血浆胆固醇调节由幽门螺杆菌真空细胞毒素

培养幽门螺杆菌和VacA的纯化。

幽门螺杆菌700392按上述方式种植(5).幽门螺杆菌在含有5%FBS和5μg万古霉素/ml的无亚硫酸盐和亚硫酸盐布鲁氏菌肉汤中，在37°C的5%氧气-5%二氧化碳-90%氮气气氛下，在旋转台振动器上的培养瓶中培养48小时至固定相。幽门螺杆菌培养物通过使用Sorvall RC2-B离心机在4°C下以7500的相对离心力进行离心收集。VacA最初通过硫酸铵（50%）沉淀分离和浓缩。将硫酸铵饱和颗粒重新悬浮并透析到PBS（pH 7.2）中。通过快速蛋白液相色谱法，在HR16/50柱（新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚）中使用Superose 6制备级树脂进一步纯化浓缩的VacA，之前在PBS（pH 7.2）中4°C下平衡。利用兔抗VacA多克隆抗体通过免疫印迹分析快速蛋白液相色谱组分的VacA(59). 通过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进一步分析显示交叉反应物质的组分，然后进行考马斯亮蓝染色。使用Centricon 100离心微浓缩器对纯度最高的馏分进行混合和浓缩，并在4°C下保存，直至使用。

激活VacA。

如前所述，通过滴加0.1 N HCl对VacA进行酸活化，直至溶液的pH值约为3(12). 将溶液在37°C下培养30分钟，然后通过滴加300 mM NaOH重新中和，直到溶液pH值约为7。

细胞培养。

所有哺乳动物细胞均以单层形式培养在25cm²37°C、5%CO下的塑料瓶₂HeLa细胞在90%Dulbecco最小必需培养基（DMEM）中生长。Vero细胞在含有1 mM丙酮酸钠、2 mM伊格尔最小基本培养基的90%培养基中培养我-谷氨酰胺、0.1 mM非必需氨基酸和1.5 g碳酸氢钠/升。CHO-K1和AGS细胞系在含2 mM的90%Ham’s F-12培养基中培养我-谷氨酰胺调整为每升含有1.5克碳酸氢钠。所有培养基均补充10%FBS、100U青霉素/ml和100mg链霉素/ml。在每次实验前24小时，将100μl细胞以1×10的密度接种到96孔板的每个孔中⁵细胞/ml。

操纵细胞系。

除非另有说明，否则用不同浓度的每种药物预处理哺乳动物细胞系1小时。制备以下储备溶液：蒸馏水中每毫升400 mg MβCD；蒸馏水中每毫升0.5毫克HPCD；蒸馏水中50 mMβ-CD复合胆固醇（水溶性）；甲醇中每毫升5毫克菲利平；在PBS中每毫升1毫克皂苷；乙醇中的1 mM洋地黄素；二甲基亚砜中制霉菌素5mg/ml；在50%乙醇中的1mM洛伐他汀；乙醇中的10 mM压实素；蒸馏水中每毫升含1毫克氯丙嗪。在含有5 mM NH的DMEM中稀释的酸活化VacA₄将Cl添加到细胞中并在37°C下孵育24小时。在一些实验中，细胞在4或37°C的温度下用酸活化的VacA预孵育4小时，然后用MβCD、HPCD或β-CD复合胆固醇再孵育24h。

细胞空泡化分析。

用Olympus CK2相控倒置显微镜观察VacA诱导的HeLa细胞空泡化。如前所述，根据哺乳动物细胞对中性红的吸收来量化真空化(4). 在每个实验结束时，从细胞单层中吸取培养基。每孔用100μl中性红溶液（在DMEM中稀释1:6）培养单层4分钟。用200μl/孔的PBS清洗细胞一次后，用100μl酸化乙醇（0.37%[vol/vol]HCl溶于70%[vol/vol]乙醇中）培养细胞。使用Dynatech MR5000微量滴定板阅读器测量530 nm处的吸光度减去410 nm处的吸光度，从而测定中性红吸收。

将每个孔的中性红摄取读数归一化为总蛋白。细胞单层用200μl PBS/孔清洗一次，并用50μl M-PER/孔溶解。以牛血清白蛋白（BSA）为标准物，采用考马斯Plus蛋白分析试剂测定总蛋白浓度。通过将中性红摄取数据除以总蛋白质浓度，对每个孔的值进行标准化。

胆固醇定量。

用PBS清洗细胞单层，用离解缓冲液分离，在含有0.1%SDS、1 mM Na的缓冲液中溶解₂EDTA和0.1 M Tris-HCl（pH 7.4），并使用连接至1 ml注射器的19号针头进行均质(19). 根据制造商的说明，使用Infinity胆固醇试剂盒测定胆固醇含量。在每个孔中，使用考马斯Plus蛋白质分析试剂将总胆固醇含量归一化为总蛋白质浓度。

哺乳动物细胞活力分析。

根据制造商的规范，将组合的LIVE/DEAD分析试剂添加到八个室载玻片中生长的HeLa细胞单层中。细胞在室温下孵育30至45分钟，用PBS洗涤三次，并用荧光显微镜（Olympus BX60）进行目测分析，以计算死亡和活细胞的数量。

VacA的体外转录和翻译。

³⁵S-VacA由根据制造商规范使用的TNT T7耦合网织红细胞裂解物系统生成；pET20b-VacA被用作模板[³⁵S] 蛋氨酸（比活性，1175 Ci/mmol）。pET20b-VacA包含编码T7启动子下游全长成熟VacA（残基1至821）的基因，并取代Nde公司我-巴姆如前所述，母体质粒pET20b的HI片段（63）。通过SDS-PAGE分析每个反应混合物，然后使用富士荧光成像仪成像，以确定耦合转录-翻译反应的效率。在4°C下，在结合缓冲液（50 mM HEPES[pH7.2]、100 mM氯化钠、1 mM氯化钙、1 mM-氯化镁、100 mg BSA/ml）中对体外翻译的放射性标记VacA进行三次透析，并将其储存在−20°C下。利用放射性标记蛋氨酸的比活度计算VacA浓度。已知浓度的放射性标记的VacA和未放射性标记的纯化VacA被酸活化并中和在一起(12).

细胞内化分析。

96孔板接种100μl含有1×10的悬浮液⁵HeLa细胞/ml，并在37°C下培养24 h。HeLa单分子膜在37°C下用MβCD或PBS（pH 7.2）预处理1 h。酸活化、放射性标记的VacA（50 nM）能够诱导细胞空泡化，以及具有5 mM NH的等体积完整DMEM₄将含有Cl的MβCD或PBS加入到HeLa细胞单层中。在37°C下培养5 h后，用冰镇0.9%NaCl清洗细胞单层三次，并用新制备的250μg/ml蛋白酶K溶液在4°C下处理30 min。将蛋白水解细胞立即置于沸水中5分钟，使蛋白酶K失活。使用LS-6001C-Beckman 15617C型闪烁计数器通过闪烁计数定量放射性。用考马斯Plus蛋白分析试剂定量每个孔中的总蛋白。样品通过SDS-PAGE进行分析，随后使用富士荧光成像仪进行可视化。

细胞结合分析。

在96孔板上接种100μl含有1×10的悬浮液⁵HeLa细胞/ml，在37°C下培养24小时。HeLa单分子膜在37°C下用MβCD或PBS（pH 7.2）预处理1小时，然后在4°C下孵育1小时。冷却、酸活化、放射性标记的VacA和等体积的预冷全DMEM与5 mM NH一起₄将含有MβCD或PBS的Cl添加到单层中。在4°C下培养4 h后，用冰镇结合缓冲液快速清洗细胞三次，并在100μl M-PER中溶解。通过重新悬浮在2ml闪烁液中的样品的闪烁计数来量化放射性。将回收的辐射归一化为每个孔中的总蛋白浓度。

VacA的放射性碘化。

纯化的VacA用放射性标记¹²⁵I使用制造商规定的IODO-GEN预涂碘化管。使用Micro-Bio-Spin色谱柱从游离碘中分离放射性标记的VacA。蛋白质浓度通过微量BCA分析测定，并使用Apex自动γ计数器（型号28023；美国生物医学顾问公司，密苏里州史密斯维尔）量化标记的比活性。

培养细胞的清洁剂提取。

HeLa细胞单层（1×10⁵细胞/ml）预冷至4°C并与预冷培养¹²⁵4°C时的I-VacA（0.05至25μM）。4h后，使用分离缓冲液分离HeLa细胞，并在300×克将细胞重新悬浮在0.5 ml冷TNE缓冲液（25 mM Tris-HCl[pH7.5]，150 mM NaCl，5 mM EDTA）中，每ml补充1%Triton X-100和25μl蛋白酶抑制剂鸡尾酒组III。在4°C下培养细胞24小时，在16000×克温度为4°C。通过γ计数定量上清液中的放射性（洗涤剂可溶部分）和颗粒中的放射性。

蔗糖密度离心。

HeLa细胞的融合单层与¹²⁵I-VacA（1至25μM）在4°C下完全DMEM（pH 7.4）中放置4小时。用冰冷的PBS洗涤细胞三次，使用解离缓冲液分离，并通过300×克将细胞重新悬浮在0.5 ml冰镇TNE缓冲液中，每ml补充1%Triton X-100和25μl蛋白酶抑制剂鸡尾酒组III。通过在4°C下旋转摇晃使膜溶解过夜。用逐步蔗糖梯度纯化耐洗涤剂膜（DRM）。将细胞裂解液中的蔗糖浓度调节为41%（在10 mM Tris-HCl中，pH 7.4），将裂解液装入SW40 Beckman管的底部，并覆盖8 ml 35%的蔗糖，随后覆盖15%的蔗糖。使用带SW40转子的Beckman XL-80超速离心机在4°C下以35000 rpm离心18 h后，从蔗糖梯度的顶部到底部收集12个1-ml组分。每个部分的放射性通过γ计数进行量化。

VacA与胆固醇联合免疫沉淀。

VacA-胆固醇联合免疫沉淀是使用前面描述的方法进行的(20). 将单独的VacA（0.1至5μM）或缓冲液与[³H] 胆固醇（25至100 nM）在室温下搅拌2小时。样品在18000×克在4°C下保持5分钟。上清液与抗VacA抗体一起孵育(59)在4°C下搅拌1小时。然后添加蛋白质G-Sepharose（15μl），并在4°C下继续培养1 h，再次搅拌。样品在18000×克在4°C下放置10分钟，并丢弃上清液。用1 ml PBS将颗粒洗涤四次，然后再悬浮在100μl SDS-PAGE样品缓冲液中（0.28 M Tris-HCl[pH6.8]，30%甘油，1%SDS，0.5 M二硫苏糖醇，0.012%溴酚蓝）。将样品在95°C下加热10 min，并通过18000×离心将珠粒造粒克持续5分钟。通过液体闪烁计数测定90μl上清液中的放射性。剩余的10μl用SDS-PAGE和VacA抗血清进行免疫印迹分析(17)以验证VacA是否沉淀。对照实验是在没有VacA的情况下进行的。每次免疫沉淀均进行三次，整个实验重复四次。

TLC重叠分析。

我们使用了改编自先前描述的方法的TLC重叠分析(53). 在TLC板上发现不同浓度的纯胆固醇（0.1至5 mg/ml）。将平板干燥并用1%卵清蛋白在1%PVP-PBS中封闭。在室温下培养3小时后，用活化或未活化的20μM VacA或PBS单独培养平板。在4°C下培养过夜后，用PBS清洗两次平板，并在37°C下用1:2000稀释的抗VacA抗体在3%PVP-PBS中培养24小时。用PBS清洗平板两次，然后在室温下用1%卵清蛋白封闭30分钟。再次清洗平板，并在37°C下用1:10000稀释的抗小鼠免疫球蛋白G-碱性磷酸酶结合物孵育1小时。通过在100 mM Tris-HCl（pH 8.8）-150 mM NaCl-1 mM MgCl中培养平板，以比色法检测结合共轭物₂37°C下含有硝基蓝四氮唑-BCIP。通过降低溶液的pH值来停止酶反应。这个实验重复了五次。

VacA与HeLa细胞相关的胆固醇拮抗作用。

酸活化的¹²⁵将I-VacA（0.1至4μM）与纯胆固醇（100μg/ml）或PBS混合，并在37°C下搅拌培养1 h。将胆固醇-VacA混合物冷却至4°C并添加到预冷的HeLa细胞中。在4°C下孵育4小时后，用冰冷的洗涤缓冲液快速洗涤细胞三次，并在100μl M-PER中裂解。通过γ计数定量放射性。用BCA法定量每个孔中的总蛋白浓度。每个结合反应进行四次，整个实验重复至少四次。

HeLa细胞的转染。

在T7启动子的控制下，用表达VacA的pET20b质粒转染HeLa细胞（63）。HeLa细胞首先被携带T7 RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒（vT7）感染(15). 将痘苗病毒株在37°C下胰蛋白酶化30 min，每5至10 min剧烈旋转，然后向HeLa细胞中添加100μl(11). 在37°C下感染30分钟后，去除病毒原液，并用在37°C下含有2.5%FBS的DMEM中稀释的质粒DNA沉淀物转染HeLa细胞。通过在100μl 0.25 M CaCl中缓慢添加4μg质粒DNA来制备质粒DNA沉淀物₂至100μl 2×HEPES缓冲盐水，频繁旋转，然后在室温下培养25分钟，然后使用。将每个DNA沉淀在含有2.5%FBS的DMEM中以1:10稀释，并向每个孔中加入100μl。将细胞在37°C下培养2至4小时，并去除转染试剂。用100μl PBS（pH 7.2）洗涤细胞两次，然后在37°C下在含有2.5%FBS和5 mM NH的DMEM中培养20 h₄氯。

增加质膜胆固醇水平会增强VacA介导的空泡化。

由于通过β-CD预处理耗尽质膜胆固醇阻止了VacA对HeLa细胞的空泡化作用，因此我们假设膜中胆固醇水平对调节VacA介导的空泡形成很重要。为了验证这一假设，我们研究了增加血浆胆固醇水平对随后被VacA中毒的HeLa细胞的影响。在应用酸活化的VacA之前，用β-CD复合胆固醇在37°C下预处理HeLa细胞单层1小时(60). 用与β-CD复合的胆固醇预处理HeLa细胞会导致细胞胆固醇水平升高（表​（表1）1)在单层中没有可检测到的细胞毒性或形态变化（图。​（图4A，4A级面板c和d）。然而，胆固醇预处理明显增强了VacA引起的细胞空泡化。在低VacA浓度下，单层细胞中只有1%到5%的细胞产生液泡，用β-CD复合胆固醇预处理会导致几乎整个单层细胞的液泡化（图。​（图4A，4A级面板a和b）。与这些观察结果一致，在应用VacA之前用β-CD复合胆固醇预处理的HeLa细胞，相对于单独使用VacA处理的细胞，中性红摄取量呈剂量依赖性增加（图。​（图4B）。4B类). 总之，这些结果表明，质膜胆固醇浓度调节VacA诱导的细胞空泡化，低水平降低空泡化程度，高水平增加空泡化。

在单独的窗口中打开

图4。

胆固醇以剂量依赖的方式增强VacA介导的空泡化。HeLa细胞与100μM胆固醇预孵育1h，然后与酸活化的VacA（25μg/ml）孵育。24小时后，通过相控显微镜（A）或中性红摄取定量（B）分析HeLa细胞单层的空泡化。（A） 用VacA处理的HeLa细胞（A组）、胆固醇加VacA（b组）、PBS（c组）或胆固醇单独处理的HeLa细胞（d组）。（B） 如材料和方法所述，对HeLa细胞进行中性红摄取分析。这些数据是至少一式四份的代表性实验数据。误差线表示标准偏差。

质膜胆固醇调节多个细胞系的空泡化。

接下来，我们测试了在HeLa细胞中观察到的质膜胆固醇水平对VacA介导的细胞空泡化的重要性是否可以在其他上皮衍生细胞系中重现。值得注意的是，先前已经报道了细胞系对VacA敏感性的差异(10,39)可能是因为细胞结合和/或内化所需的质膜成分不同。在应用酸活化的VacA之前，用MβCD、HPCD或β-CD复合胆固醇在37°C下预处理Vero、CHO-K1、HeLa或胃源性AGS细胞单层1小时。24小时后，中性红摄取被量化，结果显示，MβCD阻断了每个细胞系中VacA介导的空泡化（图。​（图5A）5A级)和HPCD（图。​（图5B）5亿)以剂量依赖的方式。这些结果通过相控显微镜进行了验证，结果表明，用4 mg MβCD/ml或30μg HPCD/ml预处理的每个细胞系中的液泡化完全被阻断（数据未显示）。类似地，用β-CD复合胆固醇对单层进行预处理会增强所有被测细胞系的空泡化（图。​（图5C）。第5页). 这些数据表明，在多个细胞系中，质膜胆固醇水平调节VacA诱导的空泡化。

在单独的窗口中打开

图5：。

胆固醇调节多个细胞系对VacA的敏感性。将CHO-K1、Vero、HeLa和AGS细胞与不同浓度的MβCD（A）、HPCD（B）或胆固醇（C）在37°C下预孵育1 h，然后与酸活化的VacA孵育。24小时后，如材料和方法中所述，通过定量中性红的摄取来分析细胞的空泡化。这些数据是至少一式四份的代表性实验数据。误差线表示标准偏差。

质膜胆固醇调节VacA与靶细胞的结合。

为了确定质膜胆固醇是否直接影响VacA细胞中毒的机制，我们研究了质膜胆固醇耗竭对细胞吸收VacA的影响。HeLa细胞在37°C下用4mg MβCD/ml或PBS（pH 7.2）预孵育，然后用酸活化在37°C下孵育4h³⁵S-放射性标记的VacA（50 nM），如前所述制备(16). 对细胞进行抗蛋白酶K处理的VacA分析。如前所述，经蛋白酶K处理后的SDS-PAGE分析显示，VacA很容易进入细胞(28,43). 为了测试从质膜中消耗胆固醇是否影响内化，用浓度为4 mg/ml的MβCD对细胞进行预处理，该浓度可完全阻止VacA介导的细胞空泡化，然后用酸活化的VacA再处理4小时。用MβCD对HeLa细胞单层进行预处理后，发现放射性标记的VacA的回收率降低到仅用VacA预处理的对照单层观察到的水平的30%以下（数据未显示），这表明膜胆固醇的消耗减少了VacA进入靶细胞的量。

VacA内化的减弱可能是由于VacA与MβCD处理细胞的结合减少所致。来自两个独立小组的独立报告表明，VacA以非特异性方式与哺乳动物细胞结合(28,43). 与之前的研究一致，我们检测到放射性标记的VacA（0.5到50 nM）与HeLa细胞单层的剂量依赖性结合（数据未显示）。与之前的报告类似，我们还发现，当细胞与非放射性标记的VacA的50倍摩尔过量共聚时，VacA（10 nM）与HeLa细胞的结合没有受到明显抑制（数据未显示）。我们使用完全阻断VacA基空泡化的MβCD浓度提取膜胆固醇，并测试VacA与细胞的相关性。用4 mg MβCD/ml在37°C下预处理细胞1 h，然后冷却至4°C至少1 h。允许酸性活化放射性标记的VacA（50 nM）在4°C下结合4 h。然后对细胞进行广泛清洗和溶解，并通过闪烁计数对回收的毒素进行定量。这些实验表明，用MβCD预处理细胞可将放射性标记的VacA的回收水平降低至约为单独用PBS预处理的对照单层细胞的60%的水平（数据未显示）。

消耗胆固醇药物减少VacA与培养的哺乳动物细胞的相关性的证明表明，VacA可能直接与富含胆固醇的洗涤剂不溶性膜微结构域（称为DRM）相关。为了验证这一假设，我们将放射性标记的VacA和单层HeLa细胞预冷至4°C培养，如上所述。4小时后，用1.0%Triton X-100提取细胞，通过离心分离并量化可溶部分中的辐射和不可溶部分的辐射。在对照实验中，我们分析了用¹²⁵I-转铁蛋白和¹²⁵I-霍乱毒素，已被证明主要分离为洗涤剂可溶部分和不可溶部分。这些实验表明，放射性标记的VacA主要分离为不溶性部分，如霍乱毒素（图。​（图6A）。6A级). 相反，转铁蛋白主要存在于可溶性部分。

在单独的窗口中打开

图6。

VacA与洗涤剂不溶微区的关联。HeLa细胞单层与酸活化培养¹²⁵I-放射性标记的VacA（50 nM）（○），霍乱毒素（10 nM）(▪), 或含有NH的DMEM中的转铁蛋白（10μg/ml）（▴）₄氯（5 mM）。在4°C下培养4h后，用冰镇PBS清洗细胞三次，分离细胞，并在300×克持续5分钟。将细胞重悬于0.5 ml冷TNE缓冲液中，该缓冲液补充有1%Triton X-100和25μg蛋白酶抑制剂混合物III/ml。通过在4°C下旋转振荡溶解膜。（A） 上清液（洗涤剂可溶部分）和颗粒（洗涤剂不溶部分）中的放射性按照材料和方法中的描述进行量化。（B） 如材料和方法中所述，用逐步蔗糖梯度纯化DRM。这些值是总计数的百分比。这些数据是来自至少进行四次的代表性实验的数据。误差线表示标准偏差。

为了进一步研究VacA与DRM结合的观点，我们通过密度梯度离心法分离洗涤剂提取的细胞。放射性标记的VacA与HeLa细胞单层在4°C下培养4 h。细胞用1.0%Triton X-100清洁剂提取，如上所述，并使用蔗糖密度梯度进行分级。收集单个组分，并量化每个组分中的辐射。如图所示。​图6B，6亿从蔗糖密度梯度顶部收集的组分中富集了细胞相关的VacA。对照实验表明，霍乱毒素（而非转铁蛋白）在蔗糖密度梯度的顶部富集。此外，从蔗糖梯度顶部收集的组分中，单独的VacA（在没有细胞的情况下）没有富集（数据未显示）。总的来说，细胞相关的VacA不溶于洗涤剂，漂浮在蔗糖密度梯度的顶部，这表明VacA可能直接与哺乳动物细胞表面的DRM结合。

由于VacA介导的空泡化依赖于质膜胆固醇水平，并且胆固醇是DRM的主要成分，因此VacA可能与胆固醇直接相关。我们尝试使用三种不同的方法检测VacA-胆固醇相互作用，如材料和方法所述。首先，我们确定了预先培养VacA和胆固醇是否会拮抗毒素和靶细胞的结合。其次，我们尝试在TLC板上检测VacA与纯化胆固醇的结合。最后，我们研究了放射性标记胆固醇是否会与VacA共沉淀。重复使用这三种方法都未能证明VacA和胆固醇之间可检测的相互作用（数据未显示）。这些结果表明，VacA可能与除胆固醇以外的DRM成分有关。

我们感谢P.Hardin使用荧光显微镜，也感谢A.Vailas和D.Martinez使用他们实验室的微量滴定板读数器。P.Roch被公认为协助编写手稿，Jessica Feith被公认为是细胞胆固醇水平的初始表征。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（AI45928拨款）、罗伯特·A·韦尔奇基金会（E-1311拨款）和美国心脏协会（BG472拨款）的支持。