跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
EMBO J。2024年3月；43(6): 931–955.
2024年2月15日在线发布。 数字对象标识：10.1038/s44318-024-00051-2
预防性维修识别码：项目编号：10943020
PMID：38360997

VHL通过PHD1依赖的Beclin1羟基化抑制自噬和肿瘤生长

郑旺（音）,#1,2 梅斯燕,#三 《雷光叶》,#4 周启敏,#5 段玉然,1,2 姜红飞,6 王磊（Lei Wang）,1,2 欧阳渊,7,8,9,10 张华和,11,12 沈玉莉（Yuli Shen）,1,2 吉桂梅,1,2 陈晓涵（Xiaohan Chen）,13 齐天,1,2 李维肖（Liwei Xiao）,1,2 吴庆刚,1,2 英蒙,1,2 刘桂军,1,2 莱娜·马,6 薄磊,通讯作者11,12 卢志敏,通讯作者1,2和徐大千通讯作者1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料
数据可用性声明

摘要

Von Hippel–Lindau（VHL）蛋白在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中经常发生突变，是参与氧化应激的低氧诱导因子（HIF）的主要调节因子。然而，VHL是否具有HIF非依赖性肿瘤抑制活性尚不清楚。在此，我们证明VHL抑制营养应激诱导的自噬，其在散发的ccRCC标本中的缺失与自噬水平显著升高有关，并与患者预后较差有关。从机械上讲，VHL在其PHD1介导的Pro54羟化后直接与自噬调节因子Beclin1结合。这种结合抑制Beclin1-VPS34复合物与ATG14L的结合，从而抑制营养缺乏引起的自噬启动。非羟基化Beclin1 P54A的表达可消除VHL介导的自噬抑制，并显著降低VHL的抑瘤作用。此外，Beclin1 P54-OH水平与表达野生型VHL的人ccRCC标本中的自噬水平呈负相关，并与不良的患者预后呈负相关。此外，自噬抑制剂和HIF2α抑制剂联合治疗VHL缺陷小鼠肿瘤可抑制肿瘤生长。这些发现揭示了VHL抑制肿瘤生长的意外机制，并建议通过联合抑制自噬和HIF2α来治疗ccRCC。

关键词：VHL、Beclin1、羟基化、自噬、ccRCC
主题术语：自噬和细胞死亡，癌症

简介

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Figa_HTML.jpg

PHD1介导的脯氨酰羟基化作用靶向HIF-1α，实现VHL依赖性泛素化，是细胞氧传感机制中的关键步骤。这项研究表明，PHD1和VHL还抑制Beclin1和自噬的启动，调节异常导致肾透明细胞癌的进展。

  • PHD1在肾透明细胞癌细胞自噬前结构上介导Beclin1 Pro54羟基化。
  • VHL与Pro54羟基化Beclin1结合，并阻止ATG14L与Beclin1/VPS34之间的结合。
  • VHL抑制VPS34依赖性PI（3）P的产生、自噬启动和肾肿瘤生长。

Von Hippel-Lindau（VHL）E3连接酶与脯氨酸羟基化Beclin1结合，抑制自噬的启动并阻止肾肿瘤生长。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为44318_2024_51_Figb_HTML.jpg

介绍

Von Hippel–Lindau抑癌基因的体细胞突变(VHL（甚高频）)常见于散发性肾细胞癌（RCC），其中透明细胞肾细胞癌是最常见的亚型（Foster等人，1994; Gossage等人，2015). VHL蛋白（VHL）作为cullin支架蛋白（CUL2）-RING泛素连接酶复合物的底物识别模块，与缺氧诱导因子（HIF）1/2α结合。这种结合依赖于脯氨酰羟化酶酶（PHD1，也称为EGLN2）、PHD2（EGLN1）和PHD3（EGLN3）在HIF1/2α中两个保守脯氨酸残基的羟基化，这些酶需要氧气作为共底物（Hon等人，2002; 伊凡和凯琳，2017). 因此，在常氧条件下，PHD介导的HIF1/2α羟基化导致VHL介导的HIF1/2α泛素化和降解，而在低氧条件下，PHD的活性被低氧抑制2水平，导致HIF1/2α表达增强，从而诱导下游基因表达（Lisztwan等人，1999; Ohh等人，2000; Tanimoto等人，2000). 这个VHL（甚高频）-VHL患者肾脏出现的缺陷病变表明HIF和HIF靶基因增加，小鼠VHL（甚高频）–/–ccRCC异种移植实验揭示了HIF2α的促瘤作用和HIF1α的抑瘤作用（Kaelin，2022). 然而，一些VHL（甚高频）–/–ccRCC细胞系不受HIF2α活性操作的影响（Cho等人，2016; Stransky等人，2022)和一些VHL突变的ccRCC对HIF2α抑制剂治疗产生耐药性（Choueiri和Kaelin，2020)表明VHL缺乏通过尚未确定的HIF2α非依赖性机制促进肿瘤的发展。

自噬在癌细胞中经常失调，在肿瘤发生中起着关键作用。癌症细胞具有高水平的基础自噬，通过利用自噬分解产物（如氨基酸、核苷酸、碳水化合物和脂肪酸）进行生物合成和能量生成，上调自噬以应对微环境压力，并增加生长和攻击性（Kimmelman和White，2017; 莱文和克罗默，2008; 白色，2012,2015). 在自噬开始过程中，自噬体成核需要一种复合物，哺乳动物Beclin1（酵母中的APG6）在其中招募III类磷脂酰肌醇3-激酶VPS34，生成磷脂酰肌糖3-磷酸（PI（3）P），以将蛋白质与PI（3，从而调节细胞内运输和自噬体的形成（Funderburk等人，2010; Kim等人，2013; Saito等人，2016). ATG14L与VPS34复合，与Beclin1相互作用，靶向VPS34及其膜锚定物VPS15进入自噬前结构，并促进自噬体-内溶体融合（Diao等人，2015; Kametaka等人，1998; Obara等人，2006). 除了通过含有ATG14L的Beclin1/VPS34调节自噬外，Beclin1/1VPS34还与抗紫外线相关基因（UVRAG）形成一个独特的复合物，以调节内吞贩运（Itakura和Mizushima，2009; Kim等人，2013). 雷帕霉素（mTOR）抑制类UNC-51的机制靶点AMP-活化蛋白激酶（AMPK）激酶-Beclin1/VPS34/ATG14复合物的1（ULK1）、磷酸甘油酸激酶-1（PGK1）和Bcl-2依赖性调节在自噬活性中起着重要作用（Funderburk等人，2010; 加西亚和肖，2017; Herzig和Shaw，2018; Kim等人，2013; Pattingre等人，2005; Qian等人，2017年a; Russell等人，2013). 然而，Beclin1/VPS34/ATG14L复合物活性和自噬是否由肿瘤抑制因子以肿瘤类型特异性的方式直接和差异地调节尚不清楚。

在本报告中，我们证明VHL通过直接与PHD1在P54处羟基化的Beclin1结合并抑制ATG14与Beclin1/VPS34的结合，抑制了营养应激诱导的ccRCC细胞自噬。Beclin1 P54A敲除表达可消除VHL介导的自噬抑制并促进肿瘤生长。

结果

VHL独立于其E3连接酶活性及其对HIF2α表达的调节，抑制营养缺乏诱导的ccRCC细胞自噬

为了鉴定VHL的HIF2α非依赖性肿瘤抑制功能，并确定自噬在ccRCC细胞和正常肾细胞之间是否受到不同的调节，我们对30个ccRCC标本及其邻近的正常组织进行了免疫组织化学（IHC）染色。我们发现，肿瘤组织中LC3B表达上调（用于形成自噬体）反映的自噬水平远高于正常组织（附录图S1安培). 值得注意的是，与野生型（WT）表达VHL的肿瘤组织相比，VHL缺乏的ccRCC标本表现出较高的自噬水平（图1A、B)与患者预后较差有关（附录图S1B年). 这些结果表明，ccRCC增加了自噬水平，VHL丢失促进自噬，并与不良预后相关。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig1_HTML.jpg
VHL独立于其E3连接酶活性及其对HIF2α表达的调节，抑制营养缺乏诱导的ccRCC细胞自噬。

(一)使用所示抗体对ccRCC患者组织进行代表性免疫组织化学（IHC）染色（左）。比较不同ccRCC患者组织的LC3B和p62表达水平的指示染色分数（右）***P（P） < 0.001作者：Mann–WhitneyU型测试。(B类)使用所示抗体对不同人类ccRCC样本进行代表性免疫印迹分析。(C类)用ATG14L抗体免疫沉淀VPS34复合物，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平归一化为检测中使用的ATG14L量***P（P） < 0.001（双尾学生）t吨测试。(D类,E类)用所示质粒稳定转导786-O细胞，并在葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺的情况下处理2小时。GFP-LC3B的典型图像(D类)和内源性LC3B(E类)图中显示了punta（左）。对来自30个细胞的LC3点状物的数量进行定量（右）***P（P） < 0.001双尾学生t吨测试。(F类)将转染有所示质粒的786-O细胞在有或无20μM氯喹（CQ）的情况下进行2小时的葡萄糖剥夺处理。如图所示，采集全细胞裂解物进行免疫印迹分析。S.E.短期敞口，L.E.长期敞口。显示自噬通量。(G公司)在存在或不存在20μM CQ的情况下，对有或无VHL缺失的SN12C细胞和指示的shRNA-resistant Flag-VHL蛋白的重组表达进行2小时的葡萄糖剥夺处理。如图所示，采集完整细胞裂解物进行免疫印迹分析。显示自噬通量。数据信息：数据表示平均值±SD。使用指定的统计方法比较平均值。免疫印迹和免疫荧光分析进行了三次，结果相似。 可在线获取此图的源数据.

之前的一份报告显示，p62（一种由SQSTM1系列对于注定会被自噬降解的货物），由于获得SQSTM1系列ccRCC细胞系中的拷贝数（Li等人，2013). 一致地，IHC染色和ccRCC组织的定量PCR分析表明，p62表达水平和mRNA水平SQSTM1系列在含有WT VHL的肿瘤中高于其邻近的正常组织（附录图S1A、，1个). 值得注意的是，p62表达，而非mRNA水平SQSTM1系列与表达WT VHL的人相比，在含缺陷VHL表达的人ccRCC标本中，表达量减少。这些结果表明，p62蛋白的表达是由包括转录和翻译后调节在内的多层调控动态控制的，并且VHL缺陷的ccRCC细胞中自噬增加促进了p62的降解。

为了验证临床样本的结果，我们在葡萄糖剥夺培养基中培养了VHL缺陷的786-O或RCC4 ccRCC细胞。正如预期的那样，葡萄糖剥夺导致PI（3）P生成增加，从而导致自噬启动增强（图1个)，增强的GFP-LC3B反映了增强的自噬体形成（图一维)以及内源性LC3B斑点所反映的自噬体/自溶体形成增强（图1E级)外观，LC3B-I向LC3B-II的转化增加，p62表达降低（图1楼; 附录图S一维). 与之前的出版物一致（Lonergan等人，1998)WT Flag-VHL的外源表达，而不是Flag-VHL C162F E3连接酶活性死亡突变，降低HIF2α的表达（图1楼; 附录图S一维)，是ccRCC中主要表达的HIF亚型（Hoefflin等人，2020). 然而，这两种蛋白同等地抑制了VHL缺乏的ccRCC细胞中葡萄糖剥夺诱导的自噬（图1C至F; 附录图S一维)溶酶体抑制剂氯喹（CQ）减少，LC3B表达增加（图1楼; 附录图S一维)表明VHL抑制自噬的启动，而不是自噬体成分的溶酶体活性依赖性降解。相反，VHL-profective SN12C和TK-10肾癌细胞中的VHL缺失（附录图S1E级)PI（3）P生成增加反映出葡萄糖缺乏诱导的自噬显著增强（附录图S1楼)以及LC3B-I向LC3B-II的转化率升高，p62表达降低（图1G；附录图S1G个). 始终，PI（3）P产量增加（附录图S1楼)和自噬（图1G个; 附录图S1G个)在VHL缺失的SN12C和TK-10细胞中，WT VHL和Flag-VHL C162F的重组表达分别伴随抑制和非抑制HIF2α（附录图S1层，G层). 总之，这些结果表明VHL独立于E3连接酶活性抑制自噬启动。

值得注意的是，Flag-VHL表达和VHL耗竭（图电动汽车1A)受影响的葡萄糖剥夺诱导的AMPK激活和mTOR抑制，如下游蛋白底物乙酰辅酶A羧化酶（ACC）1和S6的磷酸化水平所反映的，表明VHL调节自噬而不干扰AMPK和mTOR活性。同样，HIF2α和HIF1β（图电动汽车1B)，也不是Cul2（图EV1C公司)消耗影响葡萄糖剥夺诱导的自噬。此外，VHL缺失并没有改变表达水平（图EV1D公司)和半衰期（图EV1E汽车)Beclin1的缺失，并且VHL或Cul2的缺失都不影响泛素化（图EV1F、G)Beclin1。一直以来，Cul2缺失并不影响VHL过度表达抑制的PI（3）P生成（图电动汽车1小时)或自噬（图EV1I公司)在VHL缺乏的ccRCC细胞中。这些结果表明VHL以其E3连接酶活性和HIF2α/HIF1β非依赖性的方式调节自噬。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig7_ESM.jpg
VHL以其E3连接酶活性和HIF2α/HIF1β非依赖性方式抑制营养缺乏诱导的ccRCC细胞自噬。

(一)Flag-VHL转染的786-O细胞（左）或VHL缺失的SN12C细胞（右）在指定时间内接受葡萄糖剥夺治疗。(B类)稳定转染HIF2α（左）或HIF1β（右）shRNA的786-O细胞在葡萄糖剥夺或不剥夺的情况下处理2 h(C类)对稳定转染Cul2 shRNA的SN12C和TK-10细胞进行葡萄糖剥夺或不剥夺处理2 h(D类)如图所示，采集稳定转染VHL shRNA的SN12C和TK-10细胞进行免疫印迹分析。(E类)将稳定转染VHL shRNA的SN12C和TK-10细胞用CHX（100μg/ml）处理指定的时间段。显示了Beclin1蛋白水平相对于微管蛋白水平的定量。(F类,G公司)如图所示，采集稳定转染有所示构建物的SN12C细胞进行免疫沉淀和免疫印迹分析。(H（H）)用ATG14L抗体免疫沉淀VPS34复合物，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平归一化为检测中使用的ATG14L量。(我)在20μM氯喹（CQ）存在或不存在的情况下，对转染有所示质粒的786-O细胞进行2小时的葡萄糖剥夺处理(J型)在20μM氯喹（CQ）存在或不存在的情况下，分别用氨基酸（AA）剥夺1h、血清剥夺9h或谷氨酰胺（Gln）剥夺4h处理转染或不转染Flag-VHL的786-O细胞2h。(K（K）)分别用氨基酸（AA）剥夺1h、血清剥夺9h或谷氨酰胺（Gln）剥夺4h处理转染或未转染VHL shRNA的SN12C细胞。(L（左）)将SN12C和TK-10细胞在葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺的情况下处理2 h。用ATG14L或VHL抗体免疫沉淀VPS34复合物，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平标准化为试验中使用的VPS34量。数据信息：数据表示平均值±SD。统计显著性使用双尾Student’st吨测试***P（P）  <  0.001; NS无显著性。(一–G公司,我–K（K）)进行免疫沉淀或免疫印迹分析。(B类,C类,我,J型)显示了自噬流量。所有实验重复三次，结果相似。

与葡萄糖剥夺一样，氨基酸、血清或谷氨酰胺的剥夺都会诱导自噬；这种诱导被786-O细胞中Flag-VHL的表达所抑制（图EV1J公司)或因SN12C细胞中VHL缺失而增强（图电动汽车1K). 总之，这些结果表明，VHL抑制ccRCC细胞中营养缺乏诱导的自噬，而不依赖于其E3连接酶活性及其对HIF2α表达的调节。

VHL结合Beclin1并抑制ATG14与Beclin1/VPS34/VPS15复合物的结合

为了确定VHL抑制自噬起始的机制，我们用抗VHL抗体进行了联合免疫沉淀，结果表明VHL与Beclin1、VPS34和VPS15相关，但与ATG14L无关（图2安培). 由于不同VPS34复合物的活性受能量应激的不同调节（Kim等人，2013)，我们接下来确定与哪个VPS34池VHL关联。我们用VPS34、Beclin1或ATG14L抗体免疫沉淀法分离出各种含有VPS34的池（图2B型). 在归一化到VPS34蛋白水平后，我们发现大多数VHL蛋白在Beclin1-associated VPS34池中富集，而VPS34沉淀剂包含中等水平的VHL蛋白。然而，在ATG14L免疫沉淀剂中没有检测到VHL水平（图2B型). GST下拉分析显示GST-VHL与纯化的Flag/strep-Beclin1结合，但未纯化的ATG14L或VPS34（图2摄氏度). 这些结果表明，VHL直接与Beclin1结合，而在相同的蛋白复合物中没有ATG14L。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig2_HTML.jpg
VHL结合Beclin1并抑制ATG14与Beclin1/VPS34/VPS15复合物的结合。

(一–J型)免疫沉淀（IP）或免疫印迹分析按指示进行三次，结果相似。(一)SN12C细胞的细胞裂解物用于免疫沉淀和免疫印迹，抗体如图所示。(B类)使用所示抗体对SN12C细胞的不同VPS34复合物进行免疫纯化。通过免疫印迹法测定VPS34结合伙伴的相对丰度。每个免疫沉淀均归一化为VPS34的量。(C类)将GST或GST融合的VHL与从293T细胞纯化的所指示的Flag/Strep标记的蛋白质一起孵育，用于下拉测定。(D类–F类)如图所示，用质粒瞬时转染293T细胞。(G公司)采集稳定转染所示shRNA的SN12C细胞进行免疫沉淀或免疫印迹分析。(H（H）)采集具有或不具有VHL缺失的SN12C细胞，并重建所示shRNA-resistant Flag-rVHL蛋白的表达，以进行免疫沉淀或免疫印迹分析。(我,J型)采集转染有所示质粒的786-O细胞进行免疫沉淀或免疫印迹分析。数据信息：所有实验独立重复三次，结果相似。 可在线获取此图的源数据.

已知ATG14L与Beclin1 CCD域结合（Kang等人，2011). 我们引入了Beclin1的不同截短变体，发现CCD域删除了Beclin 1，它失去了与ATG14L和VHL的结合（图二维). 这些结果表明VHL和ATG14L竞争性地结合到Beclin1的同一区域。始终，VHL或ATG14L与Beclin1的结合受到ATG14L的剂量依赖性抑制（图第二版)和VHL（图2楼)进一步表明VHL和ATG14L以互斥的方式绑定到Beclin1/VPS34/VPS15复合体。其他证据表明，VHL-profective SN12C细胞中的VHL缺失特别增加了Beclin1与ATG14L的结合，但没有增加UVRAG（图2克). 这种增加不受HIF2α耗竭的影响（图2克)，被WT VHL或VHL C162F突变体的重组表达减弱（图2小时). 此外，在VHL缺乏的786-O细胞中过度表达WT VHL或VHL C162F突变体会降低Beclin1与ATG14L的结合亲和力，但不会降低UVRAG（图第二阶段). 与这一发现一致，Cul2的缺失并不影响ATG14L与Beclin1的VHL过度表达抑制结合（图2J型)表明这种抑制与VHL E3连接酶活性无关。与ATG14L在自噬中的重要作用一致（Diao等人，2015; Kametaka等人，1998; Obara等人，2006)与ATG14L相关VSP34复合物相比，VHL相关VSP24复合物的活性被消除（图EV1升)，进一步支持VHL对VPS34依赖的PI（3）P生成和随后的自噬启动的抑制作用。这些结果表明，VHL与Beclin1结合，随后抑制ATG14与Beclin 1/VPS34/VPS15复合物、VPS34活性和自噬的结合，而不改变与胞内转运相关的UVRAG连接的Beclin1/VPS34复合物。

PHD1是VHL与Beclin1结合和VHL介导的自噬抑制所必需的

VHL与PHD-羟基化HIF蛋白结合（Hon等人，2002; 伊凡和凯琳，2017). 共免疫沉淀分析表明，VHL Y98H、Y111H和W117R突变体在与脯氨酸羟基化蛋白的结合方面存在缺陷，它们不能独立于HIF2α的表达与Beclin1结合（附录图S2安培). 该结果在体外GST下拉试验中得到进一步验证，在该试验中，纯化的GST融合VHL变体未能与纯化的293T细胞表达的Flag/strep-Beclin1结合（附录图S2B型). 此外，这些突变体在VHL缺乏的786-O和RCC4细胞中的异位表达（图3A、B)或内源性VHL缺失的SN12C和TK-10细胞中shRNA-resistant（r）突变体的重组表达（附录图S2C、D)表明这些突变体与WT对应物不同，未能抑制Beclin1和ATG14L之间的关联（图3A级; 附录图S2摄氏度)，葡萄糖缺乏增加了PI（3）P的产生（图3B公司; 附录图S二维)，GFP-LC3穿孔的编号（图3C公司)，内源性LC3点（图三维)、LC3B-II表达和p62下调（图第三方; 附录图S第二版). 这些结果表明，VHL的羟化脯氨酸结合能力是与Beclin1相互作用和抑制自噬所必需的。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为44318_2024_51_Fig3_HTML.jpg
PHD1是VHL与Beclin1结合和VHL介导的自噬抑制所必需的。

(一)用所示质粒转染786-O细胞，并按所示进行免疫沉淀和免疫印迹分析。(B类)将转染不同Flag-VHL WT或突变体构建物的786-O和RCC4细胞在葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺的情况下处理2 h。用ATG14L抗体免疫沉淀VPS34复合物，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平归一化为检测中使用的ATG14L量。(C类,D类)将转染不同Flag-VHL WT或突变结构的786-O细胞进行葡萄糖剥夺2h。GFP-LC3B的典型图像(C类)和内源性LC3B(D类)显示了泪点（左）。对30个细胞的LC3点状细胞数量进行了量化（右）。(E类)将转染不同Flag-VHL WT或突变体构建物的786-O细胞在葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺的情况下处理2 h。如图所示，采集全细胞裂解物进行免疫印迹分析。(F类)采集稳定转染所示shRNA的SN12C细胞进行免疫沉淀或免疫印迹分析。(G公司)采集PHD1缺失的SN12C细胞，并重建所示shRNA-resistant Flag-rPHD1蛋白的表达，进行免疫沉淀或免疫印迹分析。(H（H）)用ATG14L抗体免疫沉淀VPS34复合物，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平归一化为检测中使用的ATG14L量。(我,J型)用所示shRNA稳定转染的SN12C细胞用葡萄糖剥夺处理2小时。GFP-LC3B的代表性图像(我)和内源性LC3B(J型)图中显示了punta（左）。对30个细胞的LC3点状细胞数量进行了量化（右）。(K（K）)在有或无20μM氯喹（CQ）的情况下，对稳定转染PHD1 shRNA的SN12C和TK-10细胞进行2小时的葡萄糖剥夺处理。如图所示，采集全细胞裂解物进行免疫印迹分析。显示自噬通量。(L（左）)在存在或不存在20μM氯喹（CQ）的情况下，对PHD1缺失的SN12C和TK-10细胞以及所示shRNA-resistant Flag-rPHD1蛋白的重组表达进行2小时的葡萄糖剥夺处理。如图所示，采集全细胞裂解物进行免疫印迹分析。显示了自噬通量。数据信息：数据代表平均值±SD。统计显著性使用Student’st吨测试***P（P）  <  0.001; NS无显著性。所有实验重复三次，结果相似。 可在线获取此图的源数据.

与这些发现一致，脯氨酰羟化酶（PHD）抑制剂二甲基草酰甘氨酸（DMOG）仅在VHL-profective SN12C细胞中增加了葡萄糖剥夺诱导的自噬（图电动汽车2A)，但不包括VHL缺乏的786-O细胞（图EV2B型)，以HIF2α独立的方式。此外，DMOG挽救了786-O细胞中VHL过度表达介导的自噬抑制（图电动汽车2C). 这些结果表明，VHL以PHD依赖的方式抑制营养应激诱导的自噬。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig8_ESM.jpg
PHD1是VHL与Beclin1结合和VHL介导的自噬抑制所必需的。

(一,B类)SN12C系列(一)或786-O(B类)在葡萄糖剥夺2小时之前，用或不用DMOG（200μM）预处理HIF2α缺失和未缺失的细胞1小时(C类)将Flag-VHL转染的786-O细胞与DMOG（200μM）预处理1 h，然后再进行葡萄糖剥夺2 h。（D）,E类)SN12C系列(D类)或786-O(E类)收获用所指示的质粒转染的细胞。(F类,G公司)将转染有所示shRNA的SN12C细胞在葡萄糖剥夺或不剥夺的情况下处理2小时(H（H）)对PHD1缺失或未缺失的SN12C细胞以及指示的shRNA-耐药标记-PHD1蛋白的重组表达进行葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺处理2小时(我)用ATG14L抗体免疫沉淀VPS34复合物，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平归一化为检测中使用的ATG14L量。(J型,K（K）)对PHD1缺失的SN12C细胞进行2小时的葡萄糖剥夺处理，重组表达shRNA-resistant Flag-rPHD1蛋白。GFP-LC3B的代表性图像(J型)或内源性LC3B(K（K）)显示了泪点（上部）。对30个细胞的LC3B点状细胞数量进行了量化（较低）。(L（左）)对PHD1缺失或未缺失的786-O细胞进行葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺处理2小时(M（M）)对具有所示shRNA-resistant Flag-PHD1蛋白重组表达的内源性PHD1缺失786-O细胞进行葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺处理2小时(N个)用所示质粒转染PHD1缺失或未缺失的786-O细胞，并用或不用葡萄糖剥夺处理2小时(O（运行）)用所示质粒转染具有所示shRNA-resistant Flag-rPHD1蛋白重组表达的786-O细胞，并在葡萄糖剥夺或不剥夺的情况下处理2 h。数据信息：数据表示平均值±SD。统计显著性使用双尾Student’st吨测试***P（P）  <  0.001. (一–H（H）,L（左）–O（运行）)按照指示进行免疫沉淀和/或免疫印迹分析。所有实验重复至少两次，结果相似。

值得注意的是，内源性表达VHL的SN12C细胞中PHD1、PHD2和PHD3的缺失（图第三层和EV2D系统)或VHL再表达的786-O细胞（图电动汽车2E)结果表明，只有PHD1缺失抑制了VHL和Beclin1之间的相互作用，相应地，ATG14L与Beclin1HIF2α非依赖性结合增加。一贯地，无催化活性的PHD1 D311A突变体的表达破坏了Beclin1与ccRCC细胞中VHL的关联（图第三代移动通信). 此外，在VHL-profective SN12C或TK-10细胞中，PHD1而非PHD2或PHD3的缺失增强了PI（3）P的产生（图3小时)，GFP-LC3穿孔的编号（图第三章)，内源性LC3点（图3J型)、LC3B-II表达和p62下调（图3公里和EV2F、G)以HIF2α非依赖性方式剥夺葡萄糖。一致地，PHD1 D311A表达概括了PHD1缺失对Beclin1-ATG14L相互作用的影响（图电动汽车2小时)葡萄糖缺乏增加了PI（3）P的生成（图电动汽车2I)，GFP-LC3的编号（图电动汽车2J)和内源性LC3（图每2公里)punta、LC3B-II表达和p62下调（图3升)在VHL-profective SN12C或TK-10细胞中。相反，在VHL缺乏的786-O细胞中，PHD1缺失（图电动汽车2L)或无催化活性的PHD1 D311A的重组表达（图电动汽车2百万)不影响葡萄糖剥夺诱导的自噬，但消除了在葡萄糖剥夺下这些细胞中异位VHL表达诱导的自噬抑制（图电动汽车2N，O). 这些结果表明，在营养胁迫条件下，PHD1是VHL与Beclin1结合和VHL介导的自噬抑制所必需的。

PHD1介导的Beclin1 P54羟基化是VHL与Beclinl结合和VHL介导的自噬抑制所必需的

为了确定Beclin1是否是PHD1的底物，我们进行了联合免疫沉淀分析，发现PHD1（而不是PHD2或PHD3）与Beclinl结合（图电动汽车3A). 免疫荧光染色（图电动汽车3B)和细胞分馏分析（图电动汽车3C)结果表明，PHD1定位于ccRCC细胞的胞浆和细胞核中。共免疫沉淀分析表明，Beclin1在细胞的胞浆中与PHD1相互作用（图电动汽车3D). Beclin1的免疫沉淀和随后的液相色谱-串联质谱/质谱（LC-MS/MS）分析表明，Beclin 1在脯氨酸（P）54处羟基化（图电动汽车3E)，不同物种间进化上保守的残基（图电动汽车3F). 体外羟基化测定显示Beclin1 P54A突变体的孵育（图4A级)或含有Beclin1 P54A突变的肽（图4B类)如经特异性验证的抗Beclin1 P54-OH抗体检测到的那样，消除了由纯化细菌表达的WT His-PHD1诱导的Beclin1-hydroxylation，而不是非活性的His-PHD311A（图EV3G–I). 此外，PHD1损耗（图电动汽车3J)或非活性PHD1 D311A的重组表达，但不是其WT对应物（图4摄氏度和电动汽车3K)减少不同ccRCC细胞中Beclin1 P54的羟基化。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig4_HTML.jpg
PHD1介导的Beclin1 P54羟基化是VHL与Beclinl结合和VHL介导的自噬抑制所必需的。

(一)通过将重组His-PHD1 WT或D311A与从293T细胞纯化的Flag/Strep-Beclin1蛋白混合，进行体外羟化试验。按照指示进行免疫印迹分析。(B类)如图所示，通过将重组His-PHD1 WT或D311A与各种Beclin1肽混合用于点免疫印迹分析来进行体外羟基化测定。(C类)如图所示，采集用抗shRNA PHD1 WT或D311A突变体重建的PHD1缺失SN12C细胞进行免疫印迹分析。(D类)用所示质粒转染Beclin1缺失的786-O细胞和用shRNA-resistant Beclin1-WT或P54A突变体重建的RCC4细胞，并采集用于免疫沉淀和免疫印迹分析。(E类)如图所示，采集亲代SN12C和TK-10细胞以及Beclin1 P54A敲除表达的克隆进行免疫沉淀和免疫印迹。(F类)父母SN12C和TK-10细胞以及具有Beclin1 P54A敲除表达的克隆在葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺的情况下处理2 h。用ATG14L抗体免疫沉淀VPS34复合物，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平归一化为检测中使用的ATG14L量。(G公司,H（H）)亲代SN12C细胞和具有Beclin1 P54A敲除表达的克隆被稳定转染GFP-LC3B或不转染GFP LC3B，并进行葡萄糖剥夺2h处理。GFP-LC3的典型图像(G公司)或内源性LC3B(H（H）)图中显示了punta（上部）。定量了30个细胞中GFP-LC3或内源性LC3B点的数量（较低）。(我)在有或无20μM氯喹（CQ）的情况下，对亲代SN12C和TK-10细胞以及具有Beclin1 P54A敲除表达的所示克隆进行2小时的葡萄糖剥夺处理。如图所示，采集全细胞裂解物进行免疫印迹分析。显示自噬通量。(J型,K（K）)用HA-VHL转染亲代786-O细胞和Beclin1 P54A敲除表达的克隆，并用葡萄糖剥夺处理2 h。GFP-LC3的典型图像(J型)或内源性LC3B(K（K）)图中显示了punta（上部）。对30个细胞的LC3B点状细胞数量进行了量化（较低）。(L（左）)用HA-VHL转染亲代786-O和RCC4细胞以及Beclin1 P54A敲除表达的所示克隆，并在葡萄糖剥夺或不剥夺的情况下处理2 h。如图所示，采集全细胞裂解物进行免疫印迹分析。显示自噬通量。数据信息：数据表示平均值±SD。统计显著性使用Student’st吨测试***P（P）  <  0.001; NS无显著性。C1克隆1，C2克隆2。所有实验重复至少两次，结果相似。 此数字的源数据可在线获取.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig9_ESM.jpg
PHD1羟基化物Beclin1 P54。

(一)如图所示，收集转染有所示质粒的293T细胞进行免疫沉淀和免疫印迹分析。(B类)使用所示抗体进行免疫荧光分析（左）。Beclin1和PHD1的相对亚细胞分布强度如图所示（右）。(C类)制备了SN12C和TK-10细胞的细胞质和细胞核部分。不同组分中Beclin1和PHD1的相对丰度通过斑点密度分析进行量化(n个 = 6).n个代表独立的生物复制。(D类)如图所示，采集SN12C细胞的胞浆部分进行免疫沉淀和免疫印迹分析。(E类)对从SN12C细胞中免疫沉淀的Flag/Strep Beclin1进行液相色谱-串联质谱/质谱（LC-MS/MS）分析。具有代表性的LC-MS/MS光谱显示了源自Beclin1的含羟脯氨酸片段。对m/z 1391.02930Da（+0.06mmu/+0.08ppm）的胰蛋白酶片段的质谱分析表明，Beclin1 P54被羟基化，该片段与带+2电荷的肽42-LTAPLLTTAAKPGE-56相匹配。XCorr得分为4.47。(F类)不同物种Beclin1 Pro54蛋白质序列的比对。(G公司)使用不同浓度稀释的所示合成肽进行点免疫印迹分析，并按照所示进行免疫印迹检测。(H（H）)采集转染有所示质粒的SN12C细胞，在是否存在Beclin1 P54羟基化阻断肽的情况下进行免疫沉淀和免疫印迹分析。(我)在存在或不存在Beclin1 P54羟基化阻断肽的情况下，使用指示的抗体对人类ccRCC样本进行IHC分析。(J型)采集稳定转染所示shRNA的SN12C细胞进行免疫沉淀和免疫印迹分析。(K（K）)收获用PHD1 WT或D311A突变体重建的786-O细胞用于免疫沉淀和免疫印迹分析。(L（左）–O（运行）)从具有Beclin1 P54A敲除表达的不同亲本ccRCC细胞的两个单独克隆中提取基因组DNA。从指定的DNA片段扩增PCR产物(L（左）)用琼脂糖凝胶分离(M（M）). Beclin1 P54A敲除表达的不同亲本ccRCC细胞和两个克隆的测序(N个,O（运行）). 红线表示sgRNA-目标序列。黑线表示原间隔区相邻基序（PAM）。蓝色箭头表示突变的核苷酸。突变氨基酸及其野生型对应物由实心红框表示。数据信息：数据表示平均值±SD。统计显著性使用双尾Student’st吨测试***P（P）  <  0.001. WCL全细胞裂解物，细胞胞浆，Nuc核。实验重复至少两次，结果相似。

Beclin1 P54A的重组表达失去了与VHL的结合亲和力，减少了VHL缺陷786-O和RCC4细胞中异位VHL介导的ATG14L和Beclin 1相互作用的抑制（图4D（四维）). 使用CRISPR基因编辑技术，在VHL-profective SN12C和TK-10肾癌细胞中Beclin1 P54A的敲除表达也观察到类似的变化（图第四版和EV3L–O型). 此外，Beclin1 P54A敲除表达或重建进一步增强了葡萄糖剥夺诱导的PI（3）P产生（图4楼)，GFP-LC3（图4G网络)和内源性LC3（图4小时)puncta形成、LC3B-II表达和p62下调（图4I型)在VHL熟练的SN12C或TK-10细胞中，但不在VHL缺乏的786-O或RCC4细胞中（附录图S3A–D级). 这些结果表明，PHD1介导的Beclin1 P54羟基化是VHL与Beclin 1结合和VHL介导的自噬抑制对营养应激反应所必需的。此外，Beclin1 P54A敲除表达减轻了786-O或RCC4细胞中外源性表达的VHL介导的自噬抑制效应（图4J–L型; 附录图S第三方)表明VHL以Beclin1 P54羟化依赖的方式抑制葡萄糖剥夺诱导的自噬。值得注意的是，Beclin1 P54A表达失去了对VPS34活性的调节（附录图S第三层)未能诱导自噬（附录图S第三代移动通信)在缺乏VHL的SN12C细胞中，表明Beclin1 P54羟基化以VHL依赖的方式抑制葡萄糖剥夺诱导的自噬。

为了羟基化蛋白质底物，PHD需要氧气作为共底物（Hon等人，2002; Ivan和Kaelin，2017). 如预期，缺氧刺激（图EV4A、B)但不剥夺葡萄糖（图电动汽车4C)或氨基酸（图电动汽车4D)在常氧条件下，减少了Beclin1 P54的羟基化，还原剂Trolox或N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）显著减少了该羟基化（图电动汽车4A)，并废除VHL与WT Beclin1的绑定（图电动汽车4B). 此外，WT-Beclin1和Beclin1 P54A的表达对VPS34活性没有差异影响（图电动汽车4E)和自噬诱导（图电动汽车4F)在缺氧条件下，在VHL-profective SN12C细胞中。持续地，低氧刺激消除了VHL过度表达抑制或Beclin1 P54A增强的VPS34活性（图电动汽车4G)和自噬（图电动汽车4H)在786-O电池中。这些结果进一步支持了VHL通过依赖PHD1介导的Beclin1 P54羟基化抑制自噬的发现，并且在营养应激和低氧诱导的自噬中起着独特的作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig10_ESM.jpg
VHL以依赖于PHD1介导的Beclin1 P54羟基化的方式抑制自噬，并在营养应激和缺氧诱导的自噬中发挥独特作用。

(一)SN12C和786-O细胞在缺氧刺激8 h之前，用或不用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）（5 mM）或Trolox（100 mM）预处理1 h。收集全细胞裂解物进行免疫印迹分析，如图所示。(B类)亲代SN12C细胞和具有Beclin1 P54A敲除表达的克隆被稳定转染或不转染VHL shRNA，并在缺氧条件下处理8h(C类,D类)对具有shRNA-resistant Flag-Beclin1蛋白重组表达的内源性Beclin1缺失SN12C细胞进行葡萄糖剥夺或不葡萄糖剥夺治疗2 h(C类)或氨基酸（AA）剥夺1小时(D类)分别是。(E类)将亲代SN12C和TK-10细胞以及具有Beclin1 P54A敲除表达的克隆在缺氧条件下处理8 h。用ATG14L抗体免疫沉淀VPS34复合物，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平归一化为检测中使用的ATG14L量。(F类)父母SN12C细胞和Beclin1 P54A敲除表达的克隆在有或无20μM氯喹（CQ）的缺氧条件下处理8小时(G公司)父母786-O和RCC4细胞以及具有Beclin1 P54A敲除表达的指示克隆，无论是否转染Flag-VHL，均在缺氧条件下处理8 h。VPS34复合物用ATG14L抗体免疫沉淀，然后用定量ELISA检测PI（3）P。PI（3）P水平归一化为检测中使用的ATG14L量。(H（H）)用或不用Flag-VHL转染亲代786-O细胞和Beclin1 P54A敲除表达的克隆，并在有或无20μM氯喹（CQ）的情况下进行缺氧处理8小时(我)在20μM氯喹（CQ）存在或不存在的情况下，对亲代SN12C和TK-10细胞以及Beclin1 P54A敲除表达的克隆进行氨基酸（AA）剥夺处理1h(J型)在20μM氯喹（CQ）存在或不存在的情况下，对亲代786-O和RCC4细胞以及转染或不转染Flag-VHL的Beclin1 P54A敲除表达的所示克隆进行氨基酸（AA）剥夺处理1h。数据信息：数据表示平均值±SD。使用双尾Student’st吨测试。NS无显著性。(一–D类,F类,H（H）–J型)按照指示进行免疫沉淀和/或免疫印迹分析。(F类,H（H）–J型)显示自噬通量。所有实验重复至少两次，结果相似。

与对葡萄糖缺乏诱导的自噬的影响类似，Beclin1 P54A的重组表达与VHL-profective ccRCC细胞中WT对应物相比，可以增加氨基酸饥饿诱导的自吞噬（图电动汽车4I). 此外，VHL缺陷的ccRCC细胞中Flag-VHL的表达抑制了表达WT-Beclin1的肿瘤细胞中氨基酸饥饿诱导的自噬，但不抑制Beclin1 P54A的肿瘤细胞（图第4页). 这些结果表明，Beclin1 P54羟基化在调节氨基酸和葡萄糖饥饿诱导的自噬中起着关键作用。

接下来，我们研究了PHD1介导的Beclin1 P54羟基化对不同类型肿瘤细胞自噬的影响，包括HCT116人结肠癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞或HeLa人宫颈癌细胞。我们表明PHD1的损耗（附录图S4A级)或Beclin1 P54A的重组表达（附录图S4B、C)破坏VHL与Beclin1的结合，ATG14L与Bellin1在这些肿瘤细胞中的相互作用相应增加。此外，与WT-Beclin1的表达相比，Beclin1 P54A的表达增强了葡萄糖剥夺诱导的自噬（附录图S4D（四维）). 一贯地，葡萄糖剥夺后，Flag-VHL的过度表达抑制了表达WT-Beclin1的细胞中的自噬，但不抑制Beclin1 P54A的细胞中自噬（附录图S第四版). 因此，PHD1依赖的Beclin1羟基化和VHL抑制的自噬不是肿瘤类型特异性的。

VHL抑制肿瘤生长需要PHD1介导的Beclin1 P54羟基化

自噬对肿瘤细胞存活和肿瘤生长至关重要（白色，2012). Beclin1 P54A内源性基因敲除表达抑制了VHL表达的SN12C和TK-10细胞中葡萄糖剥夺诱导的凋亡（图5A级; 附录图S5A级)但在VHL缺乏的786-O和RCC4细胞中没有（图5亿). 正如预期的那样，786-O和RCC4细胞中VHL表达的恢复增加了葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡（图5亿; 附录图S5亿)，并且这种增加在很大程度上被Beclin1 P54A敲除表达所抑制（图5亿; 附录图S5亿)表明在营养胁迫条件下，VHL促进细胞凋亡需要Beclin1 P54羟基化。此外，Beclin1 P54A表达和VHL缺乏的786-O和RCC4细胞在肿瘤细胞死亡方面没有差异（图5亿)表明Beclin1 P54A以VHL依赖的方式抑制葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡。值得注意的是，在Flag-VHL表达的786-O和RCC4细胞中异位表达非降解HIF2α以恢复HIF2 a表达水平，仅部分缓解了Flag-VHL在葡萄糖剥夺条件下诱导的凋亡（图5摄氏度; 附录图S5摄氏度). 这些结果表明，VHL表达介导的自噬抑制和HIF2α降解都有助于VHL抑制肿瘤细胞存活。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig5_HTML.jpg
VHL抑制肿瘤生长需要PHD1介导的Beclin1 P54羟基化。

(一)父母SN12C和TK-10细胞以及Beclin1 P54A敲除表达的克隆在葡萄糖剥夺或不剥夺的情况下处理8 h。对凋亡细胞进行计数。(B类,C类)用所示质粒稳定转染亲代786-O和RCC4细胞以及Beclin1 P54A敲除表达的所示克隆，并在葡萄糖剥夺或不剥夺的情况下处理8 h。对凋亡细胞进行计数。(D类,E类)父母SN12C细胞（1×106)或将Beclin1 P54A敲除表达的克隆分别皮下注射到裸鼠侧翼。测量小鼠异种移植瘤的生长(D类). 按照指示对肿瘤样本进行IHC分析(E类). (F类,G公司)亲代786-O细胞和Beclin1 P54A敲除表达的克隆分别用所示质粒进行稳定转染，并皮下注射到裸鼠侧翼。测量小鼠异种移植瘤的生长(F类). 按照指示对肿瘤样本进行IHC分析(G公司). (H（H）,我)将786-O细胞皮下注射到无胸腺裸鼠体内。当肿瘤达到50毫米时三，将小鼠随机分为不同的治疗组。每天以100 mg/kg的剂量腹腔注射PT2385或SAR405，直到第28天的终点。计算肿瘤体积(H（H）). 对显示的肿瘤样本进行TUNEL分析(我，上部）。凋亡细胞被染成棕色，并在n个 = 10个微观领域(我，上部）。数据信息：数据代表平均值±SD。统计显著性使用Student’st吨测试***P（P）  <  0.001; NS无显著性。C1克隆1，C2克隆2。实验重复至少两次，结果相似。 可在线获取此图的源数据.

已知促生存调节因子BCL2与Beclin1相互作用以抑制自噬（Pattingre等人，2005). 共免疫沉淀分析表明，WT-Beclin1和Beclin1 P54A与BCL2相互作用，这些结合在缺乏葡萄糖的肿瘤细胞中均被破坏（附录图S5D、E). 此外，我们耗尽了对自噬体形成和自噬发生至关重要的ATG7，并发现Beclin1 P54A表达受抑制的凋亡被VHL-profective SN12C细胞中ATG7的缺失所消除（附录图S5F、G)或VHL外显表达的786-O细胞（附录图S5H，我). 这些结果表明，Beclin1 P54羟基化增加的细胞死亡与Beclin 1和BCL2之间的相互作用无关。

Beclin1被证明是肿瘤生长所必需的（Gong等人，2013; Pan等人，2022). 小鼠研究表明，ccRCC细胞中Beclin1的耗竭（图电动汽车5A)抑制小鼠肿瘤生长（图EV5B、C). 接下来，我们通过皮下注射ccRCC细胞来检测Beclin1 P54羟基化对肿瘤生长的影响。我们发现在VHL-profective SN12C细胞中Beclin1 P54A敲除表达增加了肿瘤体积（图第五天)，重量（图电动汽车5D)和Ki67的表达式（图电动汽车5E)和LC3B表达，p62表达相应减少（图第五版)在肿瘤组织中。与VHL的抑癌作用相一致，VHL缺失增加了肿瘤生长（图第五天和电动汽车5D). 值得注意的是，它消除了Beclin1 P54A表达诱导的差异效应（图5D、E和EV5D、E). 正如预期的那样，VHL缺乏的786-O细胞中恢复的VHL表达减少了肿瘤体积（图5楼)，重量（图电动汽车5F)和Ki67的表达式（图电动汽车5G)和LC3B-II，p62表达相应增加（图5克)在肿瘤组织中，Beclin1 P54A的表达基本上消除了这些变化（图5F、G和EV5F、G). 相反，在VHL缺乏的肿瘤中，Beclin1 P54A诱导的效应减弱（图5F、G和EV5F（单位：G）). 共免疫沉淀分析表明，WT-Beclin1和Beclin1 P54A与肿瘤组织中的BCL2相互作用相似（图EV5H，I型)进一步支持Beclin1 P54羟基化以BCL2诱导的方式调节肿瘤生长。这些结果表明Beclin1 P54羟基化是抑制自噬和肿瘤所必需的。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为44318_2024_51_Fig11_ESM.jpg
VHL抑制肿瘤生长需要PHD1介导的Beclin1 P54羟基化。

(一–C类)收集WT和Beclin1基因敲除786-O细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹分析，如图所示(一). WT和Beclin1敲除786-O细胞（1×106)在6周龄雄性裸鼠的左右两侧皮下注射(n个 = 6). n代表每组中独立动物的数量。注射后25天切除肿瘤。分析肿瘤体积和重量***P（P） < 0.001（学生双尾）t吨测试(B类,C类). (D–F型)亲代SN12C细胞（1×106)或将稳定转染或不转染VHL shRNA的Beclin1 P54A敲除表达克隆分别皮下注射到裸鼠左右两侧。测量小鼠异种移植瘤的重量(D类). 按照指示对肿瘤样本进行IHC分析(E类，左）。Ki67阳性细胞在10个显微镜视野中定量(E类，右侧）。用所示抗体对所示肿瘤进行免疫沉淀和免疫印迹分析(F类). 数据表示平均值±SD***P（P） < 0.001; 学生的双尾无意义t吨测试。(G公司–我)亲代786-O细胞（1×106)将稳定转染或不转染Flag-VHL的Beclin1 P54A敲除表达克隆分别皮下注射到裸鼠侧翼。测量小鼠异种移植瘤的重量(G公司). 按照指示对肿瘤样本进行IHC分析(H（H），左）。在10个显微镜下对Ki67阳性细胞进行定量(H（H），右侧）。用所示抗体对所示肿瘤进行免疫沉淀和免疫印迹分析(我). 数据表示平均值±SD***P（P） < 0.001; 学生的双尾无意义t吨测试。(J型–L（左）)将786-O细胞皮下注射到裸鼠体内。当肿瘤达到50毫米时三，将小鼠随机分为不同的治疗组。PT2385或SAR405以100mg/kg的剂量每天腹膜内注射，直到第28天的终点。测量小鼠异种移植瘤的重量(J型). 按照指示对肿瘤样本进行IHC分析(K（K）、左侧和L（左）). 在10个显微镜下对Ki67阳性细胞进行定量(K（K），右侧）。数据表示平均值±SD***P（P） < 0.001（学生双尾）t吨测试。

鉴于自噬抑制和HIF2α表达都有助于VHL诱导的肿瘤抑制作用，我们接下来用VPS34抑制剂SAR405（Pasquier，2015)和PT2385，一种HIF2α抑制剂，目前用于晚期ccRCC患者治疗（Chen等人，2016; Courtney等人，2018; Wallace等人，2016). 单独使用SAR405或PT2385治疗可减少肿瘤体积（图5小时)，重量（图电动汽车5J)和Ki67表达降低（图电动汽车5K)肿瘤组织中的凋亡增加（图5I型). 此外，用SAR405而非PT2385治疗可降低LC3B-II的表达，同时肿瘤组织中p62的表达也相应增加，而用PT2385而非SAR405治疗可降低肿瘤组织中表达的cyclin D1，该cyclin由HIF2α靶基因CCND1编码（Choueiri和Kaelin，2020)（图电动汽车5L)值得注意的是，与SAR405和PT2385的联合治疗对肿瘤生长抑制产生了额外的效果（图5小时和韩国EV5J)与单独使用SAR405或PT2385相比，其诱导的肿瘤细胞凋亡率要高得多（图5I型). 这些结果揭示了通过抑制VHL缺乏引起的自噬和HIF2α激活来治疗ccRCC的潜力。

Beclin1 P54-OH水平与人ccRCC自噬水平呈负相关，并可预测患者预后不良

为了进一步确定VHL介导的自噬抑制的临床相关性，我们对WT-VHL表达的人ccRCC标本进行了IHC或免疫印迹分析，结果表明Beclin1 P54-OH水平与自噬水平呈负相关，这反映在LC3B表达增加和p62表达减少（图6A–C级). 此外，肿瘤中Beclin1 P54-OH含量低的ccRCC患者（49例）的生存期短于肿瘤中Becin1 P55-OH水平高的患者（41例）（图第6天). 这些结果支持VHL介导的自噬抑制在人类ccRCC临床行为中的作用，并揭示了Beclin1 P54-OH水平与ccRCC的临床侵袭性之间的关系。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为44318_2024_51_Fig6_HTML.jpg
Beclin1 P54-OH水平与人ccRCC自噬水平呈负相关，可预测患者预后不良。

(一–C类)使用所示抗体对人类ccRCC样本（VHL WT）进行代表性IHC和免疫印迹分析(一,B类). 对具有指示抗体的人ccRCC样本的IHC染色进行评分，并进行相关性分析(C类). 采用皮尔逊相关检验（双尾）(n个 = 40). 请注意，某些样本的分数重叠。(D类)90例ccRCC（VHL WT）患者总生存率的Kaplan–Meier曲线根据Beclin1 P54羟化的高表达（染色分数，4–8）和低表达（染色得分，0–3）归一化为Beclin 1蛋白进行分组。P（P）使用对数-秩检验（双尾）计算值。(E类)VHL通过PHD1依赖的Beclin1羟基化抑制自噬的分子机制。数据信息：实验重复两次，结果相似。 可在线获取此图的源数据.

讨论

肿瘤抑制因子VHL缺乏或突变经常发生在大多数（80-90%）散发性RCC中，并促进肿瘤生长（Gossage等人，2015). 肿瘤快速生长必然会导致营养和氧化应激，从而触发自噬以维持肿瘤细胞的代谢需求、生存和增殖（Li等人，2017; Qian等人，2017年b; 白色，2012). 然而，肿瘤细胞对这些应激是否有不同的反应，VHL是否通过直接调节自噬发挥其抑癌活性尚不清楚。我们在这里表明，VHL抑制营养应激诱导的自噬。与表达WT VHL的肿瘤组织相比，ccRCC标本中VHL缺乏导致自噬水平升高，并与患者预后不良相关。力学研究表明VHL直接与Beclin1结合，这种相互作用依赖于Beclin1-P54处的羟基化，该羟基化由PHD1介导，而不是PHD2或PHD3。这种相互作用抑制了ATG14L与Beclin1/VPS34的结合，而没有改变与细胞内转运相关的Beclinl/UVRAG复合物，从而抑制了VPS34依赖的PI（3）P的产生和随后的自噬启动，而自噬的启动是由缺乏营养素（如葡萄糖、氨基酸、谷氨酰胺和血清）诱导的。Beclin1 P54A敲除表达破坏了VHL与Beclinl的结合以及VHL介导的自噬抑制，在很大程度上消除了VHL的抑瘤作用，促进了小鼠的肿瘤生长（图第六版). 这些发现揭示了先前发现的VHL抑制自噬的功能，并揭示了VHL抑制肿瘤生长的关键机制。

VHL介导的HIF降解以及HIF2与HIF1表达的增加以及HIF靶基因表达的增加与更晚期的ccRCCs相关（Kaelin，2022). 深入研究表明，HIF2α，而非HIF1α，在ccRCC进展中起着重要作用（Kaelin，2022); 因此，包括PT2385在内的HIF2α抑制剂已被开发并用于ccRCC治疗的临床试验（Chen等人，2016; Courtney等人，2018; Wallace等人，2016). 然而，一些VHL突变的ccRCC对HIF2α缺失或HIF2β抑制剂治疗的反应较低（Choueiri和Kaelin，2020)这表明VHL具有参与ccRCC发育的其他细胞靶点。研究表明，VHL参与其他蛋白质的调节，包括锌指和同源盒2（ZHX2）、AKT和TBK1（Gossage等人，2015; 郭等人，2016; 胡等，2020; Zhang等人，2018). 然而，体外羟基化分析表明，重组PHD不能有效地羟基化这些报道的非HIF底物（Cockman等人，2019). 我们通过质谱分析证明Beclin1 P54在ccRCC细胞中羟基化。重要的是，我们的结果表明，PHD1在体内和体外都能羟基化Beclin1 P54，并且这种PHD1调节的羟基化可以被一种特异的Beclin1P54羟基化抗体识别。功能研究表明，Beclin1 P54A敲除表达或自噬抑制剂联合HIF2α抑制剂治疗对PHD1介导的Beclin1P54羟基化和自噬的抑制，与单独消除自噬或HIF2β相比，肿瘤生长抑制明显改善。这些结果证实了Beclin1是VHL靶蛋白的发现，VHL通过抑制HIF2α和自噬发挥其抑瘤功能。

据报道，天冬酰胺在完整蛋白质上的羟基化脱氢反应表明羟基化是一个可逆过程（Rodriguez等人，2020). 然而，蛋白质中的脯氨酸羟基化是否会发生脱羟基作用仍然未知。此外，在不同的生理条件下，Beclin1羟基化和VHL与羟基化Beclin 1的结合是否可以通过其他蛋白-蛋白质相互作用和/或翻译后修饰相互调节，例如磷酸化、乙酰化和泛素化，目前尚不清楚。此外，Beclin1修饰在缺乏VHL表达的786-O或RCC4细胞中的作用尚不清楚。探索Beclin1羟基化是否影响自噬无关但已知或未知的Beclin1-dependent功能，如囊泡转运，值得关注。确定这些方面对于理解肿瘤细胞自噬和Beclin1功能的动态调节至关重要。

自噬的抑瘤和促进功能已被报道。越来越多的证据表明，自噬在肿瘤早期发展过程中抑制肿瘤的发生，但通过缓解能量应激和促进受损或功能失调的细胞器的清除，支持已确立和转移肿瘤的代谢适应是必需的（Debnath等人，2023). Beclin1介导的自噬对肿瘤生长的影响似乎取决于肿瘤分期和癌基因的特异性激活或肿瘤抑制因子（如VHL）的失活，这与细胞环境有关。鉴于肿瘤中的自噬可以同时受到内在和外在因素的调节，涉及一系列复杂的输入，因此需要对体内快速发展的肿瘤中的自噬进行进一步研究。

与邻近正常组织相比，人ccRCC表现出高水平的自噬。此外，低Beclin1 P54-OH水平与WT-VHL表达的ccRCC标本中高水平的自噬和ccRCC患者较短的生存期相关。这些发现首次揭示了VHL通过排除ATG14L到Beclin1/VPS34直接调节自噬，其方式独立于E3泛素连接酶活性和HIF调节，并强调了VHL缺乏增加的自噬在肿瘤进展和疾病临床侵袭性中的作用。我们的临床前概念验证研究确立了联合抑制自噬和HIF2α作为治疗ccRCC的新策略。

方法

材料

兔抗Myc标签（ab9106）、VPS34（ab227861）、PHD3（ab184714）、VHL（用于IHC）（ab140989）、VPS15（ab128903）、p62（ab207305）、Cul2（ab166917）、LC3B（ab51520）和IgG重链（HRP）（ab99702）抗体购自Abcam（英国剑桥）。正常小鼠IgG（sc-2025）、正常兔IgG（sc-2027）、小鼠抗HA标签（sc-7392）、小鼠抗Myc（sc-40）、GST（sc-138）、泛素（sc-271289）、生物素（sc-101339）和微管蛋白（sc-8035）抗体获自Santa Cruz Biotechnology（Dallas，TX）。兔抗Ki67抗体（AB9260）来自Millipore（马萨诸塞州伯灵顿）。抗HIF2α（#59973）、HIF1β（#5537）、ACC1 pS79（#111818）、UVRAG（#5320、分离PARP（#5625）和PHD2（#3293）从Cell Signaling Technology（马萨诸塞州丹弗斯）购买。在1:5000时使用Jackson ImmunoResearch的次级辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗鼠或兔抗体和AlpVHH的IP AlpSdAbs VHH（HRP。二甲基草酰甘氨酸（DMOG），抗-His（SAB1305538），过氧化氢（H2O（运行）2)、CHX、MG132、Trolox、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、SAR405、PT2385、反旗帜M2琼脂糖珠、无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒、氯喹（CQ）、小鼠反旗帜（F1804）和兔反旗帜（F7425）购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。Beclin1抗体（PA5-140987）（用于IF）、PHD1（PA5-96102）、Cul2（51-1800）、VHL抗体（用于IP或WB）（PA5-27322）、谷胱甘肽琼脂糖和DAPI从Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）获得。BCL2抗体（60178-1-Ig）（用于IP）是从蛋白质技术获得的。利用Selleck-Chem合成了Beclin1 P54羟基化阻断肽（PLLTTAQAK-P（OH）-GETQEETN）和Beclin1WT控制肽（PLLT TAQAKPGETQEETN）。Ni-NTA琼脂糖来源于恰根。Beclin1 P54羟化特异性抗体由Signalway Biotechnology（德克萨斯州皮尔兰）生产。PI（3）P Mass ELISA来自Echelon Biosciences。

细胞系和细胞培养条件

293T、786-O、HeLa、HCT116和MDA-MB-231细胞来自ATCC。TK-10、SN12C和RCC4细胞来自中国科学院（中国上海）的细胞库。所有这些细胞都保存在补充了10%小牛血清（HyClone，#SH30071）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（GIBCO，#C11995500BT）中。在国际细胞系认证委员会维护的常见错误识别细胞系数据库和NCBI维护的BioSample数据库中未发现本研究中使用的细胞系。谷氨酰胺或葡萄糖饥饿是通过在不含谷氨酰胺的培养基中培养细胞来实现的（GIBCO，#11960）或葡萄糖（GIBCO，#11966），补充透析的FBS、丙酮酸钠（GIBCO#11360）和Pen-Strep（GIBCO#15140）。根据Invitrogen（#11965-092）高糖DMEM配方和所有维生素（氯化胆碱、Sigma-Aldrich#C7017；钙）制备无氨基酸培养基d日-（+）-泛酸，圣克鲁斯生物技术#sc-202515；叶酸，Sigma-Aldrich#F8758；烟酰胺，Supelco#47865-U；盐酸吡哆醇，Sigma-Aldrich#P6280；核黄素，西格玛-奥尔德里奇#R9504；盐酸硫胺，Sigma-Aldrich#T1270；肌醇，Sigma-Aldrich#17508），无机盐（氯化钙，Sigma-Aldrich#499609；硝酸铁（III）九水合物，Sigma Aldrich#F8508；硫酸镁，Sigma-Aldrich#M7506；氯化钾，Sigma-Aldrich#P5405；碳酸氢钠，Sigma-Aldrich#S5761；氯化钠，Sigma-Aldrich#S9625；磷酸钠一水合物，Sigma-Aldrich#71507），d日-葡萄糖（Sigma-Aldrich#G7021）和酚红（Sigma-Aldrich#P3532），但不含所有氨基酸。氨基酸饥饿包含10%的透析FBS。细胞系通过短串联重复序列分析进行鉴定，并定期检测支原体污染。细胞以4×10的密度进行电镀5每个60-mm培养皿或1×105转染前18小时，每孔6孔板。转染过程如前所述（Du等人，2020).

DNA构建与诱变

PCR-扩增的人类VHL、ATG14L、Beclin1、Beclin 1Δ1-173、BeclinCMV-MCS-EF1-Puro/Neo-（Flag、HA或SFB）、PGEX4T-1（GST）或pColdI。HIF2α-PA（P405A/P531A）、VHL Y98H、Y111H、W117R、C162F、PHD1 D311A、Beclin1 P54A、含有A456T、G459A、A362T和G465A突变的短发夹RNA（shRNA）抗性VHL构装体、含有C1020A、G1023A和A1026C突变的shRNA-resistant PHD1构装体，含有C891T的抗shRNA-Beclin 1构装体，G894A和A897G突变是使用QuikChange定点突变试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）构建的。PLKO.1 shRNA靶序列如下：VHL shRNA1，5'-TATCACACTGCCAGTGTATAC-3'；VHL shRNA2，5'-CCATCTCTCAATGTGACGGA-3’；EGLN2（PHD1）shRNA1，5'-GCTGCATCACCTGTATCTATT-3'；EGLN2（PHD1）shRNA2，5'-GCCAACATCGAGCCACTTT-3'；EGLN1（PHD2）shRNA，5'-GACGACTGATACGCACTGT-3'；EGLN3（PHD3）shRNA，5'-CACCTGCATCTACTATCTGAAC-3'；BECN1（Beclin1）shRNA，5'-CCCCGTGGAATGGAATGATATT-3'；HIF2αshRNA1，5'-CAGTACCACAGACGGATTCAA-3'；HIF2αshRNA2，5'-GCGCAAAATGTACCCAATGATA-3'；HIF1βshRNA1，5'-ACTAGGTCCCACAGCTAATTT-3'；HIF1βshRNA2，5'-GAGAGTCAGATGTTTATTT-3’；Cul2 shRNA1，5'-CCCTTTGGAAAGACTTTATA-3'，Cul2 shoRNA2，5'-GCCTTATTCAAGAGGTGATT-3’；ATG7 shRNA，5'-CCCAGCTATTGAACACTGTA-3'。GFP-LC3B质粒由中国南京医科大学徐谦教授慷慨提供。

免疫沉淀和免疫印迹分析

用改良的缓冲液从培养细胞中提取蛋白质，该缓冲液由20 mM Tris-HCl、pH 7.5、137 mM NaCl、5 mM EDTA、1%NP-40、10%甘油、50 mM NaF、1 mM Na组成三VO（旁白）4和蛋白酶抑制剂鸡尾酒，然后使用前面描述的相应抗体进行免疫沉淀和免疫印迹（Xu等人，2015)，（原田等，2003; Rui等人，2004). 简单地说，细胞提取物通过12000 rpm离心澄清，上清液与所示抗体一起进行免疫印迹或免疫沉淀。在4°C下与抗体孵育过夜后，加入蛋白A/G琼脂糖珠并再放置3小时。然后通过SDS-PAGE电泳对免疫复合物进行免疫印迹分析。

CRISPR–Cas9-介导的基因组编辑

如前所述，使用CRISPR–Cas9系统将基因组突变引入细胞。使用CRISPR设计工具，设计单引导RNA（sgRNAs）靶向Beclin1 P54突变位点附近的基因组区域(http://crispr.mit.edu/). 将退火的引导RNA寡核苷酸插入用BbsI限制酶消化的PX458载体（Addgene）中（Xu等人，2019). 细胞以60%的融合率接种，然后联合转染sgRNAs（0.5μg）和单链供体寡核苷酸（10 pmol）作为模板引入突变。转染后24小时，对细胞进行胰蛋白酶处理，稀释成单个细胞，然后接种到96周的平板中。从GFP阳性细胞中提取基因组DNA，然后对跨越突变位点的PCR产物进行测序。Beclin1 P54的sgRNA靶向序列为5′-ACCACAGCCAGGAAAACC-3′；Beclin1 P54的单链供体寡核苷酸（ssODN）序列为5′-CAGATGCCCCTGCTTTAATAGACTGTCTGACCAATATTTCCTCCTAGCTACTTACCACAGCCAAGCaGCaAAggCAGGAGAGACCAGAGAGAGGAGACTAACTCAGAGAGAAGAGAGTGCCCTCCTCTACTCCTACTCATTACGTAAAA-3′。ssODN序列中的小写字母表示突变的核苷酸，将使用CRISPR–Cas9系统替换亲代细胞基因组DNA中的内源性核苷酸。使用CRISPR–Cas9系统生成VHL-KO和Beclin1-KO细胞系（Xu等人，2019). VHL-KO的sgRNA-靶向序列为5′-TACGGCTCTGAAGAAGACGG-3′。Beclin1 KO的sgRNA靶向序列为5′-GTCACAACAGCACCATGC-3′。通过对以下引物扩增的PCR产物进行测序，进行基因分型：Beclin1正向：5′-TAATGGGGAGGAGACCA-3′；贝格林1反面：5′-TTCTTCTGTCCAGCGCAATCA-3′。VHL-KO正向：5′-CCTCCGTACAACACGCCTAC-3′；VHL-KO反面：5′-TCGAAGTGAGCCATACGGG-3′。Beclin1-KO前锋：5′-ACCTCTCAGGCTCTTATTGG-3′；Beclin1-KO反面：5′-GGAAAGCTCAGAAGCACA-3′。

商品及服务税下调

在改良的结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5；1%Triton®声波风廓线仪X-100；150 mM氯化钠；1 mM DTT；0.5 mM乙二胺四乙酸二乙酯；100μM PMSF；100μM亮氨酸肽；1μM抑肽酶；100μM原钒酸钠；100μM焦磷酸钠；和1 mM氟化钠）。然后用结合缓冲液将谷胱甘肽琼脂糖珠洗涤四次，并进行前面所述的免疫印迹分析（Qian等人，2019b年).

重组蛋白的纯化

GST-VHL及其不同突变在细菌中表达，并如前所述进行纯化（Qian等人，2019a年). 293T细胞中表达的Flag/streptavidin双标记Beclin1、ATG14L或VSP34分别用抗Flag琼脂糖珠富集并用3XFlag肽洗脱。超滤并从洗脱的蛋白质中去除3XFlag肽后，进行二次链亲和素下拉测定。

体外羟化试验

如前所述进行体外羟化试验（Guo等人，2016). 简而言之，肽（10μg）或纯化的重组蛋白（1μg）与1μg纯化的重组PHD1蛋白混合在30μL反应缓冲液中[50 mM HEPES（pH 7.4）、1500 U/μL过氧化氢酶、100μM FeSO4、1μM抗坏血酸、0.2μMα-酮戊二酸（α-KG）]，在37°C下混合1h、 然后对反应进行免疫印迹或质谱分析。

质谱分析

通过蛋白A/G琼脂糖珠上的抗Flag抗体在SN12C细胞中免疫沉淀转染的Flag/Strep Beclin1，然后用Flag肽洗脱（Thermo Fisher Scientific，#A36805），然后用Zeba Spin脱盐柱脱盐（Thermo-Fisher科学，#89882）。免疫沉淀的Beclin1蛋白用TCEP还原，进行烷基化，并用GluC在37°C下消化过夜。样品用三氟乙酸酸化，并在Orbitrap-Elite质谱仪上用LC-MS/MS进行分析（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA），如前所述（Qian等人，2017年b).

体外PI（3）P ELISA

根据制造商的说明（Echelon Biosciences K-3000）（如前所述），在定量和竞争ELISA格式分析中检测PI（3）P的总量（Xu等人，2016). 简言之，不同的VPS34复合物由各种抗体富集，然后与磷脂酰肌醇底物混合在2×激酶反应缓冲液中（100 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl，2 mM CHAPS，10 mM MnCl22 mM DTT和100μM ATP）在37°C下反应1 h。PI3K反应完成并熄灭后，将反应产物稀释并添加到PI（3）P涂层微孔板中，以与PI（3。通过比色检测测定与平板结合的PI（3）P检测蛋白的量。

自噬试验

用或不用GFP-LC3质粒转染在凝胶盖玻片上生长的细胞。48小时后，将培养基改为完全培养基或葡萄糖缺乏培养基。在具有相同参数的共聚焦显微镜（蔡司LSM900）下观察外源性GFP-LC3绿色荧光蛋白（GFP）或Alexa Fluor 488染料结合抗体识别内源性LC3B的点状荧光。通过在Image J软件中将488个通道的图片设置为8位类型，并在相同的参数下调整阈值，在30个细胞中手动计数穿孔数。通过分析有无CQ时LC3B-II/Tubulin水平的差异，计算自噬通量。

亚细胞分离

根据制造商的说明，使用核/细胞质分馏试剂盒（K266，BioVision）从细胞中分离出核和胞质部分。简言之，通过600×克在4°C下保持5分钟，并用含有DTT和蛋白酶抑制剂的胞浆提取缓冲液重新悬浮。通过16000×离心机收集上清液（细胞质提取物）部分克在4°C下保持5分钟。然后在核提取缓冲液中重新悬浮颗粒，并在16000×克在4°C下孵育40分钟后，孵育10分钟。

细胞凋亡分析

如前所述，通过DAPI染色分析凋亡细胞的数量（Lee等人，2018). 电池（1×105)在六孔板中播种并培养过夜。然后通过直接向培养基中添加甲醛（最终浓度为12%）来固定细胞。固定后，用DAPI（1μg/mL）对细胞染色5分钟，然后用PBS洗涤。染色质浓缩和/或破碎的细胞被确定为正在发生凋亡并进行计数（Qian等人，2018). 对于TUNEL分析，肿瘤组织切片厚度为5μm。根据制造商的说明，使用Dead-End比色TUNEL系统（Promega）对凋亡细胞进行计数。

斑点免疫印迹分析

生物素标记的肽被缓慢地印在硝化纤维素膜上以渗透。将膜干燥并在含有5%非脂肪乳的PBST缓冲液中封闭30分钟，然后使用先前报告的指示的一级抗体和HRP偶联的二级抗体进行免疫印迹分析（Guo等人，2016; Zhang等人，2018).

人ccRCC标本的IHC分析和组织学评价

我们从上海Outdo Biotech购买了人体ccRCC组织阵列（HkidE180Su02）(http://www.superchip.com.cn/)经中国浙江省台州市医院伦理委员会批准。用LC3B、p62、VHL或Beclin P54-OH抗体和非特异性IgG作为阴性对照，对石蜡包埋的人ccRCC样本切片进行染色。如前所述，根据阳性细胞的百分比和染色强度对组织切片的染色进行定量评分（Yang等人，2011). 将以下比例分数分配给切片，如果0%的肿瘤细胞显示阳性染色，则为0；如果0–1%的细胞显示阳性，则为1；如果2–10%的细胞显示着色，则为2；如果11–30%的细胞显示阴性，则为3；如果31–70%的细胞显示为4；如果71–100%的细胞显示染色，则表示为5。此外，染色强度按0-3:0评分，无染色；1、弱；2、中度；和3，强大。然后将比例和强度得分结合起来，得出总得分（范围1-8），如前所述（Xu等人，2020). 将分数与总生存期进行比较，总生存期定义为从诊断日期到死亡日期或最后一次已知随访检查的时间。所有患者术后均接受了标准治疗。

动物研究

在含有33%Matrigel的20μL DMEM中收集100万ccRCC细胞，并将其皮下注射到6周龄雄性裸鼠BALB/c的肝脏中。按照之前的描述进行注射（Li等人，2016). 注射后第4天，将小鼠随机分为不同的治疗组（每组6只小鼠）。每天腹腔注射PT2395或SAR405，剂量为100 mg/kg。每3天测量肿瘤体积，直到注射后28天。对每只安乐死小鼠的肿瘤进行解剖，然后将其固定在4%甲醛中并包埋在石蜡中。通过H&E染色切片的组织学分析来确定肿瘤的形成和表型。肿瘤体积的计算公式为：V=1/2a2b（V，体积；a，最短直径；b，最长直径）。根据相关机构和国家指南和法规对动物进行治疗。动物的使用得到了杭州浙江大学医学院附属第一医院和中国青岛癌症研究所机构审查委员会的批准。没有使用统计方法预先确定样本量。研究人员在实验期间没有对治疗分配或结果评估盲目。

统计分析和再现性

所有统计数据均以平均值±标准偏差（SD）表示。所有实验均独立重复至少两次，结果相似。分析对照组和实验组中获得的平均值的显著差异。使用双尾t吨测试。P（P）小于0.05的值被认为是显著的。除非另有说明，否则这些实验不是随机的，研究人员在实验期间对治疗分配或结果评估也不是盲目的。

补充信息

附录（2.0M，pdf格式）

源数据图1（5.1M，拉链）

源数据图2（1.1M，拉链）

源数据图3（2.5米，拉链）

源数据图4（4.1M，拉链）

源数据图5（7.5M，拉链）

源数据图6（4.5M，拉链）

同行评审文件（12M，pdf）

展开视图地物（871K，pdf）

致谢

本研究得到了中华人民共和国科学技术部（2021YFA0805600，DX；2020YFA0803300，ZL）、国家自然科学基金（82072630，92157113，DX，82188102，82030074，ZL；82372814，82173114，ZW；82002811，MY；82103658，QZ）的资助，上海浦江计划（No.2022PJD040，QZ）、黑龙江省自然科学基金（LH2023H095，B.L.）、北京市医学奖基金项目（YXJL-2021-0581-0484，BL）、浙江省自然科学重点项目（LD22H160002，DX；LD21H160003，ZL）浙江省自然科学基金发现项目（LQ22H160023，ZW）。ZL是王宽诚特聘主席。

展开的视图

作者贡献

郑旺（音）：数据管理；调查；方法论；项目管理。梅斯燕：数据管理；调查；方法。《雷光叶》：形式分析；验证；调查；方法。周启敏：概念化；数据管理；调查；方法。段玉然：概念化；数据管理。姜红飞：数据管理；方法。王磊（Lei Wang）：调查。欧阳渊：概念化；方法。张华和：数据管理。沈玉莉（Yuli Shen）：验证。吉桂梅：数据管理。陈晓涵（Xiaohan Chen）：验证。齐天：验证。李维肖（Liwei Xiao）：形式分析。吴庆刚：软件；可视化。英蒙：可视化；方法。刘桂军：形式分析。莱娜·马：概念化。薄磊：资金获取；项目管理；写作-评论和编辑。卢志敏：监督；资金获取；撰写原稿；项目管理；写作-评论和编辑。徐大千：监督；资金收购；撰写原稿；项目管理；写作-评论和编辑。

数据可用性

本研究不包括存放在外部存储库中的数据。

披露和竞争利益声明

ZL拥有Signalway Biotechnology（德克萨斯州皮尔兰）的股份，该公司提供识别Beclin1 P54羟基化的兔抗体。ZL对该公司的兴趣与其被选择提供这些试剂无关。其余作者声明没有相互竞争的利益。

脚注

这些作者贡献均等：郑旺、颜美思、叶雷光、周启敏。

参与者信息

伯雷，nc.ude.umbrh@obiel公司.

卢志敏，nc.ude.ujz@ulnimihz.

徐大千，nc.ude.ujz@naiqadux公司.

补充信息

扩展视图数据、补充信息和附录可在10.1038/s44318-024-00051-2上获取。

工具书类

  • Chen W、Hill H、Christie A、Kim MS、Holloman E、Pavia Jimenez A、Homayoun F、Ma Y、Patel N、Yell P、Hao G、Yousuf Q、Joyce A、Pedrosa I、Geiger H、Zhang H、Chang J、Gardner KH、Bruick RK、Reeves C等。用HIF-2拮抗剂靶向肾细胞癌。自然。2016;539:112–117. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cho H、Du X、Rizzi JP、Liberzon E、Chakraborty AA、Gao W、Carvo I、Signoretti S、Bruick RK、Josey JA、Wallace EM、Kaelin WG。HIF-2alpha拮抗剂在临床前肾癌模型中的靶向疗效。自然。2016;539:107–111. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Choueiri TK，Kaelin工作组。，Jr靶向肾细胞癌中的HIF2-VEGF轴。自然医学。2020;26:1519–1530.[公共医学][谷歌学者]
  • Cockman ME、Lippl K、Tian YM、Pegg HB、Figg WDJ、Abboud MI、Heilig R、Fischer R、Myllyharju J、Schofield CJ、Ratcliffe PJ。重组HIF脯氨酰羟化酶（PHD）在报告的非HIF底物上缺乏活性。电子生活。2019;8：e46490。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Courtney KD、Infante JR、Lam ET、Figlin RA、Rini BI、Brugarolas J、Zojwalla NJ、Lowe AM、Wang K、Wallace EM、Josey JA、Choueiri TK。PT2385是一种一流的低氧诱导因子-2α拮抗剂，用于先前治疗的晚期透明细胞肾癌患者的一期剂量递增试验。临床肿瘤学杂志。2018;36:867–874. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Debnath J，Gammoh N，Ryan KM。癌症中的自噬和自噬相关途径。Nat Rev Mol细胞生物学。2023;24:560–575. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 刁J，刘R，荣Y，赵M，张J，赖Y，周Q，Wilz LM，Li J，Vivona S，Pfeetzner RA，Brunger AT，Zhong Q.ATG14促进自噬体与内溶酶体的膜连接和融合。自然。2015;520:563–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Du L，Lee JH，Jiang H，Wang C，Wang S，Zheng Z，Shao F，Xu D，Xia Y，Li J，Zhen Y，Qian X，Li X，Kim HR，Xing D，Liu P，Lu Z，Lyu J.β-Catenin诱导PD-L1转录表达，促进胶质母细胞瘤免疫逃避。《实验医学杂志》。2020;217：e20191115。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Foster K、Prowse A、van den Berg A、Fleming S、Hulsbeek MM、Crossey PA、Richards FM、Cairns P、Afara NA、Ferguson Smith MA等。非家族性透明细胞肾癌中von Hippel-Lindau病肿瘤抑制基因的体细胞突变。人类分子遗传学。1994;三:2169–73.[公共医学][谷歌学者]
  • Funderburk SF，Wang QJ，Yue Z.Beclin 1-VPS34复合物位于自噬和自噬以外的十字路口。细胞生物学趋势。2010;20:355–62. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Garcia D，Shaw RJ.AMPK：细胞能量感应和代谢平衡恢复的机制。分子细胞。2017;66:789–800. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gong C、Bauvy C、Tonelli G、Yue W、Delomenie C、Nicolas V、Zhu Y、Domergue V、Marin-Esteban V、Tharinger H、Delbos L、Gary-Gouy H、Morel AP、Ghavami S、Song E、Codogno P、Mehrpour M.Beclin 1和自噬是乳腺癌干样/祖细胞致瘤所必需的。致癌物。2013;32:2261–72. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gossage L，Eisen T，Maher ER。VHL，肿瘤抑制基因的故事。Nat Rev癌症。2015;15:55–64.[公共医学][谷歌学者]
  • 郭J，查克拉博蒂AA，刘P，甘伟，郑X，Inuzuka H，Wang B，Zhang J，Zhang-L，袁M，Novak J，Cheng JQ，Toker A，Signoretti S，ZhangQ，Asara JM，Kaelin WG，Jr，Wei W.pVHL以脯氨酸水解依赖的方式抑制Akt的激酶活性。科学。2016;353:929–32. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Harada J、Kokura K、Kanei-Ishii C、Nomura T、Khan MM、Kim Y、Ishii S.共同抑制因子同源域相互作用蛋白激酶2对滑雪介导抑制骨形态发生蛋白诱导的转录激活的要求。生物化学杂志。2003;278:38998–9005.[公共医学][谷歌学者]
  • Herzig S，Shaw RJ。AMPK：新陈代谢和线粒体稳态的守护者。Nat Rev Mol细胞生物学。2018;19:121–135. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 霍夫林·R、哈兰德·S、谢弗·S、梅茨格·P、郭·F、肖恩伯格·D、阿德莱西克·M、佩伊甘巴里·A、塞德尔·P、陈赛因、康塞恩扎·孔特雷拉斯·M、朱德·A、拉赫曼·B、格拉贝·N、海德·D、乌尔·FM、陈·TA、杜伊斯特·J、泽塞·R、谢尔·C等。HIF-1α和HIF-2α对小鼠透明细胞肾癌的肿瘤发展和炎症有不同的调节作用。国家公社。2020;11:4111. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hon WC、Wilson MI、Harlos K、Claridge TD、Schofield CJ、Pugh CW、Maxwell PH、Ratcliffe PJ、Stuart DI、Jones EY。pVHL识别HIF-1α中羟脯氨酸的结构基础。自然。2002;417:975–8.[公共医学][谷歌学者]
  • Hu L，Xie H，Liu X，Potjewyd F，James LI，Wilkerson EM，Herring LE，Xie L，Chen X，Cabrera JC，Hong K，Liao C，Tan X，Baldwin AS，Gong K，Zhang Q.TBK1是VHL缺失癌症的合成致死靶点。癌症发现。2020;10:460–475. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Itakura E、Mizushima N.Atg14和UVRAG：哺乳动物Beclin 1-PI3K复合物的互斥亚单位。自噬。2009;5:534–6.[公共医学][谷歌学者]
  • Ivan M，Kaelin工作组。，Jr EGLN-HIF O2传感系统：多输入和反馈。分子细胞。2017;66:772–779. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 凯林工作组。，Jr Von Hippel-Lindau病：氧感应、蛋白质降解和癌症的见解。临床研究杂志。2022;132：e162480。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kametaka S、Okano T、Ohsumi M、Ohsami Y.Apg14p和Apg6/Vps30p形成了酵母自噬所必需的蛋白质复合物，即酿酒酵母。生物化学杂志。1998;273:22284–91.[公共医学][谷歌学者]
  • Kang R，Zeh HJ，Lotze MT，Tang D.Beclin 1网络调节自噬和凋亡。细胞死亡不同。2011;18:571–80. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim J，Kim YC，Fang C，Russell RC，Kim JH，Fan W，Liu R，Zhong Q，Guan KL。AMPK在营养应激和自噬中对不同Vps34复合物的差异调节。单元格。2013;152:290–303. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kimmelman AC，White E.自噬与肿瘤代谢。单元格元数据。2017;25:1037–1043. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee JH，Liu R，Li J，Wang Y，Tan L，Li XJ，Qian X，Zhang C，Xia Y，Xu D，Guo W，Ding Z，Du L，Zheng Y，Chen Q，Lorenzi PL，Mills GB，Jiang T，Lu Z.磷酸果糖激酶1的EGFR-磷酸化血小板亚型促进PI3K活化。分子细胞。2018;70：197–210.e7。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Levine B，Kroemer G.自噬在疾病发病机制中的作用。单元格。2008;132:27–42. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Li L、Shen C、Nakamura E、Ando K、Signoretti S、Beroukhim R、Cowley GS、Lizotte P、Liberzon E、Bair S、Root DE、Tamayo P、Tsherniak A、Cheng SC、Tabak B、Jacobsen A、Hakimi AA、Schultz N、Ciriello G、Sander C等。SQSTM1是肾癌5q拷贝数增加的致病靶点。癌细胞。2013;24:738–50. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Li X，Qian X，Peng LX，Jiang Y，Hawke DH，Zheng Y，Xia Y，Lee JH，Cote G，Wang H，Wang L，钱CN，Lu Z.酮己激酶-C到酮己激酶-A的剪接开关驱动肝细胞癌的形成。自然细胞生物学。2016;18:561–71. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Li X，Yu W，Qian X，Xia Y，Zheng Y，Lee JH，Li W，Lyu J，Rao G，Zhang X，Qiang CN，Rozen SG，Jiang T，Lu Z.细胞核转移的ACSS2促进溶酶体生物发生和自噬的基因转录。分子细胞。2017;66：684–697.e9。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lisztwan J、Imbert G、Wirbelauer C、Gstaiger M、Krek W。血管Hippel-Lindau抑癌蛋白是E3泛素蛋白连接酶活性的组成部分。基因开发。1999;13:1822–33. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lonergan KM、Iliopoulos O、Ohh M、Kamura T、Conaway RC、Conawy JW、Kaelin WG.、。，von Hippel-Lindau抑癌蛋白对低氧诱导mRNA的调节需要结合到包含伸长蛋白B/C和Cul2的复合物。分子细胞生物学。1998;18:732–41. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Obara K，Sekito T，Ohsumi Y.磷脂酰肌醇3-激酶复合物的组合-Atg14p将复合物I与酿酒酵母中的自噬前结构联系起来。分子生物学细胞。2006;17:1527–39. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Oh M、Park CW、Ivan M、Hoffman MA、Kim TY、Huang LE、Paveletich N、Chau V、Kaelin WG。低氧诱导因子的泛素化需要与von Hippel-Lindau蛋白的β结构域直接结合。自然细胞生物学。2000;2:423–7.[公共医学][谷歌学者]
  • Pan Y，Zhao Z，Li J，Li J.，Luo Y，Li W，You W，Zhang Y，Li Z，Yang J，Xiao ZJ，Wang Y.核Beclin 1破坏视网膜母细胞瘤蛋白的稳定性，促进细胞周期进展和结直肠癌生长。癌症。2022;14:4735. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pasquier B.SAR405，一种PIK3C3/Vps34抑制剂，可防止肿瘤细胞自噬并与MTOR抑制协同作用。自噬。2015;11:725–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pattinger S、Tassa A、Qu X、Garuti R、Liang XH、Mizushima N、Packer M、Schneider MD、Levine B.Bcl-2抗凋亡蛋白抑制Beclin 1依赖性自噬。单元格。2005;122:927–39.[公共医学][谷歌学者]
  • Qian X，Li X，Cai Q，Zhang C，Yu Q，Jiang Y，Lee JH，Hawke D，Wang Y，Xia Y，Zheng Y，Jiang BH，Liu DX，Jiang T，Lu Z。磷酸甘油酸激酶1磷酸化Beclin1以诱导自噬。分子细胞。2017;65（5） ：917–931.e6。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Qian X，Li X，Cai Q，Zhang C，Yu Q，Jiang Y，Lee JH，Hawke D，Wang Y，Xia Y，Zheng Y，姜波黑，Liu DX，姜T，Lu Z.磷酸甘油激酶1磷酸化Beclin1诱导自噬。分子细胞。2017;65：917–931.e6。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Qian X，Li X，Shi Z，Bai X，Xia Y，Zheng Y，Xu D，Chen F，You Y，Fang J，Hu Z，Zhou Q，Lu Z.KDM3A感知氧可用性以调节PGC-1α介导的线粒体生物发生。分子细胞。2019;76：885–895.e7。[公共医学][谷歌学者]
  • Qian X，Li X，Shi Z，Xia Y，Cai Q，Xu D，Tan L，Du L，Zheng Y，Zhao D，Zhang C，Lorenzi PL，You Y，Jiang BH，姜T，Li H，Lu Z.PTEN通过去磷酸化和抑制自磷酸化PGK1抑制糖酵解。分子细胞。2019;76：516–527.e7。[公共医学][谷歌学者]
  • Qian X，Li X，Tan L，Lee JH，Xia Y，Cai Q，Zheng Y，Wang H，Lorenzi PL，Lu Z.通过AMPK介导的磷酸化将PRPS六聚体转化为单体抑制核苷酸合成以应对能量应激。癌症发现。2018;8:94–107. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rodriguez J、Haydinger CD、Peet DJ、Nguyen LK、von Kriegsheim A.天冬酰胺羟基化是一种可逆的翻译后修饰。分子细胞蛋白质组学：MCP。2020;19:1777–1789. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rui Y，Xu Z，Lin S，Li Q，Rui H，Luo W，Zhou HM，Cheung PY，Wu Z，Ye Z，Li P，Han J，Lin SC。Axin通过多聚物形成激活HIPK2激酶来刺激p53功能。EMBO J。2004;23:4583–94. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Russell RC、Tian Y、Yuan H、Park HW、Chang YY、Kim J、Kim H、Neufeld TP、Dillin A、Guan KL。ULK1通过磷酸化Beclin-1和激活VPS34脂激酶诱导自噬。自然细胞生物学。2013;15:741–50. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Saito T、Ichimura Y、Taguchi K、Suzuki T、Mizushima T、Takagi K、Hirose Y、Nagahashi M、Iso T、Fukutomi T、Ohishi M，Endo K、Uemura T、Nishito Y、Okuda S、Obata M、Kouno T、Imamura R、Tada Y、Obada R等。p62/Sqstm1通过Nrf2依赖性代谢重编程促进HCV阳性肝细胞癌的恶性。国家公社。2016;7:12030. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stransky LA、Vigeant SM、Huang B、West D、Denize T、Walton E、Signoretti S、Kaelin WG、。，VHL突变肾癌对HIF2抑制剂的Jr敏感性不需要完整的p53通路。美国国家科学院程序。2022;119：e2120403119。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tanimoto K，Makino Y，Pereira T，Poellinger L.von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白调节低氧诱导因子-1α的机制。EMBO J。2000;19:4298–309. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wallace EM、Rizzi JP、Han G、Wehn PM、Cao Z、Du X、Cheng T、Czerwinski RM、Dixon DD、Goggin BS、Grina JA、Halfmann MM、Maddie MA、Olive SR、Schlachter ST、Tan H、Wang B、Wang K、Xie S、Xu R等。HIF2alpha小分子拮抗剂对肾细胞癌临床前模型有效。癌症研究。2016;76:5491–500.[公共医学][谷歌学者]
  • 怀特E.解开癌症中自噬的上下文依赖性作用。Nat Rev癌症。2012;12:401–10. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 怀特E.自噬在癌症中的作用。临床研究杂志。2015;125:42–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Xu D，Li X，Shao F，Lv G，Lv H，Lee JH，Qian X，Wang Z，Xia Y，Du L，Zheng Y，Wang H，Lyu J，Lu Z。果糖激酶A的蛋白激酶活性通过磷酸化p62指定肿瘤细胞的抗氧化反应。科学高级。2019;5：eaav4570。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Xu D，Wang Z，Xia Y，Shao F，Xia W，Wei Y，Li X，Qian X，Lee JH，Du L，Zheng Y，Lv G，Leu JS，Wang H，Xing D，Liang T，Hung MC，Lu Z。葡萄糖新生酶PCK1磷酸化INSIG1/2用于脂肪生成。自然。2020;580:530–535.[公共医学][谷歌学者]
  • Xu D，Wang Z，Zhang Y，Jiang W，Pan Y，Song BL，Chen Y.PAQR3通过将Scap/SREBP复合物锚定到高尔基体来调节胆固醇稳态。国家公社。2015;6:8100. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Xu DQ，Wang Z，Wang CY，Zhang DY，Wan HD，Zhao ZL，Gu J，ZhangYX，Li ZG，Man KY，Pan Y，Wang ZF，Ke ZJ，Liu ZX，Liao LJ，Chen Y.PAQR3通过整合AMPK信号来增强ATG14L相关PI3K活性，从而控制自噬。EMBO J。2016;35:496–514. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yang W，Xia Y，Ji H，Zheng Y，Liang J，Huang W，Gao X，Aldape K，Lu Z。核PKM2在EGFR激活时调节β-catenin反式激活。自然。2011;480:118–22. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhang J，Wu T，Simon J，Takada M，Saito R，Fan C，Liu XD，Jonasch E，Xie L，Chen X，Yao X，Teh BT，Tan P，Zheng X，Li M，Lawrence C，Fan J，Geng J，Liu X，Hu L等。VHL底物转录因子ZHX2在透明细胞肾细胞癌中作为致癌驱动因素。科学。2018;361:290–295. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团