AMPK-dependent phosphorylation of MTFR1L regulates mitochondrial morphology

doi:10.1126/sciadv.abo7956

。2022年11月11日；8（45）：eabo7956。

doi:10.1126/sciadv.abo7956。 Epub 2022年11月11日。

AMPK依赖的MTFR1L磷酸化调节线粒体形态

附属公司

¹英国剑桥大学医学研究委员会线粒体生物学研究室，Hills Road，CB2 0XY Cambridge。
²英国苏格兰邓迪DD1 5EH邓迪大学生命科学学院细胞信号与免疫学系。
^三哥伦比亚大学神经科学系，纽约，NY 10032，美国。
⁴英国剑桥大学医学系。

PMID： 36367943
预防性维修识别码： PMC9651865
内政部： 10.1126/sciadv.abo7956

AMPK依赖的MTFR1L磷酸化调节线粒体形态

丽莎·蒂洛卡尼等人。科技进步。 2022。

。2022年11月11日；8（45）：eabo7956。

doi:10.1126/sciadv.abo7956。 Epub 2022年11月11日。

附属公司

¹英国剑桥大学医学研究委员会线粒体生物学单元，Hills Road，CB2 0XY Cambridge。
²英国苏格兰邓迪DD1 5EH邓迪大学生命科学学院细胞信号与免疫学系。
^三哥伦比亚大学神经科学系，纽约，NY 10032，美国。
⁴英国剑桥大学医学系。

PMID： 36367943
预防性维修识别码： PMC9651865
内政部： 10.1126/sciadv.abo7956

摘要

线粒体是一种动态的细胞器，在代谢改变的作用下，线粒体会发生膜重构事件，以生成足够的线粒体网络。在这里，我们研究了线粒体裂变调节器1样蛋白（MTFR1L）的功能，一种在磷酸蛋白质组学筛选中确定为潜在AMP活化蛋白激酶（AMPK）底物的未表征蛋白质。我们发现，MTFR1L是一种外线粒体膜定位蛋白，调节线粒体形态。MTFR1L缺失导致线粒体伸长，与线粒体融合事件和线粒体融合蛋白水平增加相关，即视神经萎缩1。从机制上讲，我们表明MTFR1L被AMPK磷酸化，从而控制MTFR1L在哺乳动物细胞系和小鼠体内皮层神经元中调节线粒体形态的功能。此外，我们证明MTFR1L是应激诱导的AMPK依赖性线粒体断裂所必需的。总之，这些发现将MTFR1L确定为一种关键的线粒体蛋白，通过调节线粒体动力学来转换AMPK依赖的代谢变化。

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数字

图1。 — **图1.MTFR1L是一种线粒体蛋白。**
(A类)亚细胞分馏的免疫印迹分析显示MTFR1L在用非靶向（NT）或MTFR1L-siRNA处理的HeLa细胞中定位。全细胞（WC）裂解物被分馏成含有粗线粒体（CM）和细胞溶质（Cyt）组分的厚膜。分别使用Vinculin和VDAC1作为细胞溶质和线粒体标记物。(B类)NT或MTFR1L siRNAs沉默的U2OS细胞MTFR1L定位的典型共焦图像。线粒体和MTFR1L分别用TOM20和MTFR1抗体标记。比例尺，20μm。(C类)HeLa细胞粗线粒体蛋白酶K消化试验。粗线粒体组分（CMF）用增加浓度的蛋白酶K处理并通过免疫印迹分析。Mfn2、AIF、Mic60和MDH2分别用作OMM、膜间隙、IMM和基质标记。(D类)碳酸钠处理从HeLa细胞分离的CMF。用免疫印迹法分析全细胞（WC）、粗线粒体（CM）、含有膜插入蛋白的颗粒（P）和含有可溶性蛋白的上清液（SN）的组分。使用Vinculin作为全细胞标记物，使用Mic60和VDAC1作为完整膜蛋白的对照，而使用CytC作为可溶性蛋白的对照。(E类)MTFR1L在不同野生型（WT）小鼠组织中表达的免疫印迹分析。使用Vinculin和GRP75作为负载对照。MTFR1L有两种不同的时间风险，低风险和高风险。使用阿特拉斯抗体（HPA027124）检测MTFR1L。另请参见图S1。

图2。 — **图2 MTFR1L缺失导致线粒体伸长。**
(A类)WT和MTFR1L KO U2OS细胞线粒体形态的典型共焦图像。用抗TOM20抗体标记线粒体。比例尺，20μm。(B类)MTFR1LKO U2OS克隆中MTFR1L水平的免疫印迹分析。采用Vinculin和HSP60作为负荷对照。(C类)线粒体形态定量（A）。(D类到如果)线粒体形态量化为（D）线粒体数量、（E）平均线粒体面积和（F）每个ROI的连接数。(**G公司**)WT和MTFR1L KO U2OS细胞的活细胞成像过度表达鸟氨酸氨甲酰转移酶（OCT）–光敏GFP（mt-PAGFP）探针和线粒体标记物TOM20-mCherry。比例尺，10μm。(**H（H）**)根据（G）量化OCT-PAGFP探针扩散，计算为0分钟和5分钟时OCT-PAGFP在总线粒体网络（TOM20-mCherry）上占据面积的比率(我)WT和MTFR1L KO U2OS细胞的典型TEM图像。比例尺，1μm。(J型)TEM图像定量显示线粒体长度分布（I）。(**K（K）**)WT和MTFR1L KO U2OS细胞线粒体形态的典型共焦图像，P2A-mCherry单独或MTFR1L-P2A-mCherry短暂过度表达。用抗TOM20抗体标记线粒体。比例尺，20μm。(**L（左）**)线粒体形态定量（K）。所有值：平均值±SD；至少三个独立的实验。另请参见图S2和S3。

图3。 — **图3 MTFR1L缺失引起的线粒体伸长是由于线粒体融合增加所致。**
(A类和B类)WT和MTFR1L KO U2OS细胞线粒体（A）分裂和（B）融合相关蛋白的免疫印迹。使用Vinculin、β-actin、ATP5a和GRP75作为负荷对照。(C类)经二甲基亚砜（DMSO）或交联剂1,6-双马来酰亚胺基己烷（BMH）处理的WT和MTFR1L KO U2OS细胞OPA1低聚物的免疫印迹。Tubulin和SDHB被用作负荷控制。(D类)WT和MTFR1L KO U2OS细胞OPA1水平的免疫印迹显示空载体pcDNA3+（−）和pcDNA3-MTFR1L（+）短暂过度表达。使用Vinculin和GRP75作为负荷控制。(E类)WT和MTFR1L KO U2OS细胞线粒体融合和分裂事件的量化线粒体标记GFP-OMP25短暂过度表达。每625-μm聚变和裂变事件比率的代表性量化²5分钟内的ROI显示为散点图。(如果)用指示的siRNA沉默的WT和MTFR1L KO U2OS细胞的代表性共聚焦图像。使用抗TOM20抗体标记线粒体。(**G公司**)线粒体形态定量（F）。(**H（H）**和我)线粒体形态量化为（H）线粒体数量和（I）每个ROI的平均线粒体面积。(J型)用指示的siRNA沉默的WT和MTFR1L KO U2OS细胞的代表性共聚焦图像。用TOM20抗体标记线粒体。(**K（K）**)线粒体形态的定量来自（J）。(**L（左）**和**M（M）**)线粒体形态量化为每个ROI的（L）线粒体数量和（M）平均线粒体面积。所有标尺，20μm。所有值：平均值±SD；至少三个独立的实验。另请参见图S4至S8。

图4。 — **图4 MTFR1L的AMPK依赖性磷酸化控制线粒体形态。**
(A类)WT和AMPK-α1中指示蛋白和MTFR1L磷酸化的免疫印迹分析^−/−-α2^−/−DKO U2OS细胞，短暂过度表达FLAG-WT MTFR1L^重量，MTFR1L标记^S103A标准，或FLAG-MTFR1L^S238A型磷酸化突变体，并用DMSO（−）或AMPK激活剂A769662（+）在200μM下处理1小时。使用特异性兔抗MTFR1L磷酸化抗体检测血清中两种不同的磷酸化¹⁰³和Ser²³⁸使用抗-FLAG来确认不同结构的过度表达，并使用β-肌动蛋白作为负荷对照。将来自两个不同实验的样品并排装载。(B类,E类、和**H（H）**)（B）WT、（E）MTFR1L KO和（H）AMPK-α1α2 DKO U2OS细胞的典型共焦图像，稳定表达P2A-mCherry单独（−）、MTFR1L^重量-P2A-m樱桃，双磷模拟物MTFR1L^{S103D/S238D标准}-P2A-mCherry或双磷酸突变体MTFR1L^{S103A/S238A型}-P2A-m樱桃。用抗TOM20抗体标记线粒体。(C类,D类,如果,**G公司**,我、和J型)线粒体形态量化为（C、F和I）平均线粒体面积和（D、G和J）线粒体长度，每个ROI来自（B）、（E）和（H）。(**K（K）**)单独稳定表达P2A-mCherry载体（−）、MTFR1L的WT和MTFR1LKO U2OS细胞OPA1水平的免疫印迹^重量-P2A-mCherry或MTFR1L^S103A/S238A-P2A mCherry。使用文丘林作为负荷控制。(**L（左）**)仅瞬时表达P2A-mCherry载体（−）、MTFR1L的WT和AMPK-α1α2 DKO U2OS细胞OPA1水平的免疫印迹^{S103D/s238天}-P2A-mCherry或MTFR1L^{S103A/S238A型}-P2A-m樱桃。GRP75和TOM20用作加载控制。所有标尺，20μm。所有值：平均值±SD；至少三个独立的实验。另请参见图S9。

图5。 — **图5 AMPK驱动的线粒体断裂需要MTFR1L。**
(A类)使用DMSO、10μM抗霉素A（AA）或变构AMPK激活剂C13处理1小时后的WT和MTFR1L KO U2OS细胞的典型共焦图像。用抗TOM20抗体标记线粒体。比例尺，20μm。(B类)线粒体形态定量（A）。(C类和D类)线粒体形态量化为（C）平均线粒体面积和（D）线粒体长度，每个ROI。(E类)对与（A）相对应的指示蛋白质进行免疫印迹分析，显示经DMSO、10μM抗霉素A（AA）或变构AMPK活化剂C13处理1小时后，WT和MTFR1L KO U2OS细胞中AMPK激活。使用文丘林作为负荷控制。(如果)（E）中指示蛋白质水平的量化。信号强度通过密度测定法进行量化，并归一化为负荷控制。N个=3个独立实验。(**G公司**)使用Oroboros仪器对完整WT和MTFR1L KO U2OS细胞进行高分辨率呼吸测定分析。常规：细胞基础耗氧率（pmol O₂/s）在补充培养基或缺乏葡萄糖的情况下，每百万个细胞（饥饿4小时）。泄漏是指在ATP合酶抑制剂寡霉素存在下的非磷酸化呼吸。ETS：存在解偶联剂CCCP时的最大呼吸速率。N个=3个独立实验。(**H（H）**)通过生物发光法定量测定经二甲基亚砜或抗霉素A处理的WT和MTFR1L KO U2OS细胞的ATP/ADP比率。N个=3个独立实验。所有值：平均值±SD或SEM；至少三个独立的实验。另请参见图S10和S11。

图6。 — **图6.小鼠皮层PNs中MTFR1L的敲除导致轴突中线粒体延长和线粒体密度增加。**
(A类)体外14天（DIV）表达2/3层PNs的小发夹（sh）非靶向（shNT）或MTFR1L（shMTFR1L）轴突的典型共焦图像。轴线粒体形态通过以下组合的皮层体外电穿孔进行可视化：（i）遗传编码的线粒体标记：OMM-靶向mCherry（ActA-mCherri）、基质靶向mtagBFP2（mito-mtagBFP2）或基质靶向YFP（mito-YFP），（ii）细胞质填料tdTomato或mtagBFP3，以及（iii）控制shNT或shMTFR1L。分离并共同培养电穿孔的个体E15.5脑。(B类到D类)线粒体形态由（A）作为（B）平均线粒体长度、（C）累积线粒体长度和（D）线粒体在轴突中的占有率（轴突段中的累积线粒体长度除以总段长度）进行量化。(E类)表达shMTFR1L的DIV14轴突与mito-mTagBFP2和tdTomato电穿孔的典型共焦图像，以及WT-MTFR1L的过度表达^重量或双磷酸突变体MTFR1L^{S103D/S238D标准}. (如果到**H（H）**)线粒体形态通过（E）as（F）平均线粒体长度、（G）累积线粒体长度和（H）轴突中的线粒体占有率进行量化。(我)出生后第21天shNT或shMTFR1L处理的2/3层PN对侧轴突投射的典型共焦图像（P21）。通过线粒体YFP和td番茄的宫内皮层电穿孔、shNT或线粒体基质（matrix-DsRed）探针、细胞质填充物Venus和shMTFR1L，观察轴线粒体形态。(J型到**L（左）**)线粒体形态由（I）量化为（J）平均线粒体长度、（K）累积线粒体长度和（L）轴突中的线粒体占有率。所有标尺，10μm。所有值：平均值±SD；至少三个独立的实验。另请参见图S12和S13。

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