞生物学。2002;22:5319–5336. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Heiland I，Erdmann R.过氧化物酶体的生物发生。过氧化物酶体膜和基质蛋白的局部发生。FEBS J公司。2005;272:2362–2372.[公共医学][谷歌学者]
  • Olivier LM、Kovacs W、Masuda K、Keller GA、Krisans SK。胆固醇生物合成酶中过氧化物酶体靶向信号的鉴定。AA-CoA硫酶、hmg-CoA合成酶、MPPD和FPP合成酶。脂质研究杂志。2000;41:1921–1935.[公共医学][谷歌学者]
  • Huber PA、Birdsey GM、Lumb MJ、Prowse DT、Perkins TJ、Knight DR、Danpure CJ。人类丙氨酸的过氧化物酶体输入：乙醛酸转氨酶需要远离其C末端的辅助靶向信息。生物化学杂志。2005;280:27111–27120.[公共医学][谷歌学者]
  • Paton VG，Shackelford JE，Krisans SK。仓鼠和大鼠异戊烯基二磷酸二甲基烯丙基二磷酸异构酶的克隆和亚细胞定位。PTS1基序将酶靶向过氧化物酶体。生物化学杂志。1997;272：18945年至18950年。[公共医学][谷歌学者]
  • Loughran PA、Stolz DB、Vodovotz Y、Watkins SC、Simmons RL、Billar TR。单体诱导型一氧化氮合酶定位于肝细胞中的过氧化物酶体。美国国家科学院程序。2005;102:13837–13842. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • McNew JA，Goodman JM。一种寡聚蛋白被导入体内过氧化物酶体。细胞生物学杂志。1994;127:1245–1257. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Min JH，Yang H，Ivan M，Gertler F，Kaelin WG，Jr，Paveletich NP。HIF-1alpha-pVHL复合物的结构：信号中的羟脯氨酸识别。科学。2002;296:1886–1889.[公共医学][谷歌学者]
  • 尊敬的WC、Wilson MI、Harlos K、Claridge TD、Schofield CJ、Pugh CW、Maxwell PH、Ratcliffe PJ、Stuart DI、Jones EY。pVHL识别HIF-1α中羟脯氨酸的结构基础。自然。2002;417:975–978.[公共医学][谷歌学者]
  • Haase VH，Glickman JN，Socolovsky M，Jaenisch R.肝血管瘤，靶向灭活von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子。美国国家科学院程序。2001;98:1583–1588. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jungermann K，Katz N.不同肝细胞群的功能专门化。生理学评论。1989;69:708–764.[公共医学][谷歌学者]
  • Berra E，Roux D，Richard DE，Pouyssegur J.低氧诱导因子-1α（HIF-1α）逃避O（2）驱动的蛋白酶体降解，而与其亚细胞定位无关：细胞核或细胞质。EMBO代表。2001;2:615–620. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tuckerman JR，Zhao Y，Hewitson KS，Tian YM，Pugh CW，Ratcliffe PJ，Mole DR。HIF-prolyl羟化酶比活性的测定和比较。FEBS信函。2004;576：145–150。[公共医学][谷歌学者]
  • 出血VH。肾脏中的低氧诱导因子。美国生理学杂志。2006;291：F271–F281。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Metzen E、Berchner-Pfannschmidt U、Stengel P、Marxsen JH、Stolze I、Klinger M、Huang WQ、Wotzlaw C、Hellwig-Burgel T、Jelkmann W、Acker H、Fandrey J.人类HIF-1α-羟化酶的细胞内定位：对氧传感的影响。细胞科学杂志。2003;116:1319–1326.[公共医学][谷歌学者]
  • Soilleux EJ、Turley H、Tian YM、Pugh CW、Gatter KC、Harris AL。使用新型单克隆抗体测定缺氧调节因子PHD-1、PHD-2、PHD-3和FIH在正常和肿瘤人体组织中的表达和分布。组织病理学。2005;47:602–610.[公共医学][谷歌学者]
  • Oehme F、Ellinghaus P、Kolkhof P、Smith TJ、Ramakrishnan S、Hutter J、Schramm M、Flamme I。PH-4（一种新型脯氨酸4-羟化酶）的过度表达调节低氧诱导转录因子的活性。生物化学与生物物理研究委员会。2002;296:343–349.[公共医学][谷歌学者]
  • Hirsila M，Koivunen P，Gunzler V，Kivirikko KI，Myllyharju J.修饰低氧诱导因子的人脯氨酸4-羟化酶的特性。生物化学杂志。2003;278:30772–30780.[公共医学][谷歌学者]
  • Kuznetsova AV、Meller J、Schnell PO、Nash JA、Ignacak ML、Sanchez Y、Conaway JW、Conawy RC、Czyzyk-Krzeska MF。von Hippel-Lindau蛋白通过脯氨酸羟基化基序结合RNA聚合酶II的超磷酸化大亚基，并将其作为泛素化的靶点。美国国家科学院程序。2003;100:2706–2711. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jansen GA、Ofman R、Denis S、Ferdinandusse S、Hogenhout EM、Jakobs C、Wanders RJ。大鼠肝脏植物醇-CoA羟化酶。蛋白质纯化和cDNA克隆对植酸α-氧化亚细胞定位的影响。脂质研究杂志。1999;40:2244–2254.[公共医学][谷歌学者]
  • Mihalik SJ，Rainville AM，Watkins PA。大鼠肝脏过氧化物酶体中的Phytanic acidα氧化。双加氧酶辅因子可促进α-羟基植酸-CoA和甲酸盐的生成。欧洲生物化学杂志。1995;232:545–551.[公共医学][谷歌学者]
  • 线粒体：氧气下沉而不是传感器？医学假说。2006;66：380–383。[公共医学][谷歌学者]
  • De Duve C，Baudhuin P.过氧化物酶体（微体和相关颗粒）。生理学评论。1966;46:323–357.[公共医学][谷歌学者]
  • Hagen T，Taylor CT，Lam F，Moncada S.一氧化氮对缺氧时细胞内氧的再分布：对HIF1alpha的影响。科学。2003;302:1975–1978.[公共医学][谷歌学者]
  • Metzen E，Zhou J，Jelkmann W，Fandrey J，Brune B.一氧化氮通过抑制脯氨酰羟化酶损害HIF-1α的正常氧降解。分子生物学细胞。2003;14:3470–3481. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Papandreou I、Cairns RA、Fontana L、Lim AL、Denko NC。HIF-1通过主动下调线粒体耗氧量来调节缺氧适应。单元格元数据。2006;三:187–197.[公共医学][谷歌学者]
  • Selak MA、Armour SM、MacKenzie ED、Boulahbel H、Watson DG、Mansfield KD、Pan Y、Simon MC、Thompson CB、Gottlieb E.琥珀酸通过抑制HIF-α-脯氨酸羟化酶将TCA循环功能障碍与肿瘤发生联系起来。癌细胞。2005;7:77–85.[公共医学][谷歌学者]
  • Kim JW，Tchernyshyov I，Semenza GL，Dang CV.HIF-1介导的丙酮酸脱氢酶激酶表达：细胞适应缺氧所需的代谢开关。单元格元数据。2006;三:177–185.[公共医学][谷歌学者]
文章来自美国病理学杂志由以下人员提供美国病理研究学会