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。2023年1月1日；16（1）：dmm049856。
doi:10.1242/dmm.049856。 Epub 2023年1月18日。

浸润性循环单核细胞是脊髓损伤早期BMP4的重要来源

沈伟云 1 2, 刘树新 1 2, 魏晓静 1 2, 王亚萍 1 2 三, 林阳（Lin Yang） 1 2
附属机构

浸润性循环单核细胞是脊髓损伤早期BMP4的重要来源

沈伟云等。 Dis模型机械。 。

摘要

骨形态发生蛋白（BMP）4在脊髓损伤（SCI）过程中对神经元和胶质细胞的活动起着重要的调节作用。BMP4在受损脊髓积聚的潜在原因和细胞来源尚不清楚。在此，我们观察到SCI患者的血浆BMP4水平在统计学上高于健康献血者。当比较假手术组大鼠（无脊髓损伤的T9椎板切除术）和脊髓损伤组大鼠时，我们发现BBB评分持续下降，挫伤部位出现坏死和单核细胞积聚。此外，SCI后2周内，血浆和脑脊液BMP4水平均显著升高，且呈正相关。重要的是，SCI组循环BMP4-阳性（BMP4+）单核细胞和浸润MDM的百分比高于假手术组。最后，在SCI+氯膦酸盐脂质体组中，单核细胞的耗竭有效地减弱了BMP4+MDM和BMP4在受损脊髓中的积聚。我们的结果表明，脊髓损伤后，浸润性MDM为受损脊髓提供了BMP4的重要来源，因此可能成为潜在的治疗靶点。

关键词：血脊髓屏障；骨形态发生蛋白4；单核细胞；单核细胞源性巨噬细胞；脊髓损伤。

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竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

图1。
图1。
脊髓损伤（SCI）患者和健康献血者的BMP2/4/7和noggin血浆水平。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SCI患者和健康献血者（HD）血浆中BMP4（A）、BMP2（B）、BMP7（C）和noggin（D）的浓度。曼·惠特尼U型-进行了测试**P（P）<0.01. ns，不显著。
图2。
图2。
脊髓损伤会导致持续性截瘫、神经损伤和受损脊髓的细胞丢失。对大鼠进行假手术或脊髓损伤干预。（A-C）然后，在连续14天内，用Basso-Bettie-Bresnahan（BBB）量表对两组的运动功能进行评估 天（A）；伤后第3天，采集脑脊液（CSF）（B）和血浆（C），用ELISA检测NEFL浓度（B，C）。（D） 脑脊液和血浆中NEFL水平的相关性。（E） 在dpi-3时，采集脊髓组织的冰冻切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色以显示形态学变化。（F，G）免疫荧光显示脊髓损伤部位（黄色虚线框中）NEUN（神经元标记物，红色）的表达变化（F）并量化（G）。（H-J）Western印迹用于检测脊髓中CNPase（少突胶质细胞标记物）和GFAP（星形胶质细胞标记物）的表达变化（H）并定量（CNPase，I；GFAP，J）。未配对双尾学生t吨-测试（G，I，J），Kruskal–Wallis测试，然后进行Dunn多重测试（B，C），双向方差分析，然后进行Sidak多重比较测试（A）和Spearman秩相关分析（D）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001。ns，不显著。
图3。
图3。
SCI诱导循环单核细胞BMP4上调。从SCI和假手术大鼠中采集血液用于ELISA和细胞术分析。（A，B）ELISA检测血浆中dpi-1、dpi-7和dpi-14的BMP4（A）和noggin（B）水平。（C-K）用Ficoll梯度分离法从全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs），并在dpi-3处用流式细胞术进行分析。（C） 大鼠循环单核细胞（CD45）的步骤和门控策略+CD11b型+)来自PBMC。（D，E）显示BMP4百分比的代表性流式细胞术图（D）和统计数据（E）+循环单核细胞中的细胞。（F，G）流式细胞术直方图（F）和统计数据（G）显示循环单核细胞中BMP4表达的平均荧光强度（MFI）。（H，I）显示BMP4百分比的代表性流式细胞术图（H）和统计数据（I）+CD86中的细胞+单核细胞。（J，K）流式细胞术直方图（J）和统计数据（K）显示CD86中BMP4 MFI+单核细胞。未配对双尾学生t吨-进行了测试（E、G、I、K）和Kruskal–Wallis测试，然后进行了Dunn的多项测试（A、B）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001。ns，不显著。FSC，正向散射；SSC，侧面散射。
图4。
图4。
BMP4在损伤脊髓中浸润的单核细胞源性巨噬细胞（MDM）中上调。脊髓损伤后，从脊髓损伤大鼠和假手术大鼠身上采集脊髓和脑脊液进行进一步实验。（A-D）为了进行流式细胞术分析，采集脊髓并制备成单细胞悬浮液，然后通过Percoll梯度离心分离脊髓单核细胞 SCI后天。（A） CD11b的代表性流式细胞术图+CD45型你好SCI组和假手术组的（MDM）细胞。以前选通为CD11b的细胞+（B）CD11b的百分比+CD45型你好脊髓CD11b中的（MDM）细胞+细胞。用ELISA法测定脑脊液中BMP4（C）和noggin（D）在第1、7和14天的水平 SCI后天。（E） 脑脊液和血清中BMP4浓度的相关性分析。（F） 脑脊液与血清noggin浓度的相关性分析。（G） BMP4的代表性流式细胞仪图+脊髓CD11b各亚群中的细胞+细胞（CD11b+巨噬细胞/小胶质细胞；CD11b型+CD45型洛，大胶质细胞；CD11b型+CD45型你好，巨噬细胞）。（H） BMP4的百分比+脊髓CD11b各亚群中的细胞+假手术组和脊髓损伤组的细胞。（I，J）流式细胞术分析显示脊髓CD11b各亚群中的BMP4 MFI+SCI组和假手术组的细胞。数据以代表性流式细胞术直方图（I）和总结图（J）表示。（K，L）流式细胞术检测CD86的百分比+在脊髓CD11b的每个亚群中+SCI大鼠的细胞。数据以代表性流量图（K）和汇总图（L）的形式呈现。（M） 流式细胞术数据的t分布随机邻域嵌入（tSNE）图，显示细胞-子集分布（CD11b+骨形态发生蛋白4+，CD11b+CD45型你好和CD86+CD11b型+细胞）。数据显示为平均值±标准差未配对双尾学生t吨-测试（B）、单因素方差分析（ANOVA）、Sidak多重比较测试（C、D、H、J、L）和Spearman相关分析（E、F）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001。ns，不显著。
图5。
图5。
循环单核细胞耗竭可减少脊髓单核细胞浸润和BMP4水平，减轻脊髓损伤引起的神经损伤。（A） 显示药物治疗、脊髓损伤手术和进一步实验时间表的实验图表。（B） 流式细胞仪图显示血液中单核细胞在3 注射氯膦酸盐脂质体（CLL）后第天。（C） 3岁时血液中单核细胞数量的统计分析 给药后天。（D，E）流式细胞术分析显示脊髓中浸润MDM的百分比 SCI治疗后第天。数据以代表性流式细胞仪图（D）和统计图（E）表示。（F） 典型的western blot图像显示脊髓中CD45和CD11b的表达。（G） 脊髓中CD45与GAPDH的灰度比值。（H） 脊髓CD11b与GAPDH的灰度比值。（I，J）通过蛋白质印迹法评估脊髓中BMP4的水平。数据以代表性图像（I）和显示BMP4与GAPDH灰度比值（J）的图形表示。未配对双尾学生t吨-进行测试（C，E）和单因素方差分析，然后进行Sidak的多重比较测试（G，H，J）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001。ns，不显著。流式细胞术；WB，western blotting。
图6。
图6。
BMP4在脊髓损伤过程中上调的可能机制。（1） SCI后，BMP4在CD86中高度表达+循环单核细胞；（2） 循环单核细胞通过受损的血脊髓屏障迁移，并增强MDM在受损脊髓中的浸润；（3） 浸润的MDM有助于BMP4的积聚，并加剧中枢神经系统损伤部位的促炎微环境。
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