美国国家科学院院刊。2006年5月2日；103(18): 6901–6906.
胃泌素释放肽磷酸化TNF-α转化酶诱导双调节蛋白释放和EGF受体活化
,* ,† ,† ,† ,*‡ ,§ ,‡¶ ,‖和*†‡**
吉尔·M·齐格弗里德
*药理学，以及
‡匹兹堡大学癌症研究所，匹兹堡，宾夕法尼亚州15213；
惠州风扇
§新泽西州皮斯卡塔韦市罗伯特·伍德·约翰逊医学院新泽西医科大学生理学和生物物理系，邮编08854；和
托马斯·E·史密斯加尔
*药理学和
‡匹兹堡大学癌症研究所，匹兹堡，宾夕法尼亚州15213；
戈登·米尔斯
‖德克萨斯大学安德森癌症中心分子治疗学系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
詹妮弗·鲁宾·格兰迪斯
以下部门†耳鼻喉科，
*药理学和
‡匹兹堡大学癌症研究所，匹兹堡，宾夕法尼亚州15213；
以下部门†耳鼻喉科，
*药理学和
¶匹兹堡大学医学院分子遗传学和生物化学
‡匹兹堡大学癌症研究所，匹兹堡，宾夕法尼亚州15213；
§新泽西州皮斯卡塔韦市罗伯特·伍德·约翰逊医学院新泽西医科大学生理学和生物物理系，邮编08854；和
‖德克萨斯大学安德森癌症中心分子治疗学系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
乔治·斯塔克（George R.Stark）编辑，克利夫兰诊所基金会，俄亥俄州克利夫兰，2006年3月23日批准
作者贡献：Q.Z.、V.W.Y.L.、J.M.S.、H.F.、T.E.S.、G.B.M.和J.R.G.设计研究；Q.Z.、S.M.T.和S.X.进行了研究；H.F.和T.E.S.提供了新的试剂/分析工具；Q.Z.、T.E.S.、G.B.M.和J.R.G.分析数据；Q.Z.、G.B.M.和J.R.G.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
GUID:17CEC6F0-41F2-4C25-9F15-9ECA6C1DEB78
GUID:7D0C47B6-2102-4869-9A68-7A44F1708CA9
GUID:B421CC14-56CE-4601-A8CD-B30C53E9E9D5
制导：1782E5CF-D4F0-4E0F-B6DC-33DDA237E153
GUID:0897B79C-1D08-4A14-A04F-9CF0C5838875
GUID:0205BD6F-9ABB-4F7E-A581-3EDEB7344364
GUID:5044A6A9-A640-4D64-A6D8-26306F730FA4
GUID:AA136597-6373-4440-8702-DA73DD53D270
GUID:F681DFF3-F008-48BA-9B6D-987F904D375B
GUID:85662C00-9186-4DD4-AB9B-DF43E2BD0FB5
GUID:2451452D-AE58-49A7-9D9F-35EAC0D63365
GUID:A9E5C6B1-5A70-4A8B-B613-F6EA1160212E
摘要
G蛋白偶联受体诱导EGF受体（EGFR）信号传导，导致癌细胞增殖和侵袭。通过G蛋白偶联受体阐明EGFR激活的机制可能会发现新的信号范式。胃泌素释放肽（GRP）/GRP受体介导的自分泌途径先前在头颈部鳞癌中被描述。在本研究中，我们证明了TNF-α转换酶（TACE），一种去整合素和金属蛋白-17，经历了Src-依赖性磷酸化，调节GRP治疗后EGFR配体双调节蛋白的释放。进一步研究表明磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）是c-Src和TACE的中间产物，有助于它们的结合和TACE磷酸化。磷脂酰肌醇依赖性激酶1（PDK1）是PI3-K的下游靶点，已被确定为先前未描述的激酶，在GRP治疗后直接磷酸化TACE。这些发现表明GRP-Src-PI3-K-PDK1-TACE-增白素-EGFR的信号级联具有多个相互作用点、易位点和磷酸化。此外，PDK1的敲除增强了EGFR抑制剂厄洛替尼的抗肿瘤作用，表明PDK1是改善EGFR抑制剂临床反应的治疗靶点。
关键词：G蛋白偶联受体与头颈部鳞状细胞癌
上皮性癌的特征是表皮生长因子受体（EGFR）过度表达，这一观察结果导致了阻止该生长因子受体的治疗策略的发展。在EGFR激活突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者群体中，EGFR靶向治疗的反应引人注目(1,2). 然而，在NSCLC和其他癌症中，没有激活EGFR突变的患者的反应频率是有限的，但并非没有(三–5). 尽管在临床前模型中观察到了强健的活性，但大多数患者的这些适度临床反应的基础尚不完全清楚。除了配体直接激活EGFR外，EGFR还可以被多种细胞类型的G蛋白偶联受体（GPCR）反式激活，包括成纤维细胞、平滑肌细胞、神经元和肿瘤细胞(6–9). EGFR激活后，肿瘤细胞表现出增殖、侵袭、生存和化疗抵抗增加(10).
GPCR诱导EGFR信号传导的机制涉及细胞内和细胞外途径(11). GPCR对EGFR的激活被认为是由Src家族激酶、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）和/或PKC信号介导的(11). 据报道，Src家族激酶可调节结肠癌细胞系Caco-2、胃上皮细胞RGM1、Cos-7细胞、GT1-7神经元细胞、肺癌细胞201T和头颈癌细胞中GPCR配体诱导的EGFR磷酸化(12–16). PI3-K也与GPCR和EGFR串扰有关(17–19). 除了参与GPCR诱导的EGFR激活的细胞内分子外，越来越多的证据表明跨膜金属蛋白酶介导EGFR脯氨酸和脱落，以响应GPCR配体(8,20–23). 累积结果表明，参与EGFR脯氨酸裂解的金属蛋白酶是细胞型和GPCR配体特异性的。据报道，基质金属蛋白酶2和9分别在乳腺癌细胞和促性腺细胞中介导雌激素受体/GPCR配体诱导的EGFR配体裂解(24,25)而去整合素和金属蛋白酶（ADAM）10与蛙皮素或溶血磷脂酸诱导的Cos-7细胞中的肝素结合EGF裂解和EGFR激活有关(23). TNF-α转化酶（TACE）已被证明能介导卡巴胆碱或溶血磷脂酸诱导的头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）细胞原角蛋白调节素释放和下游EGFR和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活(26). 然而，精确的细胞内信号级联将GPCR刺激与金属蛋白酶激活和EGFR信号耦合仍不完全清楚。
我们以前报道过Src家族激酶调节胃泌素释放肽（GRP）诱导的EGFR前体和切割，导致SCCHN下游EGFR和MAPK激活，从而促进细胞增殖和侵袭(15,27). 此外，使用2A11抗体阻断内源性GRP可降低SCCHN细胞增殖和肿瘤生长体内(28). 在这里，我们显示在GRP处理SCCHN细胞后，Src与TACE相关。这种联系伴随着Src和TACE的磷酸化和移位到细胞膜。GRP使TACE磷酸化需要Src家族激酶和PI3-Ks。进一步研究证实，磷脂酰肌醇依赖性激酶1（PDK1）是直接介导GRP诱导的TACE磷酸化的激酶。敲除PDK1可增强EGFR抑制剂的抗肿瘤作用。这些结果表明PDK1是癌症的治疗靶点，GPCR对EGFR的反式激活有助于肿瘤进展。
结果
GRP诱导TACE和c-Src关联。
我们之前证明，Src家族激酶通过促进SCCHN中栓系EGFR配体的释放，有助于GRP诱导的EGFR和MAPK活化(15). 对GPCR激活的EGFR配体裂解可由几种金属蛋白酶介导，包括ADAM家族成员(8,20,21). 许多ADAM在其细胞质结构域上富含脯氨酸残基，特别是PXXP共有序列，使其能够与多种细胞内蛋白质中的Src同源3结构域相互作用(29). 事实上，TACE已被证明有助于凝血酶和溶血磷脂酸诱导的EGFR激活(20,26). 因此，我们通过Src同源性3结构域相互作用与TACE的物理结合，检查了Src家族激酶是否有助于EGFR配体裂解。
为了测试TACE和c-Src是否可以组成性地或在GPCR激活后结合，我们用WT c-Src-表达质粒转染HEK-293细胞，然后进行共免疫沉淀。在这个模型中，c-Src转染后TACE和c-Src-关联增加，并且这种关联在TACE免疫沉淀中是特定的（图8一和b条，作为支持信息发布在PNAS网站上）。为了研究GRP在生物相关系统中对内源性TACE和c-Src相关性的影响，用GRP处理SCCHN细胞（PCI-37A和PCI-15B），然后进行TACE和c-Src联合免疫沉淀。在两种SCCHN细胞系中，GRP增加了TACE和c-Src之间的联系( 一和b条).
GRP诱导TACE和c-Src关联。(一和b条)代表性SCCHN细胞（PCI-37A或PCI-15B）用GRP（400 nM）处理10分钟，然后用TACE免疫沉淀（IP）和c-Src免疫印迹（IB）。剥离膜进行TACE免疫印迹，以确保等效负载。(c（c）)将PCI-15B细胞接种在盖玻片上，然后进行血清饥饿2天。在用GRP（400nM）孵育5分钟后，用抗TACE（绿色）和抗-Src（红色）抗体对细胞进行双重染色。箭头表示在GRP刺激下TACE和c-Src重新分布到细胞膜。
据报道，GPCR激动剂血管紧张素II可诱导TACE重新分布到心尖膜，随后EGFR磷酸化(30). 接下来，我们利用共焦显微镜研究了GRP是否可以通过这些蛋白的细胞内移位来诱导TACE和c-Src的结合。在没有GRP的情况下，TACE和c-Src主要存在于细胞质中。GRP短期处理诱导Src和TACE向细胞外周的配位重新分布(c（c）). 使用EGFR细胞外抗体使细胞与TACE共染，以确认GRP治疗后TACE易位到膜（图9，作为PNAS网站上的支持信息发布）。这些结果表明，GRP诱导TACE和c-Src的结合，以及转位到细胞膜，TACE可以在细胞膜上裂解EGFR脯氨酸。
TACE是参与GRP诱导的EGFR增殖和裂解的金属蛋白酶。
TACE与凝血酶和溶血磷脂酸诱导的前两性调节蛋白裂解有关，随后在SCCHN细胞中激活EGFR和MAPK(26). 为了确定TACE在GRP诱导的EGFR和MAPK激活中的作用，用TACE小干扰RNA（siRNA）或阴性对照GFP双重体转染SCCHN细胞（PCI-37A），然后进行GRP处理。如所示一，GRP在抑制TACE表达后未能诱导EGFR和MAPK磷酸化。然而，在GFP-siRNA双转染细胞中，GRP保留了诱导EGFR和MAPK激活的能力。
TACE介导GRP诱导的EGFR激活。(一)将代表性SCCHN细胞（PCI-37A）接种在6孔板上，然后进行TACE siRNA转染或转染阴性对照GFP双链体。在血清饥饿2天后，用GRP（400 nM）处理细胞10分钟，然后按指示进行免疫印迹（IB）和免疫沉淀（IP）。(b条)根据制造商的说明，在细胞培养基上进行两性调节蛋白ELISA。TACE siRNA GRP治疗与GFP siRNA GRP治疗进行比较。累积结果来自六个独立实验(P（P）= 0.0011).
我们之前在SCCHN的研究表明，在使用GRP治疗后，会释放两种调节蛋白和TGF-α，但不会释放肝素结合的EGF或EGF(27). 为了确定TACE在GRP介导的EGFR配体释放中的作用，我们在细胞培养基中刺激GRP后进行了双调节蛋白ELISA。如所示b条，用siRNA抑制TACE表达可消除GRP诱导的两性调节蛋白释放到条件培养基中(P（P）= 0.0011). 在细胞裂解物中，与GFP siRNA转染细胞相比，TACE siRNA转导细胞中的两性调节蛋白表达更高（图10，作为PNAS网站上的支持信息发布）。这些结果表明TACE参与GRP诱导的EGFR转录激活。
GRP诱导的TACE磷酸化需要c-Src。
据报道，一种众所周知的脱落激活剂——12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（TPA）可诱导苏氨酸残基上的TACE磷酸化(31,32). EGF可诱导TACE丝氨酸磷酸化(33). 为了阐明GRP导致TACE重定位和随后的双调节蛋白释放的机制，我们检测了GRP处理SCCHN细胞后TACE丝氨酸和苏氨酸磷酸化。GRP最早在2分钟时刺激TACE磷酸化，在添加GRP后10分钟达到最大水平，而GRP诱导的EGFR和MAPK磷酸化在5分钟时在PCI-37A细胞中首次检测到，10分钟时达到峰值（图11，作为PNAS网站上的支持信息发布），与作用于EGFR和MAPK磷酸化上游的TACE相容。虽然在丝氨酸和苏氨酸残基上都很容易检测到磷酸化，但我们无法检测到酪氨酸残基的TACE磷酸化（数据未显示）。GRP诱导TACE磷酸化的机制尚不清楚。据报道，ADAM15经历了Src家族激酶依赖性磷酸化，这有助于ADAM15细胞质结构域和Src族蛋白之间的相互作用(34). 由于c-Src在GRP治疗后易位到质膜，其中c-Src-与TACE相关，我们假设GRP诱导的Src家族激酶激活可能有助于TACE磷酸化。通过用Src家族激酶抑制剂A-419259处理细胞，GRP诱导的TACE和c-Src关联和移位被消除，表明TACE和c-Src之间的相互作用是磷酸化依赖的（图12，作为PNAS网站上的支持信息发布）。
为了证实c-Src在GRP诱导的TACE磷酸化中的作用，用c-Src siRNA转染SCCHN（PCI-37A）细胞，然后进行GRP处理。如所示一在c-Src表达下调后，GRP未能诱导TACE磷酸化。此外，在c-Src-siRNA存在的情况下，GRP不能诱导两调节蛋白释放到培养基中(b条;P（P）= 0.0011).
Src介导GRP诱导的SCCHN中TACE磷酸化。(一)用c-Src siRNA转染PCI-37A细胞，然后血清饥饿2天，用GRP（400 nM）处理10分钟。对细胞裂解物进行c-Src表达的Western印迹和TACE免疫沉淀。免疫印迹法；IP，免疫沉淀。(b条)根据制造商的说明，在细胞培养基上进行两性调节蛋白ELISA。累积结果来自六个独立实验(P（P）= 0.0011).
PI3-K作为中间体，是GRP诱导TACE磷酸化所必需的。
由于c-Src是一种酪氨酸激酶，只在酪氨酸残基上磷酸化底物，而TACE在丝氨酸/苏氨酸残基中磷酸化，因此我们推断丝氨酸/苏氨酸激酶可能在c-Src-和TACE磷酸化之间起中介作用。据报道，Src家族激酶通过Src同源性3结构域和PI3-K的p85调节亚基之间的相互作用激活PI3-K，随后Y688磷酸化并释放p85对p110催化亚基活性的抑制(35,36). 此外，Src家族激酶可以抑制PTEN活性，也可以通过PI3-K途径增加信号传导(37). 为了检测PI3-K通路是否通过作用于Src家族激酶下游参与GRP诱导的EGFR信号传导，用Src族激酶抑制剂A-419259（100 nM）处理SCCHN细胞（PCI-37A），然后再进行GRP处理。使用磷酸化Akt作为PI3-K通路激活的替代标记，我们发现GRP诱导的PI3-K活性受到Src家族激酶阻断的抑制(一). 除了Src激酶抑制剂外，还使用了c-Src siRNA，并观察到类似的结果（图13，作为PNAS网站上的支持信息发布）。
PI3-K起中介作用，是GRP诱导TACE磷酸化所必需的。（a） PCI-37A细胞被血清饥饿2天。在用Src家族激酶抑制剂PD0180970（500 nM）预处理2 h后，用GRP或EGF处理细胞10 min。用磷酸化Akt（Ser-473）和总Akt对细胞裂解物进行免疫印迹。(b条)用p85αsiRNA转染PCI-37A细胞，然后血清饥饿2天，用GRP（400 nM）处理10分钟。对细胞裂解物进行蛋白质印迹以检测p85α表达和TACE免疫沉淀。免疫印迹法；IP，免疫沉淀。(c（c）)根据制造商的说明，在细胞培养基上进行两性调节蛋白ELISA。累积结果来自四个独立实验(P（P）= 0.014).
由于GRP通过c-Src依赖的方式激活PI3-K，我们假设PI3-K可能作为TACE和c-Src.之间的中间产物。为了验证这一假设，我们用p85 siRNA转染SCCHN细胞。在p85表达下调后，GRP未能诱导TACE和c-Src关联，表明相互作用不是直接的（数据未显示）。PI3-K可能是c-Src和TACE之间的中间产物。由于PI3-K介导c-Src和TACE关联，我们假设PI3-K活性是GRP诱导细胞质域TACE磷酸化所必需的。如所示b条，GRP未能诱导p85αsiRNA-转染细胞中的TACE磷酸化，而GRP保留了刺激对照siRNA转染SCCHN细胞中TACE磷酸化合的能力。为了证实PI3-K作用于c-Src激酶下游并有助于GRP诱导的EGFR配体释放，研究了p85α在GRP诱导EGFR配子释放中的作用。p85αsiRNA消除GRP诱导的两性调节蛋白释放(P（P）= 0.014;c（c）). 在PCI-15B细胞中观察到类似结果（数据未显示）。除p85 siRNA外，还使用了两种PI3-K抑制剂，沃特曼或LY294002。这两种化合物以剂量依赖的方式抑制PI3-K，而不影响Src活性（图14一和b条，作为支持信息发布在PNAS网站上）。此外，这两种化合物都消除了GRP诱导的TACE磷酸化、EGFR配体释放和EGFR/MAPK磷酸化（图15-17，其作为支持信息发布在PNAS网站上）。因此，在SCCHN细胞中，GRP诱导的TACE磷酸化和EGFR配体释放需要PI3-K。
PDK1磷酸化物TACE对GRP的反应。
虽然PI3-K含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，但唯一确定的PI3-K蛋白底物是PI3-K本身。因此，我们推断一种替代的中间激酶必须直接磷酸化TACE以响应GRP刺激。由于PI3-K产生的三种磷酸化磷脂酰肌醇直接或间接激活，因此有许多可能的候选物(38–40). 特别有趣的是，据报道，PDK1与这些底物的特异性对接是高效磷酸化所必需的，磷酸化定位于底物上的疏水性Phe-Xaa-Xaa-Phe（PXXP）结构域(41,42). 由于TACE在细胞质结构域上包含多个PXXP结构域，我们假设在GRP激活PI3-K后，PDK1转位到膜，在膜上识别TACE细胞质PXXP域并调节TACE磷酸化。为了测试PDK1激酶是否能磷酸化全长TACE，SCCHN（37A）细胞被血清饥饿，然后进行在体外用重组PDK1酶进行激酶测定。如所示一，PDK1诱导TACE磷酸化。在PCI-15B细胞中观察到类似结果（数据未显示）。为了证实PDK1能够在细胞内磷酸化TACE，我们纯化了一个与TACE细胞质结构域相连的GST融合蛋白（GST-TACEc）。如所示b条，PDK1激酶可以在细胞质域磷酸化TACE在体外，暗示PDK1是介导GRP诱导的TACE磷酸化的一个效应器。相反，PKC活性酶未能诱导GST-TACEc磷酸化（数据未显示）。为了研究PDK1在GRP诱导的TACE磷酸化中的需求，使用PDK1 siRNA敲低内源性PDK1表达。PDK1敲除后，GRP未能诱导TACE磷酸化(c（c）). 此外，PDK1敲除消除了GRP诱导的TACE向细胞膜的移位（图18，作为PNAS网站上的支持信息发布）。这些结果表明PDK1可以介导GRP诱导的TACE磷酸化和移位。
在SCCHN中，PDK1激酶在GRP处理后磷酸化TACE。(一)SCCHN细胞（PCI-37A）被血清饥饿2天，然后进行TACE免疫沉淀。使用PDK1酶与细胞颗粒孵育，然后在体外激酶分析。使用相同的膜来探测总TACE。免疫印迹法；IP，免疫沉淀。(b条)活性PDK1激酶与重组GST或GST-TACEc孵育，然后在体外激酶分析。用抗GST抗体对同一膜进行免疫印迹，以确保负载相等。(c（c）)将PDK1 siRNA或阴性对照（GFP）siRNA转染SCCHN细胞（PCI-37A），然后用PDK1抗体免疫印迹，或用TACE免疫沉淀，然后用磷酸苏氨酸或丝氨酸抗体免疫印记。
靶向PDK1增强EGFR抑制剂的细胞毒性和抗侵袭作用。
EGFR抑制剂，包括酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼（OSI-774/Tarceva），在肿瘤不含激活EGFR突变的癌症患者中，导致临床反应有限(5). 由于GRP通过EGFR的反式激活刺激SCCHN生长，我们假设EGFR抑制剂的细胞毒和抗侵袭作用可以通过同时靶向PDK1而增强。埃洛替尼治疗（1μM）在24小时时导致约50%的生长抑制。当与PDK1 siRNA结合时，埃洛替尼布的细胞毒作用显著增强(一;P（P）= 0.0011). 此外，PDK1 siRNA与厄洛替尼联合使用时显著降低SCCHN细胞的侵袭能力(b条;P（P）< 0.001). 这些结果表明，PDK1阻断可以增强EGFR抑制剂的细胞毒性和抗侵袭作用。
通过联合靶向PDK1和EGFR增强抗肿瘤作用。将SCCHN（PCI-37A）细胞接种在24孔板上，然后用PDK1 siRNA或GFP双重siRNA转染。转染后24小时，向孔中添加厄洛替尼（1μM）。(一)厄洛替尼治疗24小时后进行3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑鎓测定。结果来自六个独立实验(P（P）= 0.0011). (b条)将细胞一式两份置于基质凝胶侵入室中，然后用PDK1 siRNA或GFP双重siRNA转染。转染后24小时，加入厄洛替尼（1μM）24小时。用光学显微镜在×400倍放大镜下计数10个代表性区域的侵入细胞。
讨论
EGFR和GPCR信号通路的整合已被证明在多种癌症模型中有助于致癌(8,16,21,24,43,44). GPCR激活EGFR的确切机制尚不完全清楚。本研究结果表明，在GPCR刺激后，c-Src被激活，导致PI3-K下游诱导。PI3-K激活后，PDK1可以磷酸化苏氨酸和丝氨酸残基上的TACE，导致TACE移位，EGFR脯氨酸（例如两性调节蛋白）裂解，以及随后的EGFR和MAPK磷酸化。该模型表明，GPCR配体诱导的双调节蛋白释放在有丝分裂信号中起着关键作用，这与之前的发现一致，即GPCR配体能诱导双调节蛋白的释放，导致EGFR反式激活增殖、运动和侵袭头颈癌细胞(20,26).
在GPCR配体刺激EGFR的背景下，TACE磷酸化的机制之前尚未确定。TACE的磷酸化可能导致其转移到靶细胞或在膜上形成Src和TACE的功能复合物。我们以前报道过Src家族激酶参与GRP诱导的SCCHN中EGFR磷酸化(15). c-Src和TACE均位于胞浆中的点状病灶中，分别通过Src N末端结构域和TACE跨膜结构域的肉豆蔻酰化，与细胞膜的c-Src和TACE结合。在本研究中，我们通过SCCHN细胞的共免疫沉淀和共聚焦显微镜证明，在没有外源性GRP治疗的情况下，TACE与细胞质中的c-Src相关。TACE与c-Src之间的相互作用可能是由肿瘤系统中GRP/胃泌素释放肽受体自分泌途径引起的(28). 在GRP治疗后，相关性显著增加，随后TACE和c-Src易位到膜。TACE向质膜的转运可能通过将其放置在靶蛋白原角蛋白的附近而在TACE功能中发挥重要作用。然而，TACE是否直接或间接介导两性调节蛋白释放尚待确定。
GRP诱导TACE与c-Src结合的机制尚不清楚，但可能涉及TACE细胞质结构域中富含脯氨酸的序列和c-Srcs的Src同源性3结构域。另外，由于p85结合TACE和c-Src（数据未显示），p85可能是TACE和c-Src之间的中间产物。一些观察结果表明，TACE与c-Src之间的相互作用具有生理意义。首先，EGFR的反式激活和下游MAPK对GRP的激活需要活性c-Src。其次，用GRP刺激SCCHN细胞导致细胞质中TACE和c-Src结合增加。第三，TACE与c-Src易位到质膜，在那里发生TACE对两性调节蛋白的裂解。最后，GRP刺激SCCHN细胞以c-Src依赖方式诱导TACE磷酸化。
GRP诱导的TACE磷酸化发生在丝氨酸和苏氨酸上，但不发生在酪氨酸残基上。因此，我们推断需要额外的信号分子来调节TACE磷酸化。据报道，PDK1可促进几种AGC蛋白激酶的激活，包括PKA、PKG和PKC(38–40). 这里我们显示，除了AGC蛋白激酶外，PDK1还可以磷酸化TACE。PDK1主要是细胞质，在基础条件下，在质膜上有一些定位(45,46). 与其他激酶不同，PDK1是一种组成性活性激酶，即使在没有外源刺激的情况下也是如此。此外，PDK1的磷酸化似乎对PI3-K的激动剂刺激具有抵抗力(39,40,47). 与之前的发现一致，在GRP治疗后，我们没有检测到PDK1磷酸化增加在体外激酶分析。然而，我们观察到PDK1 siRNA消除了GRP诱导的TACE向膜的易位。我们提出以下PDK1诱导的TACE磷酸化模型：(我)GRP诱导c-Src活化和下游PI3-K活化，产生PIP2和PIP3；(ii（ii）)这些脂质分子诱导PDK1和TACE从细胞质向质膜移位；和(三)通过PDK1识别TACE细胞质结构域上的多个PXXP基序，TACE发生构象变化，这可以作为PDK1的底物。尽管之前有报道称TACE的细胞质结构域不需要用于一些跨膜分子的裂解(48)我们在这里表明，TACE细胞质域的磷酸化可能有助于EGFR配体的释放。TACE细胞质结构域激活的需求可能取决于正在研究的精确模型。
阐明GPCR/EGFR串扰的关键介质具有重要的临床意义。PDK1作为许多信号通路中枢的激酶，已被报道能使关键信号分子接近，通过易位激活细胞信号，以及核受体诱导的下游分子激活信号复合物，如NF-κB(49). 广谱激酶抑制剂staurosporine对PDK1和Akt的抑制可促进多种癌细胞的凋亡(50). 然而，由于非选择性，这种化合物对临床开发来说毒性太大(51). 7-羟基staurosporine（UCN-01）非选择性抑制PDK1，据报道可抑制肿瘤细胞生长并促进凋亡(52,53). PDK1反义寡核苷酸已显示可减少胶质母细胞瘤细胞的增殖和存活(54).
虽然PDK1和PI3-K是已知的EGFR信号通路的下游成分，但我们的证据表明，它们也可以通过介导EGFR-ligand释放作用于EGFR的上游。本研究结果表明，PDK1靶向结合EGFR阻断可能增强EGFR抑制剂的治疗效果。PDK1靶向可能阻断EGFR-依赖性和EGFR-诱导性通路，从而促进癌细胞增殖和侵袭。PDK1似乎在GPCR激活EGFR中起着关键作用，可以作为癌症治疗的靶点。
材料和方法
细胞培养。
所有SCCHN细胞系（PCI-37A和PCI-15B）均为人类来源(55–57). 细胞保存在DMEM中，在37°C和5%CO条件下，加入10%热灭活FCS（Invitrogen）2.
免疫印迹法和免疫沉淀法。
25微克蛋白质在8%SDS/PAGE中溶解。对于免疫沉淀，将200μg总蛋白与3μg抗TACE抗体（QED Biosciences，San Diego）、抗EGFR抗体（Upstate Biotechnology）或2μg抗C-Src抗体（Santa Cruz Biotechnology）在4°C下孵育2 h，然后轻轻搅拌，遵循参考文献中报告的方案。15.
支持信息。
化学品和试剂、siRNA转染、ELISA、人TACE细胞质域（TACEc）的克隆及其作为GST-TACEc融合蛋白的表达、免疫荧光显微镜分析、，在体外激酶分析，在体外细胞毒性试验、基质凝胶侵入试验和统计数据发布为支持材料和方法，作为支持信息发布在PNAS网站上。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院卓越研究专项拨款P50CA90440和R01 CA098372（发给J.R.G.）的支持。
缩写
| 亚当 | 一种去整合素和金属蛋白酶 |
| 表皮生长因子受体 | EGF受体 |
| 全球采购控制报告 | G蛋白偶联受体 |
| 玻璃钢 | 胃泌素释放肽 |
| MAPK公司 | 丝裂原活化蛋白激酶 |
| PDK1系列 | 磷脂酰肌醇依赖性激酶1 |
| PI3-K型 | 磷脂酰肌醇3-激酶 |
| SCCHN公司 | 头颈鳞癌 |
| 小核糖核酸 | 小干扰RNA |
| TACE公司 | TNF-α转化酶 |
脚注
利益冲突声明：未声明冲突。
本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。
参考文献
1Lynch T.J.、Bell D.W.、Sordella R.、Gurubhagavatula S.、Okimoto R.A.、Brannigan B.W.、Harris P.L.、Haserlat S.M.、Supko J.G.、Haluska F.G.等人。北英格兰。医学杂志。2004;350：2129–2139。[公共医学][谷歌学者] 2Paez J.G.、Janne P.A.、Lee J.C.、Tracy S.、Greulich H.、Gabriel S.、Herman P.、Kaye F.J.、Lindeman N.、Boggon T.J.等人。科学。2004;304:1497–1500.[公共医学][谷歌学者] 三。巴塞尔加J。安·昂科尔。2000;11（补充3）：187–190。[公共医学][谷歌学者] 4加伯·K·。J.国家。癌症研究所。2000;92:967–969.[公共医学][谷歌学者] 5Arteaga C.L.、Baselga J。癌细胞。2004;5:525–531.[公共医学][谷歌学者] 6Daub H.、Weiss F.U.、Wallasch C.、Ullrich A。自然。1996;379:557–560.[公共医学][谷歌学者] 7Daub H.、Wallasch C.、Lankenau A.、Herrlich A.、Ullrich A。EMBO J。1997;16:7032–7044. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Prenzel N.、Zwick E.、Daub H.、Leserer M.、Abraham R.、Wallasch C.、Ullrich A。自然。1999;402:884–888.[公共医学][谷歌学者] 9Zwick E.、Daub H.、Aoki N.、Yamaguchi-Aoki Y.、Tinhofer I.、Maly K.、Ullrich A。生物学杂志。化学。1997;272:24767–24770.[公共医学][谷歌学者] 10Yarden Y.、Sliwkowski M.X。自然修订版分子细胞生物学。2001;2:127–137.[公共医学][谷歌学者] 11Gschwind A.、Zwick E.、Prenzel N.、Leser M.、Ullrich A。致癌物。2001;20:1594–1600.[公共医学][谷歌学者] 12Pai R.、Soreghan B.、Szabo I.L.、Pavelka M.、Baatar D.、Tarnawski A.S。自然医学。2002;8:289–293.[公共医学][谷歌学者] 13Luttrell L.M.、Hawes B.E.、van Biesen T.、Luttrel D.K.、Lansing T.J.、Lefkowitz R.J。生物学杂志。化学。1996;271:19443–19450.[公共医学][谷歌学者] 14Shah B.H.、Farshori M.P.、Jambusaria A.、Catt K.J。生物学杂志。化学。2003;278:19118–19126.[公共医学][谷歌学者] 15Zhang Q.、Thomas S.M.、Xi S.、Smithgall T.E.、Siegfried J.M.、Kamens J.、Gooding W.E.、Grandis J.R。癌症研究。2004;64:6166–6173.[公共医学][谷歌学者] 16Thomas S.M.、Grandis J.R.、Wentzel A.L.、Gooding W.E.、Lui V.W.、Siegfried J.M。肿瘤。2005;7：426–431。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Hawes B.E.、van Biesen T.、Koch W.J.、Luttrell L.M.、Lefkowitz R.J。生物学杂志。化学。1995;270：17148–17153。[公共医学][谷歌学者] 18Touhara K.、Hawes B.E.、van Biesen T.、Lefkowitz R.J。程序。国家。阿卡德。科学。美国。1995;92:9284–9287. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Lopez Ilasaca M.、Crespo P.、Pellici P.G.、Gutkind J.S.、Wetzker R。科学。1997;275:394–397.[公共医学][谷歌学者] 20Schafer B.、Marg B.、Gschwind A.、Ullrich A。生物学杂志。化学。2004;279:47929–47938.[公共医学][谷歌学者] 21Schafer B.、Gschwind A.、Ullrich A。致癌物。2004;23:991–999.[公共医学][谷歌学者] 22Le Gall S.M.、Auger R.、Dreux C.、Mauduit P。生物学杂志。化学。2003;278:45255–45268.[公共医学][谷歌学者] 24Razandi M.、Pedram A.、Park S.T.、Levin E.R。生物学杂志。化学。2003;278:2701–2712.[公共医学][谷歌学者] 25Roelle S.、Grosse R.、Aigner A.、Krell H.W.、Czubayko F.、Gudermann T。生物学杂志。化学。2003;278:47307–47318.[公共医学][谷歌学者] 26Gschwind A.、Hart S.、Fischer O.M.、Ullrich A。EMBO J。2003;22:2411–2421. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Lui V.W.、Thomas S.M.、Zhang Q.、Wentzel A.L.、Siegfried J.M.，Li J.Y.、Grandis J.R。致癌物。2003;22:6183–6193.[公共医学][谷歌学者] 28Lango M.N.、Dyer K.F.、Lui V.W.、Gooding W.E.、Gubish C.、Siegfried J.M.、Grandis J.R。J.国家。癌症研究所。2002;94:375–383.[公共医学][谷歌学者] 29Feng S.、Chen J.K.、Yu H.、Simon J.A.、Schreiber S.L。科学。1994;266:1241–1247.[公共医学][谷歌学者] 30Lautrette A.、Li S.、Alili R.、Sunnarberg S.W.、Burtin M.、Lee D.C.、Friedlander G.、Terzi F。自然医学。2005;11:867–874.[公共医学][谷歌学者] 31Black R.A.、Rauch C.T.、Kozlosky C.J.、Peschon J.J.、Slack J.L.、Wolfson M.F.、Castner B.J.、Stocking K.L.、Reddy P.、Srinivasan S.等人。自然。1997;385:729–733.[公共医学][谷歌学者] 32Diaz-Rodriguez E.、Montero J.C.、Esparis-Ogando A.、Yuste L.、Pandiella A。分子生物学。单元格。2002;13:2031–2044. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Fan H.、Turck C.W.、Derynk R。生物学杂志。化学。2003;278:18617–18627.[公共医学][谷歌学者] 34Poghosyan Z.、Robbins S.M.、Houslay M.D.、Webster A.、Murphy G.、Edwards D.R。生物学杂志。化学。2002;277:4999–5007.[公共医学][谷歌学者] 35普莱曼·C·M、赫兹·W·M、坎比尔·J·C。科学。1994;263:1609–1612.[公共医学][谷歌学者] 36Cuevas B.D.、Lu Y.、Mao M.、Zhang J.、LaPushin R.、Siminovitch K.、Mills G.B。生物学杂志。化学。2001;276：27455–27461。[公共医学][谷歌学者] 37陆毅、于强、刘建华、张杰、王宏、库尔·D、麦克默里·J·S、方十、容伟凯、西米诺维奇·K·A等。生物学杂志。化学。2003;278:40057–40066.[公共医学][谷歌学者] 38Stokoe D.、Stephens L.R.、Copeland T.、Gaffney P.R.和Reese C.B.、Painter G.F.、Holmes A.B.、McCormick F.和Hawkins P.T。科学。1997;277:567–570.[公共医学][谷歌学者] 39Alessi D.R.、Deak M.、Casamayor A.、Caudell F.B.、Morrice N.、Norman D.G.、Gaffney P.、Reese C.B.、MacDougall C.N.、Harbison D.等人。货币。生物。1997;7:776–789.[公共医学][谷歌学者] 40Pullen N.、Dennis P.B.、Andjelkovic M.、Dufner A.、Kozma S.C.、Hemmings B.A.、Thomas G。科学。1998;279:707–710.[公共医学][谷歌学者] 41比昂迪·R·M。生物化学趋势。科学。2004;29:136–142.[公共医学][谷歌学者] 43Lemjabbar H.、Li D.、Gallup M.、Sidhu S.、Drori E.、Basbaum C。生物学杂志。化学。2003;278:26202–26207.[公共医学][谷歌学者] 44McCole D.F.、Keely S.J.、Coffey R.J.和Barrett K.E。生物学杂志。化学。2002;277:42603–42612.[公共医学][谷歌学者] 45Anderson K.E.、Coadwell J.、Stephens L.R.、Hawkins P.T。货币。生物。1998;8:684–691.[公共医学][谷歌学者] 46Currie R.A.、Walker K.S.、Gray A.、Deak M.、Casamayor A.、Downes C.P.、Cohen P.、Alessi D.R.、Lucocq J。生物化学。J。1999;337:575–583. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47Vanhaesebroeck B.、Alessi D.R。生物化学。J。2000;346:561–576. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 48Reddy P.、Slack J.L.、Davis R.、Cerretti D.P.、Kozlosky C.J.、Blanton R.A.、Shows D.、Peschon J.和Black R.A。生物学杂志。化学。2000;275:14608–14614.[公共医学][谷歌学者] 49Lee K.Y.、D’Acquisto F.、Hayden M.S.、Shim J.H.、Ghosh S。科学。2005;308:114–118.[公共医学][谷歌学者] 50Hill M.M.、Andjelkovic M.、Brazil D.P.、Ferrari S.、Fabbro D.、Hemmings B.A。生物学杂志。化学。2001;276:25643–25646.[公共医学][谷歌学者] 51哈里斯·T·K。IUBMB寿命。2003;55:117–126.[公共医学][谷歌学者] 52佐藤S.、藤田N.、津饶T。致癌物。2002;21:1727–1738.[公共医学][谷歌学者] 53Senderowicz A.M.公司。癌症生物学。疗法。2003;2：S84–95。[公共医学][谷歌学者] 54Flynn P.、Wongdagger M.、Zavar M.、Dean N.M.、Stokoe D。货币。生物。2000;10：1439–1442。[公共医学][谷歌学者] 55Heo D.S.、Snyderman C.、Gollin S.M.、Pan S.、Walker E.、Deka R.、Barnes E.L.、Johnson J.T.、Herberman R.B.、Whiteside T.L。癌症研究。1989;49:5167–5175.[公共医学][谷歌学者] 56萨克斯·P·G、帕内斯·S·M、加里克·G·E、曼苏里·Z、利希特纳·R、萨蒂亚·普拉卡什·K·L、帕塔克·S、帕森斯·D·F。癌症研究。1988;48:2858–2866.[公共医学][谷歌学者] 57Riser B.L.、Mitra R.、Perry D.、Dixit V.、Varani J。癌症研究。1989;49:6123–6129.[公共医学][谷歌学者] 
