蛋白激酶Cδ亚种转运和激活的三种不同机制

细胞培养。

COS-7细胞购自日本筑波市Riken Cell Bank。菌株CHO-K1（ATCC CCL 61）来自美国型培养物收藏。COS-7细胞在添加44 mM NaHCO的Dulbecco改良Eagle培养基中培养_三和10%胎牛血清（FBS）在含有5%CO的湿化空气中₂37°C时。CHO-K1细胞在添加10%FBS和14 mM NaHCO的Ham’s F-12培养基中培养_三所有培养基均添加青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml），所用的FBS未经热灭活。

编码δ-PKC-GFP融合蛋白质粒的构建。

含有人源化GFP cDNA（pEGFP-N1）的质粒购自Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）。编码GFP的cDNA片段门我-生态RI公司-Bgl公司5′-末端的II个位点和门以GFP为模板，通过PCR获得3′末端的I位点。GFP的阳性引物为5′-TTCAATTGAATTCAGATCTATGGTGAGAGGCGAGGAG-3′，反义引物为5'-GGCAATTGCTAGCTAGCTGGCCAGGATCC-3′。GFP的PCR产物经门一、 子克隆到生态RI位点位于表达载体pTB 701中，命名为BS340。δ-PKC的cDNA片段(34)或其激酶阴性突变体（δ-PKC-KN）(18)带有生态5′终点的RI站点和巴姆PCR还检测到3′端HI位点。δ-PKC-KN（Lys³⁷⁶突变为Met），如前所述(18). 所用的正、反义引物分别为5′-TTGGATTCATGGCACGTCCTGCG-3′和5′-GCGGATCCCACAGGAATTCAT-3′。δ-PKC及其激酶阴性突变体的PCR产物用生态RI和巴姆HI，然后将子克隆到生态RI公司/Bgl公司BS340中的II位点，分别命名为BS391（表达δ-PKC-GFP）和BS435（表达δ-BKC-KN-GFP）。质粒pTB801用于大鼠δ-PKC的表达(34).

培养细胞中δ-PKC-GFP蛋白的表达。

电穿孔法瞬时转染COS-7细胞。编码δ-PKC-GFP或δ-PKC的质粒（约32μg）被转染到6×10⁶使用基因脉冲发生器（960μF，220 V；Bio-Rad，Hercules，Calif.）。根据制造商的标准方案，使用TransIT（日本京都高原市）通过脂质体转染方法将CHO-K1细胞转染。转染后16 h，在两种细胞系中均可检测到δ-PKC–EGFP的荧光。所有实验均在转染后2天进行。

δ-PKC-GFP和δ-PKC的免疫沉淀。

用含有1%Triton X-100的1 ml匀浆缓冲液（250 mM蔗糖、10 mM EGTA、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl、200μg leupeptin/ml、1 mM苯甲基磺酰基氟化物[PH7.4]）收集表达δ-PKC-GFP或δ-PKC的细胞，并通过超声波均质（UD-210 TOMY SEIKO Co.Ltd.，Tokyo，Japan；产量，5；负荷，50%；在4°C下10次）。19000×离心后克将上清液与抗δ-PKC单克隆抗体（肯塔基州列克星敦的Transduction Laboratories，Lexington）或抗GFP多克隆抗体（1:50）（Clontech）在4°C下培养15分钟，然后与蛋白A-Sepharose再培养2小时。将样品在2000×克在4°C下保持5分钟，并用不含Ca的磷酸盐缓冲盐水（PBS）将颗粒洗涤三次²⁺和镁²⁺[PBS（−）]。最后，将颗粒悬浮在50μl PBS（−）中，并用于激酶分析或免疫印迹。

免疫印迹分析。

为了检测易位，收集转染细胞，并用无Triton X-100的匀浆缓冲液进行超声均质。19000×离心后克15分钟后，收集上清液作为胞浆部分。在含有1%Triton X-100的匀浆缓冲液中对颗粒进行超声处理，并在19000×克持续15分钟；然后收集上清液作为颗粒物。为了进行免疫印迹，细胞液样品、颗粒样品或免疫沉淀样品在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分离的蛋白质电泳转移到二氟化聚乙烯（PVDF）过滤器上（Millipore，Bedford，Mass.）。通过在含有0.03%Triton X-100的0.01 M PBS中用5%脱脂牛奶孵育18小时，阻断PVDF过滤器上的非特异性结合位点。然后用抗δ-PKC单克隆抗体（稀释1:1000）、抗磷酸酪氨酸抗体4G10（稀释1:2000；Upstate Biotechnology，Lake Placid，N.Y.）、，或抗GFP多克隆抗体（1:1000稀释）在25°C下保持1小时。清洗后，将过滤器与生物素标记的马抗鼠免疫球蛋白G（用于δ-PKC抗体或抗磷脂酰肌醇抗体）或生物素标记马抗兔免疫球蛋白G（用于GFP抗体）孵育30分钟，然后与亲和素-生物素过氧化物酶复合物孵育30min。三次清洗后，用增强化学发光检测试剂盒（英国白金汉郡阿默沙姆）观察免疫反应带。

δ-PKC-GFP和δ-PKC的酶学性质。

免疫沉淀样品（10μl悬浮颗粒）用于激酶分析。如前所述，对COS-7细胞中表达的δ-PKC和δ-PKC-GFP进行激酶测定(35). 简言之，通过测量³²P（P）_我从[γ]到小牛胸腺H1组蛋白-³²P] 含有磷脂酰丝氨酸（PS；8μg/ml）、二醛（DO；0.8μg/ml²⁺（5毫微米）。在存在0.5 mM EGTA而不是PS、DO和Ca的情况下测量基础活性²⁺通过测量β-PKC–GFP在CHO-K1细胞中的掺入量来测定不同刺激后CHO-K1.细胞中δ-PKC-GFP的激酶活性³²P（P）_我从[γ]到小牛胸腺H1组蛋白-³²P] ATP不含任何激活剂，如PS、DO和Ca²⁺.

δ-PKC-GFP易位的观察。

将转染δ-PKC-GFP或其突变体的CHO-K1细胞接种到玻璃底培养皿（MatTek Corp.，Ashland，Mass.）上，并在观察前培养至少16 h。将培养基替换为含有5 mM HEPES（pH 7.3）而非FBS的Ham’s F-12培养基。

在共聚焦激光扫描荧光显微镜（德国耶拿卡尔蔡司）下，在488-nm氩激发下，使用515-nm-长通屏障滤光片监测δ-PKC-GFP的荧光。在培养基中直接应用高浓度的各种刺激物，以获得适当的最终浓度，从而触发δ-PKC-GFP的转移。所有涉及共焦激光扫描荧光显微镜的实验均在37°C下进行。

ATP、H诱导δ-PKC-GFP易位的可视化研究₂O（运行）₂和TPA。

δ-PKC-GFP的强荧光遍布细胞质，包括转染CHO-K1细胞的核质（图。​（图2）。2). 在共焦激光扫描荧光显微镜下观察到的荧光定位至少在1小时内没有改变，荧光强度略有下降（数据未显示）。1 mM ATP激活δ-PKC-GFP可诱导荧光从胞浆快速转移到质膜。刺激后30秒内观察到移位。此后，δ-PKC-GFP再次从细胞膜快速重定位到胞浆，并在3分钟内恢复到与刺激前类似的状态。相反，H刺激后至少30分钟未观察到移位₂O（运行）₂尽管荧光强度似乎略有减弱。TPA诱导的δ-PKC-GFP易位比ATP慢，并且是单向的，从细胞质到膜。TPA刺激后3min内，核周δ-PKC-GFP完全移位至膜；刺激后10min，核质中的荧光开始向核膜转移。TPA处理后，荧光在质膜或核膜上停留至少60分钟，并且没有回到被检细胞的细胞质中。

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图2

在37°C（bar=10μM）、5 mM H下用1 mM ATP刺激CHO-K1细胞表达的δ-PKC–GFP的荧光变化证明了各种刺激诱导的δ-PKC的移位₂O（运行）₂在37°C（巴=10μM）下，以及在37°C（巴=10μM）下的1μM TPA。

ATP、H处理后δ-PKC-GFP的激酶活性₂O（运行）₂和TPA。

免疫沉淀的δ-PKC-GFP的激酶活性通过测定³²P（P）_我来自[γ-³²P] ATP转化为H1组蛋白，没有任何额外的活化剂，如PS和DO。用ATP处理后，免疫沉淀的δ-PKC-GFP的激酶活性略有但显著增加（图。​（图3A）。三A） 。相反，H治疗后₂O（运行）₂治疗后30分钟，δ-PKC-GFP的激酶活性持续增加，约为基础水平的三倍（图。​（图3B）。三B） ●●●●。TPA还将激酶活性增加到基础水平的2.5倍，并且在治疗后5分钟，激酶活性达到稳定（图。​（图3C）。三C） ●●●●。

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图3

1 mM ATP（A）、5 mM H刺激转染CHO-K1细胞后δ-PKC-GFP激酶活性的变化₂O（运行）₂（B） 和1μM TPA（C）。在刺激后的不同时间点，用抗δ-PKC抗体免疫沉淀δ-PKC–GFP，并用H1组蛋白作为底物，在没有任何激活剂（如DO和PS）的情况下测定激酶活性。数据以对照水平（刺激前的激酶活性）的百分比表示。所有结果均代表四次以上测定的平均值和标准误差。统计显著性：*，P（P）与刺激前的激酶活性相比<0.05；**，P（P）两个指示点之间<0.05。

ATP、H处理后δ-PKC-GFP的酪氨酸磷酸化₂O（运行）₂和TPA。

ATP、H处理后δ-PKC-GFP的酪氨酸磷酸化₂O（运行）₂，并使用抗磷酪氨酸抗体通过免疫印迹法检测TPA（图。​（图4）。4). 将相当于激酶分析样品的免疫沉淀样品进行SDS-PAGE，然后转移到膜上。ATP未引起δ-PKC-GFP的酪氨酸磷酸化，TPA治疗30分钟后仅检测到轻微的酪氨酸磷酸化。然而，经H处理后，δ-PKC-GFP明显被酪氨酸磷酸化₂O（运行）₂H后酪氨酸磷酸化逐渐增加₂O（运行）₂治疗。抗GFP抗体的免疫印迹显示，所有样本中免疫沉淀了相似数量的δ-PKC-GFP。

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图4

ATP，H处理的转染CHO-K1细胞中δ-PKC–GFP的酪氨酸磷酸化₂O（运行）₂和TPA。顶行，酪氨酸磷酸化的变化。用抗酪氨酸抗体免疫印迹法分析抗δ-PKC抗体免疫沉淀的δ-PKC-GFP的酪氨酸磷酸化。最下面一行，δ-PKC–GFP量的变化。抗δ-PKC抗体免疫沉淀的δ-PKC-GFP量用抗GFP多克隆抗体免疫印迹法测定。

与H同时治疗的效果₂O（运行）₂以及TPA对δ-PKC–GFP易位和激酶活性的影响。

阐明H₂O（运行）₂TPA通过同样的途径激活δ-PKC–GFP，我们研究了同时应用H₂O（运行）₂和TPA。用抗δ-PKC抗体免疫沉淀的δ-PKC-GFP的激酶活性通过H处理增加了3.2倍和2.4倍₂O（运行）₂和TPA（图。​（图5A）。5A） 。与H同时治疗₂O（运行）₂TPA进一步激活了δ-PKC–GFP，并且激酶活性随时间增加达五倍（图。​（图5B）。5B） ●●●●。H的累积效应₂O（运行）₂在转染天然δ-PKC的细胞中也发现了TPA。在转染δ-PKC-KN–GFP的CHO-K1细胞的免疫沉淀样品中未发现或可忽略的激酶活性）。为了排除抗δ-PKC抗体影响δ-PKC-激酶活性的可能性，用抗GFP抗体免疫沉淀δ-PKC-GFP。当使用抗GFP抗体代替抗δ-PKC抗体时，TPA和H的加性效应₂O（运行）₂同样观察到，转染δ-PKC-KN–GFP的CHO-K1细胞没有或几乎没有激酶活性（图。​（图5C）。5C） ●●●●。

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图5

TPA和H同时刺激后δ-PKC和δ-PKC-GFP的激酶活性₂O（运行）₂用抗δ-PKC抗体（A和B）或转染CHO-K1细胞的抗GFP抗体（C）免疫沉淀Δ-PKC、δ-PKC-GFP或δ-PKC-KN-GFP₂O（运行）₂单独30分钟，1μM TPA单独30分钟或H₂O（运行）₂和TPA同时进行30分钟（A和C）或0至30分钟（B）。数据表示五个以上实验的平均值±标准误差。

TPA和H同时应用后δ-PKC-GFP的易位₂O（运行）₂也进行了研究。H治疗30分钟₂O（运行）₂没有改变δ-PKC–GFP的定位，如图所示。​图2，2但随后用TPA将δ-PKC-GFP转位到膜上，如无H时所见₂O（运行）₂（图。​（图6A，6A、 顶行）。即使在用H处理细胞后，ATP也能诱导δ-PKC-GFP的瞬时易位₂O（运行）₂（图。​（图6A，6A、 底行）。

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图6

CHO-K1细胞表达的δ-PKC–GFP和δ-PKC-KN–GFP的易位。（A） H治疗后TPA（顶部）和ATP（底部）诱导的δ-PKC-GFP移位₂O（运行）₂（5 mM）持续30分钟（bar=10μM）；（B） TPA诱导的δ-PKC-KN–GFP荧光变化（δ-PKC-GFP显示类似的易位）（顶部）和TPA在H₂O（运行）₂（5 mM）持续30分钟（底部）（bar=10μM）。

当CHO-K1细胞用δ-PKC-KN–GFP转染时，同样观察到TPA的易位，尽管突变激酶没有显示激酶活性（图。​（图6B，6B、 顶行）。H预处理₂O（运行）₂没有改变TPA诱导的δ-PCK-KN–GFP易位（图。​（图6B，6B、 底行）。

这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部、山口代谢紊乱研究基金会和加藤纪念生物科学基金会的资助。

我们感谢西冢康美的有益讨论。