在真核细胞中，DNA模板的可及性受染色质结构的影响。例如，在酿酒酵母，转录因子已被证明与基因上游的共有序列相结合，优先于发生在转录基因编码序列中的相同共有序列(24,31). 同样，转座子优先插入启动子区域(33)以及减数分裂重组所需的双链断裂酿酒酵母优先发生在基因启动子而不是编码区(12,55). 因此，染色质上下文是基因组DNA模板上许多生物现象将发生的主要决定因素。
DNA模板可及性的调节可能在很大程度上通过核小体占有率的差异调节进行调节。的启动子区域酿酒酵母全基因组核小体占有率降低(2,26)核小体占有率的这些差异对启动子的可及性很重要(47). 此外，在酿酒酵母启动子和非调节染色质可以进行生化分离，表明这些区域具有不同的物理性质(36). 核小体可以通过几种一般机制从特定基因组区域移动或移位，包括核小体重塑复合物，如SWI/SNF和RSC(34)活化剂与DNA的结合(三,4,35)，RNA聚合酶II（RNAP II）的转录延伸(20,26,46)和DNA序列的固有属性(47). 模板可及性和核小体占有率也可以通过N末端组蛋白尾部的翻译后修饰介导，最显著的是乙酰化(27,48). 虽然染色质上下文可能部分由组蛋白修饰的区域差异来定义，但没有发现染色质标记与整个基因组的编码或调控区域特别对应。在此，我们提出证据证明组蛋白H3在赖氨酸36（H3K36me2）处的二甲基化，这是由甲基转移酶Set2p介导的(25,51)，可提供此类标记。
Set2p与RNAP II的C末端域（CTD）相互作用(22,29,56)这种相互作用由CTD的磷酸化状态调节。CTD重复序列的丝氨酸5（Ser5）在转录起始时被Kin28p磷酸化，而丝氨酸2（Ser2）和Ser5在伸长过程中被Ctk1p磷酸化(8,17,19,30). Set2p优先与RNAP II CTD的Ser2/Ser5磷酸化重复序列相关CTK1型废除H3K36me2(22,56). Set2p-RNAP II相互作用也依赖于Paf1复合物（Paf1p、Rtf1p、Cdc73p、Ctr9p和Leo1p）(22)也与RNAP II相关(21,40,49). 这一和其他生化数据表明，Set2p在转录延长期间与RNAP II特异性相关(18,22,29,45,56). 染色质免疫沉淀（ChIP）分析，然后在一些选定的基因座上进行定量PCR，支持了这一说法，表明H3K36me2通常局限于RNAP II调节基因的转录区域(1,18,22,45).
虽然有强有力的证据表明Set2p与伸长聚合酶有关，但Set2p和H3K36me2的生理功能尚不清楚。有证据表明，Set2p在转录延伸中起作用，其结果显示集合2延伸抑制剂6-氮杂嘧啶的Δ应变。这些表型与编码延伸因子如Chd1p、Iswi1p和Fkh1p的基因缺陷菌株表现出的表型相似(22,28,29,45,57). 转录延伸的作用也得到了间合成遗传相互作用的支持集合2Paf1复合物所有成员的Δ和缺失、色域因子Chd1p、假定的延伸因子Soh1p和组蛋白H2B泛素化复合物的Bre1p或Lge1p组分(22). 然而，Set2p在伸长率中扮演的任何角色都不是必需的或多余的，因为集合2Δ菌株是可行的，在许多背景下，表现出非常温和的表型。
为了进一步阐明H3K36me2的细胞功能，我们测定了其在整个细胞中的分布模式酿酒酵母基因组。我们进行了额外的实验，以确定H3K36me2的模式如何响应全局转录状态的变化以及H3K36me2标记与核小体稳定性之间的关系。H3K36me2界定了酵母基因组染色质结构上不同的调节和非调节区域，并可作为染色质上下文的指示物。
材料和方法
术语。
在整篇论文中，我们使用了最近提出的统一组蛋白修饰命名法(53). 因此，例如，“H3K36”是指残基36处的组蛋白H3赖氨酸，“H3C36me2”是指该残基的二甲基化。
菌株和培养条件。
对于H3K36me2和组蛋白H3 ChIPs，菌株AS4(垫子αtrp1-1型 arg4-17 tyr7-1 ade6 ura3)已使用(50). 对于组蛋白H4 ChIPs，之前描述的myc标记的H4菌株在菌株UCC1111中构建[垫子αade2::他的3-Δ200 吕2-Δ0赖氨酸2-Δ0 符合15-Δ0个trp1-Δ63 尿酸3-Δ0小时4::URA3-TEL公司（VII-L）时2分-时2分::MET15型 hhf1小时1小时::LEU2级pRS412型(ADE2 CEN ARS系统)-HHF2-HHT2型]已使用(37,38). 除非另有说明，否则在100 ml酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）中，在600 nm下将酵母培养至0.8至1.0的光密度，并在30°C下摇晃。
抗体。
抗组蛋白H3赖氨酸36二甲基化的抗体已在前面描述过(51)和源自Upstate（目录号07-369）。myc标记抗体也从Upstate获得（目录号05-419）。兔组蛋白H3抗血清从Abcam，Inc.（AB1791）获得，并使用与人类组蛋白H4的氨基酸124至135（CGIQLIRERGERA）相对应的肽在兔体内培养。
斑点印迹。
肽（KSAPSTGGVK（K）KPHRYKPGTGK-生物素），其中对应于H3K36（下划线）的残基是单甲基、二甲基或三甲基的，将其重新悬浮在双蒸馏H中2O（10μg/μl），并在Tris缓冲盐水（TBS）（150 mM NaCl，10 mM Tris，pH 7.6）中连续稀释。使用Bio-Rad点印迹设备将100μl肽TBS溶液的等分试样点在聚偏二氟乙烯膜上。在TBS中清洗膜，然后将其封闭在2.5%（wt/vol）康乃馨脱脂奶粉和TBS-Tween 20（TBS中0.1%吐温20）的溶液中10分钟，然后在室温下用规定抗体的1:10000稀释液培养2小时。用TBS-Tween 20清洗膜三次，每次10 min，用抗兔辣根过氧化物酶结合免疫球蛋白G在室温下培养2 h，然后再次清洗三次，然后使用Amersham的ECL-Plus进行检测。
ChIP分析。
如前所述进行ChIP分析(23). 简单地说，全细胞提取物是由1%甲醛固定的野生型和集合2使用裂解缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，300 mM NaCl，1 mM EDTA，1%Triton X和0.1%脱氧胆酸钠）对Δ细胞进行超声剪切染色质（0.25-1kb范围）。使用抗H3K36me2、抗myc或抗H3进行免疫沉淀。在65°C下交联逆转后，根据制造商的说明，使用QIAGEN PCR纯化试剂盒提取DNA。
DNA扩增、标记、阵列杂交和数据处理。
如前所述，在所有实验中扩增富含ChIP的DNA和参考DNA(5). 简单地说，使用引物1（5′-GTTCCCAGTCAGCGATCNNNNNN-3′）用T7 DNA聚合酶进行两轮初始DNA合成，然后使用引物2（5′-GTTTCCCAGCACGATC-3′）进行25次PCR。然后使用引物2将Cy3-UTP或Cy5-dUTP与额外的25个PCR循环直接结合。使用标准程序进行微阵列杂交(16). 阵列用GenePix 4000扫描仪扫描，数据用GenePix 5.0软件提取。数据进行了标准化处理，以便中值对数2每个阵列上所有质量元素的比值等于零，并且检索每个点的像素比值中值。通过目视检查，只有高质量的斑点，至少有50像素的质量数据（回归R（右）2（>0.6）和参考信号强度强（>350U），用于分析。至少一半阵列上不符合这些标准的阵列元素被排除在分析之外。在进一步分析之前，对所有数据进行了日志转换。对于核小体占有率数据的标准化，中值对数2从H3K36me2-ChIP比值中值中减去H4-myc-ChIP比值。除非另有说明，否则所有数据都是以这种方式归一化的核小体占有率。虽然许多批量核小体标准化的方法都是可能的，但所有方法都必须解决将用两种不同抗体产生的ChIP数据集相结合的固有困难(6). 这里使用的方法是最简单的，与非规范化数据相比，它提供了更真实的修改模式表示。我们提供所有原始数据（见下文），以便读者可以应用他们首选的规范化方法。
DNA微阵列制备。
如前所述，使用机器人阵列器对酵母（S288C）的开放阅读框（ORF）和基因间区进行PCR扩增并打印在聚赖氨酸涂层玻璃载玻片上(16). ORF通常由从起始密码子延伸到终止密码子的PCR产物表示。代表基因间区域的元素通常包括注释ORF之间的所有DNA，片段被分割，PCR产物不超过1.5kb。
ChIP富集的位点特异性检测。
使用的引物序列（见图。和)如表所示.
验证H3K36me2在第十二染色体16 kb上的分布并进行精细标度绘图。（A） 染色体XII坐标1036089至1052141的示意图，显示了用于询问三个独立的H3K36me2 ChIP-chips的引物的位置，如图所示。表中列出了底漆组（B）面板A（测试）中所示引物组产生的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶分析。参考产物（Ref）对应于V号染色体上YEL073C和YEL072W之间的一个大非编码区的146 bp。（C）面板B所示凝胶的定量。图中显示了H3K36me2和组蛋白H4-myc ChIPs之后PCR引物集检测到的平均富集度。每个片段的绘制值计算如下：[(w个/x个)/(年/z)]，其中所有值都是每个频带的像素强度之和。w个，ChIP片段；x个，ChIP参考；年，输入测试片段；z，输入参考。因此，数字反映了相对免疫沉淀效率；值可能小于1。误差条显示了与平均值的平均偏差。（D） 用一般核小体占据水平标准化后的H3K36me2富集值。绘制的值计算如下：[(w个/x个)/ (年/z)]H3K36me2型/[(w个/x个)/(年/z)]H4-myc公司.
基因激活后H3K36me2获取的验证和精细制图。（A） 的示意图PHM7型基因座，显示了用于询问图中所示的三个独立H3K36me2 ChIP芯片的引物的位置。热休克前后。底漆组列于表中（B）面板A（测试）中所示引物组产生的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶分析。参考产品（参考文献）与图。（C）图B所示凝胶的定量。图中显示了热休克前后PCR引物集在H3K36me2和组蛋白H4-myc ChIPs之后检测到的平均富集度。按照图的图例所述计算每个碎片的绘制值。（D）用一般核小体占有率水平归一化后热冲击前后的H3K36me2富集值，如图图例所示进行计算。热休克后H3K36me2水平升高。注意，增加主要局限于代表基因中心和3′端的区域R、S和T，而不是分别代表5′端启动子和编码序列的区域P和Q。
表1。
| 设置 | 正向引物（5′至3′） | 反向引物（5′至3′） |
|---|
| A类 | GGAGCATGCACTAAGTGTG公司 | CGTCTCAAAAGCACTCTCT |
| B类 | TAAGGCATCCAGAAAAAGAGC公司 | CAGAGGTTCATTGACGCTTCAG公司 |
| C类 | CTGCGGTGCACAGAGAGATAA公司 | CGTGAGCGCTTACGAATCTC公司 |
| D类 | CGTTAGGTGAACCACCTGAAGTG公司 | CCTGAGGACCTTCAAAGTTGC |
| E类 | CACCTAAGGGAGTTGCTGTTTTAC公司 | GGCAGTAATGGGTCATCTG公司 |
| F类 | GAAGAGACATGAAGTATGCGAAG公司 | GGACGAGAGATAAAGACAGAG公司 |
| G公司 | CAGTCTACACTCCTTGTCAC公司 | GTGGAGACGCTGGTTTTC公司 |
| H（H） | GTGTTAGCAGCCAAAGGTG公司 | CTGAAACTGCACGGTCGATAC公司 |
| 我 | CCACGTTCGTTATTATATCTATCG | CCGTTCTTGCTGACATGTTTTC |
| J型 | CCTATTTTTTGGCTTTAACTCAAC公司 | CTGTCCTTTGTAATAGCTACGTTC公司 |
| K（K） | CCGATTAATGTCTACTGAAGTGG公司 | CATTAGTAGATTTGTGGAATCA公司 |
| L（左） | GGTGCTAGGTCGGTTTTTATG公司 | 计算机辅助 |
| M（M） | CGCAGATGTCCACCATTATTC公司 | 关贸总协定 |
| N个 | GCCGTTGCAAAGCTAACTTTC公司 | GTGGTCTCAACGTTTTAACAACC公司 |
| O（运行） | 加拿大政府 | CATGGTCTCTTGCCCAGTTG公司 |
| P（P） | CGTTAATCTCCCTGAAATACTTTAAATAC公司 | CGCTGCTTTGAATATGTGGC |
| 问 | GGAGAGAGAACGGAACC公司 | GTTGGTAACATTTGAAAATGAGAG公司 |
| R（右） | CTTCCTGATGTGTGTCATACT公司 | GTCAATATCAGTCAACGGTG公司 |
| 秒 | CGATGTTGAGGCATTGAAAATAAG公司 | 计算机计算机 |
| T型 | CCGCATCTGTGAGCTTGG公司 | GATAGACACTCTCACCTATAGGAACTAGTTC（加塔加卡） |
结果
ORF和ORF下游区域的染色质富含组蛋白H3赖氨酸36二甲基化。
作为我们确定H3K36me2全基因组定位目标的第一步酿酒酵母，我们鉴定了针对H3K36me2的多克隆抗体。虽然该抗体对H3K36甲基化的一般特异性已经过验证(18,57)，其对不同可能的H3K36甲基化状态（单甲基化、二甲基化和三甲基化）的精确特异性尚不清楚。为了确定该抗体对H3K36甲基化的特异性，我们对H3K 36对应残基的单甲基、二甲基或三甲基肽进行了斑点杂交（见材料和方法）。如图所示。，抗血清对H3K36的二甲基化具有特异性，并且与任何相关修饰物都没有交叉反应。
H3K36me2仅限于全基因组RNAP II转录区。（A） 将所示数量（顶部）的指定肽（右侧）印在聚偏二氟乙烯膜上，并用1:10000稀释的H3K36me2抗血清进行探测。为了验证是否存在H3K36me1和H3K365me3肽，分别使用针对这些肽的抗体平行检测补充材料中的相同印迹（见图S1）。（B） 颜色（底部刻度）表示比率的中位数[log2（H3K36me2 ChIP信号强度/标准化参考信号强度）]酵母菌属基因组数据库功能类（括号中排列的元素数量）。数据来自12个独立的野生型和8个第2套ΔH3K36me2 ChIP实验（生物复制品）。基因间区域分为以下三类：双基因，两个不同基因的上游；单个，一个基因上游；非，零基因上游。（C） 显示H3K36me2 ChIP中值对数分布的直方图2a中的比率集合2Δ应变。通过减去H4-myc对数中位数，将面板C与H的比率归一化为核小体占据率2比率（八个独立实验，野生型）或抗H3 ChIP（五个独立实验，集合2Δ）来自H3K36me2 ChIP对数中值2比率（与面板B中提到的12个ChIP相同）。（D） 与面板C相同，但适用于野生型菌株。（E） 与面板D相同，但不是计算归一化，绘制的比率是通过H3K36me2 ChIP与H4-myc ChIP的直接杂交得出的（四个独立的ChIP集）。注意，对于面板C到E，在双启动子报告的比率和相邻ORF报告的比率之间观察到正相关（数据未显示）。因此，在双启动子中报告的任何高比率可能（至少部分）归因于相邻ORF中的高比率。这可能是由于ChIP-ChIP程序和我们的微阵列的分辨率有限。（F） 与面板C相同，但适用于非编码区域。（G） 与面板D相同，但适用于非编码区域。（H） 与面板E相同，但适用于非编码区域。
在验证了该抗血清的特异性之后，使用野生型菌株的提取物进行了ChIP实验。为了评估ChIP富集的基因组片段的相对丰度，对样品进行RNase处理，扩增DNA并进行荧光标记。同时，从输入提取物中制备总基因组DNA，对RNase进行处理、扩增，并用不同的荧光标记进行标记。然后通过与DNA微阵列的比较杂交对两个样本进行分析。本研究中使用的微阵列覆盖了整个酵母基因组，包括编码和非编码区域，分辨率约为1kb（参见材料和方法）。H3K36me2 ChIP-microarray（ChIP-ChIP）实验是用总共12种独立的野生型酵母培养物进行的（详见补充材料中的表S1）。作为对照，对八种独立提取物进行ChIP-ChIP实验，其中H3K36me2通过删除设置2基因。我们发现H3K36me2 ChIPs富含染色质，与基因上游基因组区域的染色质相关的ORF相对应（图。).
在酿酒酵母，两个聚合转录基因下游的非编码区几乎总是被聚合聚合酶完全转录，通常在两条链上(15). 我们发现，这些对应于3′非翻译区（UTR）的区域被H3K36me2 ChIPs富集，富集程度等于或大于ORF中观察到的富集程度（图。). 为了确认我们的ChIP是H3K36me2水平的反映，我们使用来自集合2Δ应变。从这些ChIP中回收的DNA很少，对回收的DNA进行分析，没有发现上述特定模式（图。). 因此，我们解释H3K36me2 ChIP后每个位点的DNA恢复效率，以反映相对的H3K365me2水平。迄今为止提供的证据支持了由RNAP II转录的基因组区域富集H3K36me2的假设。
ORF上游的染色质缺乏H3K36me2。
为了进一步支持H3K36me2仅限于转录区的假设，H3K365me2的最低水平发现于两个差异转录基因（“双启动子”）的染色质上游，而RNAP II预计不会转录该基因（图。). 另一方面，由于“单个启动子”包含上游基因的3′UTR，因此预计会部分转录。正如预测的那样，单启动子的富集水平低于ORF和3′UTR，但高于双启动子（图。). 这些实验提供了组蛋白H3在赖氨酸36处的二甲基化在未被RNAP II转录的基因组区域中不存在的证据。
H3赖氨酸36二甲基化的基因组模式在一般核小体占有率归一化后仍然存在。
基因上游非编码区的核小体占有率通常低于ORF(2-4,26,43,52). 因此，我们想知道我们在H3K36me2特异性抗血清中观察到的模式是否反映了核小体的普遍占有率，至少在一定程度上是这样。为了确保我们的结果针对H3K36me2修饰，我们将H3K365me2分布数据标准化为一般核小体占有率。我们从酵母细胞中制备提取物，其中组蛋白H4的唯一来源用myc表位标记，并使用抗myc抗体进行ChIP分析。组蛋白H4-ChIP在五种独立的酵母培养物上进行。与公布的数据一致(26)组蛋白占据率ChIPs的结果显示，核小体在基因编码区的富集程度高于基因间区（图。). 使用组蛋白H3的C末端特异性抗体的核小体ChIP芯片获得了不可区分的结果（数据未显示）。同时，使用相同的提取物进行H3K36me2 ChIP。即使没有标准化，H3K36me2的分布和一般核小体占有率之间的定性差异表明，H3K 36me2模式确实是不同的。具体而言，汇聚转录基因下游的非编码区被H3K36me2 ChIP富集，其富集程度几乎与ORF中观察到的富集程度相同，而在组蛋白H3或H4 ChIP中，ORF的富集程度高于3′UTR（图。).
为了进行进一步的数据分析，我们通过减去中值对数选择了最简单的归一化例程2H4-myc ChIP-ChIP数据的比值来自H3K36me2 ChIP-cchip数据的中值（参见材料和方法）。归一化后，转录基因组区域的明显富集和基因组调控区域的相应缺失持续存在（图。). 为了测试这种归一化方法的有效性，我们在富含H3K36me2 ChIP的DNA和富含H4-myc ChIP的DNA之间进行了直接比较杂交。直接比较杂交获得的数据与计算归一化H3K36me2数据基本相同（图。).
高分辨率、局部特异性的ChIPs证实H3K36me2集中在编码区内和基因3′端的染色质中。
在H3K36me2 ChIP中，聚合转录基因下游的染色质是迄今为止最丰富的非编码染色质（图。). 这表明Set2p在整个转录长度上都是活跃的，为区分非调节性基因间区和启动子提供了可能的机制。为了验证这一观察结果，我们用PCR引物对我们的ChIP结果进行了检查，这些引物代表了染色体XII上16-kb区域的调节性染色质和转录的染色质（图。). 我们再次发现，H3K36me2 ChIPs高度富集的染色质对应于编码区和两个融合转录基因下游的区域。例如，SST2型和LEU3级都是在分析条件下转录的。它们的3′UTR长度约为450 bp(15)和由图中的引物集B、C和D表示。这些引物组所覆盖的染色质是测试区域中最富集的。
组蛋白H3K36二甲基化水平与转录频率无关。
H3K36me2在RNAP II转录基因体内染色质上的定位与早期研究一致，早期研究表明Set2p与RNAP II的延长形式有关。我们想知道转录频率是否与H3K36二甲基化程度相关。每个基因的转录频率（也称为转录率）酿酒酵母该基因是根据30°C下指数生长酵母细胞中稳态RNA水平和RNA半衰期的测量值计算出来的(14). 我们将这些公布的转录频率值与12个独立的H3K36me2 ChIP-ChIP实验的结果进行了比较。我们发现，在具有可测量转录频率（>0信使核糖核酸/小时）的基因中，H3K36me2的富集水平与转录频率无关（图。). 转录频率为1至120 mRNAs/h的基因在H3K36me2 ChIP中持续富集。例如，尽管转录率低预算14和TPK2（TPK2）H3K36me2 ChIP（分别为第97和第95百分位ChIP）中的（均为1.8 mRNAs/小时）富集程度与高转录基因（如HXK2型（71 mRNAs/小时，第96个ChIP百分位数）。这些结果表明，H3K36二甲基化主要发生在基因转录的初始或早期，随后的转录至多起维持作用。
ORF中H3K36me2水平与转录频率无关。（A） 基因在有丝分裂生长过程中按转录率排序(x个轴）(14)，并绘制了H3K36me2 ChIP中其富集度的移动平均值（mov avg）（窗口[win]=40，步长=1）（百分位秩，年轴）。在该图中，H3K36me2 ChIP值未归一化为整体核小体占有率。（B） 与面板A相同，只是绘制了H3K36me2 ChIP和H4-myc ChIP。
H3K36me2水平似乎可以补偿转录偶联核小体的丢失。
先前的研究表明，转录水平很高的基因中的染色质显示出相对较低的核小体占有率，这表明核小体在转录活性染色质上要么被移除，要么被暂时取代(26,46). 然而，对于含有二甲基化H3K36的核小体，我们没有观察到这种现象。H3K36me2的水平在基因上似乎保持不变，与它们的转录速率无关（图。). 这表明，H3K36甲基化水平是通过含有H3K36me2的核小体优先保留或H3K26甲基化随转录速率非线性增加而维持在高转录染色质上的。为了使“非线性”假设成立，H3K36me2标记必须在所有基因中都不饱和，Set2p酶活性的增加必须与转录活性的增加相联系，因为只有在大量转录的基因子集中观察到大量核小体丢失。由于转录率和H3K36me2水平之间没有相关性，因此在广泛的转录率范围内观察到（图。)我们支持“优先保留”假设。
然后我们询问在没有H3K36me2的情况下，高转录染色质上的核小体是否不太稳定。我们通过在集合2Δ应变。然而，我们发现核小体从高转录染色质中丢失的数量在集合2Δ和野生型菌株，表明核小体占有率不受H3K36me2的直接影响（参见补充材料中的图S2）。因此，其他机制可能起到稳定H3K36me2核小体的作用，或H3K365me2可能是转录稳定核小体指标，但不是原因。
H3K36二甲基化与“开启”或“关闭”转录状态相关。
H3K36二甲基化是稳定的，主要发生在基因转录的初始阶段，这一假设预测H3K36-二甲基化水平与转录率之间没有相关性（正如我们观察到的那样），但确实预测了H3K36.二甲基化程度与基因的开或关转录状态之间的正相关。我们定义一个基因，如果它有可测量的转录率（>0 mRNA/小时）(14)如果没有，则关闭（0 mRNA/小时）(14). 为了验证这一预测，我们根据H3K36me2 ChIP实验中ORF的富集水平对其进行排序，并将其平均分为10个箱子，这样，富集程度最低的10%ORF位于箱子1中，富集程度最高的10%位于箱子10中，依此类推。然后我们简单地问一下每个箱子中的基因比例是多少（图。). 结果表明，未被H3K36me2 ChIP富集的基因比其他基因更有可能关闭，并且任何给定基因关闭的可能性随着H3K36me2 ChIP富集的增加而降低。H4-myc ChIP没有观察到这种趋势（图。)或使用H3K36me2 ChIP执行集合2Δ应变（数据未显示）。这一结果提供了证据，证明H3K36me2与基因转录频率本身无关，而是与转录的发生有关。
H3K36me2水平与“开”或“关”转录状态相关。（A） 根据ORF在H3K36me2 ChIPs（归一化为H4-myc）或H4-myc-ChIPs中的富集程度，将ORF平均分为10个箱子。然后将每个仓中的ORF分类为“开启”（>0 mRNAs/hr）或“关闭”（0 mRNAs/hr）。显示了每个分类为“开”的箱子中的基因百分比。我们注意到，ORF大小和转录状态不是独立变量，因为较短的ORF往往处于关闭状态，即使删除了SGD注释的可疑ORF。然而，对相似大小的ORF而非所有ORF的分析显示了此处所示的相同模式（补充材料中的图S3）。注意，在有丝分裂生长期间，约85%的基因在可检测的水平上转录(14,15)因此，统一的H4-myc数据反映了与转录状态的中性关系。（B） 根据热休克时转录水平变化的程度对基因进行分类(x个轴）(10). 每个ORF的相对H3K36me2 ChIP富集（归一化为平行测量的一般组蛋白H4占有率）的移动平均值（mov avg）（窗口[win]=40，步长=1）(年轴）在热冲击前后绘制。大多数基因在热休克后保持不变，因此聚集在图的中心附近。右边的点表示被热休克激活的ORF，左边的点表示受到热休克抑制的ORF。
成为转录活性的休眠染色质获得H3K36me2。
H3K36二甲基化是由基因转录的初始实例建立的假设预测，当从非活性状态转换到活性状态时，染色质将在H3K36-处发生二甲基化。为了验证这一预测，我们通过将酵母细胞从25°C转移到37°C，同时诱导数百个基因的转录(7,10). 在热休克期间转录的ORF获得H3K36me2标记，而在被抑制的ORF中观察到H3K365me2水平的相对降低（图。). 特别令人感兴趣的是在对数期关闭但在热休克后强烈诱导的基因（测量到的表达增加>log22). 在这些基因中，75%（48/65）的H3K36me2水平增加。相反，在对数期关闭而在热休克期间保持关闭的基因中（<log的表达增加21） ，只有47%（306人中的144人）的H3K36me2水平升高。这些组之间的差异显著（χ2测试；P（P）= 8.6 × 10−5).
我们还观察到抑制基因ORF中H3K36me2的相对丢失。在对数阶段开启并保持活性的基因（对数2表达比率>−1），只有46%（1099/2388）的H3K36me2水平升高。相反，在对数期开启并在热休克后被抑制四倍或更多的基因中，65%（210/332）的H3K36me2水平下降（χ2测试；P（P）= 0.0014). 通过检查未归一化为核小体占有率的H3K36me2 ChIP数据（数据未显示），我们发现这种相对减少部分归因于抑制基因的大量核小体补充(26)而不是在现有核小体上丢失H3K36me2。
为了进一步证实我们的ChIP芯片数据，我们在热冲击前后沿着PHM7型（图。).PHM7型在对数生长的细胞培养中被抑制（每小时～0 mRNA），但在热休克期间由7因子诱导(10). 结果表明，该基因在热休克后获得了H3K36me2标记，并且仅在ORF的3′区（引物集R和S）获得（图。). 这一结果在我们对热休克后的体组蛋白占有率变化进行归一化后仍然存在（图。).
基因长度与测量的H3K36me2 ChIP富集度呈正相关，表明H3K36二甲基化是在转录开始的固定距离处启动的。
先前对选定基因的研究，包括ADH1（ADH1）,PYK1型,项目管理A1、和SCC2公司，表明H3K36的二甲基化是在转录起始后启动的，伴随着Set2p与伸长聚合酶的结合(1, 18,22). 如果这种机制在全基因组范围内起作用，并且无论基因长度如何，转录起始和Set2p关联之间的间隔都是恒定的，那么我们的H3K36me2 ChIP将在更大程度上丰富更长的基因。这种预测关系的原因如图所示。以及相应的图例，这是因为我们微阵列上的DNA覆盖了从起始密码子到终止密码子的每个ORF，而不管长度如何。
证据表明H3K36二甲基化开始于基因组范围内转录起始的设定距离。（A） 假设H3K36二甲基化开始于转录起始点的确定且一致的距离，这预示着较长ORF的比率将更高。请注意，“输入染色质”被用作这些实验的参考，零期望是两个通道中的原始信号强度将与ORF长度成比例，从而导致所有ORF的中性比率。预测较长ORF的较高比率完全基于二甲基化的阵列元素的相对比例，而不是阵列元素的绝对长度或基因组特征本身。例如，如果整个ORF被修改，或者，如果从转录起始开始的修饰距离与ORF长度成正比，那么长ORF和短ORF的比率将相等。蓝色圆圈，核小体在H3K36处未二甲基化。（B） ORF按其在H3K36me2 ChIPs（未归一化为H4-myc）和H4-myc-ChIPs中富集比率的长度和移动平均值（mov avg）（窗口[win]=40，步长=1）排序（来自本研究和参考文献26)绘制了。
为了验证这一预测，我们绘制了H3K36me2 ChIP的富集与ORF长度（图。). 该分析表明，更长的ORF似乎更有效地富集在H3K36me2 ChIP中，与上述假设的预测一致（图。). 在～2000 bp处观察到的“稳定”也是标记的一个预测特征，标记开始于距转录起始点的设定距离，因为未修饰的基因比例随着长度的增加而变小。使用H3K36me2 ChIPs从第2套Δ提取物（数据未显示）。我们确实观察到本研究中H4-myc ChIPs的ORF长度和表观核小体占据率之间的弱关系（参考文献中的影响甚至不太明显26). 这可能是由于核小体在转录起始点附近丢失，预计会产生这种影响。无论如何，H3K36me2 ChIPs的大小和长度之间的关系要强烈得多，这表明在ORF基因组范围内H3K365me2的起始有一个明确的边界。这一结论得到了横跨16kb染色体XII的H3K36me2 ChIP图谱的进一步支持（图。). 例如，引物集A位于距离LEU3级转录起始位点，未检测到显著富集，而引物集E所代表的染色质位于SST2型并且高度富集。同样，在相对较长的时间内FMP27（飞行管理计划第27页）编码区5′端的基因、引物集K未报告富集，但下游引物集L、M和N在编码区3′端显示染色质稳定富集。
在这个分析过程中，我们注意到，总的来说，短基因往往比长基因更频繁地转录。因此，我们想知道这里报告的长度和比率之间的相关性是否与图中的结论相混淆。为了测试这种可能性，在图中所示的相同分析中只使用了长度大于1000 bp的ORF，这些ORF没有显示长度和转录频率之间的关系。。结果图与所示图无法区分（未显示数据）。
H3K36二甲基化在转录终止时终止的证据。
迄今为止的结果证明H3K36的二甲基化仅限于转录的基因组区域。该假设的推论是H3K36二甲基化在转录终止时结束。该假设预测，两个融合转录基因之间的间隔越小，我们的H3K36me2 ChIP中测得的富集率越高。这是因为这些较短的区域可能被完全转录，而随着两个上游基因之间距离的增加，整个基因间区域被转录的可能性逐渐降低。这将导致未修饰核小体朝向片段中心，导致比率降低（如图。). 请注意，对规模和富集度之间关系的预测与前面描述的ORF情景相反。
H3K36二甲基化终止于全基因组转录终止的证据。（A） H3K36二甲基化在转录终止时结束的假设预测，较短的非促性腺激素受体的比率较高（详见正文）。蓝色圆圈，核小体在H3K36处未二甲基化。（B） 非启动子按长度排序，并绘制其富集度的移动平均值（mov avg）（窗口[win]=40，步长=1），以H3K36me2 ChIPs（未归一化为H4-myc）和H4-myc-ChIPs的百分位等级表示。（C） 与面板B相同，但适用于双启动程序。（D） 与面板B相同，但适用于单个发起人。
正如预测的那样，我们发现在我们的H3K36me2 ChIP中，这些较短的非促性腺激素区域似乎比较长的非促性腺激素区域更为丰富（图。). 相反，两个差异转录基因上游调控区的大小与ChIP的富集程度无关（图。). 单个启动子有望部分转录，因为它们包含上游基因的3′UTR。正如预测的那样，单个启动子在大小和报告的H3K36me2比值之间表现出相反的关系（弱于对非启动子的观察）（图。). 当用组蛋白H3抗体进行ChIP或在H4-myc菌株中进行ChIP时，或当从集合2Δ提取物（数据未显示）。
H3K36me2缺乏转录沉默的染色质和RNA聚合酶III转录的染色质。
为了探讨H3K36二甲基化的其他机制的可能性，我们检测了端粒和配对型基因座的染色质，这两种基因座通常在转录上沉默，但具有特殊的基因组功能。这两个区域都表现出高核小体占有率，但缺乏H3K36me2（图。). 我们还询问H3K36二甲基化是否对RNAP II转录的染色质具有特异性，或者其他聚合酶是否支持共转录修饰。由于RNAP I转录rRNA基因的重复性，我们无法对这些位点的H3K36me2水平做出结论。然而，我们检查了RNAP III转录的tRNA位点，发现这些区域没有被我们的H3K36me2 ChIP富集（图。). 虽然在RNAP III转录的区域中，核小体的总体占有率也很低，但这些结果与缺乏证据表明Set2p与RNA聚合酶III相关。因此，Set2p在H3K36二甲基化中的功能似乎仅通过其与RNAP II的关联介导。
转录沉默和RNAP III转录的染色质中H3K36me2水平很低或不存在。颜色（底部的刻度）表示报告的ChIP比率的中位数，如图的图例所示。.
讨论
而之前的研究已经检查了酿酒酵母H3K36me2位于几个位点，尚不清楚所报告的特征是否代表其他基因和基因组区域。本文报道的H3K36me2分布和动力学的全基因组分析使我们能够明确地确定该表观遗传标记的核心特性酿酒酵母这些涌现属性中最重要的如下。（i） H3K36me2在上游基因调控区、端粒、交配位点和RNA聚合酶III转录的区域中稀少或缺失。这证明Set2p的酶活性严格限制于其与RNAP II的关联。（ii）ORF内H3K36二甲基化的程度与转录的“开”或“关”状态相关，但在可测量转录的基因中，修饰程度与转录频率无关。这证明H3K36二甲基化主要发生在基因转录的初始阶段，随后的几轮最多起到维持作用。（iii）为了支持前一点，转录休眠的新转录基因获得H3K36me2标记，但其水平与诱导程度无关。（iv）Set2p酶活性开始于ORF中距离转录起始点相当恒定的距离处，该距离不随基因长度变化。（v） 转录基因下游非编码区的核小体在H3K36处的二甲基化程度与ORF中的核小体一样高。这一结果提供了证据，证明一旦Set2p与RNAP II相关，则Set2p继续活跃，并在剩余的转录长度中与RNAPⅡ相关。（vi）随着终止密码子下游距离的增加，H3K36me2水平降低。这一结果提供了证据，证明Set2p组蛋白甲基转移酶活性随着转录的终止而终止。（vii）与通常在高转录染色质ORF中观察到的核小体耗竭不同，H3K36甲基化核小体似乎难以耗竭，这表明H3K36-甲基化核小体优先保留在DNA上。然而，核小体动力学集合2缺失菌株似乎是正常的，这表明虽然H3K36me2可能是稳定性的指标，但它不太可能是必需的因素。虽然不同基因座之间可能存在一些差异，但这些核心特性揭示了围绕Set2p酶和H3K36me2本身功能的重要问题。
确定染色质修饰的全球分布面临的挑战。
在讨论H3K36me2的生物功能之前，值得一提的是，任何旨在确定组蛋白修饰基因组分布的实验都存在一些固有的挑战。在本研究中，我们使用ChIP对含有H3K36me2核小体的基因组区域进行特异性富集，然后解释每个位点的DNA回收效率，以反映每个位点H3K36二甲基化的相对量。使用这种方法，有几个因素可以在结果中产生非生物变化，包括固定作用、表位可及性、抗体特异性、微阵列含量和潜在的核小体占据率。最近的审查详细讨论了这些挑战(6,13,32,54).
这项研究包括解决其中一些问题的重要进展。首先，我们通过对H3K36me0、H3K36me1和H3K36me3肽的斑点印迹彻底证明了我们的H3K36me2抗体的特异性（图。; 另请参见补充材料中的图S1）、来自全细胞和核提取物的蛋白质印迹（数据未显示）以及集合2Δ应变（图。). 其次，我们在一张幻灯片上使用了覆盖整个基因组的DNA微阵列。与许多已发表的研究相比，这是一个显著的改进，这些研究使用了仅代表ORF或仅代表非编码基因间区的阵列，或将ChIP样本分割并将其独立杂交到仅代表ORFs或基因间区单独的阵列。使用全基因组阵列对这里提出的大多数结论至关重要(13). 第三，使用来自H3或H4-myc ChIP的数据，将H3K36me2数据归一化为大量核小体占据率，这些数据是从同一提取物并行执行的。这一点很重要，因为最近的研究表明，整个酵母基因组中的核小体占有率是异质的(2,26)如果不加解释，可能会出现误导性的模式。据我们所知，这是第一次将修改的核小体ChIP数据标准化为全基因组的明显核小体占据率。最后，我们对每个ChIP-ChIP实验进行了跟踪，在各个位点进行了基于高分辨率PCR的检测，这提供了额外的信息，并证实了从阵列结果中得出的结论。
组蛋白H3K36二甲基化的复杂基因组模式是如何规定的？
通过与双修饰CTD（Ser2/Ser5）结合，通过携带延伸RNAP II，将Set2p定向到特定基因组区域的一般机制完全足以解释我们在整个基因组中观察到的H3K36me2模式。这是一个重要的结论，因为它表明Set2p仅在与RNAP II相关时修饰染色质，而不是在染色质组装之前修饰可溶性组蛋白H3。更具体地说，全基因组分析表明，无论最终转录长度如何，H3K36me2都发生在转录起始的确定距离处（图。). 该结果与基于PCR-的单基因ChIP分析一致(1,18,22,45)这里显示的位置特异性结果表明，H3K36二甲基化开始于起始密码子下游约两个核小体。此外，数据表明Set2p染色质修饰活性在转录终止时停止（图。). 我们观察到内含子的存在与H3K36二甲基化水平之间没有关系（数据未显示）。
H3K36二甲基化的生物学相关功能是什么？
我们的结果表明，H3K36me2的水平与转录频率无关，而与转录本身的发生有关（图。和图。). 这一结果表明，H3K36甲基化通常不作为基因转录的“变阻器”。在酿酒酵母,集合2Δ菌株是可行的，在许多背景下，只表现出温和的表型。那么，H3K36甲基化是做什么的？
在个别位点，Set2p被证明是一种转录抑制因子(25,51). 在其中一项研究中，Set2p导致了镀锌4但没有检测到其他基因，在另一个基因中，Set2p被人为地连接到启动子上，导致转录抑制。因此，虽然Set2p可能在单个基因上充当转录阻遏物，或者如果在启动子上被不适当地栓系，则具有抑制转录的能力，但在基因启动子上抑制转录的一般作用与本文报道的基因组模式不一致。
考虑到Set2p与伸长聚合酶建立的相互作用以及本文报道的H3K36me2的基因组模式，很容易想象Set2p和H3K365me2在转录伸长中的作用。几条证据表明情况就是这样。也许最令人信服的是合成基因阵列分析，它揭示了当集合2Δ突变体与Paf1p复合物或转录延伸因子Chd1p或Soh1p的五种组分中的任何一种缺失相结合(22). 也有研究表明，编码Paf1复合物两个组分之一Rtf1p或Cdc73p的基因缺失，导致Set2p的招募减少项目管理A1基因并在该基因座上消除H3K36二甲基化(22). 除了这些发现，涉及6-氮杂嘧啶的研究有助于确认Set2作为延伸因子的作用(18,22,28). 然而，目前尚不清楚Set2p或H3K36me2如何参与伸长过程。Set2p与伸长的关联可能只是控制H3K36二甲基化分布的一种机制，而不是直接参与转录伸长过程。在这种情况下，在没有H3K36me2的情况下观察到的延伸缺陷可能是未能招募染色质修饰酶或其他对ORF转录延伸重要的因素的间接后果。
一种表观遗传学标记，用于区分全基因组的调节性和非调节性染色质。
像H3K36me2这样的标记也可以作为转录模式的“分子记忆”，转录模式在发育或生命周期中仅在一个时间点指定，但必须在以后保持。这个转录记忆的概念类似于为酿酒酵母H3K4me3，在该位点的染色质转录停止后很久，它在染色质上保持稳定(39). H3K36甲基化的假定“记忆”作用似乎是类似稳定的，可以通过该标记对染色质纤维产生物理影响的能力来实现，或者更可能通过招募其他改变染色质结构的重塑因子来实现(41,44). 例如，最近观察到组蛋白H3和H4乙酰化在编码区通常低于启动子，并且这种全局乙酰化模式由蛋白Eaf3p调节(42). Eaf3是NuA4组蛋白乙酰化酶复合物和Rpd3组蛋白脱乙酰化酶复合体的一个亚单位(9,11). Reid等人提出“Eaf3可能识别启动子和编码区之间不同的染色质的某些特征（例如核小体构象或非组蛋白）”(42). H3K36甲基化可能正是编码和非编码染色质的一个显著特征。
沿着这些线索，一种有趣的可能性是Set2p介导H3K36二甲基化，以产生稳定的表观遗传学标记，该标记通常用于区分全基因组的调节性和非调节性染色质。这种区别有什么作用？如引言所述，编码染色质和非编码染色质表现出几个生物学上重要的差异，其潜在的物理基础尚不清楚。基因体内较高的核小体占有率可能通过阻断编码区中的结合位点来阻止非生产性转录因子-DNA的相互作用。相反，启动子区域的核小体可能更容易被占据或分解，从而暴露结合位点并将转录因子导向适当的靶点(47). 这两种趋势协同作用，将产生减少“序列空间”的效果，在找到合适的目标之前，必须按任何给定因素搜索“序列空间“。
在酿酒酵母，约85%的基因在有丝分裂生长期间以可检测的水平转录(14,15)这意味着H3K36me2区分了整个基因组中的调节染色质和非调节染色质。在活性转录染色质结构域中，上游调控序列因缺少H3K36me2标记而明显区分。因此，H3K365me2标记在真核生物进化过程中一直保持不变，代表了第一个物理标记，已被证明在全基因组范围内区分调控序列与编码和非调控基因间序列。与转录速率无关且与转录染色质上的稳定核小体相关的转录偶联标记（此处描述的H3K36me2的这两个属性）可能是真核染色质的一般特征，有助于DNA-相关蛋白的上下文相关靶向机制。
