Structure of the PAPP-ABP5 complex reveals mechanism of substrate recognition

doi:10.1038/s41467-022-33175-2

.2022年9月20日；13(1):5500.

doi:10.1038/s41467-022-33175-2。

PAPP-A的结构_{业务流程5}复合物揭示底物识别机制

附属公司

¹AbbVie，1 North Waukegan Road，North Chicago，IL，USA美国伊利诺伊州北芝加哥市。
²Calico Life Sciences LLC，美国加利福尼亚州南旧金山。
^三英国伦敦DeepMind。
⁴美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学陈医学院生物化学与分子生物技术系。
⁵美国马萨诸塞州伍斯特AbbVie生物研究中心。
⁶GRAIL，美国加利福尼亚州门罗公园。
⁷Calico Life Sciences LLC，美国加利福尼亚州南旧金山。deaton@calicolabs.com。
⁸Calico Life Sciences LLC，美国加利福尼亚州南旧金山。qhao@calicolabs.com。

^#贡献均等。

PMID： 36127359
预防性维修识别码：项目经理C9489782
内政部： 10.1038/s41467-022-33175-2

PAPP-A的结构_{业务流程5}复合物揭示底物识别机制

Russell法官等。国家公社. 2022.

.2022年9月20日；13(1):5500.

doi:10.1038/s41467-022-33175-2。

附属公司

¹AbbVie，1 North Waukegan Road，North Chicago，IL，USA美国伊利诺伊州北芝加哥市。
²Calico Life Sciences LLC，美国加利福尼亚州南旧金山。
^三英国伦敦DeepMind。
⁴美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学陈医学院生物化学与分子生物技术系。
⁵美国马萨诸塞州伍斯特AbbVie生物研究中心。
⁶GRAIL，美国加利福尼亚州门罗公园。
⁷Calico Life Sciences LLC，美国加利福尼亚州南旧金山。deaton@calicolabs.com。
⁸Calico Life Sciences LLC，美国加利福尼亚州南旧金山。qhao@calicolabs.com。

^#贡献均等。

PMID： 36127359
预防性维修识别码：项目经理C9489782
内政部： 10.1038/s41467-022-33175-2

勘误表in

作者更正：PAPP-A的结构_{业务流程5}复合体揭示了底物识别的机制。
法官RA、Sridar J、Tunyasuvunakool K、Jain R、Wang JCK、Ouch C、Xu J、Mafi A、Nile AH、Remarick C、Smith CL、Ghosh C、徐C、Stoll V、Jumper J、Singh AH、Eaton D、Hao Q。法官RA等人。国家公社。2022年9月28日；13(1):5694. doi:10.1038/s41467-022-33522-3。国家公社。2022 PMID：36171222 免费PMC文章。没有可用的摘要。

摘要

胰岛素样生长因子（IGF）信号传导高度保守，并受到包括妊娠相关血浆蛋白A（PAPP-A）在内的蛋白酶的严格调控。PAPP-A及其类似物PAPP-A2是金属蛋白酶，通过IGF结合蛋白（IGFBP）的裂解调节IGF的生物利用度。在这里，我们展示了催化失活突变体PAPP-A（E483A）与其底物IGFBP5（PAPP-A-）的肽复合物中的单粒子冷冻电镜结构_{业务流程5})也可以利用AlphaFold的强大功能生成一个高质量的预测模型作为起始模板。我们证明PAPP-A是一种柔性反式二聚体，通过延伸到金属蛋白酶活性位点的25氨基酸锚定肽结合IGFBP5。这种介导特定PAPP-A-IGFBP5相互作用的独特IGFBP5锚定肽在其他PAPP-A底物中没有发现。此外，我们还说明了PAPP-A中心结构域在介导IGFBP5识别和转异构化中的关键作用。我们进一步证明，PAPP-A反式二聚体的形成和远端结构域间的相互作用对于IGFBP4的有效蛋白水解都是必需的，但对于IGFBP5的切割是不必要的。结构和生化研究共同揭示了PAPP-A底物结合和选择性的机制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

J.S.J.C.K.W、J.X.、A.M.、A.H.N.、C.R.、C.G.、D.E.和Q.H.是Calico Life Sciences LLC的员工，并声明没有其他竞争利益。R.A.J、R.J.、C.L.S和V.S.是AbbVie的员工，拥有AbbVie股。K.T.和J.J.是DeepMind的员工。J.J.以DeepMind Technologies Limited的名义，分别提交了16/701070和PCT/EP2020/084238、PCT/EP2021/072552、PCT/EP 2021/082684、PCT/EP2021/08696、PCT/EPC 2021/082998和PCT/EP 2021/082707的非临时专利申请，这些申请均与预测蛋白质结构的机器学习有关，均处于未决状态。C.O.和C.X.声明没有竞争利益。AbbVie、Calico和DeepMind为研究提供了财务支持，并参与了出版物的设计、实施、数据分析、审查和批准。

数字

**图1。AlphaFold2促进PAPP-A结构测定_{业务流程5}.**
一PAPP-A的结构域示意图，用不同颜色高亮显示（层粘连蛋白G样结构域（LG）紫色、金属蛋白酶结构域（MP）绿色、中心结构域（M1/M2）浅蓝色、补体控制蛋白结构域或SCR（短一致重复序列）（CCP1）巧克力、（CCP2）小麦、（CCP3）桃酥、（CCP4）雾玫瑰、（CCP5）卡其色和Lin12-Notch Repeats（LNR 1、2、3）鲑鱼）。b条PAPP-A的低温电磁密度图_{业务流程5}整体分辨率为3.28 ？，使用两个阈值级别来突出显示局部分辨率（左：0.279，右：0.496）。结构表明，一种单体的分辨率高于另一种，PAPP-a核结构域的分辨率高于C末端结构域。3D低温电子显微镜地图是按分辨率着色的（中间的条形图）。局部分辨率由cryoSPARC v3计算。**c（c）**PAPP-A型_桶5用不同PAPP-A域着色的复杂低温电子显微镜密度图（EMD-26475）一，IGFBP5肽以深橙色突出显示。结构中未观察到Lin12-Notch Repeats（LNR 1、2、3）和CCP3-5畴。阈值水平设置为0.2305。冷冻电镜图由ChimeraX生成（补充参考文献1、2）。d日（左）PAPP-A_{业务流程5}带状物（PDB 7UFG）中表示的复杂结构，PAPP-A域以与中相同的颜色高亮显示一和以深橙色突出显示的IGFBP5锚定肽。（右）IGFBP5锚定肽放大，从残基Pro119到Ser143。网格密度和残渣侧链均高亮显示。用Pymol和ChimeraX制备了结构图。

**图2。PAPP-A二聚化机制。**
一PAPP-A的整体低温电子显微镜结构_{业务流程5}在表面表征中，PAPP-A以二聚体的形式存在于反式PAPP-A链A和链B分别为小麦色和蓝色。IGFBP5锚定肽显示为深橙色的卡通。b条（左）CCP2和LG域相互作用的表面表示。CCP2和LG域分别以小麦和紫色着色。（右）CCP2和LG域之间接口的特写视图。界面中的关键疏水残基突出显示为木棒。**c（c）**（上图）框中突出显示了PAPP-A二聚体整体界面的两个关键环区的特写视图。（底部）用不同颜色突出显示的两个循环区域的放大界面：绿色为残基1068-1078（循环1），灰色为残基1100-111（循环2）。d日重组纯化WT PAPP-A和三种单体变体在1.4 μM浓度。WT PAPP-A表现为稳定的二聚体，而所有三种变体都向单体部分转移。WT PAPP-A和单体变体被纯化为自叶产品。显示了紫外吸收色谱图（顶部）以及还原SDS-PAGE凝胶考马斯素染色部分（底部）。数据点代表n个 = 3个独立重复。源数据作为源数据文件提供。

**图3。PAPP-A与IGFBP5的相互作用机制。**
一结合PAPP-A的IGFBP5锚定肽的结构描述，突出显示K128残基锚定位点（左）和活性位点（右）。结构显示IGFBP5锚定肽位于PAPP-A锌配位位点附近。b条通过荧光偏振（FP）测定法测量IGFBP5锚定肽和WT PAPP-A之间的结合亲和力。N-末端Alexa Fluor 568共轭IGFBP5^121-143(5 nM）与WT PAPP-A（5.65）的系列稀释液一起培养微米至33 室温下PBS缓冲液中的nM）。**c（c）**荧光偏振（FP）法测定FL IGFBP5与PAPP-A（E483A）之间的结合亲和力。FAM标记的IGFBP5（5 nM）与PAPP-A（E483A）（10）的系列稀释液培养微米–50 室温下PBS缓冲液中的nM）。在b条,**c（c）**FP值记录为10 最小值显示的数据是三个重复的代表。数据在GraphPad Prism 9.1.2中进行了分析。d日凝胶法中WT PAPP-A对WT IGFBP5、IGFBP5K128A和IGFBP5-K128D的蛋白水解活性效率的量化。使用平行运行的凝胶对来自同一实验的样品进行定量比较。横线表示平均值 ± 标准偏差n个 = 3个独立重复（在GraphPad Prism 9.1.2中分析）。补充图13c显示了IGFBP5 K128A、IGFBP5K128D的单一数据代表。**e（电子）**基于SDS-PAGE凝胶的WT PAPP-A蛋白水解酶活性测定显示IGFBP5锚定肽的关键作用。WT PAPP-A对WT IGFBP5有有效的裂解作用，而残基121-143被相应的IGFBP4残基114-134取代的嵌合IGFBP4对WT PAPP-A几乎没有反应。数据显示为3个独立重复的代表。在d日,**e（电子）**, 500 nM WT IGFBP5或嵌合蛋白与WT PAPP-A在剂量反应中孵育。反应在37 4°C h.源数据作为源数据文件提供。

**图4。PAPP-A底物对IGFBP4和IGFBP5的选择性。**
一,b条蛋白质水解活性数据表明，IGFBP4而非IGFBP5的裂解取决于LG和CCP2结构域之间的适当相互作用。凝胶法测定IGFBP4和IGFBP5中不同PAPP-A截短和三重突变（L1254A/F1257A/H1211A）蛋白水解活性的定量如所示一和b条分别为。上述凝胶法的单一数据代表如补充图16所示。**c（c）**,d日蛋白水解活性测定表明，PAPP-A二聚体的形成对IGFBP4的裂解至关重要，但对IGFBP5的裂解不起作用。WT PAPP-A、PAPP-A-的量化^1100-1111*，乳头状瘤^1100-1135*、PAPP-A^4C4S型凝胶法中对底物IGFBP4和IGFBP5的蛋白水解活性如所示**c（c）**和d日分别为。分析的单一数据代表**c（c）**,d日如补充图17a、b所示。**e（电子）**,**（f）**PAPP-A（1132）和FL-PAP-A（E483A）的共表达显著挽救了IGFBP4的裂解。凝胶法中FL PAPP-A、催化死亡突变型PAPP_A（E483A）、PAPP-A-（1132）和共表达的PAPP-A（E4803A）/PAP-A（1132”）异二聚体蛋白水解活性对IGFBP4和IGFBP5的定量显示于**e（电子）**和**（f）**分别为。分析的单一数据代表**e（电子）**,**（f）**如补充图18b，c所示。对于所有蛋白水解活性分析，400 nM IGFBP4/700 nM IGF1或500 nM WT IGFBP5与不同蛋白酶在剂量反应中孵育。反应在37 4°C h.在所有量化中，条形为平均值 ± 标准偏差n个 = 3个独立重复。使用平行运行的凝胶对来自同一实验的样品进行定量比较。源数据作为源数据文件提供。

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